CN108866049A - 一种从口腔样本中提取基因组dna的试剂盒及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物技术领域，具体涉及一种从口腔样本中提取基因组DNA的试剂盒，所述试剂盒包括裂解液、结合液、洗涤液I、洗涤液II、蛋白酶K溶液、磁珠悬浮液和洗脱液，所述裂解液包括10‑50mM Tris‑Hcl、5‑30mM EDTA、体积分数为0.5％‑2％的表面活性剂组合物和2‑6mol/L的高离液盐，所述结合液包括1‑6mol/L的高离液盐和体积分数40％‑80％的乙醇或异丙醇；本发明还公开了一种从口腔样本中提取基因组DNA的方法。采用本发明的试剂盒和方法在20min内即可提取得到DNA。

Description

一种从口腔样本中提取基因组DNA的试剂盒及其方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种从口腔样本中提取基因组DNA的试剂盒及其方法。
背景技术
DNA提取纯化是分子生物学研究中的一项基础操作，提取得到的DNA可进一步用于基因检测、基因分型、PCR、酶切、分子杂交和文库构建等。以基因检测为例，基因检测是指对血液、其他体液、或细胞中的DNA序列进行分析，可获得所含有的基因类型和基因缺陷等，可用以诊断疾病、疾病风险的预测等。其中口腔样本作为采样样本比血液样本更有优势，是各大基因检测公司的首选样本。但是口腔脱落细胞中DNA含量有限，目前市面上常用的硅胶柱法需要耗费的时间长。
中国专利CN 107058286A，公开了一种基于磁珠法提取口腔样本基因组DNA的试剂盒及其使用方法，采用本专利所公开的技术方案对口腔样本中的基因组DNA进行提取，所需的时间在30分钟以上。
由于DNA在分子生物学实验中的应用日益广泛，提取DNA所消耗的时间又会直接影响接下来的实验或检测的进程，因此，提高DNA提取的效率很有必要。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种可从口腔样本中快速提取基因组DNA的试剂盒和从口腔样本中快速提取DNA的方法。
本发明的从口腔样本中提取基因组DNA的试剂盒采用如下技术方案：一种从口腔样本中提取基因组DNA的试剂盒，所述试剂盒包括裂解液、结合液、洗涤液I、洗涤液II、蛋白酶K溶液、磁珠悬浮液和洗脱液，
所述裂解液包括10-50mM Tris-Hcl、5-30mM EDTA、体积分数为0.5％-2％的表面活性剂组合物和2-6mol/L的高离液盐，所述表面活性剂组合物选自吐温20、NP40和TritonX100中的任意2种，所述高离液盐选自盐酸胍、异硫氰酸胍和高氯酸钠中的任意一种；
所述结合液包括1-6mol/L的高离液盐和体积分数40％-80％的乙醇或异丙醇，所述高离液盐选自盐酸胍、异硫氰酸胍和高氯酸钠中的任意一种。
优选的，所述洗涤液I包括0.5-2mol/L的高离液盐和体积分数40％-80％的乙醇或异丙醇，所述高离液盐选自盐酸胍、异硫氰酸胍和高氯酸钠中的任意一种。
优选的，所述洗涤液II包括体积分数为40％-80％的乙醇或异丙醇。
优选的，所述蛋白酶K溶液的浓度为20mg/ml。
优选的，所述磁珠悬浮液的浓度为10-50mg/ml，其中，磁珠为超顺磁性硅羟基磁珠，磁珠的核心为四氧化三铁或者三氧化二铁，磁珠的粒径为100nm-1um；溶剂为去离子水。
优选的，所述洗脱液包括1-10mM Tris-Hcl和1-10mMEDTA-2钠，所述洗脱液的PH为8.0-8.5。
优选的，所述裂解液、蛋白酶K溶液、结合液、磁珠悬浮液、洗涤液I、洗涤液II和洗脱液的体积比为45:1:40:2:70:70:(5-10)。
本发明的从口腔样本中提取基因组DNA的方法，包括如下步骤：
步骤一：向盛有口腔样本的反应容器中，加入裂解液，涡旋震荡，弃去棉签或者采样拭子，加入蛋白酶K，混匀，置于65℃保温，所述裂解液包括10-50mM Tris-Hcl、5-30mMEDTA、体积分数为0.5％-2％的表面活性剂组合物和1-6mol/L的高离液盐，所述表面活性剂组合物选自吐温20、NP40和TritonX100中的任意2种，所述高离液盐选自盐酸胍、异硫氰酸胍和高氯酸钠中的任意一种；
步骤二：保温结束后，加入结合液和磁珠悬浮液混匀，之后放置于磁力架上，2min后，磁珠完全吸附，弃去上清液，所述结合液包括1-4mol/L的高离液盐和体积分数40％-80％的醇类组成，所述高离液盐选自盐酸胍、异硫氰酸胍和高氯酸钠中的任意一种，所述醇为乙醇或异丙醇；
步骤三：加入洗涤液I，涡旋混匀，之后放置于磁力架上1min，磁珠完全吸附，弃去上清液；
步骤四：加入洗涤液II，涡旋混匀，之后管置于磁力架上1min，待磁珠完全吸附，弃去上清液，室温晾干2min；
步骤五：加入洗脱液，涡旋混匀，置于65℃洗脱，之后放置于磁力架上3min，待磁珠完全吸附后，转移上清液，并于-20℃或-80℃保存备用。
优选的，所述洗涤液I由0.5-2mol/L的高离液盐和体积分数40％-80％的醇类组成，所述高离液盐选自盐酸胍、异硫氰酸胍和高氯酸钠中的任意一种，所述醇为乙醇或异丙醇；所述洗涤液II选自体积分数为40％-80％的乙醇或异丙醇；所述蛋白酶K溶液的有效浓度20mg/ml；所述磁珠悬浮液的有效浓10-50mg/ml，其中，磁珠的核心为四氧化三铁或者三氧化二铁，磁珠的粒径为100nm-1um；所述洗脱液由1-10mM Tris-Hcl与1-10mMEDTA-2钠组成，所述洗脱液的PH为8.0-8.5。
本发明的有益效果是：本发明的试剂盒采用高效细胞裂解液及独特的结合液配方，缩短样品裂解的时间，在特定缓冲体系中20min内即可分离纯化得到高纯度的基因组DNA，有效提高了从口腔样本中提取DNA的效率；可搭载配套的高通量核酸提取仪实现高通量核酸提取，提取得到的DNA可进一步用于基因检测、基因分型等实验。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为采用本发明实施例1-7的试剂盒和基因组DNA提取方法提取得到的DNA的电泳图；
图2为采用本发明实施例1的试剂盒和基因组DNA提取方法从7位志愿者的口腔样本中提取得到的DNA的电泳图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一、验证本发明的试剂盒和提取方法的有效性：
实施例1：本发明的试剂盒包括：
裂解液：20mM Tris-Hcl、10mM EDTA、体积分数为1％的表面活性剂组合物(吐温20和NP40)和3mol/L的盐酸胍。
结合液：1mol/L的异硫氰酸胍和体积分数60％的乙醇；
洗涤液I：0.5mol/L的盐酸胍和体积分数60％的异丙醇；
洗涤液II：体积分数为70％的乙醇；
蛋白酶K溶液：20mg/ml；
磁珠悬浮液：20mg/ml，其中，磁珠为超顺磁性硅羟基磁珠，磁珠的核心为四氧化三铁，磁珠的粒径为100nm；
洗脱液：10mM Tris-Hcl、1mMEDTA-2钠，所述洗脱液的PH为8.5。
实施例2：本发明的试剂盒包括：
裂解液：30mM Tris-Hcl、15mM EDTA、体积分数为0.5％的表面活性剂组合物(吐温20和TritonX100)和2mol/L的异硫氰酸胍。
结合液：2mol/L的盐酸胍和体积分数70％的乙醇；
洗涤液I：1mol/L的高氯酸钠和体积分数50％的异丙醇；
洗涤液II：体积分数为80％的异丙醇；
蛋白酶K溶液：20mg/ml；
磁珠悬浮液：30mg/ml，其中，磁珠为超顺磁性硅羟基磁珠，磁珠的核心为三氧化二铁，磁珠的粒径为300nm；
洗脱液：8mM Tris-Hcl、3mMEDTA-2钠，所述洗脱液的PH为8.0。
实施例3：本发明的试剂盒包括
裂解液：20mM Tris-Hcl、5mM EDTA、体积分数为1.5％的表面活性剂组合物(NP40和TritonX100)和3mol/L的高氯酸钠。
结合液：3mol/L的高氯酸钠和体积分数80％的异丙醇；
洗涤液I：1.5mol/L的盐酸胍和体积分数40％的乙醇；
洗涤液II：体积分数为60％的乙醇；
蛋白酶K溶液：20mg/ml；
磁珠悬浮液：40mg/ml，其中，磁珠为超顺磁性硅羟基磁珠，磁珠的核心为四氧化三铁，磁珠的粒径为500nm；
洗脱液：6mM Tris-Hcl、5mMEDTA-2钠，所述洗脱液的PH为8.1。
实施例4：本发明的试剂盒包括：
裂解液：40mM Tris-Hcl、20mM EDTA、体积分数为1％的表面活
性剂组合物(NP40和TritonX100)和5mol/L的高氯酸钠。
结合液：6mol/L的异硫氰酸胍和体积分数40％的异丙醇；
洗涤液I：1mol/L的盐酸胍和体积分数60％的异丙醇；
洗涤液II：体积分数为60％的乙醇；
蛋白酶K溶液：20mg/ml；
磁珠悬浮液：20mg/ml，其中，磁珠为超顺磁性硅羟基磁珠，磁珠的核心为四氧化三铁，磁珠的粒径为300nm；
洗脱液：1mM Tris-Hcl、10mMEDTA-2钠，所述洗脱液的PH为8.4。
实施例5：本发明的试剂盒包括：
裂解液：30mM Tris-Hcl、30mM EDTA、体积分数为1.5％的表面活性剂组合物(吐温20和TritonX100)和4mol/L的异硫氰酸胍。
结合液：5mol/L的高氯酸钠和体积分数50％的异丙醇；
洗涤液I：1.5mol/L的高氯酸钠和体积分数80％的乙醇；
洗涤液II：体积分数为40％的异丙醇；
蛋白酶K溶液：20mg/ml；
磁珠悬浮液：10mg/ml，其中，磁珠为超顺磁性硅羟基磁珠，磁珠的核心为四氧化三铁，磁珠的粒径为1um；
洗脱液：3mM Tris-Hcl、9mMEDTA-2钠，所述洗脱液的PH为8.3。
实施例6：本发明的试剂盒包括：
裂解液：10mM Tris-Hcl、25mM EDTA、体积分数为2％的表面活性剂组合物(吐温20和NP40)和3mol/L的盐酸胍。
结合液：4mol/L的盐酸胍和体积分数60％的乙醇；
洗涤液I：2mol/L的异硫氰酸胍和体积分数70％的异丙醇；
洗涤液II：体积分数为50％的异丙醇；
蛋白酶K溶液：20mg/ml溶液；
磁珠悬浮液：50mg/ml，其中，磁珠为超顺磁性硅羟基磁珠，磁珠的核心为三氧化二铁，磁珠的粒径为800nm；
洗脱液：5mM Tris-Hcl、7mMEDTA-2钠，所述洗脱液的PH为8.2。
实施例7：本发明的试剂盒包括：
裂解液：50mM Tris-Hcl、5mM EDTA、体积分数为0.5％的表面活性剂组合物(NP40和吐温20)和6mol/L的盐酸胍。
结合液：4mol/L的高氯酸钠和体积分数50％的乙醇；
洗涤液I：0.5mol/L的异硫氰酸胍和体积分数70％的乙醇；
洗涤液II：体积分数为80％的异丙醇；
蛋白酶K溶液：20mg/ml；
磁珠悬浮液：30mg/ml，其中，磁珠为超顺磁性硅羟基磁珠，磁珠的核心为三氧化二铁，磁珠的粒径为500nm；
洗脱液：9mM Tris-Hcl、6mMEDTA-2钠，所述洗脱液的PH为8.5。
采用实施例1-7的试剂盒分别提取口腔样本中的DNA:
1.采集口腔样本：采集前清水漱口2-3次，用无菌棉签或者口腔拭子在口腔内壁刮擦不少于20次(实施例1-7所对应的口腔样本取自不同的志愿者)。
2.从口腔样本中提取基因组DNA的方法：(1)将采集有口腔脱落细胞的棉签或者采样拭子插入1.5ml无菌EP管中，加入细胞裂解液450ul，涡旋震荡后尽可能的将含有脱落细胞的溶液留下，弃去棉签或者采样拭子，加入蛋白酶K溶液10ul，混匀，置于65℃保温10min。
(2)加入结合液400ul和20ul磁珠悬浮液，混匀，将1.5ml EP管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后(约2min)，弃去上清液。
(3)加入洗涤液I 700ul，涡旋混匀，将1.5ml EP管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后(约1min)，弃去上清液。
(4)加入洗涤液II 700ul，涡旋混匀，将1.5ml EP管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后(约1min)，弃去上清液，室温晾干2min。(注意弃尽残留液)
(5)加入洗脱液50ul，涡旋混匀，置于65℃洗脱，将1.5ml EP管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后(约3min)，转移上清液(即DNA提取液)，于-20℃或-80℃保存备用。
3.对提取得到的DNA进行琼脂凝胶电泳检测
采用本发明的方法和实施例1-7试剂盒提取的样品DNA与Marker λ Hind III进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，上样量为10ul，电压为110V，电泳时间25min，结果参见图1(泳道1-7分别对应采用实施例1-7的试剂盒提取得到的DNA样品)。
4.对采用实施例1-7的试剂盒提取得到的DNA的含量及
OD260/OD280值进行检测：
使用奥盛Nano300分光光度计对采用本发明的方法和实施例1-7的试剂盒提取得到的DNA进行含量和OD260/OD280值检测，结果参见表1
表1 DNA的含量及OD260/OD280值检测：
结果显示，采用本发明的试剂盒和方法可在20min内提取得到OD260/OD280值可稳定在1.6-1.8之间的DNA(纯DNA：OD260/OD280≈1.8，OD260/OD280>1.9，表明有RNA污染；OD260/OD280<1.6，表明有蛋白质、酚等污染)，显著提高了从口腔样本中提取DNA的效率。采用本发明的试剂盒和方法提取得到的DNA可进一步用于基因检测、基因分型、PCR、酶切、分子杂交和文库构建等实验。
二、验证本发明的试剂盒和DNA提取方法的重现性：使用实施例1的试剂盒从7个志愿者的口腔样本中提取DNA。
1.口腔样本的采集方法：采集前让志愿者用清水漱口2-3次，用无菌棉签或者口腔拭子在口腔内壁刮擦不少于20次。
2.按照如下方法对口腔样本中的基因组DNA进行提取：(1)将含有口腔样本的棉签或者采样拭子插入1.5ml无菌EP管中，加入细胞裂解液450ul，涡旋震荡后尽可能的将含有脱落细胞的溶液留下，弃去棉签或者采样试子，加入蛋白酶K溶液10ul，混匀，置于65℃保温10min。
(3)加入结合液400ul和20ul磁珠悬浮液，混匀，将1.5ml EP管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后(约2min)，弃去上清液。
(4)加入洗涤液I 700ul，涡旋混匀，将1.5ml EP管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后(约1min)，弃去上清液。
(5)加入洗涤液II 700ul，涡旋混匀，将1.5ml EP管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后(约1min)，弃去上清液，室温晾干2min。(注意弃尽残留液)
(6)加入洗脱液50ul，涡旋混匀，置于65℃洗脱，将1.5ml EP管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后(约3min)，转移上清液(即DNA提取液)，于-20℃或-80℃保存备用。
3.对提取得到的DNA进行琼脂凝胶电泳检测
采用实施例1的试剂盒和本发明的方法提取得到的DNA与Marker λ Hind III进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，上样量为10ul，电压为110V，电泳时间25min，结果参见图2。
4.DNA的含量及OD260/OD280值检测
使用奥盛Nano300分光光度计对采用本发明的方法和实施例1的试剂盒提取到的7个志愿者的DNA进行含量和OD260/OD280值、OD260/OD230值检测，结果参见表2
表2 DNA的含量及OD260/OD280值检测：
结果显示，采用本发明的试剂盒和方法可在20min内提取得到OD260/OD280值可稳定在1.6-1.8之间的DNA(纯DNA：OD260/OD280≈1.8，OD260/OD280>1.9，表明有RNA污染；OD260/OD280<1.6，表明有蛋白质、酚等污染)，显著提高了从口腔样本中提取DNA的效率，且重现性好。采用本发明的试剂盒和方法提取得到的DNA可进一步用于基因检测、基因分型、PCR、酶切、分子杂交和文库构建等实验。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种从口腔样本中提取基因组DNA的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括裂解液、蛋白酶K溶液、结合液、磁珠悬浮液、洗涤液I、洗涤液II和洗脱液，
所述裂解液包括10-50mM Tris-Hcl、5-30mM EDTA、体积分数为0.5％-2％的表面活性剂组合物和2-6mol/L的高离液盐，所述表面活性剂组合物选自吐温20、NP40和TritonX100中的任意2种，所述高离液盐选自盐酸胍、异硫氰酸胍和高氯酸钠中的任意一种；
所述结合液包括1-6mol/L的高离液盐和体积分数40％-80％的乙醇或异丙醇，所述高离液盐选自盐酸胍、异硫氰酸胍和高氯酸钠中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的从口腔样本中提取基因组DNA的试剂盒，其特征在于：所述洗涤液I包括0.5-2mol/L的高离液盐和体积分数40％-80％的乙醇或异丙醇，所述高离液盐选自盐酸胍、异硫氰酸胍和高氯酸钠中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的从口腔样本中提取基因组DNA的试剂盒，其特征在于：所述洗涤液II包括体积分数为40％-80％的乙醇或异丙醇。
4.根据权利要求1所述的从口腔样本中提取基因组DNA的试剂盒，其特征在于：所述蛋白酶K溶液的浓度为20mg/ml。
5.根据权利要求1所述的从口腔样本中提取基因组DNA的试剂盒，其特征在于：所述磁珠悬浮液的浓度为10-50mg/ml，其中，磁珠为超顺磁性硅羟基磁珠，磁珠的核心为四氧化三铁或者三氧化二铁，磁珠的粒径为100nm-1um。
6.根据权利要求1所述的从口腔样本中提取基因组DNA的试剂盒，其特征在于：所述洗脱液包括1-10mM Tris-Hcl和1-10mMEDTA-2钠，所述洗脱液的PH为8.0-8.5。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的从口腔样本中提取基因组DNA的试剂盒，其特征在于：所述裂解液、蛋白酶K溶液、结合液、磁珠悬浮液、洗涤液I、洗涤液II和洗脱液的体积比为45:1:40:2:70:70:(5-10)。
8.一种从口腔样本中提取基因组DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一：向盛有口腔样本的反应容器中，加入裂解液，涡旋震荡，弃去棉签或者采样拭子，加入蛋白酶K，混匀，置于65℃保温，所述裂解液包括10-50mM Tris-Hcl、5-30mM EDTA、体积分数为0.5％-2％的表面活性剂组合物和1-6mol/L的高离液盐，所述表面活性剂组合物选自吐温20、NP40和TritonX100中的任意2种，所述高离液盐选自盐酸胍、异硫氰酸胍和高氯酸钠中的任意一种；
步骤二：保温结束后，加入结合液和磁珠悬浮液混匀，之后放置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，弃去上清液，所述结合液包括1-4mol/L的高离液盐和体积分数40％-80％的醇类组成，所述高离液盐选自盐酸胍、异硫氰酸胍和高氯酸钠中的任意一种，所述醇为乙醇或异丙醇；
步骤三：加入洗涤液I，涡旋混匀，之后放置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，弃去上清液；
步骤四：加入洗涤液II，涡旋混匀，之后管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，弃去上清液，室温晾干；
步骤五：加入洗脱液，涡旋混匀，置于65℃洗脱，之后放置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，上清液中即含有目标DNA。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述洗涤液I由0.5-2mol/L的高离液盐和体积分数40％-80％的醇类组成，所述高离液盐选自盐酸胍、异硫氰酸胍和高氯酸钠中的任意一种，所述醇为乙醇或异丙醇；所述洗涤液II选自体积分数为40％-80％的乙醇或异丙醇；所述蛋白酶K溶液的有效浓度20mg/ml；所述磁珠悬浮液的有效浓10-50mg/ml，其中，磁珠为超顺磁性硅羟基磁珠，磁珠的核心为四氧化三铁或者三氧化二铁，磁珠的粒径为100nm-1um；所述洗脱液由1-10mM Tris-Hcl与1-10mMEDTA-2钠组成，所述洗脱液的PH为8.0-8.5。
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