CN106350509A - 一种快速高效的唾液dna提取试剂盒及提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速高效的唾液DNA提取试剂盒及提取方法。快速高效的唾液DNA提取试剂盒包括了细胞裂解液，DNA结合液，漂洗液和洗脱液。唾液DNA提取方法至少包括以下三个步骤：(1)细胞裂解：唾液中加入细胞裂解液，得到含有游离DNA的细胞裂解液；(2)将DNA结合液加入上一步得到的细胞裂解液，得到DNA‑磁珠吸附复合体；(3)利用漂洗液和洗脱液对上一步生成的复合体进行洗脱，去除RNA和其他杂质，得到高纯度DNA。本发明采用一种新型的细胞裂解液，成本低，提取的DNA纯度高，完整性好，无RNA残留，可用于高通量测序，基因分型及一般分子生物学实验操作。

Description

一种快速高效的唾液DNA提取试剂盒及提取方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种快速高效的唾液DNA提取试剂盒及提取方法。
背景技术
DNA提取纯化是分子生物学研究中的一项基础性操作，获得高质量的DNA对于后续的研究分析工作非常重要。人类疾病检测，分子诊断，遗传学分析等都需要高质量的基因组DNA。目前，检验科室中用于检测的DNA一般是从抗凝血中提取的，从唾液中提取DNA进行基因检测尚不多见。
从唾液中提取DNA的主要原因如下：血液采集通常需要专业器具和专业人员，血液采集的过程常会给采集者带来痛苦和伤害。相较而言唾液采集操作简便，无痛苦，成本低，获得的基因组DNA质量高，完整性好，同样可用于各种分子生物学检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速高效的唾液DNA提取试剂盒及提取方法。
本发明提供的快速高效的唾液DNA提取试剂盒，包括口腔细胞清洗液、细胞裂解液、DNA结合液、磁珠、洗涤液和洗脱液。
本发明提供的唾液DNA提取纯化方法包括以下步骤：
(1)将1 mL唾液置于1.5 mL离心管中，12 000 rpm离心2 min，小心的吸弃上清，收集口腔细胞沉淀；
(2)向收集得到的口腔细胞沉淀中加入1 mL口腔细胞清洗液，反复吹打20次混匀样品，12 000 rpm离心2 min，小心的吸弃上清，得到清洗过的口腔细胞沉淀；
(3)向沉淀中依次加入300 μL口腔细胞裂解液和20 μL RNase，涡旋震荡5 s使样品与裂解液充分混匀，37 ℃孵育10 min；
(4)配置加有磁珠的DNA结合液: 磁珠充分混匀后，取20 μL加入 300μL的DNA结合液（可提前按本比例同时配置本次实验所需混合液）；
(5)向步骤(3)中得到的混合物中继续加入320 μL加有磁珠的DNA结合液，涡旋振荡5 s后，室温放置5 min；
(6)将上一步获得的混合物置于磁力架上静置2 min，待磁珠完全吸附于离心管侧壁时，吸弃溶液，避免接触磁珠，保留结合有DNA的磁珠；
(7)向离心管中加入500 μL 洗涤液1，将离心管从磁力架上取下涡旋振荡5 s，再置于磁力架上静置2 min后，吸弃洗涤液，同时避免接触磁珠；
(8)向离心管中加入500 μL 洗涤液2，将离心管从磁力架上取下涡旋振荡5 s，再置于磁力架上静置2 min后，吸弃洗涤液，同时避免接触磁珠；
(9)重复步骤(8)一次；
(10)将步骤(9)得到的结合有DNA的磁珠在室温下静置10 min，晾干，加入50 μL洗脱液或去离子水，涡旋振荡混匀使磁珠完全重悬于洗脱液中，静置2 min；
(11) 再次将离心管置于磁力架上静置2 min，转移洗脱液至新的离心管中-20 ℃保存备用。
上述步骤(2)所述的口腔细胞清洗液为pH6.8的0.05 M PBS缓冲液（0.05 mol/LNa2HPO4溶液和0.05 mol/L KH2P04溶液等体积混合）。
上述步骤(3)提到的口腔细胞裂解液中含有：pH8.0的40-150 mM的Tris-HCl缓冲盐；4 mM/mL的异硫氰酸胍；溶度为10-20%的非离子表面活性剂；含量为0.5 U-2 U的复合酶类；浓度为80-150 mM的可溶性盐；浓度为40-60 mM的金属离子螯合剂。
上述所述的非离子表面活性剂成分可为烷基苯磺酸钠、烷基磺酸钠、脂肪醇硫酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚等，优选十二烷基磺酸钠。
上述所述可溶性盐可为可溶性钠盐硫酸钠，氯化钠等，优选为硫酸钠；
上述所述复合酶类成分包括脂酶，蛋白酶，淀粉酶，甘露聚糖酶，纤维素酶，其优选的摩尔比例为1:2:1:1:1。
上述所属金属离子螯合剂可为乙二胺四乙酸二钠，乙二胺四乙酸四钠，乙二胺四乙酸镁等，优选为乙二胺四乙酸二钠。
上述步骤(4)提到的DNA结合液为DNA结合液为醇溶液，可选为乙醇，异丙醇和乙二醇，优选为异丙醇。
上述步骤(4)提到的磁珠，为包被硅基的直径为50-1000 nm的磁性微球的水溶液。
上述步骤(6)中的洗涤液1成分为pH8.0的50 mM的Tris-HCl，200 mM的氯化钠50%的乙醇溶液。
上述步骤(6)所述的洗涤液为70-80%的乙醇溶液，优选70%的乙醇溶液。
上述步骤(8)所述的洗脱液为pH8.0的TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA或去离子水。
本发明所提供的方法可以从唾液但不限于唾液样本中快速高效的分离纯化高质量的DNA，提取的DNA纯度高，片段完整性好，可用于包括高通量测序、基因分型等各种分子生物学实验。
本发明提供的唾液DNA提取方法与常规DNA提取方法相比较有如下优点：
整个操作流程方法简单、快捷，整个提取流程可在1小时内完成；
本发明裂解液中含有的复合酶类可有效去除蛋白质、脂类、多糖等多种杂质；
整个流程无需使用酚、氯仿等有毒溶剂，不使用任何有毒试剂，安全性好；
除步骤(1)，步骤(2)样品收集和洗涤步骤外，其他步骤无需离心操作，实验流程可用于工作站自动提取。
附图说明
图1为实施例中部分DNA样本的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果：M：DNA marker，1-7依次为样本1-7。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
以下实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。
一、唾液DNA提取
(1)取7为受试志愿者唾液各1 mL置于1.5 mL离心管中，12 000 rpm离心2 min，小心的吸弃上清，收集口腔细胞沉淀；
(2)向收集得到的口腔细胞沉淀中加入1 mL 口腔细胞清洗液，反复吹打20次混匀样品，12 000 rpm离心2 min，小心的吸弃上清，得到清洗过的口腔细胞沉淀；
(3)向沉淀中依次加入300 μL口腔细胞裂解液和20 μL RNase，涡旋震荡5 s使样品与裂解液充分混匀，37 ℃孵育10 min；
(4)配置加有磁珠的DNA结合液: 磁珠充分混匀后，取20 μL加入 300μL的DNA结合液（可提前按本比例同时配置本次实验所需混合液）；
(5)向步骤（3）中得到的混合物中继续加入320 μL加有磁珠的DNA结合液，涡旋振荡5 s后，室温放置5 min；
(6)将上一步获得的混合物置于磁力架上静置2 min，待磁珠完全吸附于离心管侧壁时，吸弃溶液，避免接触磁珠，保留结合有DNA的磁珠；
(7)向离心管中加入500 μL 洗涤液1，将离心管从磁力架上取下涡旋振荡5 s，再置于磁力架上静置2 min后，吸弃洗涤液，同时避免接触磁珠；
(8)向离心管中加入500 μL 洗涤液2，将离心管从磁力架上取下涡旋振荡5 s，再置于磁力架上静置2 min后，吸弃洗涤液，同时避免接触磁珠；
(9)重复步骤(8)一次；
(10)将步骤(9)得到的结合有DNA的磁珠在室温下静置10 min，晾干，加入50 μL洗脱液或去离子水，涡旋振荡混匀使磁珠完全重悬于洗脱液中，静置2 min；
(11)再次将离心管置于磁力架上静置2 min，转移洗脱液至新的离心管中-20 ℃保存备用。
二、提取效果鉴定
本发明提取的DNA纯度、浓度及质量检测：
(1)普通琼脂糖凝胶电泳鉴定
实施例一中获得的DNA样品进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳条件：凝胶浓度0.8%；0.5×TAE电泳缓冲液；在电压150 v条件下电泳20 min。电泳结果均显示一条尖锐的高分子量条带，表明所提取的DNA样品纯度高，质量好。电泳图见附图1。

Claims (16)

1.一种快速高效的唾液DNA提取试剂盒，其特征在于包括口腔细胞清洗液、细胞裂解液、DNA结合液、磁珠、洗涤液和洗脱液。
2.一种快速高效的唾液DNA提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将1 mL唾液置于1.5 mL离心管中，12 000 rpm离心2 min，小心的吸弃上清，收集口腔细胞沉淀；
(2)向收集得到的口腔细胞沉淀中加入1 mL 口腔细胞清洗液，反复吹打20次混匀样品，12 000 rpm离心2 min，小心的吸弃上清，得到清洗过的口腔细胞沉淀；
(3)向沉淀中依次加入300 μL口腔细胞裂解液和20 μL RNase，涡旋震荡5 s使样品与裂解液充分混匀，37 ℃孵育10 min；
(4)配置加有磁珠的DNA结合液：磁珠充分混匀后，取20 μL加入 300μL的DNA结合液（可提前按本比例同时配置本次实验所需混合液）；
(5)向步骤(3)中得到的混合物中继续加入320 μL加有磁珠的DNA结合液，涡旋振荡5 s后，室温放置5 min；
(6)将上一步获得的混合物置于磁力架上静置2 min，待磁珠完全吸附于离心管侧壁时，吸弃溶液，避免接触磁珠，保留结合有DNA的磁珠；
(7)向离心管中加入500 μL 洗涤液1，将离心管从磁力架上取下涡旋振荡5 s，再置于磁力架上静置2 min后，吸弃洗涤液，同时避免接触磁珠；
(8)向离心管中加入500 μL 洗涤液2，将离心管从磁力架上取下涡旋振荡5 s，再置于磁力架上静置2 min后，吸弃洗涤液，同时避免接触磁珠；
(9)重复步骤(8)一次；
(10)将步骤(9)得到的结合有DNA的磁珠在室温下静置10 min，晾干，加入50 μL洗脱液或去离子水，涡旋振荡混匀使磁珠完全重悬于洗脱液中，静置2 min；
(11)再次将离心管置于磁力架上静置2 min，转移洗脱液至新的离心管中-20 ℃保存备用。
3.根据权利要求1所述的一种快速高效的唾液DNA提取试剂盒，其特征在于，所述的唾液样本为人体唾液样本。
4.根据权利要求2所述的一种快速高效的唾液DNA提取方法，其特征在于，所述的唾液样本为人体唾液样本。
5.根据权利要求1所述的一种快速高效的唾液DNA提取试剂盒，其特征在于，所述的口腔细胞清洗液为pH6.8的0.05 M PBS缓冲液（由0.05 mol/L Na2HPO4溶液和0.05 mol/LKH2P04溶液等体积混合）。
6.根据权利要求1所述的一种快速高效的唾液DNA提取试剂盒，其特征在于，所述的细胞裂解液为：pH8.0的40-150 mM的Tris-HCl缓冲盐，优选浓度为100 mM；4 mM/mL的异硫氰酸胍；溶度为10-20%的非离子表面活性剂，优选为16%；含量为0.5 U-23 U的复合酶类，优选浓度为2 U；浓度为80-150 mM的可溶性盐，优选为100 mM；浓度为40-60 mM的金属离子螯合剂，优选为50 mM。
7.根据权利要求6所述的的非离子表面活性剂，其特征在于，该非离子表面活性剂成分可为烷基苯磺酸钠、烷基磺酸钠、脂肪醇硫酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚等，优选十二烷基磺酸钠。
8.根据权利要求6所述的可溶性盐，其特征在于，该可溶性盐成分可为可溶性钠盐硫酸钠，氯化钠等，优选为硫酸钠。
9.根据权利要求6所述的复合酶类，其特征在于，该复合酶类成分包括脂酶，蛋白酶，淀粉酶，甘露聚糖酶，纤维素酶，其摩尔比例优选为1:2:1:1:1。
10.根据权利要求6所述的金属离子螯合剂，其特征在于该金属离子螯合剂成分可为乙二胺四乙酸二钠，乙二胺四乙酸四钠，乙二胺四乙酸镁等，优选为乙二胺四乙酸二钠。
11.根据权利要求1所述的一种快速高效的唾液DNA提取试剂盒，其特征在于，所述的DNA结合液成分为醇溶液，可选为乙醇，异丙醇和乙二醇，优选为异丙醇。
12.根据权利要求1所述的一种快速高效的唾液DNA提取试剂盒，其特征在于，所述的磁珠，为包被硅基的直径为50-1000 nm的磁性微球的水溶液。
13.根据权利要求1所述的一种快速高效的唾液DNA提取试剂盒，其特征在于，所述的洗涤液包括洗涤液1和洗涤液2。
14.根据权利要求13所述的洗涤液1，其特征在于，该洗涤液成分为pH8.0的50 mM的Tris-HCl，200 mM的氯化钠50%的乙醇溶液。
15.根据权利要求13所述的洗涤液2，其特征在于，该洗涤液成分为70-80%的乙醇溶液，优选70%的乙醇溶液。
16.根据权利要求1所述的一种快速高效的唾液DNA提取试剂盒，其特征在于，所述的洗脱液为pH8.0的TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA）。
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