CN116926064B

CN116926064B - 一种核酸提取试剂盒及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN116926064B
Application number: CN202311067840.5A
Authority: CN
Inventors: 陆亚平; 魏光; 曹现涛; 侯龙辉; 陈威; 孙堃; 李彬; 郭琼钰; 周雪; 王蓉
Original assignee: Sinopharm Wuhan Precision Medical Technology Co ltd
Current assignee: Sinopharm Wuhan Precision Medical Technology Co ltd
Priority date: 2023-08-23
Filing date: 2023-08-23
Publication date: 2024-01-02
Anticipated expiration: 2043-08-23
Also published as: CN116926064A

Abstract

本申请提供了一种核酸提取试剂盒及其制备方法和应用，该核酸提取试剂盒包括预分装试剂板，预分装试剂板内装有含磁珠的裂解结合液、洗涤液1、洗涤液2和洗脱液；含磁珠的裂解结合液中含有以下成分：盐酸胍10～50％，EDTA 2～20mM，Tris 2～20mM，NP‑405～20％，无水乙醇20～50％，磁珠2～6％；洗涤液1中含有以下成分：盐酸胍10～30％，Tris 2～20mM，NP‑405～20％，无水乙醇20～60％。本申请在含磁珠的裂解结合液和洗涤液中加入NP‑40，可极大提高裂解效率并提高杂质去除率，提高了游离核酸的提取得率。本申请的核酸提取试剂盒搭配磁珠法全自动核酸提取仪使用，操作方法简单、安全，可实现对多个样本的同时提取检测，且抑制物质残留少，提高游离核酸的提取效率。

Description

一种核酸提取试剂盒及其制备方法和应用

技术领域

本申请属于核酸提取技术领域，更具体地说，是涉及一种核酸提取试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术

游离循环核酸(Free circulating nucleic acids)是一种存在于动植物和人体液中的细胞外游离状态的核酸，已发现的游离循环核酸包括游离循环DNA和游离循环RNA。其中，游离循环DNA，即Cell-free DNA，是一种无细胞状态的胞外DNA，广泛存在于人体的血清、血浆、滑膜液和脑脊液等体液中，其主要是由单链或双链DNA以及单链与双链DNA的混合物组成，以DNA-蛋白质复合物或游离DNA这两种形式存在。

近年来，对游离循环核酸研究的不断深入，特别是对循环DNA的检测已经在疾病监控、胎儿产前诊断和肿瘤研究中取得众多进展。利用羊膜穿刺、绒毛膜活检等技术获取胎儿遗传物质进行产前诊断对孕妇和胎儿均有创伤性，容易造成感染、出血甚至流产。胎儿游离DNA的发现为无创性产前诊断开辟了新的途径，但孕妇血浆中的胎儿游离DNA含量较低，临床检测胎儿游离DNA往往需要分离孕妇外周血中的胎儿红细胞，或先富集胎儿DNA再进行DNA提取，操作繁琐、耗时。

游离DNA提取方法一般有Trizol方法、离心柱法、磁珠法。其中，Trizol方法因其对操作者带来的毒性，现在越来越被弃用。磁珠法比较适合机器自动化提取，适合较多样本的高通量处理，但磁珠法的核酸提取得率不如离心柱法。然而离心柱法很难实现完全的自动化提取，不适合大量样本的处理，通量受限。

发明内容

本申请的目的在于提供一种核酸提取试剂盒及其制备方法和应用，以解决现有技术中的游离DNA提取方法操作繁琐、使用有毒试剂、核酸提取得率较低的技术问题。

为实现上述目的，本申请的第一方面，提供了一种核酸提取试剂盒，包括预分装试剂板，所述预分装试剂板内装有含磁珠的裂解结合液、洗涤液1、洗涤液2和洗脱液；

所述含磁珠的裂解结合液中含有以下成分：盐酸胍10～50％，EDTA 2～20mM，Tris2～20mM，NP-405～20％，无水乙醇20～50％，磁珠2～6％；

所述洗涤液1中含有以下成分：盐酸胍10～30％，Tris 2～20mM，NP-405～20％，无水乙醇20～60％。

进一步地，所述洗涤液2中含有以下成分：10mM Tris/NaCl、体积百分比为80％的乙醇。

进一步地，所述洗脱液中含有以下成分：10mM Tris。

进一步地，还包括蛋白酶K试剂和Carrier RNA试剂。

进一步地，所述蛋白酶K试剂中蛋白酶K浓度为10～20mg/ml；和/或所述CarrierRNA试剂中Carrier RNA浓度为0.05～0.2mg/mL。

进一步地，所述含磁珠的裂解结合液中含有30～40％的盐酸胍和5～10％的NP-40。

进一步地，所述洗涤液1中含有10～20％的盐酸胍和5～10％的NP-40。

进一步地，所述预分装试剂板的第一列和第二列深孔板内装有所述含磁珠的裂解结合液，第三列深孔板内装有所述洗涤液1，第四列和第五列深孔板内装有洗涤液2，第六列深孔板内装有所述洗脱液。

本申请的第二方面，提供了一种核酸提取试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

在预分装试剂板的深孔板内分别分装含磁珠的裂解结合液、洗涤液1、洗涤液2和洗脱液；

利用热封仪将所述预分装试剂板封住。

本申请的第三方面，提供了一种核酸提取试剂盒在核酸提取中的应用，包括以下步骤：

向预分装试剂板的含磁珠的裂解结合液中加入待检测核酸样本、蛋白酶k试剂和Carrier RNA试剂；

将所述预分装试剂板放到磁珠法全自动核酸提取仪中，插入磁套；

选择对应的核酸提取程序，运行提取程序；

自动化程序结束后，取出所述预分装试剂板和磁套，检测所述预分装试剂板的洗脱液中核酸浓度。

与现有技术相比，本申请具有以下的技术效果：

本申请的一种核酸提取试剂盒通过优化含磁珠的裂解结合液和洗涤液的配方，在含磁珠的裂解结合液和洗涤液中加入NP-40，可极大提高裂解效率并提高杂质去除率，提高了游离核酸的提取得率。

本申请的一种核酸提取试剂盒不使用氯仿、苯酚等有毒试剂，提高使用安全性。

本申请的一种核酸提取试剂盒搭配磁珠法全自动核酸提取仪使用，操作方法简单、安全，可实现对多个样本的同时提取检测，且抑制物质残留少，提高游离核酸的提取效率。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为使用凯杰游离DNA试剂盒提取血浆样本的核酸，进行建库后，利用安捷伦2100生物分析仪检测构建文库峰图；

图2为使用本申请实施例的核酸提取试剂盒提取血浆样本的核酸，进行建库后，利用安捷伦2100生物分析仪检测构建文库峰图。

具体实施方式

为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。

在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。

术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，用来将目的如物质彼此区分开，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。例如，在不脱离本申请实施例范围的情况下，第一XX也可以被称为第二XX，类似地，第二XX也可以被称为第一XX。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。

本申请实施例提供了一种核酸提取试剂盒，包括预分装试剂板，该预分装试剂板内装有含磁珠的裂解结合液、洗涤液1、洗涤液2和洗脱液；

其中，含磁珠的裂解结合液中含有以下成分：盐酸胍10～50％，EDTA 2～20mM，Tris 2～20mM，NP-405～20％，无水乙醇20～50％，磁珠2～6％；以含有30～40％质量浓度的盐酸胍和5～10％质量浓度的NP-40的裂解结合液效果最佳。

洗涤液1中含有以下成分：盐酸胍10～30％，Tris 2～20mM，NP-405～20％，无水乙醇20～60％。以含有10～20％质量浓度的盐酸胍和5～10％质量浓度的NP-40的洗涤液1效果最佳。

本申请实施例的含磁珠的裂解结合液中，盐酸胍能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离。在通常使用的蛋白质变性剂中作用最强的是盐酸胍，可以使多数蛋白质转换成一种随机的卷曲状态。含有较强的阴离子和阳离子基团，可以形成较强的氢键。在该含磁珠的裂解结合液中，磁珠是以纳米生物磁珠为载体的一种新型核酸提取技术，核酸分子可与磁珠表面的硅羟基发生特异性识别与结合，在外部磁场的作用下发生聚集和分散，彻底摆脱传统核酸提取过程中离心、抽取上清液等手工操作流程，从而实现核酸的自动化提取，广泛应用于临床疾病诊断、法医学鉴定等多种领域。本申请实施例的磁珠溶液为MPG-100(购于广州美基生物科技有限公司)，磁珠含量为40mg/mL。

本申请实施例的一种核酸提取试剂盒通过优化含磁珠的裂解结合液和洗涤液1的配方，在含磁珠的裂解结合液中加入NP-40，可极大地提高裂解效率；同时在洗涤液1中加入NP-40，可提高杂质去除率，最终可提高游离核酸的提取得率。

在本申请实施例中，洗涤液2中含有以下成分：10mM Tris/NaCl、体积百分比为80％的乙醇。

洗脱液为EB洗脱液，含有以下成分：10mM Tris。

本申请实施例的核酸提取试剂盒还包括蛋白酶K试剂和Carrier RNA(Poly A)试剂。其中，蛋白酶K试剂中蛋白酶K浓度为10～20mg/ml；Carrier RNA(Poly A)试剂中Carrier RNA浓度为0.05～0.2mg/mL。蛋白酶K是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键。此酶经纯化去除了RNA酶和DNA酶活性。CarrierRNA(Poly A)是助沉剂，显著提高血浆游离DNA提取效率的同时对下游实验(PCR、高通量测序实验)无不利影响，对高通量测序结果的生物信息学分析无干扰。

在本申请实施例中，以96(8*12)孔板的预分装试剂板为例进行说明，该预分装试剂的第一列和第二列深孔板内装有含磁珠的裂解结合液，第三列深孔板内装有洗涤液1，第四列和第五列深孔板内装有洗涤液2，第六列深孔板内装有洗脱液。同样，第七列和第八列深孔板内装有含磁珠的裂解结合液，第九列深孔板内装有洗涤液1，第十列和第十一列深孔板内装有洗涤液2，第十二列深孔板内装有洗脱液，具体如下表1所示。

表1

在上表1中，第1/7列(即第1列或第7列)含磁珠的裂解结合液含有以下成分：盐酸胍40％，EDTA 10mM，Tris 20mM，NP-4010％，无水乙醇50％，15uL磁珠。

第2/8列含磁珠的裂解结合液的成分含量同第1/7列。本申请实施例中，每个样本均分到两列孔板中进行裂解，以使得裂解更充分，例如，将一个500uL的样本均分成两份，各自250uL，然后分别将这两个250uL的样本加到第1列、第2列的孔板中进行裂解。

第3/9列洗涤液1含有以下成分：盐酸胍20％，Tris 20mM，NP-4010％，无水乙醇56％。

第4/10列洗涤液2含有以下成分：10mM Tris/NaCl、体积百分比为80％的乙醇。

第5/11列洗涤液2含有以下成分：10mM Tris/NaCl、体积百分比为80％的乙醇。每个样本经历两次洗涤液2的洗涤，以更充分地去除盐离子。

第6/12列洗脱液含有以下成分：10mM Tris。

第二方面，本申请实施例提供了一种上述核酸提取试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

在预分装试剂板的深孔板内分别分装含磁珠的裂解结合液、洗涤液1、洗涤液2和洗脱液；具体，可参见表1进行分装；

分装后利用热封仪将预分装试剂板封住。

本申请实施例的一种核酸提取试剂盒不使用氯仿、苯酚等有毒试剂，提高使用安全性。本申请实施例的一种核酸提取试剂盒搭配磁珠法全自动核酸提取仪使用，操作方法简单、安全，可实现对多个样本的同时提取检测，且抑制物质残留少，提高游离核酸的提取效率。

使用凯杰游离DNA试剂盒提取血浆样本的核酸，进行建库后，利用安捷伦2100生物分析仪检测构建文库峰图，得到图1；使用本申请实施例的核酸提取试剂盒(包括表1所示的预分装试剂板、蛋白酶K浓度为20mg/ml的蛋白酶K试剂20uL、Carrier RNA浓度为0.1mg/mL的Carrier RNA(Poly A)试剂10uL)提取血浆样本的核酸，进行建库后，利用安捷伦2100生物分析仪检测构建文库峰图，得到图2。

如图1和图2对比所示，图2中的小片的峰型比较集中，大片段峰型较少，本申请实施例的核酸提取试剂比凯杰的提取试剂在大片段的文库有明显减少，说明本申请实施例的的核酸提取试剂可以有效减少大片段DNA等其他核酸的污染，提高测序数据的有效性。

分别使用本申请实施例的核酸提取试剂盒(实验组，该试剂盒包括表1所示的预分装试剂板、蛋白酶K浓度为20mg/ml的蛋白酶K试剂20uL、Carrier RNA浓度为0.1mg/mL的Carrier RNA(Poly A)试剂10uL)和凯杰游离DNA试剂盒(对照组)提取16份血浆样本的核酸，并在Qubit荧光定量仪上检测提取的核酸浓度，计算各自的核酸提取得率，结果如下表2、表3所示。

表2

表3

在本申请实施例中，核酸提取具体包括以下步骤：

1、取出预分装试剂板，去除封口膜；

2、分别在第1/7列和第2/8列的孔位内加入10uL Carrier RNA(PolyA)、20uL蛋白酶k，以及250uL样本(每个样本加入的总体积为500uL)；

3、打开磁珠法全自动核酸提取仪，将加入样本的预分装试剂板放入提取仪中，然后插入磁套；

4、选择对应的核酸提取程序，运行提取程序；

5、自动化程序结束后，取出预分装试剂板和磁套，将第6/12列提取得到的核酸溶液取出进行下一步检测或保存于-20±5℃。

步骤4的核酸提取程序如下表4：

表4

从表2、表3中看到，本申请实施例的核酸提取试剂盒的核酸提取得率明显高于对照组的提取试剂盒，表明本申请实施例的核酸提取试剂盒对临床血浆样本的提取优于凯杰游离DNA提取试剂盒。

本申请实施例还对含磁珠的裂解结合液中各组分的浓度进行实验，含磁珠的裂解结合液的不同配方如下表5所示，使用下表5中的不同配方的裂解结合液按照上述所述的方法对同一份混合血浆样本分别进行游离DNA的提取，提取后进行Qubit荧光定量仪检测浓度，计算提取得率。结果如表5所示。表5中的裂解结合液配方除盐酸胍和NP-40含量变化外，其他成分含量同表1。

表5裂解结合液(磁珠)中各浓度对游离DNA提取得率的影响

由上表5可知，针对本实验所用的血浆样本，由10～50％浓度的盐酸胍和浓度为5～20％的NP-40组成的裂解液均能满足测序所需文库浓度，但以30～40％浓度的盐酸胍和5～10％的NP-40组成的裂解液效果最佳。

本申请实施例还对洗涤液1中各组分的浓度进行实验，洗涤液1的不同配方如下表6所示，使用下表6中的不同配方的洗涤液1按照上述所述的方法对同一份混合血浆样本分别进行游离DNA的提取，提取后进行Qubit荧光定量仪检测浓度，计算提取得率。结果如表6所示。表6中的洗涤液1配方除盐酸胍和NP-40含量变化外，其他成分含量同表1。

表6洗涤液1中各浓度对游离DNA提取得率的影响

由上表6可知，针对本实验所用的血浆样本，由10～30％浓度的盐酸胍和浓度为5～20％的NP-40组成的洗涤液1均能满足测序所需文库浓度，但以10～20％浓度的盐酸胍和5～10％的NP-40组成的洗涤液1去除杂质效果最好，提取得率最佳。

以上实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种血浆游离DNA提取试剂盒，其特征在于，包括预分装试剂板，所述预分装试剂板内装有含磁珠的裂解结合液、洗涤液1、洗涤液2和洗脱液；

所述含磁珠的裂解结合液中各成分分别为：盐酸胍30～40％，EDTA2～20mM，Tris 2～20mM，NP-405～10％，无水乙醇20～50％，磁珠2～6％；

所述洗涤液1中各成分分别为：盐酸胍10～20％，Tris 2～20mM，NP-405～10％，无水乙醇20～60％；

所述试剂盒还包括蛋白酶K试剂和Carrier RNA试剂。

2.如权利要求1所述的一种血浆游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述洗涤液2中各成分分别为：10mM Tris/NaCl、体积百分比为80％的乙醇。

3.如权利要求1所述的一种血浆游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述洗脱液中成分为：10mM Tris。

4.如权利要求1所述的一种血浆游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述蛋白酶K试剂中蛋白酶K浓度为10～20mg/ml；和/或所述Carrier RNA试剂中CarrierRNA浓度为0.05～0.2mg/mL。

5.如权利要求1-4任一项所述的一种血浆游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述预分装试剂板的第一列和第二列深孔板内装有所述含磁珠的裂解结合液，第三列深孔板内装有所述洗涤液1，第四列和第五列深孔板内装有洗涤液2，第六列深孔板内装有所述洗脱液。

6.如权利要求1-5任一项所述的一种血浆游离DNA提取试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

利用热封仪将所述预分装试剂板封住。

7.如权利要求1-5任一项所述的一种血浆游离DNA提取试剂盒在血浆游离DNA提取中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

选择对应的核酸提取程序，运行提取程序；