CN111172153B - 一种人尿液外泌体核酸提取方法 - Google Patents

Abstract

一种人尿液外泌体核酸提取方法，尿液外泌体的提取：收集晨尿样本，首先离心去除尿沉渣，再将上清液加入离心过滤管，去除大于0.22μm的成分，再将上清加入已处理好的超滤管中，离心浓缩尿液外泌体；PBS缓冲液对浓缩后的尿液外泌体进行洗涤一次，离心再次浓缩尿液外泌体，洗涤膜表面，收集液体即为尿液外泌体；尿液外泌体核酸的提取：上一步骤分离得到的尿液外泌体，直接进行核酸提取，得到高质量的核酸样本。提取过程经过裂解、洗涤、洗脱步骤，可进行手工法操作，也可进行仪器法操作。本发明克服了现有技术的不足，整个提取操作过程操作时间短、无毒性、可实现自动化和高通量，且核酸样本得率较高、纯度较好，易于后续在临床广泛应用。

Description

一种人尿液外泌体核酸提取方法

技术领域

本发明涉及外泌体核酸提取技术领域，具体涉及一种人尿液外泌体核酸提取方法。

背景技术

外泌体，是一类由细胞分泌的30-150nm的小囊泡，除了可一定程度调控生物学过程外，其内部更携带了大量核酸（mRNA、microRNA等）和蛋白质。近年来随着其在多种疾病领域内研究的深入，发现外泌体可广泛应用于多种疾病的诊断和治疗，对其内容物的检测在液态活检中具有重要的发展前景。应用外泌体对疾病进行诊断，具有较好的准确性，样本来源广泛且取样方便、可达到无创，应用范围广泛，具有极高的潜能和价值。尿液作为临床上常用的检测样本，其易于获得且样本量较大，可更好的实现尤其是泌尿系统疾病的无创诊断，用于疾病早期筛查或复发监测。对尿液外泌体的分离及核酸提取，是后续有效诊断疾病的基础。

对于尿液外泌体分离技术，目前外泌体的提取专利、文献相关报道较多，主要集中于高速离心法、磁珠法、旋转超滤法、超滤法、冻干技术或冻干和磁珠法相结合等。尿液样本具有体积较大、外泌体浓度较低的特点。对于尿液外泌体的提取，大多数已有方法采用的是耗时较长、需特殊离心设备的高速离心法（此方法较为公认，多数尤其是科研用户常用），或需要特殊超滤设备的旋转超滤法、需要配备冻干设备的结合样本冻干技术和磁珠法的外泌体提取方法，另有部分采用的是对于尿液来说提取效率较低、价格较贵的磁珠法。上述尿液外泌体提取方法在使用普遍性或高效性等方面尚存在不足之处，难以在临床广泛应用。超滤法对于大体积样本的提取更具有适用性，但处理后外泌体样本的核酸提取方法多为毒性较大、得率较低的trizol等提取法。

对于外泌体核酸的提取，由于尿液外泌体总量不多，其含有的核酸量较少，因此在后续的核酸提取纯化方面，存在较大的挑战。目前无论外泌体提取方面采用何种方法，对于外泌体核酸对的提取，普遍使用的是毒性较大、需使用有机试剂、得率相对较低、必须人工操作的trizol提取法，本方法更多的是匹配高速离心法进行外泌体提取；近年来部分技术方法使用柱膜法进行核酸提取，在核酸提取得率、纯度方面有一定改善，但提取过程中可能还会使用到具有毒性的试剂成分进行样本裂解，且提取过程必须人工操作，操作时间较长；而此技术方法的外泌体提取部分为柱式提取法，而非超滤法。此外，目前已有的技术方法价格昂贵或操作过程繁琐，不易于实现自动化，难以在临床上实现自动化、高通量。

基于磁珠法的核酸提取技术，对于自动化、高通量的实现方面具有较好的发展前景，逐渐受到临床的认可。但在外泌体提取方面，如何提高核酸样本的得率、纯度等，仍存在一定挑战。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种人尿液外泌体核酸提取方法，克服了现有技术的不足，整个提取操作过程操作时间短、无毒性、可实现自动化和高通量，且核酸样本得率较高、纯度较好，易于后续在临床广泛应用。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种人尿液外泌体核酸提取方法，包括以下步骤：

1）尿液外泌体的提取：

1.1）收集晨尿样本；

1.2） 取所收集的样本于离心管中，涡旋混匀，2000-3000g离心3-8min；

1.3）取离心后的上清液加入过滤离心管的内管中，70-100g 离心3-10min；使液体全部流入下层外管；

1.4）取出过滤离心管的内管，将下层液体转移到已处理好的超滤管内管中，再将超滤管放置于离心机中3000-4000g 离心15-45min；

1.5）倒出超滤管下层外管中的液体，加入1-5mL PBS缓冲液，混匀后，再次3000-4000g 离心15-45min，进行超滤浓缩；

1.6）吸取上层内管中的样本至离心管中，即得到尿液外泌体样本；

2）尿液外泌体核酸的提取：

2.1）在离心管中依次加入100-300μL提取所得到的尿液外泌体样本、与样本等体积的裂解液、10-20μL蛋白酶混合液，再加入10μL磁珠悬液和300-350μL异丙醇，进行高速旋涡震荡10-15次，再50℃-70℃孵育15-20分钟，室温放置5分钟；

2.2）将含有磁珠的离心管置于磁力架，颠倒混匀，回收管盖残留磁珠，静置、至磁珠全部吸附到管壁，用移液器吸去管内及管盖液体；且不能将磁珠吸出；

2.3）移去磁力架，向离心管中加入洗涤液以对样本进行充分洗涤，再将离心管置于磁力架上，静置直至磁珠全部吸附到管壁，用移液器吸去管内液体，且不能将磁珠吸出；

2.4）打开离心管盖，于室温干燥2-3分钟，至磁珠表面无明显液体，将待用洗脱液放置于70-90℃预热2-3分钟；

2.5）移去磁力架，加入30-50μL预热好的洗脱液，用枪头吹吸至磁珠分布均匀或高速涡旋10-15次；70℃-90℃孵育5-10分钟，期间每隔1分钟左右摇晃离心管10-15次，使管内磁珠始终保持均匀分布的状态；温育结束后，将离心管高速涡旋10-15次；

2.6）将离心管置于磁力架上，静置直至磁珠全部吸附到管壁，吸取上清到一个无核酶干净的离心管中，即得到纯化后的核酸溶液。

进一步地，在步骤1.4）之前对于超滤管的预处理步骤为：在超滤管的内管中加入5-10mL无菌水，2-6℃放置5-10 min，并使用之前充分倒出灭菌水后立即使用。

进一步地，在步骤2.1）中，50℃-70℃孵育15-20分钟以及室温放置5分钟的过程中，期间每隔2分钟上下颠倒离心管10次，使管内磁珠分布均匀。

进一步地，所述步骤2.3）的洗涤操作具体包括以下步骤：

2.3.1）移去磁力架，加入900μL洗涤液A，低速旋涡震荡至其分布均匀后，上下颠倒离心管10-15次充分洗涤；再将离心管置于磁力架，颠倒混匀，回收管盖残留磁珠，静置至磁珠全部吸附到管壁后，用移液器吸去管内及管盖液体；

2.3.2）再移去磁力架，再次加入600μL洗涤液A，低速旋涡震荡至其分布均匀后，上下颠倒离心管10-15次充分洗涤，离心管置于磁力架，颠倒混匀，回收管盖残留磁珠，静置至磁珠全部吸附到管壁后，用移液器吸去管内及管盖液体；

2.3.3）再移去磁力架，加入600μL洗涤液B，用移液器吹散磁珠后将液体带磁珠全部转移入新的离心管内，再将离心管置于磁力架，颠倒混匀，回收管盖残留磁珠，静置至磁珠全部吸附到管壁后，用移液器吸去管内及管盖液体；

2.3.4）再移去磁力架，再次加入600μL洗涤液B，低速旋涡震荡至其分布均匀后，上下颠倒离心管10-15次充分洗涤。瞬时低速离心，将离心管置于磁力架上，静置直至磁珠全部吸附到管壁后，用移液器吸去管内液体。

进一步地，所述洗涤液A的组分包括0.1-10M胍盐、10-50%无水乙醇，用于洗涤去除蛋白质等杂质成分；所述洗涤液B的组分包括0.1-10M NaCl、50-90%无水乙醇，用于洗涤去除盐类杂质成分。

进一步地，所述步骤2.1）中的裂解液包括0.1-10M胍盐、0.1-15%十二烷基硫酸钠、0.1-10M NaCl、1-20mM DTT。

进一步地，所述步骤1.3）中的过滤离心管包括外管和内管，所述外管安装在内管的下方，所述内管的内壁上固定安装有过滤膜。

本发明提供了一种人尿液外泌体核酸提取方法。具备以下有益效果：采用适用于大量样本提取、操作简便、快速的超滤法进行尿液外泌体提取，并在此基础上做了优化，简便样本处理操作；后续核酸提取对提取试剂成分和具体操作方法进行改良，使其核酸得率更高、纯度更好；本发明针对尿液外泌体核酸的提取，是在现有技术方法的一种新的组合，且在磁珠法外泌体提取试剂成分、具体操作方法方面进行了改良，整个提取操作过程操作时间短、无毒性、可实现自动化和高通量，且核酸样本得率较高、纯度较好，易于后续在临床广泛应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1 本发明尿液外泌体的透射电镜图；

图2 本发明尿液外泌体的NTA检测图；

图3 本发明尿液外泌体的Western blot检测图；

图4 本发明的外泌体核酸提取结果与现有的外泌体RNA提取试剂扩增曲线对比图；

图5 本发明中的过滤离心管的结构示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。

本发明提供了一种人尿液外泌体核酸提取方法，包括以下步骤：

1）尿液外泌体的提取：

1.1）收集晨尿样本；本发明的晨尿样本可以为新鲜晨尿样本，或以冻存方式保存的晨尿样本，避免反复冻融，可提取前放置于4℃自然解冻。

1.2）取25mL样本于50mL离心管中，涡旋混匀90s，再放置于离心机中2500g离心5min；

1.3）吸取21mL上清液加入过滤离心管的内管中，拧紧管盖，再放置于离心机中80g离心5min；使液体全部流入下层外管；其中，如图5所示，过滤离心管包括外管1和内管2，所述外管1安装在内管2的下方，所述内管2的内壁上固定安装有过滤膜3。

1.4）取出过滤离心管的内管，将下层液体转移到已处理好的超滤管内管中，拧紧管盖，再将超滤管放置于离心机中3000g 离心30min，并调整离心升降速为升1降9；并且在将超滤管放置于离心机时，应使超滤管内管竖直隔板对着离心机轴，膜分布于两侧。

1.5）倒出超滤管下层外管中的液体，加入3mL PBS缓冲液，混匀后，再次3000g 离心30min，并调整离心升降速为升1降9，进行超滤浓缩；

1.6）使用200μL移液器小心吸取上层内管中的样本到一个无核酶干净的离心管中，该样本即为尿液外泌体样本。若需继续分离同一样本以获取更多的外泌体，可重复步骤1.2.1-1.2.4一次，注意第一次吸取样本时不要碰到超滤管上层内管下方的膜，防止破损影响重复使用的分离效果；

通过步骤1）所分离提取的样本，在短期保存于4℃或-20℃条件下，长期保存于-70℃条件下。

本发明通过采用超滤法提取，并对传统超滤法提取进行改良，增加过滤离心管，而传统方法本步骤使用的是0.22μm的滤膜进行手工过滤，传统方法过滤需要匹配一次性滤器和注射器针头，手动过滤，一次一人只能操作一个样本，样本量较大时操作费时费力。本技术方法在传统超滤法提取分离外泌体的基础上，简化处理步骤，便于实现高通量处理样本，且只需要普通离心机即可完成分离过程。综上，本发明有效缩短分离提取外泌体的时间，提高提取效率。

将所提取的外泌体样本进行透射电镜、NTA和Western blot 检测结果如图1-3所示。

由图1所示的透射电镜图可以看出外泌体结构完整；由图2所示的NTA检测图可以看出外泌体总量可达10¹¹个以上，外泌体粒径以90-150nm为主（占比98%以上），纯度较好；由图3所示的Western blot检测图可以看出提取所得外泌体具有CD9、CD63蛋白表达（外泌体普遍表达的检测指标）。

2）尿液外泌体核酸的提取：

2.1）在离心管中依次加入300μL提取所得到的尿液外泌体样本、与样本等体积的裂解液、20μL蛋白酶混合液，再加入10μL磁珠悬液和350μL异丙醇，进行高速旋涡震荡15次（溶液完全涡旋震荡、磁珠分布均匀算作一次），再60℃孵育15分钟，室温放置5分钟，期间每隔2分钟上下颠倒离心管10次，始终使管内磁珠分布均匀；

2.2）将含有磁珠的离心管置于磁力架，颠倒混匀，回收管盖残留磁珠，静置30s、至磁珠全部吸附到管壁，用移液器吸去管内及管盖液体；且不能将磁珠吸出；

2.3）移去磁力架，向离心管中加入900μL洗涤液A，低速旋涡震荡10s至其分布均匀后，上下颠倒离心管10-15次充分洗涤。离心管置于磁力架，颠倒混匀，回收管盖残留磁珠，静置30s至磁珠全部吸附到管壁，用移液器吸去管内及管盖液体，注意不能将磁珠吸出；

2.4）移去磁力架，再次加入600μL洗涤液A，低速旋涡震荡10s至其分布均匀后，上下颠倒离心管10次充分洗涤。离心管置于磁力架，颠倒混匀，回收管盖残留磁珠，静置30s至磁珠全部吸附到管壁，用移液器吸去管内及管盖液体，注意不能将磁珠吸出。

2.5）再移去磁力架，加入600μL洗涤液B，用移液器吹散磁珠后将液体带磁珠全部转移入新的离心管内。离心管置于磁力架，颠倒混匀，回收管盖残留磁珠，静置30s至磁珠全部吸附到管壁，用移液器吸去管内及管盖液体，注意不能将磁珠吸出。

2.6）移去磁力架，再次加入600μL洗涤液B，低速旋涡震荡10s至其分布均匀后，上下颠倒离心管10次充分洗涤。瞬时低速离心，将离心管置于磁力架上，静置直至磁珠全部吸附到管壁，用移液器吸去管内液体（特别注意：务必吸尽离心管内残留液体，可以多次吸取液体，但不能将磁珠吸出）。

2.7）打开离心管盖，于室温干燥3分钟，至磁珠表面无明显液体，将待用洗脱液放置于80℃预热2-3分钟；

2.5）移去磁力架，加入40μL预热好的洗脱液，用枪头吹吸至磁珠分布均匀或高速涡旋15次（溶液完全涡旋震荡、磁珠分布均匀算作一次）；80℃孵育6分钟，期间每隔1分钟左右摇晃离心管15次，使管内磁珠始终保持均匀分布的状态；温育结束后，将离心管高速涡旋15次（溶液完全涡旋震荡、磁珠分布均匀算作一次）；

2.6）将离心管置于磁力架上，静置直至磁珠全部吸附到管壁，吸取上清到一个无核酶干净的离心管中，即得到纯化后的核酸溶液。

其中，所述洗涤液A的组分包括0.1-10M胍盐、10-50%无水乙醇，用于洗涤去除蛋白质等杂质成分；所述洗涤液B的组分包括0.1-10M NaCl、50-90%无水乙醇，用于洗涤去除盐类杂质成分；裂解液的组分包括0.1-10M胍盐、0.1-15%十二烷基硫酸钠、0.1-10M NaCl、1-20mM DTT，用于裂解样本，释放核酸，有效防止核酸降解。

通过步骤2）所分离提取的外泌体核酸样本，在短期保存于-20℃条件下，长期保存于-70℃条件下。

现有的尿液外泌体核酸提取试剂盒，该试剂盒外泌体分离步骤为自主研发的外泌体分离柱，操作步骤大致如下：将尿液样本离心，经0.22μm的滤膜进行手动过滤，过滤后样本加入外泌体分离柱（最大上样量16mL样本，且无法重复使用），离心将外泌体拦截于膜中，加入trizol至滤膜，过滤收集trizol裂解成分，加入氯仿离心分层，吸取上层清液，后续，匹配柱膜法试剂进行核酸提取。

将本发明的外泌体核酸提取结果与现有的外泌体RNA提取试剂盒扩增曲线图的对比结果如图4所示（样本为16mL新鲜收集的同一份人晨尿样本）。

与本发明方法相比，现有的外泌体核酸提取试剂盒分离外泌体、核酸提取的方法、原理完全不同。在外泌体分离方面，现有的提取方法无法收集到外泌体样本并进行短期保存，必须收集外泌体之后继续提取核酸，且无法进行鉴定操作，本发明可短期合理保存分离好的外泌体样本，即外泌体分离和核酸提取步骤可以分开进行，增强了实验操作的灵活性；在核酸提取方面，现有的技术方法完全使用的裂解组分是传统的trizol提取法，与常规超速离心法分离外泌体后使用的外泌体提取方法接近，差别在于后续核酸提取纯化方面现有的的提取方法所采用的是柱膜法提取试剂，trizol提取需要使用有机试剂，且trizol本身的毒性很大，长期使用对操作者健康产生一定影响，本发明方法所使用的所有试剂组分均无毒性，不会对操作者健康产生影响；在操作时间方面，本发明方法提取时间大大缩短，且核酸提取步骤可使用核酸提取仪，实现高通量和自动化，而现有的提取方法全程必须手工操作；在提取得率方面，经过对比实验，对于16mL尿液外泌体RNA进行提取，使用荧光定量PCR进行检测，发现本发明提取得到的外泌体核酸浓度高于现有的提取方法。

综上，本发明使用基于超滤法的提取原理进行尿液外泌体的分离并进行鉴定，相比于已有方法如高速离心法、磁珠法等，在提取速度、提取效率等方面优化出最优的提取方案，提取过程不需要特殊设备（如高速离心机），是一种快速、高效、便于实现自动化的尿液外泌体提取方法，用于后期临床检测可具有更广泛的应用。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (2)

1.一种人尿液外泌体核酸提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）尿液外泌体的提取：

1.1）收集晨尿样本；

1.2） 取所收集的样本于离心管中，涡旋混匀，2000-3000g离心3-8min；

1.3）取离心后的上清液加入过滤离心管的内管中，70-100g离心3-10min；使液体全部流入下层外管；其中，过滤离心管包括外管和内管，所述外管安装在内管的下方，所述内管的内壁上固定安装有过滤膜；

1.4）取出过滤离心管的内管，将下层液体转移到已处理好的超滤管内管中，再将超滤管放置于离心机中3000-4000g 离心15-45min；

1.5）倒出超滤管下层外管中的液体，加入1-5mL PBS缓冲液，混匀后，再次3000-4000g离心15-45min，进行超滤浓缩；

1.6）吸取上层内管中的样本至离心管中，即得到尿液外泌体样本；

2）尿液外泌体核酸的提取：

2.1）在离心管中依次加入100-300μL提取所得到的尿液外泌体样本、与样本等体积的裂解液、10-20μL蛋白酶混合液，再加入10μL磁珠悬液和300-350μL异丙醇，进行高速旋涡震荡10-15次，再50℃-70℃孵育15-20分钟，室温放置5分钟；

2.2）将含有磁珠的离心管置于磁力架，颠倒混匀，回收管盖残留磁珠，静置、至磁珠全部吸附到管壁，用移液器吸去管内及管盖液体；且不能将磁珠吸出；

2.3）移去磁力架，向离心管中加入洗涤液以对样本进行充分洗涤，再将离心管置于磁力架上，静置直至磁珠全部吸附到管壁，用移液器吸去管内液体，且不能将磁珠吸出；

2.4）打开离心管盖，于室温干燥2-3分钟，至磁珠表面无明显液体，将待用洗脱液放置于70-90℃预热2-3分钟；

2.5）移去磁力架，加入30-50μL预热好的洗脱液，用枪头吹吸至磁珠分布均匀或高速涡旋10-15次；70℃-90℃孵育5-10分钟，期间每隔1分钟左右摇晃离心管10-15次，使管内磁珠始终保持均匀分布的状态；温育结束后，将离心管高速涡旋10-15次；

2.6）将离心管置于磁力架上，静置直至磁珠全部吸附到管壁，吸取上清到一个无核酶干净的离心管中，即得到纯化后的核酸溶液；

其中，在步骤2.1）中，50℃-70℃孵育15-20分钟以及室温放置5分钟的过程中，期间每隔2分钟上下颠倒离心管10次，使管内磁珠分布均匀；

所述步骤2.3）的洗涤操作具体包括以下步骤：

2.3.1）移去磁力架，加入900μL洗涤液A，低速旋涡震荡至其分布均匀后，上下颠倒离心管10-15次充分洗涤；再将离心管置于磁力架，颠倒混匀，回收管盖残留磁珠，静置至磁珠全部吸附到管壁后，用移液器吸去管内及管盖液体；

2.3.2）再移去磁力架，再次加入600μL洗涤液A，低速旋涡震荡至其分布均匀后，上下颠倒离心管10-15次充分洗涤，离心管置于磁力架，颠倒混匀，回收管盖残留磁珠，静置至磁珠全部吸附到管壁后，用移液器吸去管内及管盖液体；

2.3.3）再移去磁力架，加入600μL洗涤液B，用移液器吹散磁珠后将液体带磁珠全部转移入新的离心管内，再将离心管置于磁力架，颠倒混匀，回收管盖残留磁珠，静置至磁珠全部吸附到管壁后，用移液器吸去管内及管盖液体；

2.3.4）再移去磁力架，再次加入600μL洗涤液B，低速旋涡震荡至其分布均匀后，上下颠倒离心管10-15次充分洗涤，瞬时低速离心，将离心管置于磁力架上，静置直至磁珠全部吸附到管壁后，用移液器吸去管内液体；

其中，所述洗涤液A的组分包括0.1-10M胍盐、10-50%无水乙醇，用于洗涤去除蛋白质等杂质成分；所述洗涤液B的组分包括0.1-10M NaCl、50-90%无水乙醇，用于洗涤去除盐类杂质成分；

所述步骤2.1）中的裂解液的组分包括0.1-10M胍盐、0.1-15%十二烷基硫酸钠、0.1-10MNaCl、1-20mM DTT。

2.根据权利要求1所述的一种人尿液外泌体核酸提取方法，其特征在于：在步骤1.4）之前对于超滤管的预处理步骤为：在超滤管的内管中加入5-10mL无菌水，2-6℃放置5-10min，并使用之前充分倒出灭菌水后立即使用。