CN108918228B - 血清或血浆中的外泌体制备试剂盒及外泌体制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种血清或血浆中的外泌体制备试剂盒及外泌体制备方法，所述试剂盒包括外泌体提取试剂，所述外泌体提取试剂为亲水聚合物或亲水聚合物的溶液；所述亲水聚合物包括PEG、硫酸葡聚糖、PVP中的一种或几种的组合，所述PEG的分子量为20,000‑1,200,000道尔顿，所述硫酸葡聚糖的分子量为5,000‑20,000道尔顿，所述PVP的分子量为10,000或40,000‑700,000道尔顿，利用该试剂盒得到的外泌体粒径分布更集中；本发明提供的外泌体制备方法还优化了外泌体纯化步骤，使得外泌体的杂质更少，纯度更高。

Description

血清或血浆中的外泌体制备试剂盒及外泌体制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域。更具体地，涉及一种血清或血浆中外泌体制备试剂盒及外泌体制备方法。

背景技术

外泌体(Exosome)发现于1986年，是一种直径约30-150nm的双层脂膜囊泡状结构小体，可由机体内多种细胞如免疫细胞、干细胞、心血管细胞、网织红细胞、血小板、神经细胞和肿瘤细胞等主动分泌产生，广泛分布于外周血、尿液、唾液、乳汁、腹水、羊水等体液中。外泌体携带大量特异性的蛋白质(如细胞因子、生长因子)以及功能性的mRNA、 miRNA等生物活性物质。目前人们多采用超速离心、免疫磁珠、超滤、沉淀或试剂盒等方法实现外泌体的提取分离。但是由现有技术的方法提取得到的外泌体，收率较低，颗粒范围大，且纯度不高，易含有与外泌体尺寸特征类似的蛋白质颗粒。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种高效的外泌体提取试剂。

本发明的第二个目的在于提供一种血清或血浆中的外泌体制备试剂盒。

本发明的第三个目的在于提供一种制备血清或血浆中外泌体的方法。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

根据上述第一个目的，本发明提供一种血清或血浆中的外泌体提取试剂，

所述提取试剂为亲水聚合物或亲水聚合物的溶液；

所述亲水聚合物包括PEG、硫酸葡聚糖、PVP中的一种或几种的组合；

所述PEG的分子量为20,000-1,200,000道尔顿，所述硫酸葡聚糖的分子量为 5,000-20,000道尔顿，所述PVP的分子量为10,000或40,000-700,000道尔顿。

优选地，所述亲水聚合物的溶液为水溶液、盐溶液或有机溶液；所述亲水聚合物的总浓度为1-500mg/ml。

优选地，所述亲水聚合物包括PEG和PVP中的至少一种与硫酸葡聚糖的组合，所述硫酸葡聚糖的浓度为1-250mg/ml，优选为10-150mg/ml，最优选为50-100mg/ml。

优选地，所述亲水聚合物的溶液包括高分子物质，所述高分子物质包括单糖、二糖、多糖和蛋白质中的至少一种；所述亲水聚合物的溶液中高分子物质的浓度为0.01-50mg/ml。

优选地，所述单糖为葡萄糖，二糖为蔗糖，多糖为糖原，蛋白质为碱性蛋白。

根据上述第二个目的，本发明提供一种制备外泌体的试剂盒，包括如上任一项所述的外泌体提取试剂。

优选地，所述试剂盒还包括纯化微球，所述纯化微球包括琼脂糖珠，所述琼脂糖珠与有机基团进行了偶联。

优选地，所述琼脂糖珠包括Protein A，Protein G，Protein L，Blue beads 6FF、丁基- 琼脂糖凝胶4B、DEAE-琼脂糖凝胶CL-6B中的一种或几种的组合。

优选地，所述试剂盒还包括外泌体溶解试剂。

本发明还提供一种如上任一项所述的试剂盒在制备分离外泌体或外泌体类似双层脂膜囊泡中的应用。

根据上述第三个目的，本发明还提供一种血清或血浆中的外泌体制备方法，包括以下步骤：

向血清或血浆中加入1/4倍体积至1倍体积的外泌体提取试剂，混匀后静置，离心去除上清，得到外泌体沉淀；

向所述外泌体沉淀中加入外泌体溶解试剂，得到外泌体溶解液；

向所述外泌体溶解液中加入纯化微球，静置后离心，收集上清即为高纯度外泌体。

优选地，还包括向血清或血浆中加入Proteinase K进行预处理的步骤。

本发明的有益效果如下：

本发明提供一种独特的外泌体提取试剂配方，使得沉淀下来的囊泡的粒径范围更窄，外泌体粒径分布更集中，富集的非目标双层囊泡结构的小泡更少；且在沉降后，本发明还优化了外泌体的纯化工艺，利用纯化微球去除掉沉降下来的血清或者血浆中的杂质蛋白颗粒，使得通过本方法制备的外泌体更容易获得高质量的电镜图像，Western blot检测实验中可获得更加特异性的条带，减少非特异性物质的干扰，且能确保外泌体的活性。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出本发明试验例1中得到的外泌体粒径测试结果图；

图2示出本发明试验例1中得到的外泌体两次粒径测试结果平均值分布图；

图3示出本发明试验例2中得到的外泌体电镜图；

图4示出本发明试验例3中不同配比的纯化微球纯化效果考马斯亮蓝染色图；

图5本发明试验例3中交叉实验考马斯亮蓝染色图；

图6示出本发明试验例4中得到的外泌体Western blot检测结果图；

图7示出本发明试验例5中得到的外泌体细胞迁移距离统计结果图；

图8示出试验例5两次细胞迁移实验的统计结果图；

图9示出试验例6的qPCR统计结果图；

图10示出试验例7中正常人和结直肠癌患者血清中外泌体的miR-19a的qPCR结果比较图。

具体实施方式

现有技术如SBI公司专利号为US9005888B2的专利中公开一种血清血浆中外泌体的分离方法，主要是利用亲水聚合物聚乙二醇(PEG)、硫酸葡聚糖和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等单一一种或者几种组合的成分作为聚成物，进行沉降后离心收集，其后没有纯化步骤或者只有简单纯化，导致得到的外泌体提取物存在很多不足。首先，其沉降下来的双层脂囊泡颗粒的粒径范围约10～400nm或者更大，包含有太多不同种类的其他非外泌体同性质的囊泡。其次，其沉降下来的外泌体中含有大量的非外泌体的、血清或者血浆中存在的各类蛋白质颗粒，导致获得的外泌体纯度很低，具体体现为电镜实验中杂质点多，且电镜图片不干净，Western blot实验中非特异性信号多，甚至可以严重干扰检测，出现假阳性或假阴性条带等。而且，上述的诸多不确定性导致利用该方法沉降下来的外泌体的活性不明确。

针对现有技术中存在的问题至少之一，本发明提供一种血清或血浆中的外泌体提取试剂，所述提取试剂为亲水聚合物或亲水聚合物的溶液；所述亲水聚合物包括PEG(聚乙二醇)、硫酸葡聚糖、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)中的一种或几种的组合；

所述PEG的分子量为20,000-1,200,000道尔顿，例如，具体可以为35,000道尔顿，50,000 道尔顿，100,000道尔顿，200,000道尔顿，300,000道尔顿，400,000道尔顿，600,000道尔顿，900,000道尔顿，1000,000道尔顿，2000,000道尔顿，4000,000道尔顿，5000,000 道尔顿，8000,000道尔顿等。

所述硫酸葡聚糖的分子量为5,000-20,000道尔顿，例如，具体可以为5,000道尔顿， 9,000道尔顿，15,000道尔顿，20,000道尔顿等。

所述PVP的分子量为10,000或40,000-700,000道尔顿，例如，具体可以为10,000道尔顿，55,000道尔顿，360,000道尔顿等。

本发明中的外泌体提取试剂可以应用于血清/血浆中的外泌体提取，也可以应用于血清 /血浆类似体液中的外泌体提取，所述血清/血浆类似体液可以为具有血清/血浆类似生理组成或者人体或动物体循环系统内能和血液相互转换的体液，如：尿液或胸腔积液或脊髓液或脑脊髓液或唾液或乳液或关节液或精液或阴道液或羊水或细胞上清。

本发明通过筛选亲水聚合物的最优分子量范围，提供一种具有独特配方的外泌体提取试剂，利用该提取试剂进行血清或血浆中的外泌体提取，可以使得提取到的外泌体粒径分布更集中，可以解决现有技术的方法中存在的沉降下来的双层脂膜囊泡结构颗粒范围过大而导致的包含过多非外泌体及其同性质囊泡的问题，有利于后续的电镜实验或其它检测实验的进行。

优选地，所述亲水聚合物的溶液为水溶液、盐溶液或有机溶液；所述亲水聚合物的总浓度为1-500mg/ml，例如，可以为1mg/ml，30mg/ml，100mg/ml，300mg/ml，500mg/ml。

优选地，所述亲水聚合物包括PEG和PVP中的至少一种与硫酸葡聚糖的组合，所述硫酸葡聚糖的浓度为1-250mg/ml，优选为10-150mg/ml，最优选为50-100mg/ml。

所述亲水聚合物的溶液包括高分子物质，所述高分子物质包括单糖、二糖、多糖和蛋白质中的至少一种；所述亲水聚合物的溶液中高分子物质的浓度为0.01-50mg/ml。

优选地，所述单糖为葡萄糖，二糖为蔗糖，多糖为糖原，蛋白质为碱性蛋白。

另一方面，本发明提供一种制备外泌体的试剂盒，包括如上任一项所述的外泌体提取试剂。

优选地，所述试剂盒还包括纯化微球，所述纯化微球包括琼脂糖珠；优选地，所述琼脂糖珠包括Protein A，Protein G，Protein L，Blue beads 6FF、丁基-琼脂糖凝胶4B、DEAE- 琼脂糖凝胶CL-6B中的一种或几种的组合。所述琼脂糖珠与有机基团进行了偶联，偶联了有机基团的琼脂糖珠可以吸附吸附沉降下来的杂质蛋白颗粒，使得提取得到的外泌体纯度更高。

所述纯化微球可以为两种琼脂糖珠的任意组合，例如：

Protein A和丁基-琼脂糖凝胶4B；

Protein A和Blue beads 6FF；

Protein A和DEAE-琼脂糖凝胶CL-6B；

Protein G和丁基-琼脂糖凝胶4B；

Protein G和Blue beads 6FF；

Protein G和DEAE-琼脂糖凝胶CL-6B；

Protein A/G和丁基-琼脂糖凝胶4B；

Protein A/G和Blue beads 6FF；

Protein A/G和DEAE-琼脂糖凝胶CL-6B；

丁基-琼脂糖凝胶4B和Blue beads 6FF；

丁基-琼脂糖凝胶4B和DEAE-琼脂糖凝胶CL-6B；

Blue beads 6FF和DEAE-琼脂糖凝胶CL-6B。

当所述纯化微球由两种琼脂糖珠组成时，两种琼脂糖珠的组成比例可以为100：1～1： 100，例如，可以为100:1，50:1，1:1，1:2，1:7，1:20，优选为1:1-1:20，最优选为1:2-1:7。

在本发明的一个具体实施方式中，所述纯化微球为Protein G和丁基-琼脂糖凝胶4B，其组成比例为1:20。

所述纯化微球也可以为三种琼脂糖珠的任意组合，例如：Protein A、丁基-琼脂糖凝胶 4B和Blue beads 6FF；Protein A、DEAE-琼脂糖凝胶CL-6B和丁基-琼脂糖凝胶4B；Protein G、DEAE-琼脂糖凝胶CL-6B和丁基-琼脂糖凝胶4B等。当所述纯化微球由三种琼脂糖珠组成时，三种琼脂糖珠的组成比例可以为1:1:1-1:20:20，例如，可以为Protin A:丁基琼脂糖凝胶4B:Blue beads 6FF＝1:1:1。

优选地，所述试剂盒还包括外泌体溶解试剂，最常选用的为PBS溶液。

本发明还提供一种如上任一项所述的试剂盒在制备分离血清、血浆中的外泌体或外泌体类似双层脂膜囊泡中的应用，该试剂盒也可以应用于血清/血浆类似体液中的外泌体或外泌体类似双层脂膜囊泡的提取。

此外，本发明还提供一种血清或血浆中的外泌体制备方法，包括以下步骤：

向血清或血浆样品中加入如上任一所述的外泌体提取试剂，混匀后静置，离心去除上清，得到外泌体沉淀；外泌体提取试剂的加入量为待提取样品体积的1/4倍-1倍，优选为 1/4倍-1/2倍；所述静置的条件优选为4℃静置10-60分钟，进一步优选为20-40分钟，在保证充分沉降的同时保证外泌体的活性；离心条件优选为2000g-15000g，10分钟，进一步优选为8000g-12000g，10分钟。

向所述外泌体沉淀中加入如上所述的外泌体溶解试剂，得到外泌体溶解液；所述外泌体溶解试剂优选为PBS缓冲溶液。

向所述外泌体溶解液中加入如上任一所述的纯化微球，静置后离心，收集上清即为高纯度外泌体。所述静置的条件优选为4℃静置10-60分钟，进一步优选为20-40分钟；所述离心的条件优选为3000g-4000g，5-10分钟。

本领域技术人员可以想到的是，在用外泌体提取试剂对待提取样品进行处理之前，可以先进性离心处理，以去除血清或血浆样品中残留的细胞和碎片，也可以提前加入Proteinase K进行处理，初步去除样品中的杂质蛋白。

利用本发明提供的外泌体制备方法，采用本发明提供的独特的外泌体提取试剂，并优化了外泌体的纯化步骤，使得制备得到的外泌体粒径范围集中，纯度高，杂质少，且能保证外泌体的活性，更易获得高质量的外泌体电镜图像。

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

不同聚合程度的PEG和PVP均购自Sigma-Aldrich公司。不同聚合程度的硫酸葡聚糖均购自Amresco公司。碱性蛋白购自Sigma-Aldrich公司。Protein A，Protein G，ProteinL， Blue beads 6FF、丁基-琼脂糖凝胶4B、DEAE-琼脂糖凝胶CL-6B均购自天地仁和公司。MDA-MB-231购自ATCC。CD81抗体、CD9抗体和CD63抗体均购自Santa Cruz公司。TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(AT301-02)，TransStart TipGreen qPCR SuperMix(AQ141-01)均由TransGen公司提供。SBI公司产品为ExoQuick PLUSExosome Purification Kit-Serum and Plasma(EQPL10A-1)，其操作完全按照随产品提供的说明书进行。

以下实验中涉及的引物由lifetech合成，各引物序列如下表所示。

表1引物序列表

ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagctcggggc	miR-486-5p RT
		acactccagctggg tcctgtactgagctgc	miR-486-5p QF
ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagaactcagt	miR-223 RT
		acactccagctggg cgtgtatttgacaagc	miR-223 QF
ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagaactcagt	miR-451 RT
		acactccagctgggaaaccgttaccattac	miR-451 QF
tggtgtcgtggagtcg	URP
		ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagtcagtttt	has-miR-19a-3p RT
acactccagctgggtgtgcaaatctatgcaa	has-miR-19a-3p QF

本发明各实施例所用试剂P1和B1的组分如下表所示。

表2各实施例所用试剂P1和B1组分

实施例1

血清中外泌体的提取

使用试剂的组成：

提取试剂P1(硫酸葡聚糖13,000，5％，葡萄糖，2.5％)

溶解试剂S1(PBS溶液)

纯化微球B1(Protein G和丁基-琼脂糖凝胶4B，20:1)

1、3,000g 4℃离心15分钟去除血清中残留的细胞和碎片。

2、每份样品100μl血清，加入25μl P1颠倒混匀，4℃静置30分钟，10,000g离心10分钟。

3、弃掉上清，收集沉淀，再次离心10,000g，5分钟，弃去残余上清。

4、加入初始体积两倍的S1溶液，用移液器轻轻吹打溶解，得到外泌体溶解液。

5、取出和起始血浆量等体积的纯化微球B1，4,000g离心3分钟，弃去上清，加入1mlS1 溶液颠倒混匀。

6、4,000g离心3分钟，弃上清，保留微球，向微球中加入步骤4得到的外泌体溶解液，置于4℃混匀仪上混匀2小时。

7、4,000g，4℃离心3分钟，小心的吸取上清到新的EP管中，即为纯化后的外泌体。

实施例2

血浆中外泌体的提取

使用试剂的组成：

提取试剂P1(PEG 30,000，5％，硫酸葡聚糖15,000，5％，葡萄糖，6％)

溶解试剂S1(PBS溶液)

纯化微球B1(Protein G和丁基-琼脂糖凝胶4B，1:1)

Proteinase K(20％)

1、3,000g 4℃离心15分钟去除血清中残留的细胞和碎片。

2、转移上清到新的EP管中，加入0.5倍体积的S1溶液，颠倒或者涡旋震荡混匀。

3、加入0.05倍体积的Proteinase K，混匀样品，于37℃保温10分钟，然后预冷到4℃。

4、加入现有总体积(血浆的体积+S1的体积)的0.2倍体积P1到样品中，混匀后置于4℃，静置30分钟。

5、10,000g 4℃10分钟离心。

6、收集沉淀，弃去上清，再次离心10,000g，5分钟，弃去残余的上清。

7、加入2倍体积的S1溶液溶解，用移液器轻轻吹打至溶解，得到外泌体溶解液。

8、取出和起始血浆量等体积的B1微球，4,000g离心3分钟，弃去上清，加入1ml S1溶液颠倒混匀。

9、4,000g离心3分钟，弃上清，保留微球，向微球中加入得到外泌体溶解液，置于4℃混匀仪上混匀2h。

10、4000g离心3分钟，小心的吸取上清到新的EP管中，即为纯化后的外泌体。

实施例3

血清中外泌体的提取

使用试剂P1和B1的组成如表2所示，溶解试剂S1为PBS溶液。

重复实施例1中的外泌体提取步骤。

实施例4

血浆中外泌体的提取

使用试剂P1和B1的组成如表2所示，溶解试剂S1为PBS溶液。

重复实施例1中的外泌体提取步骤。

实施例5

血浆中外泌体的提取

使用试剂P1和B1的组成如表2所示，溶解试剂S1为PBS溶液。Proteinase K的浓度为20％。重复实施例2中的外泌体提取步骤。

实施例6

血清/血浆中外泌体miRNA的提取

使用试剂组成

P1溶液(硫酸葡聚糖10,000，5％，NaCl 10mM，葡萄糖，5％)

以下试剂来自于TransGen公司

EasyPure miRNA Kit(ER601-01)

Lysis Buffer 10(LB10)

Wash Buffer 10(WB10)

RNA Spin Columns with Collection Tubes

miRNA Spin Columns with Collection Tubes

RNase-free Tubes(1.5ml)

RNase-free Water

1、3,000g 4℃离心15分钟去除血清中残留的细胞和碎片。

2、每份样品200μl Serum/Plasma，加入50μl P1溶液颠倒混匀，4℃静置30分钟，10,000g离心10分钟。

3、弃掉上清，收集沉淀，再次离心10000g 5分钟，弃去残余上清。

4、加入1ml LB10,用移液器仔细吹打沉淀，尽量使沉淀全部溶解。

5、加入0.2倍体积氯仿，剧烈震荡30s，室温孵育3分钟。

6、10,000g 4℃离心15分钟，此时样品分成3层，无色的水相(上层)，中间层，粉红色的有机相(下层)弃取上清，RNA主要在水相中，约占所用LB10的50％-60％。

7、转移无色水相到新的离心管中，加入1/3体积的无水乙醇(如600μl转移液中加入200μl 无水乙醇)轻轻颠倒混匀。

8、将溶液加入RNA Spin Column,12000g室温离心30s，保留留出液。

9、准确测量留出液体积，加入1.25倍体积的无水乙醇，轻轻颠倒混匀。

10、将溶液和沉淀一起加入miRNA Spin Column，12,000g室温离心30s，弃掉留出液，重复步骤直到液体加完为止。

11、加入WB10 500μl，12,000g室温离心30s，弃掉留出液。

12、重复步骤11。

13、12,000g室温离心2分钟，彻底去除残留的乙醇。

14、将miRNA Spin Column放入RNase-free 1.5ml tube中，加入20～30μl RNase-free Water 在离心柱的中央，室温静置1分钟。

15、12,000g室温离心1分钟，洗脱miRNA。

16、-80℃保存miRNA。

对比例1

利用SBI公司产品ExoQuick PLUS Exosome Purification Kit-Serum andPlasma (EQPL10A-1)提取血清中的外泌体，提取步骤完全按照随产品提供的说明书进行。

试验例1

外泌体的粒径测试

使用本发明提供的方法(实施例1-3)以及SBI公司方案(对比例1)提取外泌体，测定所得外泌体粒径。SBI-14为SBI公司产品结果，备选方案-3为本发明实施例1-3所得到的外泌体粒径测试结果。此实验是在北京电子能谱中心(NCESBJ)完成。

图1中显示了SBI产品和3个实施例1-3从14号样品血清中所提取出的外泌体的粒径测试结果。图2中显示了对比例1和实施例1、2分别从9号，11号，14号血清样品中提取出的外泌体的粒径分布(2.5％-97.5％)。由检测结果图可以看出，使用本发明实施例提供的方法得到的外泌体粒径范围更窄。

利用同样的方法对实施例4-5中制备的外泌体粒径进行检测，其大部分粒径也均分布在 30nm-150nm,比对比例1得到的外泌体粒径平均范围更窄。

试验例2

利用电镜进行外泌体的形态观察

使用本发明提供的方法(实施例1-5)以及SBI公司方案提取外泌体。每100μl血清/血浆所提取的外泌体进行一定比例的稀释(2～10倍)，使用铜网制备透射电镜样品，然后使用电镜观察并拍摄，典型视野如图3所示。由图3可以看出，与对比例1相比，利用本发明提供的方法制备得到的外泌体，其结构更加完整，得到的外泌体图像更加清晰，其中所含有的非外泌体杂质更少。

试验例3

考马斯亮蓝染色试验

使用本发明所提供的外泌体提取试剂(实施例1-5中的任意一种)提取血清/血浆中的外泌体，得到含有外泌体的沉淀粗提物后，用Protein G和丁基-琼脂糖凝胶4B的不同优化比例的混合beads纯化含有外泌体的粗提物，10％SDS-PAGE电泳检测后考马斯亮蓝染色观察纯化效果如图4所示。

将SBI的提取外泌体的方案和纯化外泌体的方案和本发明提取以及纯化外泌体的方案的交叉实验后，进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色(提取和纯化过程具体过程参考实施例1、 2)，最终结果如图5所示。由图4和图5可以看出，与对比例1相比，利用本发明的外泌体提取和纯化的方法制备得到的外泌体，其中所含有的杂质蛋白更少，纯净度更高。

试验例4

外泌体表面标志性蛋白的Western blot检测

分别检测了纯化后外泌体表面的标志性蛋白CD63、CD81和CD9。从血清中提取并纯化外泌体(实施例5)。每100μl血清/血浆最终得到约200μl纯化后的外泌体溶液。简单超声(30w，20s)破碎后加入6×protein loading。10％SDS-PAGE电泳检测，每孔上样30μl。 5％牛奶封闭30分钟，一抗(CD63，CD81，CD9抗体)4℃孵育过夜，二抗(ProteinFind Goat Anti-Mouse IgG(H+L),HRP Conjugate)室温孵育1h，ECL发光显色，结果如图6所示。由图6可以看出，利用本发明的外泌体提取和纯化的方法制备得到的外泌体能够检测到的标志性蛋白具有良好的特异性，无非特异性杂质蛋白干扰检测。

试验例5

外泌体活性测定

外泌体可能影响部分细胞的迁移速率，因此我们通过划痕实验测定细胞迁移率的变化，以此来检测本发明所提取的外泌体是否具有生物学活性的。

有文献(Harris et al.,2015)显示MDA-MB-231细胞对从它自身分泌的外泌体敏感，在加入从它自身上清中提取出来的外泌体后，细胞迁移速度发生明显改变。本实验用MDA-MB-231细胞，50％覆盖率铺盘，待24h后其长满划痕拍照，加入从人源血清中提取的外泌体后24h再次拍照。

本实验共3次重复，分别加入利用本发明实施例1提取的来自于两个不同健康人的血清中所提取的外泌体，加入外泌体的量梯度设置为0.7μl-20μl；细胞迁移距离的统计结果如图 7所示，随着外泌体的加入量的增加，细胞迁移距离梯度增加，表明了来自于人血清的外泌体能够促进MDB-MA-231的细胞迁移，同时也表明按照本专利配方所提取的来自于血清的外泌体具有生物学活性。

图8是2次实验的统计结果，均为3组数据的平均值的结果，时间跨度为24h，迁移结果计算方式为：

迁移的距离＝24h后的划痕跨度-0h的划痕跨度；

统计结果＝每个实验数据点的迁移距离/对照的实验数据点的平均迁移距离；

划痕跨度的＝划痕的面积/划痕的高度。

划痕的测距由Image J软件(由National Institutes of Health开发)完成。

利用同样的方法，对实施例2-5得到的外泌体均进行了活性测定，测定结果显示，通过

实施例2-5制得的外泌体也均具有良好的生物学活性。

试验例6

利用qPCR检测外泌体特异性miRNA

为了检测纯化得到的外泌体中含有特异性miRNA，我们对血清/血浆中外泌体内的miRNA(实施例6得到的miRNA)进行qPCR检测。

共检测了miR223，miR451,miR486-5p这3种miRNA，检测方法参考Danese et al.,2017；Poon et al.,2017。在9,10,12,14这四种来自于不同的人的血清中分别用SBI的产品和本专利配方提取了外泌体,并设计了3种miRNA的颈环反转引物和扩增引物(各引物序列如上表 1所示)，使用TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(AT301-02)反转合成cDNA。利用TransStart Tip Green qPCR SuperMix(AQ141-01)进行qPCR检测。

miR223,miR451,miR486-5p均有较为特异的信号，其中miR451和miR486-5p信号较强。来自于不同人的血清中的miRNA有明显的个体表达差异，且均能够被SBI和本专利方法检测到；同一个人的血清样品，用SBI的方法和本专利方法检测，结果差异不大。(以上结果均来自于3次重复的均值。)qPCR统计结果如图9所示。

试验例7

利用qPCR检测结直肠癌患者血清特异性miRNA

利用本发明提供的方法提取正常人和结直肠癌(CRC)患者血清中外泌体内的miRNA (实施例6得到的miRNA)并进行qPCR对比。

分别提取了8个正常人和8个结直肠癌患者的血清中的外泌体的miRNA，并设计miR-19a的颈环反转引物和qPCR扩增引物(各引物序列如上表1所示)，使用TransScriptFirst-Strand cDNA Synthesis SuperMix(AT301-02)反转录合成cDNA。利用TransStartTip Green qPCR SuperMix(AQ141-01)完成qPCR。结果如图10所示，为来自于正常人和结直肠癌患者血清中外泌体的miR-19a的qPCR的结果normalized后相对水平的比较(计算方式为2-ΔΔCT,normalized的对象各自总体均值，t-test P<0.05)。miR-19a在结直肠癌患者血清中表达升高，统计结果和已有文献(Matsumura et al.,2015)报道的结果趋势一致。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

序列表

<110> 北京全式金生物技术有限公司

<120> 血清或血浆中的外泌体制备试剂盒及外泌体制备方法

<130> JLC18I0442E

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagctcg gggc 44

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acactccagc tgggtcctgt actgagctgc 30

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagaact cagt 44

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acactccagc tgggcgtgta tttgacaagc 30

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagaact cagt 44

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acactccagc tgggaaaccg ttaccattac 30

<210> 7

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tggtgtcgtg gagtcg 16

<210> 8

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagtcag tttt 44

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acactccagc tgggtgtgca aatctatgca a 31

Claims (6)

1.一种血清或血浆中的外泌体制备试剂盒，其特征在于，包括外泌体提取试剂和琼脂糖珠；其中，所述外泌体提取试剂为亲水聚合物或亲水聚合物的溶液；

所述亲水聚合物包括PEG、硫酸葡聚糖、PVP中的一种或几种的组合；

所述PEG的分子量为20,000-1,200,000道尔顿，所述硫酸葡聚糖的分子量为5,000-20,000道尔顿，所述PVP的分子量为10,000或40,000-700,000道尔顿；

所述琼脂糖珠为Protein G与丁基-琼脂糖凝胶4B的组合，且Protein G与丁基-琼脂糖凝胶4B的组成比例为1:1-20:1。

2.根据权利要求1所述的外泌体制备试剂盒，其特征在于，所述亲水聚合物的溶液为水溶液、盐溶液或有机溶液；所述亲水聚合物的总浓度为1-500mg/ml。

3.根据权利要求1所述的外泌体制备试剂盒，其特征在于，所述亲水聚合物包括PEG和PVP中的至少一种与硫酸葡聚糖的组合，所述硫酸葡聚糖的浓度为1-250mg/ml。

4.一种如权利要求1-3任一所述的外泌体制备试剂盒在制备分离外泌体或外泌体类似双层脂膜囊泡中的应用。

5.一种利用如权利要求1-3任一所述的外泌体制备试剂盒制备血清或血浆中外泌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）向血清或血浆中加入1/4倍体积至1倍体积的外泌体提取试剂，混匀，4℃静置 30分钟，10,000g 离心10分钟；

（2）去除上清，收集沉淀，再次离心10,000g，5分钟，去除残余上清，得到外泌体沉淀；

（3）向所述外泌体沉淀中加入外泌体溶解试剂，得到外泌体溶解液；

（4）将步骤（3）获得的外泌体溶解液与琼脂糖珠4℃混匀2小时，4000g离心3分钟，收集上清即为高纯度外泌体。

6.根据权利要求5所述的制备血清或血浆中外泌体的方法，其特征在于，还包括向血清或血浆中加入Proteinase K进行预处理的步骤。

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