CN116004608A

CN116004608A - 一种核酸快速提取方法及组合物

Info

Publication number: CN116004608A
Application number: CN202210916579.0A
Authority: CN
Inventors: 聂俊伟; 瞿志鹏; 荆彦平
Original assignee: Nanjing Novozan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Nanjing Novozan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-08-01
Filing date: 2022-08-01
Publication date: 2023-04-25
Anticipated expiration: 2042-08-01
Also published as: CN116004608B

Abstract

本发明提供一种核酸提取组合物，属于生物技术领域，具体涉及一种磁珠法病毒核酸快速提取的组合物。本发明的组合物可实现对核酸样本的高效裂解，同时能促进核酸与磁珠进行一步的结合，实现DNA/RNA核酸高效提取回收。

Description

一种核酸快速提取方法及组合物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种磁珠法病毒核酸快速提取的方法及组合物。

背景技术

基于DNA和RNA分析的基因组学研究是现代分子生物学的一项热点。在临床医学诊断中，随着病毒核酸高通量提取需求日益增长，当前市面也应运产生多种病毒核酸提取试剂盒，其中以磁珠法核酸提取试剂盒应用最为广泛。磁珠法核酸提取主要采用超顺磁性硅基磁珠在高盐溶液中通过氢键和静电吸附核酸，而不吸附蛋白和其他杂质，吸附了核酸的磁珠经洗涤去除剩余的蛋白和盐离子，当使用低盐缓冲液时，磁珠释放核酸，从而达到快速分离纯化核酸的目的，该方法操作简便，不需要离心，适合高通量多样本自动化进行核酸的提取，获得的核酸可直接用于逆转录、PCR、荧光定量PCR、RT-PCR、RT-qPCR、二代测序、生物芯片分析等。磁珠法核酸提取试剂盒对病毒核酸的提取分为裂解、洗涤、漂洗和洗脱几个过程。

目前市面上的磁珠法的核酸提取试剂盒通常利用胍盐进行样本的裂解，胍盐促使细胞破裂、蛋白变性，同时胍盐在核酸和磁珠之间起到盐桥连接的作用从而增强磁珠对核酸的吸附。目前市面上的多类磁珠法核酸提取试剂盒通常需要搭配消解酶达到对样本充分裂解并释放核酸。如CN112458081A公布了磁珠法病毒核酸提取试剂盒的组分及使用过程，该病毒核酸的提取试剂由蛋白酶K溶液、裂解液、磁珠液、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ、洗涤液Ⅲ及洗脱液组成，但在实际的使用过程中，消解酶通常成本较高，需要低温运输，增加了提取试剂的原料成本和运输的困难，同时消解酶需要单独进行添加，增加了核酸提取的复杂度。

虽然市面上的核酸提取试剂盒能满足对病毒核酸的提取需求，但提取试剂盒普遍提取时间长，提取时间大概在10-30min之间，如CN113926432A公布的试剂盒需要30min完成核酸提取，CN114438076A公布的试剂盒需要20min完成核酸提取，CN112458081A公布的试剂盒最快9min完成病毒核酸的提取。在病毒核酸提取上如果提取时间长，一方面容易造成病毒核酸的降解，会影响下游的准确度；另一方面在病毒核酸的提取过程中，如果提取流程耗时长，会增加操作人员的病毒感染风险，除了在操作便捷方面，还有一些核酸提取试剂盒中含有毒性较强的试剂，不利于使用者的身心健康。

基于目前市面上磁珠法核酸提取试剂盒存在的一些弊端，开发一款成本低、提取时间快、无毒的病毒核酸提取试剂盒能方便使用者的操作与体验。

发明内容

本发明提供一种核酸提取组合物，该组合物可实现对核酸样本的高效裂解，同时能促进核酸与磁珠进行一步的结合，实现核酸高效提取回收；本发明还提供一种核酸提取方法，通过裂解、漂洗、洗脱三步简化了传统病毒核酸提取多步的流程，实现病毒DNA/RNA共提取，且可将整个提取时间控制在6min之内，提高核酸提取效率。

本发明的第一方面提供一种组合物，所述组合物包括聚丙烯酰胺、硫酸铝、甜菜碱、Tris、EDTA钠盐或其水合物、PEG8000、异硫氰酸胍、月桂醇聚氧乙烯醚、异丙醇、吐温。

在一些实施方案中，所述组合物中硫酸铝质量体积分数为0.1％-10％，例如0.1％、0.3％、0.5％、0.7％、0.9％、1％、2％、3％、5％、7％、10％；优选地，所述组合物中硫酸铝质量体积分数为1％。

在一些实施方案中，所述组合物中的聚丙烯酰胺质量体积分数为0.001％-0.1％，例如0.001％、0.01％、0.015％、0.02％、0.025％、0.03％、0.035％、0.04％、0.045％、0.05％、0.07％、0.1％；优选地，所述组合物中的聚丙烯酰胺质量体积分数为0.025％。

在一些实施方案中，所述组合物中的甜菜碱浓度为0.05mM-5mM，例如0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、3mM、5mM；优选地，所述组合物中的甜菜碱浓度为0.5mM。

在一些实施方案中，所述组合物中的Tris浓度为10mM-1M，例如10mM、30mM、50mM、70mM、90mM、100mM、120mM、150mM、200mM、500mM、700mM、1M；优选地，所述组合物中的Tris浓度为100mM。

在一些实施方案中，所述组合物中的EDTA钠盐或其水合物为EDTA·2Na·2H₂O，其浓度为1mM-100mM，例如1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、50mM、70mM、100mM；优选地，所述组合物中的EDTA·2Na·2H₂O浓度为25mM。

在一些实施方案中，所述组合物中的PEG8000质量体积分数为0.01％-1％，例如0.01％、0.05％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.4％、0.6％、0.8％、1％；优选地，所述组合物中的PEG8000质量体积分数为0.1％。

在一些实施方案中，所述组合物中的异硫氰酸胍浓度为0.5M-10M，例如0.5M、1M、2M、3M、4M、5M、6M、7M、8M、9M、10M；优选地，所述组合物中的异硫氰酸胍浓度为5M。

在一些实施方案中，所述组合物中的月桂醇聚氧乙烯醚质量体积分数为0.01％-1％，例如0.01％、0.05％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.4％、0.6％、0.8％、1％；优选地，所述组合物中的月桂醇聚氧乙烯醚质量体积分数为0.1％。

在一些实施方案中，所述组合物中的异丙醇体积分数为10％-80％，例如10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％；优选地，所述组合物中的异丙醇体积分数为35％。

在一些实施方案中，所述组合物中的吐温20体积比为0.001％-0.1％，例如0.001％、0.005％、0.007％、0.008％、0.009％、0.01％、0.015％、0.02％、0.025％、0.03％、0.04％、0.06％、0.08％、0.1％；优选地，所述组合物中的吐温20体积分数为0.01％。

在一些实施方案中，所述组合物中硫酸铝质量体积分数为1％、聚丙烯酰胺质量体积分数为0.025％、甜菜碱浓度为0.5mM、Tris浓度为100mM、EDTA·2Na·2H₂O浓度为25mM、PEG8000质量体积分数为0.1％、异硫氰酸胍浓度为5M、月桂醇聚氧乙烯醚质量体积分数为0.1％、异丙醇体积分数为35％、吐温20体积分数为0.01％。

在一些实施方案中，所述组合物的pH范围为7-9，例如pH为7、7.5、8、8.5、9；优选地，所述组合物的pH为8。

在一些实施方案中，所述组合物作为核酸提取试剂用于核酸提取的用途。

在一些实施方案中，所述组合物作为核酸提取试剂用于磁珠法核酸提取的用途。

在一些实施方案中，所述组合物作为核酸提取试剂用于病毒核酸提取的用途。

在一些实施方案中，所述组合物作为核酸提取试剂用于磁珠法病毒核酸提取的用途。

本发明的第二方面提供一种核酸提取方法，所述方法包括使用本发明的第一方面所述组合物裂解核酸样本的步骤。

在一些实施方案中，所述核酸样本包括且不限于血液样本、组织样本、口腔样本、粪便样本。

在一些实施方案中，所述核酸提取方法中使用磁珠提取样本裂解后的核酸；优选地，提取样本裂解后的病毒核酸。

在一些实施方案中，所述核酸提取方法还包括漂洗和洗脱步骤。

在一些实施方案中，所述漂洗步骤中使用的漂洗液包括Tris-base、氯化钠、异丙醇和盐酸胍。

在一些实施方案中，所述漂洗液中的Tris浓度为5mM-500mM，例如5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、300mM、500mM；优选地，所述漂洗液中的Tris浓度为50mM。

在一些实施方案中，所述漂洗液中的氯化钠浓度为10mM-1M，例如10mM、30mM、50mM、70mM、90mM、100mM、120mM、150mM、200mM、500mM、700mM、1M；优选地，所述漂洗液中的氯化钠浓度为100mM。

在一些实施方案中，所述漂洗液中的异丙醇体积分数为10％-80％，例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％；优选地，所述漂洗液中的异丙醇体积分数为60％。

在一些实施方案中，所述漂洗液中的盐酸胍浓度为100mM-10M，例如100mM、500mM、700mM、800mM、900mM、1M、2M、3M、5M、7M、10M；优选地，所述漂洗液中的盐酸胍浓度为1M。

在一些实施方案中，所述漂洗液中的Tris浓度为50mM、氯化钠浓度为100mM、异丙醇体积分数为60％、盐酸胍浓度为1M。

在一些实施方案中，所述漂洗液的pH范围为7-9，例如7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、8、9；优选地，所述漂洗液的pH为7。

在一些实施方案中，所述洗脱步骤中使用的洗脱液包括Tris-HCl、EDTA和无核酸酶的蒸馏水。

在一些实施方案中，所述洗脱液中的Tris-HCl浓度为0.1mM-5mM，例如0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、3mM、5mM；优选地，所述洗脱液中的Tris-HCl浓度为0.5mM。

在一些实施方案中，所述洗脱液中的EDTA浓度为0.1mM-5mM，例如0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、3mM、5mM；优选地，所述洗脱液中的EDTA浓度为0.5mM。

在一些实施方案中，所述洗脱液中的Tris-HCl浓度为0.5mM，EDTA浓度为0.5mM。

在一些实施方案中，所述洗脱液的pH范围为7-9，例如7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、8、9；优选地，所述洗脱液的pH为7。

本发明的第三方面提供一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述组合物。

在一些实施方案中，所述试剂盒还包括磁珠；优选地，所述磁珠为超顺磁性氧化硅羟基纳米微球，直径为20-1000nm、浓度为10-100mg/mL。

在一些实施方案中，所述试剂盒还包括漂洗液和洗脱液。

在一些实施方案中，所述漂洗液包括Tris、氯化钠、异丙醇和盐酸胍；优选地，所述漂洗液中的Tris浓度为50mM，氯化钠浓度为100mM，异丙醇体积比为60％，盐酸胍浓度为1M，pH为7。

在一些实施方案中，所述洗脱液包括Tris-HCl、EDTA和无核酸酶的蒸馏水；优选地，所述洗脱液中的Tris-HCl浓度为0.5mM，EDTA浓度为0.5mM，pH为7。

在一些实施方案中，所述试剂盒还包括实施本发明所述方法需要的其他试剂。

附图说明

图1：荧光定量PCR检测猪小肠浸出液、血液和口腔拭子ASFV核酸提取结果；

图2：荧光定量PCR检测猪小肠浸出液、血液和口腔拭子PEDV核酸提取结果；

图3：荧光定量PCR检测本发明试剂盒与对照试剂盒对血液ASFV核酸提取结果；

图4：荧光定量PCR检测本发明试剂盒与对照试剂盒对血液PEDV核酸提取结果。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

以下实施例中，若无特殊说明，所用试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。

实施例1：

用核酸自动化提取仪对采集的猪小肠浸出液、血液和口腔拭子病毒DNA和RNA进行提取，对提取后的DNA和RNA核酸进行病毒ASFV/PEDV检测。

(1)DNA和RNA核酸提取

分别采集猪小肠浸出液1ml、猪全血血液1ml、猪口腔拭子1ml，使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司VNP-32P核酸自动提取仪，提取样本中的病毒DNA和病毒RNA。

样本添加：在96孔深孔板第1列的1、2和3孔中各加入200μl猪小肠浸出液；在第1列的4、5和6孔中各加入200μl猪全血血液；在第7列的1、2和3孔中各加入200μl猪口腔拭子。样本添加好后将96深孔板放入核酸提取仪中，装上磁棒套，确认磁棒套安装到位，按表1程序进行自动化提取。

其中96孔板每列组分说明如下：

第1、7列全部孔位：裂解液600μL；

第2、8列全部孔位：磁珠液700μL(Vazyme，RM401)；

第5、11列全部孔位：漂洗液700μL；

第6、12列全部孔位：洗脱液80μL；

其中，裂解液、漂洗液和洗脱液的组分如下：

裂解液：100mM Tris、25mM EDTA·2Na·2H₂O、1％硫酸铝(质量体积分数)、0.1％PEG8000(质量体积分数)、5M异硫氰酸胍(质量体积分数)、0.1％月桂醇聚氧乙烯醚(质量体积分数)、35％异丙醇(体积分数)、0.5mM甜菜碱、0.01％吐温-20(体积分数)、0.025％聚丙烯酰胺(质量体积分数)、pH8；

漂洗液：50mM Tris、100mM氯化钠、60％异丙醇(体积分数)、1M盐酸胍、pH7；

洗脱液：0.5mM Tris-HCl、0.5mM EDTA、无核酸酶的水、pH 7。

表1VNP-32P核酸自动提取仪程序设置

(2)提取后的核酸进行Q-PCR检测

三种样本经过核酸提取仪提取后，将每个样本3个重复提取的核酸产物进行Q-PCR检测，每个提取产物进行3个重复检测。使用表6中的引物探针序列分别对ASFV和PEDV进行Q-PCR检测，每个样本提取后的核酸均按照表2-表5体系及程序进行Q-PCR反应，每个反应做三个重复。

表2ASFV病毒检测Q-PCR反应体系

表3ASFV病毒检测Q-PCR反应程序

表4PEDV病毒检测Q-PCR反应体系

<![CDATA[RNase-free ddH<sub>2</sub>O]]>	to30μl
		<![CDATA[2×One Step U<sup>+</sup>Mix(Vazyme，Q222-CN)]]>	15μl
<![CDATA[One Step U<sup>+</sup>Enzyme Mix(Vazyme，Q222-CN)]]>	1.5μl
		50×ROX Reference Dye1(Vazyme，Q222-CN)	0.6μl
PEDV-F Primer(10μM)	0.6μl
		PEDV-R Primer(10μM)	0.6μl
PEDV Probe(10μM)	0.3μl
		小肠浸出液/血液/口腔拭子核酸提取产物	5μl

表5PEDV病毒检测Q-PCR反应程序

表6ASFV和PEDV病毒检测引物探针序列

(3)ASFV和PEDV病毒检测Q-PCR结果

附图1、附图2和表7是三份不同样本核酸提取后ASFV和PEDV的Q-PCR检测结果，附图1为猪小肠浸出液、血液和口腔拭子核酸样本ASFV病毒荧光定量PCR检测结果，附图2为猪小肠浸出液、血液和口腔拭子核酸样本PEDV病毒荧光定量PCR检测结果，表7为ASFV和PEDV的Q-PCR检测CT值。以上结果可知，通过本发明所述裂解液、漂洗液和洗脱液对三种不同样本提取核酸产物ASFV和PEDV病毒检测重复性好。

表7三种不同核酸提取产物ASFV和PEDV病毒检测CT值

实施例2：

按照实施例1所述方法，使用实施例1中的裂解液、漂洗液和洗脱液，或使用西安天隆科技有限公司产品T101，分别使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司VNP-32P核酸自动提取仪，对200μl猪全血血液样本进行病毒DNA和病毒RNA核酸提取，并对提取后的核酸产物分别取5μl进行Q-PCR检测ASFV和PEDV。

实验结果见附图3、附图4和表8，附图3为两种提取试剂对血液样本提取后检测ASFV病毒Q-PCR结果，附图4为两种提取试剂对血液样本提取后检测PEDV病毒Q-PCR结果，表8为两种提取试剂提取产物的Q-PCR检测CT值。

由以上结果可以看出，在ASFV病毒检测结果中，使用本发明裂解液、漂洗液和洗脱液最终获得的CT值与天隆核酸提取产品最终获得的CT值相当，在PEDV病毒检测结果中，使用本发明裂解液、漂洗液和洗脱液最终获得的CT值比使用天隆核酸提取产品最终获得的CT值低约2.21，说明本发明的裂解液、漂洗液和洗脱液在病毒RNA上的提取浓度更高。

表8两种不同试剂提取血液样本后ASFV和PEDV病毒检测CT值

Claims

1.一种组合物，所述组合物包括聚丙烯酰胺、硫酸铝、甜菜碱、Tris、EDTA钠盐或其水合物、PEG8000、异硫氰酸胍、月桂醇聚氧乙烯醚、异丙醇和吐温。

2.权利要求1的组合物，所述组合物中硫酸铝质量体积分数为0.1％-10％、聚丙烯酰胺质量体积分数为0.001％-0.1％、甜菜碱浓度为0.05mM-5mM、Tris浓度为10mM-1M、EDTA钠盐或其水合物为EDTA·2Na·2H₂O、其浓度为1mM-100mM、PEG8000质量体积分数为0.01％-1％、异硫氰酸胍浓度为0.5M-10M、月桂醇聚氧乙烯醚质量体积分数为0.01％-1％、异丙醇体积分数为10％-80％、吐温20体积比为0.001％-0.1％。

3.权利要求2的组合物，所述组合物中硫酸铝质量体积分数为1％、聚丙烯酰胺质量体积分数为0.025％、甜菜碱浓度为0.5mM、Tris浓度为100mM、EDTA·2Na·2H₂O浓度为25mM、PEG8000质量体积分数为0.1％、异硫氰酸胍浓度为5M、月桂醇聚氧乙烯醚质量体积分数为0.1％、异丙醇体积分数为35％、吐温20体积分数为0.01％。

4.权利要求1-3任一项所述的组合物，所述组合物的pH范围为7-9；优选所述组合物的pH为8。

5.一种核酸提取方法，所述方法包括使用权利要求1-4任一项所述组合物裂解核酸样本的步骤；优选所述核酸为病毒DNA或病毒RNA；更优选所述病毒DNA为ASFV，所述病毒RNA为PEDV。

6.权利要求5的核酸提取方法，所述核酸样本选自血液样本、组织样本、口腔样本和粪便样本中的至少一种。

7.权利要求5的核酸提取方法，其中使用磁珠提取样本裂解后的核酸；优选使用磁珠提取样本裂解后的病毒核酸。

8.权利要求5的核酸提取方法，所述核酸提取方法还包括漂洗和洗脱步骤。

9.权利要求8的核酸提取方法，所述漂洗步骤中使用的漂洗液包括5mM-500mM浓度的Tris、体积比为10％-80％的异丙醇、100mM-10M浓度的盐酸胍。

10.权利要求9的核酸提取方法，所述漂洗液中的Tris浓度为50mM、氯化钠浓度为100mM、异丙醇体积比为60％、盐酸胍浓度为1M。

11.权利要求9或10任一项所述的核酸提取方法，所述漂洗液pH范围为7-9；优选所述漂洗液的pH为7。

12.权利要求8的核酸提取方法，所述洗脱步骤中使用的洗脱液包括0.1mM-5mM浓度的Tris-HCl、0.1mM-5mM浓度的EDTA和无核酸酶的蒸馏水。

13.权利要求12的核酸提取方法，所述洗脱液中的Tris-HCl浓度为0.5mM，EDTA浓度为0.5mM。

14.权利要求12或13任一项所述的核酸提取方法，所述洗脱液pH范围为7-9；优选所述洗脱液的pH为7。

15.一种试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1-4任一项所述的组合物。

16.权利要求15的试剂盒，所述试剂盒还包括磁珠；优选所述磁珠为超顺磁性氧化硅羟基纳米微球，所述磁珠的直径为20-1000nm，所述磁珠的浓度为10-100mg/mL。

17.权利要求15或16任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包括漂洗液和洗脱液；所述漂洗液包括浓度为50mM的Tris、浓度为100mM的氯化钠、体积比为60％的异丙醇、浓度为1M的盐酸胍，所述漂洗液的pH为7；所述洗脱液包括浓度为0.5mM的Tris-HCl、浓度为0.5mM的EDTA，所述洗脱液的pH为7。

18.权利要求1-4任一项所述组合物作为核酸提取试剂用于核酸提取的用途；优选用于磁珠法核酸提取的用途；更优选用于磁珠法病毒核酸提取的用途。