JP2021518157A - 核酸を抽出するための方法 - Google Patents
核酸を抽出するための方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2021518157A JP2021518157A JP2020572631A JP2020572631A JP2021518157A JP 2021518157 A JP2021518157 A JP 2021518157A JP 2020572631 A JP2020572631 A JP 2020572631A JP 2020572631 A JP2020572631 A JP 2020572631A JP 2021518157 A JP2021518157 A JP 2021518157A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- masking
- sample
- reagent
- group
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 188
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 185
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 185
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 78
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 101
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 95
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 94
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 72
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 claims abstract description 67
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 56
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 47
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims abstract description 47
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims abstract description 46
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims abstract description 41
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims abstract description 31
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 234
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 77
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 66
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 40
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 40
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical group 0.000 claims description 36
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 32
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 28
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 22
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 claims description 22
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 claims description 15
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims description 14
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 claims description 13
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 12
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 12
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 10
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 8
- 239000002253 acid Chemical class 0.000 claims description 7
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 claims description 7
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 claims description 7
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 7
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 claims description 7
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 6
- BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N diisopropylcarbodiimide Natural products CC(C)NC(=O)NC(C)C BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 6
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 claims description 5
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 claims description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 4
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 claims description 4
- 150000001350 alkyl halides Chemical class 0.000 claims description 4
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 claims description 4
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 4
- AOGYCOYQMAVAFD-UHFFFAOYSA-N chlorocarbonic acid Chemical class OC(Cl)=O AOGYCOYQMAVAFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 claims description 4
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 claims description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 4
- NOGFHTGYPKWWRX-UHFFFAOYSA-N 2,2,6,6-tetramethyloxan-4-one Chemical compound CC1(C)CC(=O)CC(C)(C)O1 NOGFHTGYPKWWRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- FEQPWZXKGNCPSP-UHFFFAOYSA-N acetic acid;1-hydroxypyrrolidine-2,5-dione Chemical compound CC(O)=O.ON1C(=O)CCC1=O FEQPWZXKGNCPSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- YHASWHZGWUONAO-UHFFFAOYSA-N butanoyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OC(=O)CCC YHASWHZGWUONAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N carbonyldiimidazole Chemical compound C1=CN=CN1C(=O)N1C=CN=C1 PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 claims description 3
- LSACYLWPPQLVSM-UHFFFAOYSA-N isobutyric acid anhydride Chemical compound CC(C)C(=O)OC(=O)C(C)C LSACYLWPPQLVSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 3
- WYVAMUWZEOHJOQ-UHFFFAOYSA-N propionic anhydride Chemical compound CCC(=O)OC(=O)CC WYVAMUWZEOHJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 2
- 150000008049 diazo compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 abstract description 9
- 150000001735 carboxylic acids Chemical group 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 48
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 29
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 28
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 27
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 20
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 19
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 18
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 16
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 15
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 15
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 13
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 13
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 12
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 12
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 11
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 11
- -1 5 to 50 mM Chemical class 0.000 description 10
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 9
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 9
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 8
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 8
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101710149004 Nuclease P1 Proteins 0.000 description 7
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 7
- 241000724252 Cucumber mosaic virus Species 0.000 description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 6
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 6
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 6
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 6
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 5
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 5
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 5
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 5
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 4
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 4
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical class ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 3
- AZUYLZMQTIKGSC-UHFFFAOYSA-N 1-[6-[4-(5-chloro-6-methyl-1H-indazol-4-yl)-5-methyl-3-(1-methylindazol-5-yl)pyrazol-1-yl]-2-azaspiro[3.3]heptan-2-yl]prop-2-en-1-one Chemical compound ClC=1C(=C2C=NNC2=CC=1C)C=1C(=NN(C=1C)C1CC2(CN(C2)C(C=C)=O)C1)C=1C=C2C=NN(C2=CC=1)C AZUYLZMQTIKGSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FPIRBHDGWMWJEP-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxy-7-azabenzotriazole Chemical compound C1=CN=C2N(O)N=NC2=C1 FPIRBHDGWMWJEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical group [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000002152 alkylating effect Effects 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GZUXJHMPEANEGY-UHFFFAOYSA-N bromomethane Chemical compound BrC GZUXJHMPEANEGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- IRXSLJNXXZKURP-UHFFFAOYSA-N fluorenylmethyloxycarbonyl chloride Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)Cl)C3=CC=CC=C3C2=C1 IRXSLJNXXZKURP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- KQNPFQTWMSNSAP-UHFFFAOYSA-N isobutyric acid Chemical compound CC(C)C(O)=O KQNPFQTWMSNSAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 description 2
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 description 2
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 description 2
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 2
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 2
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 2
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 2
- DYHSDKLCOJIUFX-UHFFFAOYSA-N tert-butoxycarbonyl anhydride Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)OC(=O)OC(C)(C)C DYHSDKLCOJIUFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VCQURUZYYSOUHP-UHFFFAOYSA-N (2,3,4,5,6-pentafluorophenyl) 2,2,2-trifluoroacetate Chemical compound FC1=C(F)C(F)=C(OC(=O)C(F)(F)F)C(F)=C1F VCQURUZYYSOUHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MRCKRGSNLOHYRA-UHFFFAOYSA-N (2-nitrophenyl) acetate Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O MRCKRGSNLOHYRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AIBPSNRYFKLLJR-UHFFFAOYSA-N 2-diazo-3-methyl-1H-pyridine Chemical compound [N+](=[N-])=C1NC=CC=C1C AIBPSNRYFKLLJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SMWZGZIZOHNWBH-UHFFFAOYSA-N 3-bromo-5-phenyl-1,2-oxazole Chemical compound O1N=C(Br)C=C1C1=CC=CC=C1 SMWZGZIZOHNWBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 235000019735 Meat-and-bone meal Nutrition 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N Orthosilicate Chemical class [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- LGRFSURHDFAFJT-UHFFFAOYSA-N Phthalic anhydride Natural products C1=CC=C2C(=O)OC(=O)C2=C1 LGRFSURHDFAFJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- MJOQJPYNENPSSS-XQHKEYJVSA-N [(3r,4s,5r,6s)-4,5,6-triacetyloxyoxan-3-yl] acetate Chemical compound CC(=O)O[C@@H]1CO[C@@H](OC(C)=O)[C@H](OC(C)=O)[C@H]1OC(C)=O MJOQJPYNENPSSS-XQHKEYJVSA-N 0.000 description 1
- 239000003082 abrasive agent Substances 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- JHIWVOJDXOSYLW-UHFFFAOYSA-N butyl 2,2-difluorocyclopropane-1-carboxylate Chemical compound CCCCOC(=O)C1CC1(F)F JHIWVOJDXOSYLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 1
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 1
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 1
- 150000001860 citric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 1
- 235000015203 fruit juice Nutrition 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Chemical class 0.000 description 1
- 150000002357 guanidines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000008863 intramolecular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- HVTICUPFWKNHNG-UHFFFAOYSA-N iodoethane Chemical compound CCI HVTICUPFWKNHNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N iodomethane Chemical compound IC INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N iron(II,III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- MHCFAGZWMAWTNR-UHFFFAOYSA-M lithium perchlorate Chemical compound [Li+].[O-]Cl(=O)(=O)=O MHCFAGZWMAWTNR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910001486 lithium perchlorate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 description 1
- FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N maleic anhydride Chemical compound O=C1OC(=O)C=C1 FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000010309 melting process Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229940102396 methyl bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 108091064355 mitochondrial RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- PVWOIHVRPOBWPI-UHFFFAOYSA-N n-propyl iodide Chemical compound CCCI PVWOIHVRPOBWPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000000962 organic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000021110 pickles Nutrition 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 210000004915 pus Anatomy 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 235000015067 sauces Nutrition 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 150000004654 triazenes Chemical class 0.000 description 1
- 150000003852 triazoles Chemical class 0.000 description 1
- GKODZWOPPOTFGA-UHFFFAOYSA-N tris(hydroxyethyl)aminomethane Chemical class OCCC(N)(CCO)CCO GKODZWOPPOTFGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000006097 ultraviolet radiation absorber Substances 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Description
分子生物学の台頭により、診断は大きな進歩を遂げた。試験試料から、宿主又は、当該試料に含まれる感染性微生物に属する核酸の抽出及び検出が可能である。この遺伝物質の検出又は、この遺伝物質の定量によってさえも、微生物感染や腫瘍遺伝子の存在に関する診断を確定することが可能になる。これは、通常、以下に説明する3つの工程で行われる。
2)様々なソースの生物学的試料での可能な実施
3)本質的に水性の媒体中における方法の実施
4)良好な抽出収率
5)抽出後の核酸の高い純度レベル
6)自動化の可能性
7)対象の配列の増幅及び/又は検出の工程(特に、in vitro診断試験の文脈において)のために十分な品質のDNA、及び/又は、
8)より信頼性の高い結果でより良い検出感度。
本開示は、タンパク質及び/又は多糖類を含む試料から核酸を抽出するための方法であって、前記方法は、前記試料を適切な固体担体と接触させて配置することによって核酸を捕捉する工程を含み、前記方法は、前記捕捉工程の前に、前記試料の前記タンパク質及び/又は前記多糖類のアミン官能基及び/又はカルボン酸官能基をマスキングするための少なくとも1つの試薬で前記試料を処理する工程を含むことを特徴とする、方法に関する。1つの具体的な実施形態において、前記アミン官能基をマスキングするための前記試薬は、アシル化剤又はアルキル化剤から選択される。例えば、前記マスキング試薬は、以下の式(I)のアシル化剤から選択され、
a.例えば、前記生物学的試料を溶解緩衝液と接触させて配置することによって細胞を溶解する工程と、
b.前記試料の前記タンパク質及び/又は前記多糖類の前記アミン官能基及び/又は前記カルボン酸官能基をマスキングするための前記試薬で溶解物を処理する工程と、
c.処理された前記溶解物を適切な固体担体、例えばシリカベースの担体と接触させて配置することによって前記核酸を捕捉する工程と、
d.必要に応じて、洗浄緩衝液で前記担体を洗浄する工程と、
e.必要に応じて、前記核酸を溶離する工程と、
を含む。
i.上記に定義された前記タンパク質及び/又は前記多糖類の前記アミン官能基及び/又は前記カルボン酸官能基をマスキングするための試薬と、
ii.前記核酸の抽出に適した固体担体、例えば、シリカベースの固体担体と、
iii.必要に応じて、前記試薬を使用して前記アミン官能基及び/又は前記カルボン酸官能基をマスキングする反応のための触媒と、
iv.必要に応じて、カップリング剤と、
を少なくとも含む核酸抽出キットに関する。
「抽出」とは、任意の試料から核酸を単離するための技術、例えば、真核細胞、原核細胞、ヒト動物細胞、微生物の細胞又は組織の細胞からのDNA及び/又はRNAの単離のための技術を意味すると理解される。したがって、本発明の意味における生物学的試料からの抽出は、一般に、細胞の溶解及び溶解物からの核酸の精製を含む。
a)例えば、生物学的試料を溶解緩衝液と接触させて配置することによって細胞を溶解する工程と、
b)溶解物のタンパク質及び/又は多糖類のアミン官能基及び/又はカルボン酸官能基をマスキングするための試薬で当該溶解物を処理する工程と、
c)処理された溶解物を適切な固体担体と接触させて配置することによって核酸を捕捉する工程と、
d)必要に応じて、洗浄緩衝液で担体を洗浄し、核酸を溶離する工程と、
を含む。
溶解工程は、核酸を放出するために試料細胞(細胞壁及び細胞膜)を破壊することを含む。細胞溶解のいくつかの方法がある。特に、機械的(例えば、ビーズ及び/又は研磨材料を用いる)、化学的又は酵素的細胞溶解、又は熱衝撃による細胞溶解を挙げることができる。
本開示による核酸を抽出するための方法の本質的な特徴は、試料のタンパク質及び/又は多糖類のアミン官能基及び/又はカルボン酸官能基をマスキングするための試薬で溶解物を処理する工程に関する。この処理工程は、溶解工程の後に、マスキング試薬を溶解物に添加することによって実施され得る。あるいは、マスキング試薬が溶解緩衝液中に直接含まれ、試料の溶解及び処理が同時に起こる。目的は、固体担体、好ましくはシリカベースの固体担体を使った抽出によって、収率に影響を及ぼしそうなタンパク質及び/又は多糖類の荷電官能基を中和することである。実際、以下の実施例において、本発明者らは、シリカ被覆粒子等の固体担体を用いる抽出方法において、抽出収率、特に生物学的試料のタンパク質及び/又は多糖類に対して、生体分子が及ぼす影響を実証した。タンパク質及び/又は多糖類は、特に、それらの荷電官能基、特にそれらのアミン官能基及び/又はカルボン酸官能基を介して、シリカビーズ及び/又は核酸と相互作用し得る。
捕捉工程は、核酸の吸着(核酸の固相抽出)を可能にする条件下で、固体担体(例えば、シリカベースの固体担体)の存在下に処理された溶解物を配置することからなる。シリカベースの担体、例えばシリカビーズ又は粒子は、シリカ上での吸着によって保持された核酸を、他の細胞汚染物質(膜、マスキング試薬で処理されたタンパク質等)から分離することを可能にする。有利には、捕捉工程中、抗体は使用されない。
捕捉工程の後、1つ又は複数の洗浄工程が洗浄緩衝液の存在下で実施され得、核酸を担体から分離することなく、汚染要素の除去を可能にする。洗浄工程は、例えば、適切な洗浄緩衝液、例えば、場合によってはアルコールを含有する低塩溶液中で洗浄する工程、及び/又は塩を除去するためにアルコールの存在下で洗浄する工程を含んでもよい。本発明の好適な実施形態において、少なくとも1つの洗浄工程が実施される。
本発明は、特に対象の核酸の増幅後に、(in vitro検出試験で)試料中の対象の核酸を検出する目的のための核酸の調製に特に適している。
(i)対象核酸配列を含む可能性の高い生物学的試料から核酸を抽出する工程と、
(ii)抽出された核酸中の核酸配列を検出する工程と、
を含む。
本発明はまた、
i.前の段落に記載されたタンパク質及び/又は多糖類のアミン官能基及び/又はカルボン酸官能基をマスキングするための試薬(例えば、アシル化剤、好ましくは無水酢酸又はその乾燥形態、N−ヒドロキシスクシンイミドアセテート)、
ii.核酸の抽出に適した固体担体、
iii.必要に応じて、試薬を使用してアミン官能基及び/又はカルボン酸官能基をマスキングする反応のための触媒、及び/又は、
iv.必要に応じて、カップリング剤、
を少なくとも含む、核酸抽出キット又はセットに関する。
i.カップリング剤(例えばEDC)、
ii.核酸の抽出のための、シリカベースの適切な固体担体(例えばシリカビーズ、特に磁性シリカビーズ)、及び以下の任意の要素の少なくとも1つ:
iii.Tris又は別の求核性緩衝液を含む溶解緩衝液、
iv.1つ以上の洗浄緩衝液、及び/又は、
v.任意選択で溶離緩衝液、
vi.任意選択で触媒、
を含んでもよい。
〔図1〕カオトロピック条件下での特定のタンパク質による固体担体上のDNA捕捉の阻害を示す図である。
〔図2〕カオトロピック条件下での特定の多糖類による固体担体上のDNA捕捉の阻害を示す図である。
〔図3〕モデル単官能性ポリマーによる固体担体上でのDNA捕捉の阻害を示す図である。
〔図4A〕easyMAG抽出キット(ビオメリュー)を使用した血液試料中に含まれる核酸の抽出、及び無水酢酸(Ac20)又は酢酸(AcOH)による溶解物の前処理(3MのGuHCl+1%のTriton中で捕捉し、エタノール洗浄する)を示す図である。〔図4B〕クロマトグラフィ分析による核酸の量の測定を示す図である。
〔図5〕無水酢酸にさらされているか、又はさらされていないDNA及びRNAの混合物の抽出溶出液のHPLC分析を示す図である。上図は、無水酢酸の存在下で、10μgのDNA及びRNAの混合物並びに5.2mgのタンパク質の抽出から得られた溶出液である。下図は、10μgのDNA及びRNAの混合物の抽出から得られた溶出液である。
〔図6〕PCRによる血液中のCMVウイルス核酸のリアルタイム増幅の蛍光検出(RFU)の曲線を示す図である。図6の曲線は、それぞれ、生物学的マトリックスを用いずに抽出した後行ったコントロール増幅(三角印)、無水酢酸による処理をせずに生物学的マトリックスを用いた増幅(X印)、及び無水酢酸による処理をして生物学的マトリックスを用いた増幅(丸印)に対応する。
〔図7〕抽出前の無水酢酸Ac2Oでの処理の有無にかかわらず、血液中のCMVウイルスの検出感度(Ct)を示す図である。左側はTris HCl中のCMVの10e4コピー、中央は血液中のCMVの10e4コピー、右側は血液中のCMVの10e4コピー+Ac2Oを示す。
〔図8〕ヒト血清アルブミン及びヘモグロビンの混合物の存在下での、シリカ膜を有するカラム上での、Ac2Oで処理した場合と処理しない場合のDNAの抽出を示す図である。左側(暗灰色)はAc2Oで処理しない場合を示し、右側(明灰色)はAc2Oで処理した場合を示す。
〔図9〕完全なオリゴヌクレオチド(A)、ヌクレアーゼP1の存在下での同じオリゴヌクレオチドであって、分解されたオリゴヌクレオチド(B)、及びヌクレアーゼP1及び無水酢酸の存在下での同じオリゴヌクレオチドであって、ヌクレアーゼのアシル化に起因するオリゴヌクレオチドのはるかに良好な安定性を示すオリゴヌクレオチド(C)に対応するクロマトグラムを示す図である。
<一般的条件>
後述の実施例において使用される化合物の分析のための一般的条件を以下に示す。
シリカベースの固体担体上での核酸の抽出の性能を改善することを試みるために、本発明者らは、第1の工程は捕捉工程の性能を高めることを試みることである、と想定した。
実施例1aの実験は、タンパク質の代わりに、正又は負に荷電した多糖類等の他の化合物を用いて行った。ここで再び、核酸の抽出収率に対する多糖類の阻害効果(図2参照)が実証される。
固体担体上での核酸の捕捉の阻害現象をより良く理解するために、実施例1に記載したものと同じ実験を実施したが、対応するタンパク質の代わりにポリカルボン酸、ポリアミン、又はポリアルコールのモデル化合物を使用した(図3)。ポリカルボン酸は、ポリアミンよりも阻害性が高く、ポリアルコール又は中性化合物よりもはるかに阻害性が高いことが非常に明確に分かる。
タンパク質の競合効果は前の実施例の条件下で既に顕著にマイナスであるが、これらの条件は、200μlの血液によって実際に提供されるタンパク質の量(約50mg)よりはるかに少ない。より現実に近づけるために、本発明者らは、今回、5mgのタンパク質(免疫グロブリン、HAS、及びヘモグロビンの、実際の血液試料中に見出され得る濃度と同様の濃度の混合物)に相当するものを、200μlの溶解溶液に添加するか、又は添加しない別の実験を実施した。
本発明者らは、磁性シリカ粒子と接触させる前に、今度は無水酢酸又はEDCによる処理を加えて、上記実施例3に記載したものと同じ実験を行った。
実際の生物学的試料を用いた試薬によるタンパク質マスキングの有益な効果を実証するために、本発明者らは、磁性シリカ粒子(ビオメリュー)、及び溶解工程のために3MのGuHCl、50mMのTris HCl(pH7)、1%のTriton、洗浄のために50%エタノール中の50mMのTris HCl(pH7)、及び最終溶離のためにEasyMAG EB3緩衝液(ビオメリュー)を使用する、わずかに改変されたプロトコルを使用することによって、200μlの血液から核酸を抽出した。
実施例5に記載したものと同じ実験を行ったが、核酸についての抽出条件(異なる緩衝液)を変更して行った。
核酸に対する無水酢酸の反応選択性を実証するために、本発明者らは以下の実験を行った。
実施例7と同じ実証を、今回は、無水酢酸の存在下又は非存在下に置かれ、次いで磁性シリカ粒子で抽出されたDNA及びRNAの混合物を使用して行った。これらの溶出液の酵素的加水分解は、無水酢酸の作用後にヌクレオシドの化学修飾がないことを明白に確認した(図5参照)。したがって、このように抽出された核酸は、PCRによって、又は遺伝物質の酵素的増幅のための任意の他の反応によって、増幅可能であるはずであると結論付けることができる。
10e4コピーの量のCMVウイルス(培養中のサイトメガロウイルス)を含有する血液試料200μlを、800μlの溶解緩衝液(6MのGuHCl、15%のTriton、AcONa、pH5.5)に加え、これに、9mlの純粋な無水酢酸、及び任意選択で1μlの10MのNaOHを、数分間の反応後に加える。
この実施例では、本発明者らが、無水酢酸がシリカ膜を有する抽出カラム等の他の抽出技術においても興味深いことを実証するために、磁性シリカ粒子とは異なる核酸抽出媒体を使用した。
60塩基のモデルオリゴヌクレオチド(1nmol)を、48μlの水及び48μlの500mMのMES(pH4.7)中の0.01ユニットのヌクレアーゼP1と接触させながら、6μlの純粋な無水酢酸を添加するか、又は添加しないで配置する。結果を図9に示す。無処理のコントロールオリゴヌクレオチド(クロマトグラムA)と比較して、無水酢酸が存在しない場合、オリゴヌクレオチドはヌクレアーゼにより直ちに加水分解される(クロマトグラムB)。一方、無水酢酸が添加された場合、オリゴヌクレオチドの分解はほとんどない(クロマトグラムC)。したがって、これは、無水酢酸がヌクレアーゼをアルキル化することによってヌクレアーゼの不活性化を可能にすることを実証する。
図10及び図11は、溶解条件(3MのGuHCl又は3MのGuSCN、50mMのTris HCl(pH7))下での0〜1.8Mの無水酢酸による25mg/mlでのHSA又はヘモグロビンのアセチル化のHPLCモニタリング(条件B)を示す。5分間の反応後、無水酢酸の濃度に応じて、タンパク質に対応するクラスタが広がり、右に移動することがわかる。このことは、そのアシル化の結果、タンパク質がより疎水性になっていることを示している。HSAの場合では、1.2M前後の濃度に達すると、保持時間はこれ以上変化しない。これは、タンパク質の全ての求核性基が反応したことを意味する。ヘモグロビンアセチル化をモニタリングするクロマトグラムでは、ヘムはアセチル化によって修飾されず、その保持時間にいかなる変化も受けないことに注意されたい。
Claims (19)
- タンパク質及び/又は多糖類を含む試料から核酸を抽出するための方法であって、
前記方法は、前記試料を適切な固体担体、例えばシリカベースの固体担体と接触させて配置することによって核酸を捕捉する工程を含み、
前記方法は、前記捕捉工程の前に、前記試料の前記タンパク質及び/又は前記多糖類のアミン官能基及び/又はカルボン酸官能基をマスキングするための少なくとも1つの試薬で前記試料を処理する工程を含むことを特徴とする、方法。 - 前記アミン官能基をマスキングするための前記試薬は、アシル化剤又はアルキル化剤から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記マスキング試薬は、活性化エステル、酸ハロゲン化物、クロロホルメート、無水物、活性化炭酸エステル、及びカルボニルジイミダゾールからなる群から選択されるアシル化剤である、請求項1〜3の何れか一項に記載の方法。
- 前記マスキング試薬は、無水酢酸、無水プロピオン酸、無水イソ酪酸、無水酪酸、又は無水安息香酸から選択される無水物である、請求項1〜4の何れか一項に記載の方法。
- 前記マスキング試薬は、ハロゲン化アルキル、ジアゾ化合物、及びアルデヒドからなる群から選択されるアルキル化剤である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記マスキング試薬は、カップリング剤と組み合わせて、前記タンパク質の前記カルボン酸官能基をマスキングするためのアミン、アルコール、及びチオールから選択される、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記カップリング剤は、カルボジイミド、例えば、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)、ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、及びジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)から選択され得る、請求項7に記載の方法。
- 生物学的試料から核酸を抽出するための、先行する請求項の何れか一項に記載の方法であって、以下の工程、
a.例えば、前記生物学的試料を溶解緩衝液と接触させて配置することによって細胞を溶解する工程と、
b.前記試料の前記タンパク質及び/又は前記多糖類の前記アミン官能基及び/又は前記カルボン酸官能基をマスキングするための前記試薬で溶解物を処理する工程と、
c.処理された前記溶解物を適切な固体担体、例えばシリカベースの固体担体と接触させて配置することによって前記核酸を捕捉する工程と、
d.必要に応じて、洗浄緩衝液で前記担体を洗浄する工程と、
e.必要に応じて、前記核酸を溶離する工程と、
を含む、方法。 - 適切な前記固体担体は、シリカ粒子、特に磁性シリカ粒子からなる、先行する請求項の何れか一項に記載の方法。
- 前記生物学的試料は、血液、血漿、又は血清の試料である、請求項9又は10に記載の方法。
- 前記捕捉工程は、カオトロピック剤の存在下で行われる、請求項9〜11の何れか一項に記載の方法。
- 前記方法は、タンパク質の除去のためのプロテアーゼの使用を含まない、請求項9〜12の何れか一項に記載の方法。
- 前記核酸捕捉工程の前又は前記核酸捕捉工程中に有機溶媒を添加しない、請求項9〜13の何れか一項に記載の方法。
- 前記方法は、特に、抽出された前記核酸の増幅によって、対象の核酸を検出するさらなる工程を含む、請求項9〜14の何れか一項に記載の方法。
- i.請求項1〜8の何れか一項に記載された前記タンパク質及び/又は前記多糖類の前記アミン官能基及び/又は前記カルボン酸官能基をマスキングするための試薬と、
ii.核酸の抽出に適した固体担体、例えば、シリカベースの固体担体と、
iii.必要に応じて、前記試薬を使用して前記アミン官能基及び/又は前記カルボン酸官能基をマスキングする反応のための触媒と、
iv.必要に応じて、カップリング剤と、
を少なくとも含む、核酸抽出キット。 - 前記マスキング試薬は、無水酢酸又はその乾燥形態、N−ヒドロキシスクシンイミドアセテートである、請求項16に記載の核酸抽出キット。
- ヌクレアーゼの阻害のための、請求項1〜8の何れか一項に記載された前記タンパク質及び/又は前記多糖類の前記アミン官能基及び/又は前記カルボン酸官能基をマスキングするための試薬の使用。
- 前記ヌクレアーゼは、例えば、生物学的試料中の核酸の増幅及び/又は検出を目的として、前記生物学的試料の溶解によって得られた溶解物に含まれる、請求項18に記載の使用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2023188265A JP2024012495A (ja) | 2018-03-16 | 2023-11-02 | 核酸を抽出するための方法 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR1852257 | 2018-03-16 | ||
FR1852257A FR3078977B1 (fr) | 2018-03-16 | 2018-03-16 | Procede d'extraction d'acides nucleiques |
PCT/FR2019/050591 WO2019175518A1 (fr) | 2018-03-16 | 2019-03-15 | Procede d'extraction d'acides nucleiques |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023188265A Division JP2024012495A (ja) | 2018-03-16 | 2023-11-02 | 核酸を抽出するための方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2021518157A true JP2021518157A (ja) | 2021-08-02 |
Family
ID=62167554
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020572631A Pending JP2021518157A (ja) | 2018-03-16 | 2019-03-15 | 核酸を抽出するための方法 |
JP2023188265A Pending JP2024012495A (ja) | 2018-03-16 | 2023-11-02 | 核酸を抽出するための方法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023188265A Pending JP2024012495A (ja) | 2018-03-16 | 2023-11-02 | 核酸を抽出するための方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20210009989A1 (ja) |
EP (1) | EP3765635A1 (ja) |
JP (2) | JP2021518157A (ja) |
CN (1) | CN111868253A (ja) |
FR (1) | FR3078977B1 (ja) |
WO (1) | WO2019175518A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112881680B (zh) * | 2021-01-19 | 2022-11-15 | 深圳市卓润生物科技有限公司 | 连接有dsDNA的磁性微粒的制备方法 |
WO2023034222A1 (en) * | 2021-08-30 | 2023-03-09 | Abbott Molecular Inc. | Selective purification of rna |
CN115092938B (zh) * | 2022-06-21 | 2024-02-06 | 苏州拉索生物芯片科技有限公司 | 一种氨基改性二氧化硅微球的制备方法及应用 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000075302A2 (en) * | 1999-04-30 | 2000-12-14 | Cyclops Genome Sciences Limited | Isolation of nucleic acid |
JP2004057064A (ja) * | 2002-07-26 | 2004-02-26 | Japan Science & Technology Corp | 核酸の分解防止方法、核酸抽出方法、および核酸保存方法 |
JP2005538116A (ja) * | 2002-08-02 | 2005-12-15 | シクロプス ゲノム サイエンス リミテッド | 核酸の安定化 |
JP2013504330A (ja) * | 2009-09-14 | 2013-02-07 | キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド | 細胞学用培地に固定された組織サンプルから核酸またはタンパク質を回収するための組成物および方法 |
US20170269069A1 (en) * | 2016-03-14 | 2017-09-21 | Woojin An | Method for identifying histone tail proteolysis |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5234809A (en) | 1989-03-23 | 1993-08-10 | Akzo N.V. | Process for isolating nucleic acid |
KR100320753B1 (ko) * | 1999-10-23 | 2002-01-17 | 박한오 | 어류의 정원세포로부터 dna 추출방법 |
FR2934595B1 (fr) | 2008-07-29 | 2013-04-05 | Biomerieux Sa | Reactifs de marquage ayant un noyau pyridine portant une fonction diazomethyle, procedes de synthese de tels reactifs et procedes de detection de molecules biologiques |
-
2018
- 2018-03-16 FR FR1852257A patent/FR3078977B1/fr active Active
-
2019
- 2019-03-15 JP JP2020572631A patent/JP2021518157A/ja active Pending
- 2019-03-15 US US16/979,565 patent/US20210009989A1/en active Pending
- 2019-03-15 WO PCT/FR2019/050591 patent/WO2019175518A1/fr active Application Filing
- 2019-03-15 CN CN201980019099.0A patent/CN111868253A/zh active Pending
- 2019-03-15 EP EP19717541.7A patent/EP3765635A1/fr active Pending
-
2023
- 2023-11-02 JP JP2023188265A patent/JP2024012495A/ja active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000075302A2 (en) * | 1999-04-30 | 2000-12-14 | Cyclops Genome Sciences Limited | Isolation of nucleic acid |
JP2004057064A (ja) * | 2002-07-26 | 2004-02-26 | Japan Science & Technology Corp | 核酸の分解防止方法、核酸抽出方法、および核酸保存方法 |
JP2005538116A (ja) * | 2002-08-02 | 2005-12-15 | シクロプス ゲノム サイエンス リミテッド | 核酸の安定化 |
JP2013504330A (ja) * | 2009-09-14 | 2013-02-07 | キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド | 細胞学用培地に固定された組織サンプルから核酸またはタンパク質を回収するための組成物および方法 |
US20170269069A1 (en) * | 2016-03-14 | 2017-09-21 | Woojin An | Method for identifying histone tail proteolysis |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20210009989A1 (en) | 2021-01-14 |
FR3078977A1 (fr) | 2019-09-20 |
WO2019175518A1 (fr) | 2019-09-19 |
FR3078977B1 (fr) | 2023-03-17 |
CN111868253A (zh) | 2020-10-30 |
JP2024012495A (ja) | 2024-01-30 |
EP3765635A1 (fr) | 2021-01-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5981235A (en) | Methods for isolating nucleic acids using alkaline protease | |
JP6204664B2 (ja) | Rnaおよびdnaの並行単離および/または並行精製のためのプロセス | |
JP2024012495A (ja) | 核酸を抽出するための方法 | |
JP5763545B2 (ja) | ホルマリン固定組織からの種々の生体分子の並行抽出 | |
JP7083756B2 (ja) | タンパク質系試料回収マトリックス及び装置 | |
WO1998004730A9 (en) | Methods for isolating nucleic acids using alkaline protease | |
US20040157223A1 (en) | Chemical treatment of biological samples for nucleic acid extraction and kits therefor | |
JPH09327291A (ja) | Rnaの抽出精製方法 | |
CN114107289A (zh) | 粪便样本的核酸提取试剂盒、制备方法及提取方法 | |
CN110607297B (zh) | 一种磁珠法提取核酸的裂解液及使用该裂解液提取核酸的方法 | |
TWI407994B (zh) | 分離核酸的方法、試劑及套組 | |
EP2521779B1 (en) | Improved recovery of nucleic acids from magnetic glass particles | |
JP2005508187A (ja) | 改良された核酸の単離方法 | |
JP2021104046A (ja) | ホルムアルデヒドを含有する液体系細胞診用保存剤中検体から核酸を単離する方法 | |
JP2003235555A (ja) | 一本鎖核酸および/または二本鎖核酸の単離方法 | |
EP2171098B1 (en) | Methods for extraction and purification of components of biological samples | |
CN116162618A (zh) | 一种从核酸溶液中分离dna和rna的方法及试剂组合 | |
JP2010534467A (ja) | タンパク質性サンプルからの非タンパク質性生体分子、特に核酸の分離方法 | |
US10131935B2 (en) | Method for parallel isolation of viral nucleic acids | |
KR20210132375A (ko) | 자성나노입자와 결합된 산화그래핀을 이용한 핵산의 분리 방법 | |
CN111455021B (zh) | 去除宏基因组中宿主dna的方法及试剂盒 | |
RU2603098C1 (ru) | Способ выделения циркулирующих днк из плазмы или сыворотки крови | |
WO2023052798A1 (en) | New virus transport medium | |
CN112226490A (zh) | 一种用于dna提取的裂解缓冲液 | |
TR2021021022A2 (tr) | Karbon dna i̇zolasyon ki̇ti̇ ve yöntemi̇ |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220113 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20221220 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20221223 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20230317 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230511 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20230704 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20231102 |