CN113249188A

CN113249188A - 一种快速核酸提取装置及提取核酸的方法

Info

Publication number: CN113249188A
Application number: CN202110617284.9A
Authority: CN
Inventors: 王德明; 周杰锋
Original assignee: Ningbo Kangcheng Deno Biomedical Co ltd
Current assignee: Ningbo Kangcheng Deno Biomedical Co ltd
Priority date: 2021-06-03
Filing date: 2021-06-03
Publication date: 2021-08-13

Abstract

本申请涉及核酸提取技术领域，尤其涉及一种快速核酸提取装置及提取核酸的方法。一种快速核酸提取装置，该装置包括快速核酸提取器、裂解液、洗涤液和洗脱液；洗脱液用于将吸附在快速核酸提取器上核酸物质洗脱收集；洗涤液采用硅油、石蜡油、C5‑C15烷烃油和卤代C1‑C15烷烃油中的一种或多种混合。该洗涤液中不含酒精，不需要晾干，也不会对核酸造成影响，保证快捷有效的检测。

Description

一种快速核酸提取装置及提取核酸的方法

技术领域

本申请涉及核酸提取技术领域，尤其涉及一种快速核酸提取装置及提取核酸的方法。

背景技术

体外样本医学检测具有简单化、自动化、接近患者现场等优势，在临床医疗和相关医学研究领域中发挥着重要作用。目前样本的处理和检测自动化程度低，不能满足临床上快速及时、高通量检验样本的需求。核酸分子检测技术在检验医学和临床研究中有强大优势，核酸提取常用柱子法、磁珠法等，普遍存在操作复杂、费事、所需费用高等问题。

中国发明专利申请(公开号：CN101684463，公开日：20100331)公开了一种从各种微量临床样本中快速提取核酸的方法，其包括以下步骤：(a)将临床样本加入裂解液，混匀；(b)抽吸临床样本，流经过滤膜，样本中的核酸成分因膜的特异性吸附而吸附在过滤膜上，滤液为有细胞碎屑和蛋白质的废液；(c)抽吸清洗液，流经过滤膜，清洗过滤膜上残留的蛋白质或其它有形成分，弃滤液；(d)抽吸洗脱液，流经过滤膜，将吸附在膜上的核酸成分洗脱，而得到不含有其他杂质的核酸水溶液，用于核酸扩增。该方法的微量临床样本核酸快速提取装置进行核酸抽提时只要简单的“三步抽吸”就可以完成所有操作；但是在进行二步抽吸清洗都是采用乙醇溶液，含乙醇溶液在洗涤完成后必须要进行晾干，这样就增加了检测的时间，如果有酒精成分进入检测的核酸，那么会影响核酸检测，造成假阴性。另外，预封装核酸提取试剂是核酸检测的一个趋势，如中国发明专利申请(CN111286448A、CN111286449A)以及申请人申请的发明专利(专利名称：一种核酸快速提取四联管装置、提取装置和提取方法、一种一体化核酸快提和检测试管及方法等)，在预封装的试管含酒精产品，在运输过程中存在易燃易爆的问题；进一步，由于酒精是良好溶剂，会腐蚀预封装的薄膜，洗涤液中带入其他物质，严重情况下导致泄露。

进一步，目前在样本裂解中需要加温下才可以实现快速裂解，因此目前的裂解液体系也无法实现本申请要求的快速裂解。进一步，由于目前裂解液体系中需要加入蛋白酶K，蛋白酶K由于价格的因素，导致核酸分子检测成本高。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本申请的目的是提供一种快速核酸提取方法，该方法在清洗的时候采用采用硅油、石蜡油、C5-C15烷烃油和卤代C1-C15烷烃油中的一种或多种混合，该洗涤液中不含酒精，不需要晾干，也不会对核酸造成影响，保证快捷有效的检测；进一步，本申请的装置便于运输。

为了实现上述的目的，本申请采用了以下的技术方案：

一种快速核酸提取装置，该装置包括快速核酸提取器、裂解液、洗涤液和洗脱液；洗脱液用于将吸附在快速核酸提取器上核酸物质洗脱收集；洗涤液采用硅油、石蜡油、C5-C15烷烃油和卤代C1-C15烷烃油中的一种或多种混合。

作为优选，裂解液、洗涤液和洗脱液预封装设置在快速核酸提取器内。

作为优选，洗涤液至少包括硅油；按体积比硅油占比为10-100％。

作为优选，洗涤液还包括与硅油互溶的石蜡油、C5-C15烷烃油和卤代C1-C15烷烃油中的一种或多种；按体积比硅油占比为10-90％。

作为优选，洗涤液由硅油、石蜡油、C5-C15烷烃油和/卤代C1-C15烷烃油混合构成。

作为优选，洗涤液按体积分数由以下成分构成：

硅油 1-10份

石蜡油 1-10份

C5-C15烷烃油和/卤代C1-C15烷烃油 1-10份。

作为再优选，洗涤液按体积分数由以下成分构成：

硅油 1-3份

石蜡油 5-8份

C5-C15烷烃油和/卤代C1-C15烷烃油 2-4份。

进一步，本申请采用采用在裂解液加入甲烷硅基化的季铵化合物(SIQAC)，使得裂解不需要在加温的条件下既可以进行快速裂解，更有利于本申请在特定环境下使用，同时可以不用蛋白酶K，降低了成本。

作为优选，裂解液含有GuSCN、Tris、Triton-X100、EDTA-2NA和SiQAC。

作为优选，裂解液含有:

上述的百分比为裂解液总质量为100％。

作为再优选，裂解液含有:

上述的百分比为裂解液总质量为100％。

作为优选，所述的快速核酸提取器包括注射器和核酸吸附头，核酸吸附头内设置有核酸吸附层，裂解后的液体中的核酸物质吸附在核酸吸附层上；或者，所述的提取装置还包括磁珠，快速核酸提取器包括磁性吸附部件，所述的裂解液中加入磁珠，所述的核酸物质通过磁珠吸附部件上。

作为优选，核酸吸附头包括针栓和所述的核酸吸附柱，所述的核酸吸附柱固定设置在针栓内，封闭针栓的内部通孔。

进一步，本申请还公开了一种快速核酸提取方法，该方法该方法采用所述的提取装置,包括以下步骤：

1)裂解、吸附：将样本置于核酸释放剂中裂解，裂解后的液体中的核酸物质吸附在快速核酸提取器中；

2)一次清洗：将快速核酸提取器在常规洗涤液中进行清洗；

3)二次清洗：将快速核酸提取器在本申请所述的洗涤液中进行清洗；

4)洗脱：将快速核酸提取器在核酸洗脱液中进行洗脱，收集洗脱的液体，直接用于分子检测或低温保存；

本申请由于采用了上述的技术方案，该方法在清洗的时候采用采用硅油、石蜡油、C5-C15烷烃油和卤代C1-C15烷烃油中的一种或多种混合，一方面不会对核酸造成影响，另外可以更彻底地清除蛋白残留，保证快捷有效的检测。本申请中硅油的作用是清除蛋白及无机盐残留，石蜡油的作用是清除蛋白及无机盐残留，烷烃油作用是调节洗涤液密度。本申请的洗涤液中不含酒精，不需要晾干，也不会对核酸造成影响，保证快捷有效的检测；进一步，本申请的装置便于运输。

附图说明

图1为实施例1的产品结构示意图。

图2-图9为实施例1方法河蟹颤抖病-RNA提取纯化后的PCR结果图。

图10-图17为实施例1方法ASFV血液-DNA提取纯化后的PCR结果图。

图18为实施例2的产品结构示意图。

图图19-图26为实施例2方法河蟹颤抖病-RNA提取纯化后的PCR结果图。

图27为试验例1不同洗涤液方法全血DNA提取纯化后的PCR结果图。

图28为试验例2不同裂解液方法全血DNA提取纯化后的PCR结果图。

具体实施方式

本申请的原料来源如下：

GuSCN、Tris、Triton-X100、EDTA-2Na、SiQAC、Isopropanol、硅油、石蜡油、溴戍烷、正己烷采购自上海麦克林生化科技有限公司(MACKLIN)。

实施例1

一种快速核酸提取装置，该提取装置包括快速核酸提取器、核酸释放剂、洗涤液和核酸洗脱液；如图1所示，本申请的快速核酸提取器包括注射器1和核酸吸附头2，核酸吸附头2内设置有核酸吸附层3，裂解后的液体中的核酸物质吸附在核酸吸附层3上，所述的核酸吸附柱3固定设置在核酸吸附头2内，封闭核酸吸附头2的内部通孔。

试剂配方如表1

表1

提取装置包装规格如表2

表2

操作方式

一、裂解：

血液样本：取100uL全血加入1mL核酸释放剂中，充分混匀后静置3min，使用核酸提取器(注射器)匀速吸取所有液体，来回匀速抽打10次，最后一次抽打后应排空核酸提取器中所有的液体。

唾液样本：取100uL唾液样本加入1mL核酸释放剂中，充分混匀后静置3min，使用核酸提取器匀速吸取所有液体，来回匀速抽打10次。

拭子样本：将拭子头折断放入1mL核酸释放剂中，充分混匀后静置3min，弃去拭子头，使用核酸提取器匀速吸取所有液体，来回匀速抽打10次。

组织样本：取少量组织样本于100mL核酸释放剂中，使用研磨杵充分研磨后(若混合液较浑浊可适当离心)，补足核酸释放剂体积到1mL，静置3min。使用核酸提取器匀速吸取所有液体，来回匀速抽打10次。

二、清洗：将核酸提取器在6mL洗涤液中匀速抽打3次(抽取液体时需要抽满1mL刻度)。

三、洗脱：使用核酸提取器匀速吸取100uL核酸释放剂，来回匀速抽打10次，收集最后一次洗脱的液体，其可直接用于分子检测或置于-20℃(DNA)/-60℃(RNA)长期保存。

试验结果

本申请分别对河蟹颤抖病-RNA、ASFV血液-DNA采用实施例1所述的提取装置进行提取纯化，进行PCR检测的结果如图2-9、图10-17所示；图2-9中A1-A4、B1-B4、C1-C4、D1-D4分别为采用实施例1所述的提取装置进行提取纯化的河蟹颤抖病-RNA 10^-2、10^-3、10^-4、10^-5样本，E1-E4、F1-F4、G1-G4、H1-H4分别为采用传统磁珠提取纯化的河蟹颤抖病-RNA 10^-2、10^-3、10^-4、10^-5样本；图10-17中A1-A4、B1-B4、C1-C4、D1-D4分别为采用实施例1所述的提取装置进行提取纯化的ASFV血液-DNA 10^-2、10^-3、10^-4、10^-5样本，E1-E4、F1-F4、G1-G4、H1-H4分别为采用传统磁珠提取纯化的ASFV血液-DNA 10^-2、10^-3、10^-4、10^-5样本。

实施例2

一种快速核酸提取装置，该提取装置包括快速核酸提取器、磁珠、核酸释放剂、洗涤液和核酸洗脱液；核酸释放剂、洗涤液和核酸洗脱液预封装在试管内；如图18所示，所述的快速核酸提取器的端部设置有磁铁4，所述的核酸释放剂中加入磁珠，所述的核酸物质通过磁珠吸附部件上。

试剂配方如表3

表3

提取装置包装规格如表4

表4

操作方式

一、裂解：

1、血液样本：取100uL全血加入裂解管5中，充分混匀后静置3min。将磁棒缓慢放入裂解管5中，来回匀速抽打10次，保证吸取裂解管5内所有磁珠。

2、唾液样本：取100uL唾液样本加入裂解管5中，充分混匀后静置3min。将磁棒缓慢放入裂解管5中，来回匀速抽打10次，保证吸取裂解管5内所有磁珠。

3、拭子样本：将拭子头折断放入裂解管5中，充分混匀后静置3min，弃去拭子头。将磁棒缓慢放入裂解管5中，来回匀速抽打10次，保证吸取裂解管5内所有磁珠。

4、组织样本：取少量组织样本(若成块状需提前研磨)放入裂解管5中，充分混匀后静置3min。将磁棒缓慢放入裂解管5中，来回匀速抽打10次，保证吸取裂解管5内所有磁珠。

二、一次清洗：将磁棒放入第一洗涤管6中，第一洗涤管6为常规洗涤液，来回快速抽打20次(操作时保证顶端浸入液体)。

三、二次清洗：将磁棒放入第二洗涤管7中，第二洗涤管7中含有表3所述的洗涤液，来回快速抽打20次(操作时保证顶端浸入液体)。

四、洗脱：将磁棒放入洗脱管8中，来回匀速抽打10次(操作时保证顶端浸入液体)弃去磁棒，管3内液体可直接用于分子检测或置于-20℃(DNA)/-60℃(RNA)长期保存。

试验结果

本申请分别对河蟹颤抖病-RNA、采用实施例2所述的提取装置进行提取纯化，进行PCR检测的结果如图19-26所示,图5中A1-A4、B1-B4、C1-C4、D1-D4分别为采用实施例2所述的提取装置进行提取纯化的河蟹颤抖病-RNA 10^-2、10^-3、10^-4、10^-5样本，E1-E4、F1-F4、G1-G4、H1-H4分别为采用传统磁珠提取纯化的河蟹颤抖病-RNA 10^-2、10^-3、10^-4、10^-5样本。

试验例1

本申请分别配制洗涤液1(硅油)、洗涤液2(石蜡油)、洗涤液3(溴戍烷)、洗涤液4(硅油+石蜡油)、洗涤液4(硅油+溴戍烷)、洗涤液5(硅油+石蜡油+溴戍烷)以及参照例(10mMTris+60％乙醇)采用实施例1的操作方式对河蟹颤抖病-RNA进行提取和纯化。

	硅油	石蜡油	溴戊烷	Tris	乙醇
						洗涤液1	100％
洗涤液2		100％
						洗涤液3			100％
洗涤液4	20％	80％
						洗涤液5	10％	60％	30％
参照例				10mM	50％

试验例2

本申请分别配制裂解液1(0.05％SiQAC)，裂解液2(0.1％SiQAC)，以及参照例(加入20uL蛋白酶K(20mg/mL))采用实施例1的操作方式对河蟹颤抖病-RNA进行提取和纯化。

GuSCN

Tris

Triton-X100

EDTA-2NA

SiQAC

Isopropanol

裂解液1

○

裂解液2

○

参照例

○

以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施列，而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种快速核酸提取装置，该提取装置包括快速核酸提取器、裂解液、洗涤液和洗脱液；其特征在于，洗涤液采用硅油、石蜡油、C5-C15烷烃油和卤代C1-C15烷烃油中的一种或多种混合。

2.根据权利要求1所述的一种快速核酸提取装置，其特征在于，裂解液、洗涤液和洗脱液预封装设置在快速核酸提取器内。

3.根据权利要求1所述的一种快速核酸提取装置，其特征在于，洗涤液至少包括硅油；按体积比硅油占比为10-100%。

4.根据权利要求2所述的一种快速核酸提取装置，其特征在于，洗涤液还包括与硅油互溶的石蜡油、C5-C15烷烃油和卤代C1-C15烷烃油中的一种或多种；按体积比硅油占比为10-90%。

5.根据权利要求2所述的一种快速核酸提取装置，其特征在于，洗涤液由硅油、石蜡油、C5-C15烷烃油和/卤代C1-C15烷烃油混合构成；优选，所述的洗涤液按体积分数由以下成分构成：

硅油 1-10份

石蜡油 1-10份

C5-C15烷烃油和/或C1-C15卤代烷烃油 1-10份。

6.根据权利要求1-4任意一项权利要求所述的一种快速核酸提取装置，其特征在于，裂解液含有甲烷硅基化的季铵化合物。

7.根据权利要求5所述的一种快速核酸提取装置，其特征在于，裂解液含有:

GuSCN 2-10M

Tris 20-100mM

Triton-X100 2-10%

EDTA-2Na 1.0-5.0mM

SiQAC 0.01-0.5%；

上述的百分比为裂解液总质量为100%。

8.根据权利要求1-7任意一项权利要求所述的一种快速核酸提取装置，其特征在于，所述的快速核酸提取器包括注射器和核酸吸附头，核酸吸附头内设置有核酸吸附层，裂解后的液体中的核酸物质吸附在核酸吸附层上；或者，所述的提取装置还包括磁珠，快速核酸提取器包括磁性吸附部件，所述的裂解液中加入磁珠，所述的核酸物质通过磁珠吸附部件上。

9.根据权利要求8所述的一种快速核酸提取装置，其特征在于，核酸吸附头包括针栓和所述的核酸吸附柱，所述的核酸吸附柱固定设置在针栓内，封闭针栓的内部通孔。

10.一种快速核酸提取方法，其特征在于，该方法采用权利要求1-9任意一项权利要求所述的提取装置，包括以下步骤：

1）裂解、吸附：将样本置于裂解液中裂解，裂解后的液体中的核酸物质吸附在快速核酸提取器中；

2）一次清洗：将快速核酸提取器在常规洗涤液中进行清洗；

3）二次清洗：将快速核酸提取器在权利要求1或3或4所述的洗涤液中进行清洗；

4）洗脱：将快速核酸提取器在洗脱液中进行洗脱，收集洗脱的液体，直接用于分子检测或低温保存。