CN105388055B - 从尿液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了从尿液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法，依次包括：先对尿液样本进行冻干处理，再使用抽提试剂提取总外泌体，然后使用EpCAM抗体标记磁珠吸附，分离纯化出肿瘤细胞来源的外泌体。本发明方法不仅克服了目前由于提取试剂盒只能提取少量尿液而无法达到大规模筛选或表达检测的实验要求的缺陷，实现了在尿液中获得可检测浓度的外泌体，而且，还克服了现有检测总外泌体肿瘤特异性低的缺陷，从而在尿液中能准确检测到肿瘤来源的外泌体生物信息。本发明方法具有无创取样、特异性强、方便易行、价格低廉、且能直接用于后续检测的优势，具有较高的临床推广应用价值。

Description

从尿液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及从尿液中分离肿瘤细胞来源的外泌体(exosome)的方法。

背景技术

外泌体(Exosome)是一种穿梭在细胞间具有双分子层的纳米级囊泡。外泌体可由多种细胞分泌到细胞外，不同细胞分泌的外泌体可以具有类似的或不同的特性和生物学功能。肿瘤细胞也能释放外泌体，且肿瘤在生长过程中会不断地将外泌体释放到细胞外影响肿瘤微环境，其在肿瘤发生、发展中所扮演的角色已经越来越受关注。外泌体不仅在体液如血清、血浆、尿液中能稳定存在，还能选择性的包裹/释放其细胞中的遗传信息(miRNA、蛋白等)，因此提取细胞外的外泌体用于疾病、肿瘤等的诊断、监控有巨大的应用潜能。

目前，外泌体提取的研究主要集中在细胞、血清样本中提取外泌体，其主要采取的提取方法有：超高速离心法、过滤离心法、密度梯度超高速离心法、免疫磁珠结合超高速离心法、色谱法。这些方法各有缺点，例如，超高速离心法以及免疫磁珠结合超高速离心法均需要采取100000g及以上的超高速离心，对设备要求高，提取成本昂贵；再例如，超高速离心法和过滤离心法均存在纯度不高的问题；密度梯度离心法虽然纯度高但其步骤繁杂、耗时、量少；色谱法需要特殊的设备，应用不广泛。此外，无论是从细胞还是血清样本中提取外泌体，在样本收集中都不可避免地会对患者进行创伤性操作，以获取血液或细胞，并且，为了满足后续检测的实验要求，有时候需要收集大量的样本，因此，类似的有创提取方式在临床应用上存在很大的局限性。所以，尤其需要发展一种能够可靠、快速、经济地无创分离提取外泌体尤其是肿瘤来源的外泌体的方法。

外泌体在尿液中能稳定存在，而且，尿液样品容易大量获得并能避免创伤性损伤，因此，如果能够检测尿液外泌体中的肿瘤信息，则有望将其用于肿瘤的无创诊断、监控等应用。但是，实际上，由于单位体积尿液中的外泌体含量非常低，采用一般方法单次提取得到的外泌体，根本无法满足后续检测测序的要求，因此，鲜少有文献报道尿液中外泌体的提取方法。在现有的为数极少的提取尿液中外泌体的相关文献中，均明显存在不少问题而导致无法临床应用。例如：题为“Isolation and Purification of Exosomes in Urine”的文章(Gonzales PA等，Methods Mol Biol.2010；641:89-99)中公开了两种从尿液中分离外泌体的方法，采用超速离心或超滤管的方法提取了外泌体，其中，超速离心的方法，污染杂质较多，操作也非常繁琐，还需要配置超高速离心机，临床应用推广困难；而借助超滤管的方法，虽然能避免超高速离心机的使用，但是避免不了其他蛋白聚集或大分子蛋白复合体等的残留，对后续针对exosome的实验研究也会带来错误信息。此外，尿液中的外泌体来源非常复杂，无法评估其中属于肿瘤细胞分泌的外泌体。基于以上的限制，目前尚未有文献公开报道从尿液中分离肿瘤细胞来源的外泌体(exosome)的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从尿液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法，能够从肿瘤患者的尿液中获得高量、特异性高且能直接用于后续的流式技术检测的肿瘤细胞来源的外泌体。

一种从尿液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法，依次包括以下步骤：

(1)将尿液样本收集于第一离心管中，2～8℃、300～500g离心10～15分钟，分离得到上层液体；

(2)将所述上层液体进行冷冻干燥，得到沉淀；

(3)用缓冲液将所述沉淀进行重悬，得到第一重悬液，其中，所述缓冲液的pH值为7～8；将所述第一重悬液在2～8℃、10000～12000g离心30～40分钟，分离得到上清液；

(4)将所述上清液与总外泌体抽提液以2:1的体积比在第二离心管混合，震荡均匀后，2～8℃孵育6～16小时，然后，将孵育后的混合液在2～8℃、10000～12000g离心60～80分钟，移除上层清液后，在所述第二离心管的底部得到固相物质，为尿液总外泌体；

(5)用缓冲液将所述尿液总外泌体进行重悬，得到第二重悬液，为尿液总外泌体的重悬液，其中，所述缓冲液的pH值为7～8；

(6)将所述第二重悬液加入到吸附有上皮细胞粘附分子(Epithelial celladhesion molecule，EpCAM)抗体标记磁珠的第三离心管中，2～8℃孵育6～16小时；

(7)将所述第三离心管置于磁力架，吸附2～10分钟，移除管内液体，这样在所述第三离心管中得到磁珠结合的肿瘤细胞来源的外泌体。

本发明中，步骤(3)和步骤(5)中，所述的缓冲液可以相同，也可以不同。优选步骤(3)和步骤(5)中均为磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS)，最优选为1×磷酸盐缓冲液。

本发明中，在步骤(7)之后，还可以向所述第三离心管中加入缓冲液，其中，所述缓冲液的pH值为7～8，然后将所述第三离心管置于磁力架吸附2～10分钟，再移除管内液体，从而对所述的磁珠结合的肿瘤细胞来源的外泌体进行清洗。优选重复该清洗步骤2～3次。优选所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液，最优选为1×磷酸盐缓冲液。

采用上述的本发明方法，只需要患者一次取样的常规量(10～100ml)的尿液样本，即可提取到能够用于后续检测测序的足够量的肿瘤细胞来源的外泌体。本发明中，优选尿液样本的体积为25～50ml。

采用本发明的上述方法，尿液样本经一次离心分离后进行冻干处理得到沉淀，使用缓冲液对所得沉淀进行重悬时，优选所述缓冲液的体积为0.5～2.5ml，以不超过1ml为最佳。在最佳的条件下，第一重悬液经离心分离得到的上清液的体积不超过1ml，而所用总外泌体抽提液的体积不超过0.5ml，这样，所用总外泌体抽提液的成本不超过40元。

因此，本发明还提供了以下优选的技术方案：

一种从尿液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法，依次包括以下步骤：

(1)将25～50ml尿液样本收集于第一离心管中，4℃、300～500g离心10～15分钟，分离得到上层液体；

(2)将所述上层液体进行冷冻干燥，得到沉淀；

(3)用0.5～2.5ml缓冲液将所述沉淀进行重悬，得到第一重悬液，其中，所述缓冲液的pH值为7～8；将所述第一重悬液在4℃、10000～12000g离心30～40分钟，分离得到上清液；

(4)将所述上清液与总外泌体抽提液以2:1的体积比在第二离心管混合，震荡均匀后，4℃孵育6～16小时，然后，将孵育后的混合液在4℃、10000～12000g离心60～80分钟，移除上层清液后，在所述第二离心管的底部得到固相物质，为尿液总外泌体；

(5)用0.5～2.5ml缓冲液将所述尿液总外泌体进行重悬，得到第二重悬液，为尿液总外泌体的重悬液，其中，所述缓冲液的pH值为7～8；

(6)将所述第二重悬液加入到吸附有上皮细胞粘附分子抗体标记磁珠的第三离心管中，4℃孵育6～16小时；

(7)将所述第三离心管置于磁力架，吸附2～10分钟，移除管内液体，这样在所述第三离心管中得到磁珠结合的肿瘤细胞来源的外泌体。

同样，在优选的技术方案中，步骤(3)和步骤(5)中，所述的缓冲液可以相同，也可以不同。进一步优选步骤(3)和步骤(5)中均为磷酸盐缓冲液(Phosphate BufferedSaline，PBS)，最优选为1×磷酸盐缓冲液。

同样，在更优选的技术方案中，在步骤(7)之后，还可以向所述第三离心管中加入0.5～2.5ml缓冲液，其中，所述缓冲液的pH值为7～8，然后将所述第三离心管置于磁力架吸附2～10分钟，再移除管内液体，从而对所述的磁珠结合的肿瘤细胞来源的外泌体进行清洗。该清洗步骤可以重复2～3次。优选所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液，最优选为1×磷酸盐缓冲液。

在更优选的技术方案中，步骤(1)中，所述离心时间为10分钟。

在更优选的技术方案中，步骤(3)中，所述离心时间为30分钟。

在更优选的技术方案中，步骤(4)中，所述离心时间为60分钟。

在更优选的技术方案中，步骤(7)中，所述吸附时间为5分钟。

本发明中，所述的总外泌体抽提液可以采用现有技术中常用的市售总外泌体抽提液，例如：Exosome Isolation kit(Life Technologies)、Exoquick(System Bioscience)、Exo-spin(Cell Guidance System)等；优选Invitrogen公司生产的Total ExosomeIsolation，可由市场购得。

本发明中，所述的上皮细胞粘附分子抗体标记磁珠可以通过商业途径购买得到，例如：Exosome-Human EpCAM Isolation Reagent(Invitrogen)、CD326(EpCAM)MicroBeads(Miltenyi Biotec)、EasySep^TM Human EpCAM Positive Selection Kit(StemCell)；优选Invitrogen公司生产的EpCAM beads。

本发明中，所述的尿液样本为肿瘤患者的尿液样本。

将通过上述方法制备得到的产物进行电子显微镜观察、免疫印迹检测、流式细胞仪分析和Real-time PCR检测，结果发现：产物具有exosome的50-100nm大小的双膜形态，表达了exosome表面特有的蛋白CD9、CD63、Hsp70、Tsg101，以及Epcam蛋白，并且在产物中检测到了一些肿瘤高表达的miR-15a的表达，从而，分别从形态学层面、蛋白层面和小分子RNA层面证实了该产物为肿瘤来源的外泌体，为后续的尿液肿瘤来源exosome的临床应用及下一步的研究工作奠定了基础。

本发明的从尿液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法，依次包括：进行尿液中总外泌体的提取和磁珠抗体的纯化。在从尿液中提取总外泌体的过程中，在使用抽提试剂(总外泌体抽提液)抽提前，对样本预先进行了冻干处理，使大体积的尿液冻干沉淀，最终在较小的体积内提取外泌体，克服了目前由于提取试剂盒只能提取小量尿液而无法达到大规模筛选或表达检测的实验要求的缺陷，从而实现在尿液中获得可检测浓度的外泌体；在磁珠抗体纯化的过程中，采用EpCAM抗体标记磁珠，克服了现有检测总外泌体肿瘤特异性低的缺陷，从而实现在尿液中能准确检测到肿瘤来源的外泌体生物信息。本发明制备得到的磁珠结合的肿瘤细胞来源的外泌体可直接用于后续的流式技术检测。

相对于现有技术，本发明具有以下有益的技术效果：

1、现有技术的研究主要集中在从血清样本中分离提取外泌体，收集这些样本不可避免地需要病人抽取大量血液，且属于有创；相对而言，本发明中采用的是肿瘤患者的尿液，非常容易大量获得而且取样无创，具有很大的临床应用价值。

2、现有技术的研究主要集中在总外泌体的提取，由于尿液中的外泌体来源复杂，因此无法从提取的总外泌体区分出属于肿瘤细胞分泌的外泌体，特异性差；相对而言，本发明中通过肿瘤特性的抗体结合磁珠吸附获得肿瘤细胞来源的外泌体，特异性强，能够有效提高后续临床诊断应用及研究的准确性。

3、现有技术认为单位体积尿液中的外泌体含量很低，而目前市售的提取试剂盒能够处理尿液样品量较小，从少量尿液样品中提取外泌体的量实在太少，无法达到一些大规模筛选或表达检测的实验要求，而且，市售的提取试剂盒售价也相当高，一瓶50ml的外泌体提取液售价达4000多元，而提取尿液外泌体时是要求按尿液与外泌体提取液体积比为1:1来进行的，这样要提取到满足后续检测测序要求的尿液外泌体的费用就太高了，在实际中很难推广应用；相对而言，本发明中在外泌体抽提前采取了冻干处理进行保持生物活性的浓缩，只需要用较少的提取试剂(意味着较小的成本)即可实现对总外泌体的提取，而且，本发明所获得磁珠结合的肿瘤细胞来源的外泌体具有一定的体积，能直接进行后续的流式技术检测。

4、现有技术的传统方法通常需要采取100000g超高速离心，对设备要求高，相应地，所需要的费用也高，严重限制了其应用，相对而言，本发明只需要在10000g高速离心即可实现，一般检测实验室均能满足该条件，因此，本发明方法非常适合推广应用。

5、本发明方法成本非常低，提取每个样品的价格大概是30～40元，有利于临床推广应用。

附图说明

图1是本发明实施例1所得产物的电子显微镜照片。

图2是对本发明实施例1所得产物中的蛋白CD9、CD63、Hsp70、Tsg101表达的免疫印迹(Western Blot)检测结果。

图3是对本发明实施例1所得产物中EpCAM表达进行流式细胞仪分析的检测结果。

图4是对本发明实施例1所得产物进行Real-time PCR检测的结果。

图5a和图5b是分别对本发明实施例2所得产物中CD63和CD9的表达进行流式细胞仪分析的检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例中未注明具体试验条件和试验方法的按照常规条件或者制造厂商所建议的条件实施。

本发明中未特别说明的各种仪器和试剂均为本领域熟知的市售产品，可通过商业途径获得。

实施例1：肾透明细胞癌患者尿液中肿瘤细胞来源exosome的提取

①得到患者知情及伦理的同意下，收集肿瘤患者病人(病理活检已经确认为肾透明细胞癌)术前的尿液标本25ml于50ml离心管中，在4℃、300g的离心条件下离心10分钟，分离以去除尿液中的细胞，然后得到上层液体。

②将①得到的上层液体进行冷冻干燥，得到沉淀。其中，冷冻干燥在冻干仪中完成，具体为：将①得到的上层液体-80℃冰冻住后，在冻干仪-40～-50℃上过夜(6～16小时均可)冻干。

③用1ml的1×PBS对冻干所得沉淀进行重悬，得到第一重悬液。

④将第一重悬液在4℃、10000g的离心条件下离心30分钟，分离以去除细胞器及其他杂质，得到上清液。

⑤将上清液移入新的离心管中，并加入其一半体积的exosome抽提液(TotalExosome Isolation,Invitrogen)混合，震荡均匀后，4℃孵育过夜(6～16小时均可)，然后，将孵育后的混合液在4℃、10000g离心1小时，移除上层清液后，得到沉淀于该离心管底部的尿液总外泌体(exosome)。

⑥用0.5ml的1×PBS将⑤所得尿液总外泌体进行重悬，得到总外泌体的重悬液；

⑦将20ul抗体磁珠(EpCAM beads,Invitrogen)和1ml的1×PBS在另一新的离心管中混匀后上磁力架吸附2分钟，移除管内液体，这样在该离心管中吸附有EpCAM抗体标记磁珠。

⑧将上述⑥所得的0.5ml总外泌体的重悬液加入上述⑦所得的吸附有EpCAM抗体标记磁珠的离心管中，4℃孵育过夜(6～16小时均可)。

⑨将⑧中的离心管置于磁力架，吸附2分钟，移除管内液体；

⑩再向上述离心管中加入1ml的1×PBS，置于磁力架，吸附2分钟，移除管内液体；重复一次；获得磁珠结合的肿瘤细胞来源的exosome。

整个过程在无菌操作台完成，避免细菌、真菌等的污染。由于1×PBS和exosome抽提液通常在4℃保存，在取用后的短时间内进行重悬、混合或磁力吸附操作，基本仍能保持在4℃，所以，上述整个过程除了冷冻干燥之外的其余操作可视为均在4℃下进行。

产物的表征和鉴定

1、将实施例1得到的产物(即，磁珠结合的肿瘤细胞来源的exosome)用1ml低pH(pH值为5-6)的TE缓冲液洗脱磁珠上结合的细胞，并使用电子显微镜观察。电子显微镜观察到的照片如图1所示，可以发现：从磁珠上洗脱下的细胞为50-100nm大小的双分子层膜结构泡体，形态学和其他文献报道的外泌体一致。

2、免疫印迹(Western Blot)检测蛋白CD9、CD63、Hsp70、Tsg101的存在

具体检测步骤如下：

(1)将实施例1得到的产物(即，磁珠结合的肿瘤细胞来源的exosome)用1ml的1×PBS重悬，得到肿瘤exosome重悬液，加入1ml裂解液，提取总蛋白；

(2)制作BSA标准曲线，加入1ml的考马斯蓝，化学分光仪上检测exosome蛋白含量。

(3)制作10％及4％的梯度胶，加入足够的缓冲液，每孔上样50ug的exosome总蛋白。

(4)在电压40V～60V进行4～5h的电泳。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。

(5)转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液(P0023C)中，漂洗1～2分钟，以洗去膜上的转膜液。后加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60分钟。

(6)封闭结束后，立即加入稀释好的一抗(CD9,CD63,Hsp70,Tsg101)。4℃缓慢摇动孵育过夜后，回收一抗，Western洗涤液洗涤3次。

(7)按照适当比例用Western二抗稀释液(P0023D)稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时，回收二抗，Western洗涤液洗涤3次。

(8)膜上蛋白面加入ECL液进行显影。

检测结果如图2所示，可以发现：在实施例1所得产物中检测到了exosome表面特有的蛋白CD9、CD63、Hsp70、Tsg101的表达，因此，从分子特性上说明了实施例1所得产物为exosome。

3、流式细胞仪检测肿瘤exosome的EpCAM表达

将实施例1得到的产物(即，磁珠结合的肿瘤细胞来源的exosome)用1ml的1×PBS重悬，得到肿瘤exosome重悬液，分别加入Epcam-FITC和Igm-FITC抗体进行4℃闭关孵育1小时后，磁力架上用1ml的1×PBS清洗3次后，加入500ul的1×PBS上流式细胞仪进行检测。

检测结果如图3所示，可以发现：在实施例1所得产物(如图3中线2所示)中检测到了EpCAM蛋白表达，且荧光强度强于同型对照组(如图3中线1所示)。这说明了实施例1所得产物为肿瘤细胞来源的exosome。

4、Real-time PCR检测miR-15a及U6表达

(1)总miRNA提取：用350ul的1×PBS重悬由上述实施例1得到的产物(即，磁珠结合的肿瘤细胞来源的exosome)，并加入700ul Qiazol(Qiagen)裂解后，加入200ul甲醇震动混匀，分2次移入总RNA抽提柱中，12000rpm离心移除离心液；依次加入700ul缓冲液RWT和700ul缓冲液RPE液进入离心柱，12000rpm离心10分钟后移除离心液；利用miRNA抽提系统(Qiagen)提取Total RNA，20ul Rnase-Free Water加入离心柱过膜，12000rpm离心10分钟，获得离心液中包含Total RNA。

(2)反转录:取11ul total RNA、10ul的反应液(Takara)、2ul BSA液(Takara)、2ulRT液(Takara)进入50ul离心管中，轻微振荡摇匀后37℃反应60分钟及85℃5秒的条件下进行反转录成cDNA。

(3)Real-time PCR检测：取12.5ul SYBR GREEN液(Takara)、1ul miR-15a或U6的引物混合液、10.5ul ddH₂O液、1ul cDNA进入96孔PCR反应孔中进行PCR反应。反应条件设置：先95℃10分钟，后进行40个循环的95℃15秒，56℃30秒，75℃35秒。

Real-time PCR扩增miR-15a和U6的结果如图4所示，可以发现：在实施例1所得产物中成功检测到肿瘤exosome U6和miR-15a的表达。取扩增对数期RN＝0.216，U6为18个Ct，miR-15a为22个Ct值。这说明了实施例1所得产物为肿瘤细胞来源的exosome。

综合以上，从形态学层面、蛋白层面和小分子RNA层面对提取的产物进行了检测，证实了产物具有exosome的50-100nm大小的双膜形态，证明了产物中存在exosome特有蛋白表达及肿瘤抗原的表达，还成功的检测到了一些肿瘤高表达的miR-15a的表达，从而说明提取产物为肿瘤来源外泌体。即，采用实施例1中的方法，能够实现从尿液中成功分离肿瘤细胞来源的外泌体，且分离的肿瘤细胞来源的外泌体高量、特异性高、能直接用于后续的流式技术检测。

实施例2：食管癌患者尿液中肿瘤源exosome的提取

采用与实施例1基本相同的方法提取食管癌患者病人尿液中的肿瘤源exosome。即：①中尿液样本为50ml食管癌患者病人术前的尿液标本，其它步骤与实施例1中完全相同。

同样，采取实施例1中的方法对实施例2所得产物进行电子显微镜观察，同样观察到与文献记载一致的外泌体形态。

进一步，采用流式细胞仪检测CD63、CD9表达：

将实施例2中得到的产物(即，磁珠结合的肿瘤细胞来源的exosome)用1ml的1×PBS重悬，得到1ml食管癌患者尿液肿瘤源exosome的重悬液，并向该重悬液中加入5ul流式抗体CD63、CD9进行常温下孵化2小时，600g离心5min后弃上清，1ml 1×PBS重悬后重复1次。避光加入荧光2抗(BioLegend,Alexa Fluora488-conjugated affinipure Goat anti-mouse IgG(H+L))，20-30℃避光孵化1小时，600g离心5min后弃上清，1ml 1×PBS重悬后重复1次。200ul 1×PBS重悬后，上流式细胞仪上检测CD63及CD9的表达。

检测结果分别如图5a和5b所示，可以发现：在实施例2所得产物中检测到了CD63及CD9的表达，且荧光强度均强于同型对照组(C)。这说明了实施例2所得产物为exosome。

此外，还采用实施例1中的方法检测实施例2所得产物中EpCAM的表达，结果显示：提取出的exosome强表达EpCAM蛋白，从而证实尿液中提取出的exosome来源于肿瘤细胞。

实施例3：肺癌患者尿液中肿瘤源exosome的提取

采用与实施例1基本相同的方法提取25ml肺癌患者病人尿液中的肿瘤源exosome。即：①中尿液样本为肺癌患者病人术前的尿液标本，其它步骤与实施例1中完全相同。

采用实施例1中产物表征方法，对实施例3所得产物进行观察和检测，结果显示：实施例3所得产物具有与文献记载一致的外泌体形态，并且在产物中检测到外泌体的特有蛋白CD9,CD63,Hsp70,Tsg101表达及肿瘤抗原EpCAM蛋白的强表达，从而证明实施例3所得产物为尿液中提取出的肿瘤细胞来源exosome。

由此可见，本发明的目的已经完整并有效的予以实现。本发明的方法以及原理已在实施例中予以展示和说明，在不背离所述原理的情况下，实施方式可作任意修改。所以，本发明包括了基于权利要求精神及权利要求范围的所有变形实施方式。

Claims (9)

1.一种从尿液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法，其特征在于，依次包括以下步骤：

(1)将尿液样本收集于第一离心管中，2～8℃、300～500g离心10～15分钟，分离得到上层液体；

(2)将所述上层液体进行冷冻干燥，得到沉淀；

(3)用磷酸盐缓冲液将所述沉淀进行重悬，得到第一重悬液，其中，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7～8；将所述第一重悬液在2～8℃、10000～12000g离心30～40分钟，分离得到上清液；

(4)将所述上清液与总外泌体抽提液以2:1的体积比在第二离心管混合，震荡均匀后，2～8℃孵育6～16小时，然后，将孵育后的混合液在2～8℃、10000～12000g离心60～80分钟，移除上层清液后，在所述第二离心管的底部得到固相物质，为尿液总外泌体；

(5)用磷酸盐缓冲液将所述尿液总外泌体进行重悬，得到第二重悬液，为尿液总外泌体的重悬液，其中，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7～8；

(6)将所述第二重悬液加入到吸附有上皮细胞粘附分子抗体标记磁珠的第三离心管中，2～8℃孵育6～16小时；

(7)将所述第三离心管置于磁力架，吸附2～10分钟，移除管内液体，在所述第三离心管中得到磁珠结合的肿瘤细胞来源的外泌体。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(7)之后，向所述第三离心管中加入缓冲液，其中，所述缓冲液的pH值为7～8，然后将所述第三离心管置于磁力架吸附2～10分钟，再移除管内液体，从而对所述的磁珠结合的肿瘤细胞来源的外泌体进行清洗。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的清洗步骤重复2～3次。

4.一种从尿液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法，其特征在于，依次包括以下步骤：

(1)将25～50ml尿液样本收集于第一离心管中，4℃、300～500g离心10～15分钟，分离得到上层液体；

(2)将所述上层液体进行冷冻干燥，得到沉淀；

(3)用0.5～2.5ml磷酸盐缓冲液将所述沉淀进行重悬，得到第一重悬液，其中，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7～8；将所述第一重悬液在4℃、10000～12000g离心30～40分钟，分离得到上清液；

(4)将所述上清液与总外泌体抽提液以2:1的体积比在第二离心管混合，震荡均匀后，4℃孵育6～16小时，然后，将孵育后的混合液在4℃、10000～12000g离心60～80分钟，移除上层清液后，在所述第二离心管的底部得到固相物质，为尿液总外泌体；

(5)用0.5～2.5ml磷酸盐缓冲液将所述尿液总外泌体进行重悬，得到第二重悬液，为尿液总外泌体的重悬液，其中，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7～8；

(6)将所述第二重悬液加入到吸附有上皮细胞粘附分子抗体标记磁珠的第三离心管中，4℃孵育6～16小时；

(7)将所述第三离心管置于磁力架，吸附2～10分钟，移除管内液体，这样在所述第三离心管中得到磁珠结合的肿瘤细胞来源的外泌体。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤(7)之后，向所述第三离心管中加入0.5～2.5ml缓冲液，其中，所述缓冲液的pH值为7～8，然后将所述第三离心管置于磁力架吸附2～10分钟，再移除管内液体，从而对所述的磁珠结合的肿瘤细胞来源的外泌体进行清洗。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的清洗步骤重复2～3次。

7.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲液为1×磷酸盐缓冲液。

8.如权利要求2或5所述的方法，其特征在于，所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲液为1×磷酸盐缓冲液。