CN109439656A - 一种大体积样品基因组提取试剂盒 - Google Patents

一种大体积样品基因组提取试剂盒 Download PDF

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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
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Abstract

本发明公开了一种大体积样品基因组提取试剂盒，包括裂解液、结合液、蛋白酶、磁珠液、漂洗液和磁珠洗脱液，其中，所述裂解液为盐酸胍、Triton x‑100和糖原的混合液。采用本发明的核酸提取试剂盒提取得到的核酸浓度是现有方法得到的核酸浓度的100倍以上，可同时满足多种下游实验需要；本发明通过磁珠与核酸特异性的结合，使得提取的核酸纯度高、浓度大；本发明用于提取核酸时安全无毒，不使用传统方法的苯、氯仿、异戊醇等有毒试剂，对实验人员的伤害减少到最少，完全符合现代绿色环保的理念；本发明采用纯手工提取，不依赖昂贵的仪器，操作简单、用时短，整个提取过程在一个小时左右。

Description

一种大体积样品基因组提取试剂盒
技术领域
本发明涉及基因提取技术领域，尤其是一种大体积样品基因组提取试剂盒。
背景技术
随着现代分子生物学的飞速发展，核酸在现代疾病诊断中占据非常重要的作用，其中DNA的地位愈发明显。在PCR、Southern blot等分子诊断过程中，提取的DNA的质量将直接影响到下游实验的结果，因此，获得有效、高质量的DNA是基因诊断的关键。
现有的DNA提取技术多采用苯酚-氯仿抽提法，而苯酚-氯仿抽提法具有以下缺点：1)苯酚-氯仿抽提法虽然能够获得较好质量的核酸，但是其中用到的化学物质(如：氯仿、苯酚等)的毒性不可忽略，对操作人员的安全有很大威胁；2)整个提取过程耗时长，浪费时间大于24小时，对于某些新型传染性疾病的检测不及时；3)苯酚-氯仿法抽提得到的DNA浓度一般较低，一般200微升的样本提取得到的DNA浓度为30ng/μL左右，很难同时进行多项下游实验，如qPCR，Southern blot，二代测序等。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种大体积样品基因组提取试剂盒，使用本发明的试剂盒提取样品的基因组，所得核酸浓度大，纯度高，而且提取过程对操作人员安全无毒。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种大体积样品基因组提取试剂盒，所述试剂盒包括裂解液、结合液、蛋白酶、磁珠液、漂洗液和磁珠洗脱液，其中，所述裂解液为盐酸胍、Triton x-100和糖原的混合液。需要说明的是，裂解液用于裂解样品中细胞，其中盐酸胍是高离液盐，也是蛋白变性剂，通过变性蛋白从而达到裂解细胞的目的；糖原作为核酸助沉剂，有助于得到更多的DNA；Tritonx-100是一种非离子型表面活性剂，也称去污剂，能够溶解脂质，增加细胞膜的通透性，有助于核酸的释放。
优选地，所述裂解液含有7mol/L的盐酸胍、20mg的糖原和0.2％(V/V)的Triton x-100。
优选地，所述漂洗液包括第一漂洗液和第二漂洗液，所述第一漂洗液为高氯酸钠和乙醇的水溶液，所述第二漂洗液为90％(V/V)的乙醇水溶液。需要说明的是，第二漂洗液(GW2液)的作用在于：利用DNA不溶于乙醇，其他盐离子、糖类等能够溶解的原理，洗去沾在核酸表面的盐离子。
优选地，所述第一漂洗液中含有2.5M的高氯酸钠和50％(v/v)的乙醇。需要说明的是，第一漂洗液(GW1液)的作用在于：能够洗去沾在核酸表面的蛋白质，其中高氯酸钠为强氧化剂，也是高离液盐，能有效洗去蛋白质。
优选地，所述结合液中含有4M的硫氰酸胍和40％(v/v)的乙醇。需要说明的是，结合液的作用在于：给核酸与磁珠的结合提供一个稳定的环境；硫氰酸胍的作用是在结合的时候与粘在核酸表面的蛋白质反应，去除蛋白质；由于蛋白质在乙醇中溶解，DNA不溶于乙醇，从而与磁珠结合。
优选地，所述磁珠液中磁珠的浓度为30mg/ml，所述磁珠内核为四氧化三铁，在所述磁珠表面有一层SiO2。
优选地，所述磁珠洗脱液(AE液)含有10mM的Tris-cl，磁珠洗脱液的pH为8.0。需要说明的是，
优选地，所述蛋白酶为蛋白酶K。需要说明的是，蛋白酶K是一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶，具有很高的比活性，是DNA提取过程中的关键试剂；在DNA提取中，主要作用是酶解与核酸结合的组蛋白，使DNA游离在溶液中。
综上所述，本发明的有益效果为：
1)采用本发明的核酸提取试剂盒提取得到的核酸浓度是现有方法得到的核酸浓度的100倍以上，可同时满足多种下游实验需要；
2)本发明通过磁珠与核酸特异性的结合，使得提取的核酸纯度高、浓度大；
3)本发明用于提取核酸时安全无毒，不使用传统方法的苯、氯仿、异戊醇等有毒试剂，对实验人员的伤害减少到最少，完全符合现代绿色环保的理念；
4)本发明采用纯手工提取，不依赖昂贵的仪器，操作简单、用时短，整个提取过程在一个小时左右。
附图说明
图1为采用本发明的试剂盒提取的DNA的电泳图；
其中，泳道1～3样品为对照组提取200微升全血所得DNA，泳道5为Marker，泳道6～8样品为对照组提取1ml全血所得DNA，泳道9～10样品为实施例1试剂盒提取200微升全血得到的DNA。
具体实施方式
本发明提供了一种大体积、高浓度的DNA快速提取试剂盒，以解决目前同类商品提取浓度低、提取时间长、安全性能低等问题。
本发明解决了传统方法提取的核酸浓度低的问题，本发明的试剂盒组分包括裂解液、结合液、蛋白酶K，磁珠液、GW1、GW2、AE液。本发明从1毫升全血中提取得到的核酸浓度高，可同时进行多种下游实验(如：qPCR、Southern blot、二代测序等)。本发明的试剂盒由纯手工操作，不需要购买昂贵的核酸提取仪配套。传统的苯酚-氯仿提取方法是用有毒的苯酚、氯仿、异戊醇等有毒试剂，而本发明的试剂盒中使用的试剂分别是乙醇、NaCL等无毒试剂。本发明通过磁珠与核酸特异性的结合，使得提取的核酸纯度优、浓度高。
本发明的试剂盒针对大体积样本，打破了现有试剂盒仅能提取200微升及以内样本的局限性，目前为1毫升全血，还可以随着样本量成比例的变化，比如400微升、500微升、600微升、700微升、800微升等。本发明试剂盒提取得到的核酸浓度非常高，是现有试剂盒的几十倍。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明的大体积样品基因组提取试剂盒的一种实施例，包括以下组分:
裂解液：浓度为7mol/L的盐酸胍、质量为20mg的糖原和体积比为0.2％的Tritonx-100；制备方法为：称取668.71g盐酸胍和20mg糖原，加入800毫升去离子水搅拌溶解，加入2毫升Triton x-100，继续加入去离子水定容至1升；
结合液：4M的硫氰酸胍，40％(v/v)的乙醇；具体配制方法：称取472.64g硫氰酸胍，用400毫升去离子水充分溶解，再加400毫升乙醇，用去离子水定容至1升；
磁珠液：浓度为30mg/mL的磁珠混悬液，磁珠内核为四氧化三铁(Fe3O4),在表面有一层SiO2；具体配制方法：称取3g磁珠，加入到100毫升去离子水，超声使其分散均匀，使用前需斡旋，作用是与核酸结合；
GW1液：2.5M的高氯酸钠和50％(v/v)乙醇的水溶液；具体配制方法：称取351.15g高氯酸钠，加入200毫升去离子水进行充分溶解，继续加入500毫升的去离子水，再用去离子水定容至1升；
GW2液：90％(v/v)的乙醇水溶液；
AE液：10mM的Tris-cl，pH为8.0；具体配制方法：称取120mg Tris-base,加入去离子水进行充分溶解，调PH为8.0，用去离子水定容至1升。
实施例2
本发明的试剂盒的使用方法的一种实施例，使用实施例1的试剂盒对血液基因组进行提取，包括如下步骤：
1)在15mL离心管中，加入100μL蛋白酶K溶液，蛋白酶K溶液的浓度为20mg/mL。
2)转移1mL全血至装有蛋白酶K的离心管中，涡旋混匀30秒。
3)加入1mL裂解液至样品中，涡旋混匀60秒，短暂离心15秒；56℃水浴或振荡温育10分钟，其间颠倒混匀1～2次，每次20秒。
4)加入100μL磁珠液至离心管中，再加入2mL结合液，盖紧管盖，涡旋振荡15秒充分混匀，室温放置5分钟，期间不时振荡混匀。
5)转移至磁力架上吸附5～6分钟。倒弃溶液。
6)加入2.5mL GW1液，涡旋混匀60秒，短暂离心。
7)转移至磁力架上吸附2分钟。倒弃或吸弃溶液。
8)重复第6)～7)步一次。
9)加入2.5mL GW2液，颠倒混匀60秒，短暂离心。
10)转移至磁力架上吸附2分钟。倒弃或吸弃溶液。
11)重复第9)～10)步一次。
12)转移至磁力架上吸附2分钟，吸弃所有溶液(切勿残留液体)。打开管盖，空气干燥10分钟。
13)加入100μl AE液，用移液器吹打10次。盖紧管盖，60℃振荡温育5分钟。若无振荡温育，其间颠倒混匀1～2次，每次20秒。
14)转移至磁力架上吸附5分钟，把上清转移至新的1.5mL或2.0mL离心管中，离心管中的即为核酸，-20℃保存。
实施例3对照实验
(1)采用相同DNA样品，采用实施例1的试剂盒和实施例2的方法提取DNA，并使用广州某生物科技有限公司的快速核酸提取试剂盒(对照试剂盒，内含裂解液、结合液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液)进行6份平行对照实验，使用超微量分光光度计K5500plus对实验组和对照组提取得到的DNA进行OD值检测，实验结果如下表1所示，检测结果显示，使用本发明试剂盒从血液中提取得到的DNA产物浓度高且纯度优。
表1提取的DNA浓度
样品 A260/A280 A260/A230 浓度/ng/μL
全血1 1.90 1.65 194.1
全血2 1.80 1.62 165.4
全血3 1.87 1.72 166.4
全血4 1.83 1.81 196.4
全血5 1.82 1.82 196.0
全血6 1.83 1.82 196.7
全血7 2.19 1.56 334.3
全血8 2.18 1.56 387.2
全血9 2.02 1.60 354.1
全血10 1.84 1.62 590.1
全血11 1.90 1.64 592.9
全血12 1.78 1.98 512.3
全血13 1.96 1.83 43.7
全血14 1.95 1.87 43.1
全血15 1.90 1.86 42.8
全血16 1.89 1.98 28.5
全血17 1.88 1.96 28.7
全血18 1.83 1.94 28.6
注：样品1-6为对照试剂盒提1毫升全血实验结果，样品7-12为实施例1试剂盒提取200微升全血DNA得到的实验结果，样本13-18为200微升全血采用对照试剂盒提取200微升全血的结果。
(2)凝胶电泳检测提取DNA：上述实验组(实施例1试剂盒提取200微升全血得到的DNA，对应图1中泳道9和10)取两份，分别取5μL上样；上述对照组提取200微升全血所得DNA取3份(电泳结果对应图1中泳道1～3)，上述对照组提取1毫升全血所得DNA取3份(电泳结果对应图1中泳道6～8)，分别取5μL上样，进行琼脂糖凝胶电泳。
电泳所得胶图(图1)显示，本发明试剂盒提取得到的DNA条带清晰完整，没有降解，每份提取的DNA条带亮度比对照组试剂要亮得多。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (8)

1.一种大体积样品基因组提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括裂解液、结合液、蛋白酶、磁珠液、漂洗液和磁珠洗脱液，其中，所述裂解液为盐酸胍、Triton x-100和糖原的混合液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解液含有7mol/L的盐酸胍、20mg的糖原和0.2％(V/V)的Triton x-100。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述漂洗液包括第一漂洗液和第二漂洗液，所述第一漂洗液为高氯酸钠和乙醇的水溶液，所述第二漂洗液为90％(V/V)的乙醇水溶液。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述第一漂洗液中含有2.5M的高氯酸钠和50％(v/v)的乙醇。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述结合液中含有4M的硫氰酸胍和40％(v/v)的乙醇。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁珠液中磁珠的浓度为30mg/ml，所述磁珠内核为四氧化三铁，在所述磁珠表面有一层SiO2。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁珠洗脱液含有10mM的Tris-cl，磁珠洗脱液的pH为8.0。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白酶为蛋白酶K。
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