CN117143857A - 一种游离dna提取裂解液及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种游离DNA提取裂解液及试剂盒。一种游离DNA提取裂解液，其特征在于，所述裂解液包括表面活性剂；所述表面活性剂包括异丙醇酰胺、SDS、TritonX‑100或Tween 20。可以有效提高对游离DNA的裂解效率、操作简单、重复性好、具有较高的提取效率。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其是涉及一种游离DNA提取裂解液及试剂盒。
背景技术
游离DNA简称cfDNA(circulating free DNA)，是指循环血液中的核酸类物质。包括循环血液中细胞内的核酸，游离的内源性脱氧核糖核酸和外源性DNA与RNA。血清、血浆中存在的游离DNA(cfDNA)可用于肿瘤相关的疾病诊断、产前无创检查等临床检测，具有重要的临床意义。
目前针对血清、血浆游离DNA提取的方法有多种，传统的酚-氯仿法通过酚、氯仿和异戊醇来变性蛋白质使其沉降，并使液体分层，再用乙醇等沉淀离心，达到提取目的，但上述有机溶剂有一定的毒性，不利于技术人员操作，而且在提取过程中cfDNA的丢失率达到70％-80％，且该方法操作复杂，步骤烦琐，容易发生污染，需要消耗较多的人力及时间；硅胶膜吸附柱法可以处理大体积样本，但需繁琐的手动操作流程，不适用于自动化提取流程；而磁珠法提取能够实现自动化、大批量操作，具有操作简单、用时短等优势。
在利用磁珠法提取样本中游离DNA的过程中，由于与试剂体系接触的耗材通常带有静电，游离DNA与耗材间的静电作用会导致部分核酸分子吸附残留在耗材壁上而损失，降低了核酸提取的得率；此外，核酸DNA分子带有相同的电荷，分子间具有一定的静电斥力，不利于核酸分子在磁珠表面的聚集吸附，从而影响游离DNA提取的得率；同时，游离DNA在血清、血浆样本中的含量较低，且样本中存在大量的干扰物，使得高效地提取富集游离DNA成为一个难题。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种游离DNA提取裂解液及试剂盒。可以有效提高对游离DNA的裂解效率、操作简单、重复性好、具有较高的提取效率。
为此，本发明第一方面提供了一种游离DNA提取裂解液，所述裂解液包括表面活性剂；所述表面活性剂包括异丙醇酰胺、SDS、TritonX-100或Tween 20。
根据本发明，所述表面活性剂为异丙醇酰胺。
在本发明的一些实施方式中，所述裂解液还包括阴离子型抗静电剂；所述阴离子型抗静电剂包括对壬基苯氧基丙基磺酸钠、聚丙烯酸钠、顺丁烯二酸酐或聚苯乙烯苯磺酸。
根据本发明，所述阴离子型抗静电剂为对壬基苯氧基丙基磺酸钠。
在本发明的一些实施方式中，所述裂解液中表面活性剂的质量百分含量为0.2％-2％；优选为0.2％-1.6％。在一些例子中，所述裂解液中对壬基苯氧基丙基磺酸钠的质量百分含量包括但不限于：0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％或2％。
在本发明的一些实施方式中，所述裂解液中阴离子型抗静电剂的质量百分含量为0.2％-2％；优选为0.2％-1.6％。在一些例子中，所述裂解液中异丙醇酰胺的质量百分含量包括但不限于：0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％或2％。
在本发明的一些实施方式中，所述裂解液还包括1-100mmol/L的柠檬酸钠、5-50mmol/L的EDTA、0.5-2.5mol/L的NaCl、0.5-5mol/L的盐酸胍和质量百分含量为1％-4％的Span-80(司盘80乳化剂)。
优选地，所述裂解液包括20-80mmol/L的柠檬酸钠、10-25mmol/L的EDTA、0.6-2mol/L的NaCl、0.5-3.5mol/L的盐酸胍和质量百分含量为1％-3.5％的Span-80(司盘80乳化剂)。
在一些例子中，所述裂解液中柠檬酸钠的浓度包括但不限于：5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、40mmol/L、60mmol/L、80mmol/L或100mmol/L；所述裂解液中EDTA的浓度包括但不限于：5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L、30mmol/L、35mmol/L、40mmol/L、45mmol/L或50mmol/L；所述裂解液中NaCl的浓度包括但不限于：0.5mol/L、0.6mol/L、0.9mol/L、1.3mol/L、1.9mol/L、2.0mol/L或2.5mol/L；所述裂解液中盐酸胍的浓度包括但不限于：0.5mol/L、1.0mol/L、1.5mol/L、2.5mol/L、3.5mol/L或5.0mol/L；所述裂解液中Span-80的质量百分含量包括但不限于：1％、1.5％、2.5％、3.5％或4％。
在本发明的一些实施方式中，所述裂解液包括：质量百分含量为0.2％-2％的异丙醇酰胺、1-100mmol/L的柠檬酸钠、5-50mmol/L的EDTA、0.5-2.5mol/L NaCl、0.5-2.5mol/L盐酸胍和质量百分含量为1％-4％的Span-80。
在本发明的另一些实施方式中，所述裂解液包括：质量百分含量为0.2％-2％的异丙醇酰胺、质量百分含量为0.2％-2％的对壬基苯氧基丙基磺酸钠、1-100mmol/L的柠檬酸钠、5-50mmol/L的EDTA、0.5-2.5mol/L NaCl、0.5-2.5mol/L盐酸胍和质量百分含量为1％-4％的Span-80。
在裂解液中，柠檬酸钠能够维持待提取样品裂解后释放的核酸的稳定性，以避免核酸的降解，提高核酸的浓度和纯度，以保证后续操作的准确性；EDTA作为螯合剂，螯合样本中镁离子、钙离子等的干扰；异丙醇酰胺、SDS、TritonX-100或Tween 20可破坏细胞膜，盐酸胍可使蛋白变性、释放核酸，异丙醇酰胺、SDS、TritonX-100或Tween 20与盐酸胍、Span-80协同作用，增强裂解液对样本的裂解能力，提高提取效率；对壬基苯氧基丙基磺酸钠、聚丙烯酸钠、顺丁烯二酸酐或聚苯乙烯苯磺酸可以屏蔽试剂溶液储存耗材具备的静电、同时减弱游离DNA分子间的静电斥力，提高游离DNA的提取效率；氯化钠提供一定的盐浓度，促进核酸与磁珠的吸附结合。
本发明第二方面提供了一种游离DNA提取试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的裂解液。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括洗涤液A。
在本发明的一些实施方式中，所述洗涤液A包括10-100mmol/L的柠檬酸钠、5-20mmol/L的EDTA、0.5-2mol/L的NaCl、质量百分含量为0.1％-0.5％的月桂醇聚氧乙烯醚、0.5-2mol/L的盐酸胍和30％-90％体积比的异丙醇或无水乙醇。在洗涤液A中，柠檬酸钠与NaCl维持DNA的稳定；月桂醇聚氧乙烯醚、盐酸胍及异丙醇共同作用，可有效除掉有机物杂质。
优选地，所述洗涤液A包括20-80mmol/L的柠檬酸钠、5-15mmol/L的EDTA、0.5-1.5mol/L的NaCl、质量百分含量为0.1％-0.3％的月桂醇聚氧乙烯醚、0.5-1.5mol/L的盐酸胍和30％-80％体积比的异丙醇或无水乙醇。
更优选地，所述洗涤液A中包括30％-80％体积比的异丙醇。
在一些例子中，所述洗涤液A中柠檬酸钠的浓度包括但不限于：10mmol/L、20mmol/L、40mmol/L、60mmol/L、80mmol/L或100mmol/L；所述洗涤液A中EDTA的浓度包括但不限于：5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L或20mmol/L；所述洗涤液A中NaCl的浓度包括但不限于：0.5mol/L、1mol/L、1.5mol/L或2mol/L；所述洗涤液A中月桂醇聚氧乙烯醚的质量百分含量包括但不限于：0.1％、0.2％、0.25％、0.3％或0.5％；所述洗涤液A中盐酸胍的浓度包括但不限于：0.5mol/L、1mol/L、1.5mol/L或2mol/L；所述洗涤液A中异丙醇的体积比包括但不限于：30％、40％、50％、60％、70％或80％；或所述洗涤液A中无水乙醇的体积比包括但不限于：30％、40％、50％、90％。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括洗涤液B。
在本发明的一些实施方式中，所述洗涤液B包括0.5-5mmol/L的氢氧化钠；优选为1-3mmol/L。在一些例子中，所述洗涤液B中氢氧化钠的浓度包括但不限于：0.5mmol/L、1mmol/L、1.5mmol/L、2mmol/L、2.5mmol/L、3mmol/L、3.5mmol/L、4mmol/L、4.5mmol/L或5mmol/L。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括洗脱液。
在本发明的一些实施方式中，所述洗脱液包括0.1-100mmol/L的柠檬酸钠；优选为60-100mmol/L。在一些例子中，所述洗脱液中柠檬酸钠的浓度包括但不限于：0.1mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、30mmol/L、50mmol/L、60mmol/L、70mmol/L、80mmol/L、90mmol/L或100mmol/L。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括磁珠和磁珠稀释液。
在本发明的一些实施方式中，所述磁珠包括携带官能团的磁珠，所述磁珠浓度为15mg/ml。
在本发明的一些实施方式中，所述磁珠携带的官能团包括但不限于：氨基、羟基、羧基或硅羟基。
在本发明的一些实施方式中，所述磁珠稀释液包括0.5-5mol/L的氯化钠；优选为1-3mol/L。在一些例子中，所述磁珠稀释液中氯化钠的浓度包括但不限于：0.5mol/L、1mol/L、1.5mol/L、2mol/L、2.5mol/L、3mol/L、4mol/L或5mol/L。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括助沉剂。
在本发明的一些实施方式中，所述助沉剂包括0.1-10mg/mL的PolyA；优选为0.5-5mg/mL。在一些例子中，所述助沉剂中PolyA的浓度包括但不限于：0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL或10mg/mL。PolyA与生物源性的核酸沉淀助剂如糖原和tRNA相比，无核酸污染、DNA酶和RNA酶活性，同时不影响酶切、连接、转录、PCR、转化转染等。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括蛋白酶K溶液，所述蛋白酶K溶液包括丝氨酸蛋白酶K。丝氨酸蛋白酶K来自从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶，具有很高的比活性，也可直接使用商品化蛋白酶K溶液。
在本发明的一些实施方式中，所述丝氨酸蛋白酶K浓度为5mg/ml。
根据本发明，所述试剂盒包括：裂解液、洗涤液A、洗涤液B、洗脱液、磁珠、磁珠稀释液、助沉剂和蛋白酶K溶液。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：
S1：根据提取样本的数量，在96深孔板的第1、2、7、8列中均依次加入10μL磁珠、20μL丝氨酸蛋白酶K、6μL助沉剂、300μL样本和600μL裂解液；
S2：根据提取样本的数量，在96深孔板的第3、9列中均加入20μL磁珠和600μL的磁珠稀释液；
S3：根据提取样本的数量，在96深孔板的第4、10列中均加入800μL洗涤液A；
S4：根据提取样本的数量，在96深孔板的第6、12列中均加入200μL洗涤液B；
S5：根据提取样本的数量，在96深孔板的第5、11列中加入60μL洗脱液；
S6：使用西安天隆GeneRotex96核酸自动提取仪或其他同等类型的仪器上进行自动化提取样本的游离DNA。
利用西安天隆GeneRotex96核酸自动提取仪提取的程序为：
GeneRotex96核酸自动提取仪按以下程序进行自动化提取样本的游离DNA(注意：程序运行前需在深孔板第2和第8列放置搅拌套，7至12列孔位无试剂则第8列可不放置搅拌套，单条试剂第2列孔位放置搅拌套)：
自动化程序结束后，将第5或11列(注意有效工作孔位)的洗脱液转移至干净的无核酸酶离心管中。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供的裂解液中采用对壬基苯氧基丙基磺酸钠，能够屏蔽提取试剂溶液储存耗材具备的静电，避免游离DNA吸附在耗材壁上，同时能够减弱核酸分子间的静电斥力，增加富集在磁珠上的游离DNA，提高游离DNA的提取得率，明显提高了血清、血浆中游离DNA的提取效率。
(2)本发明提供的裂解液中采用异丙醇酰胺，能够破坏细胞膜，能够与盐酸胍、Span-80协同作用，增强裂解液对样本的裂解能力，提高血清、血浆中游离DNA的提取效率。
(3)本发明提供的试剂盒配合自动化运行程序，裂解提取效率高，重复性好；同时在提取过程中无需离心等操作，操作简单，显著提高了实验的效率，可满足大量检测的需求。
(4)本发明提供的试剂盒，匹配西安天隆全自动核酸提取仪平台，能够实现双孔上样自动化提取，提高了血清、血浆样本上样量，提高了血清、血浆游离DNA的提取效率。
附图说明
图1为本发明实验例3中不同试剂盒提取含有不同大小DNA片段的DNA Marker的琼脂糖凝胶电泳结果；其中，1-天根D2000 DNA Marker，2-实施例2试剂盒提取D2000 DNAMarker的结果，3-对比例3试剂盒提取D2000 DNA Marker的结果，4-对比例4试剂盒提取D2000 DNA Marker的结果。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。
实施例1
本实施例提供一种游离DNA提取试剂盒，其组分及浓度如下表1所示：
表1游离DNA提取试剂盒的组分表
实施例2
本实施例提供一种游离DNA提取试剂盒，其组分及浓度如下表2所示：
表2游离DNA提取试剂盒的组分表
对比例1
本对比例中的游离DNA提取试剂盒与实施例1中的游离DNA提取试剂盒的唯一的区别为：将裂解液中异丙醇酰胺的浓度降至0.1％，其他各组分和浓度与实施例1相同。
对比例2
本对比例中的游离DNA提取试剂盒与实施例1中的游离DNA提取试剂盒的唯一的区别为：将裂解液中异丙醇酰胺的浓度提高至2.2％，其他各组分和浓度与实施例1相同。
对比例3
本对比例中的游离DNA提取试剂盒与实施例2中的游离DNA提取试剂盒的唯一的区别为：将裂解液中1％的对壬基苯氧基丙基磺酸钠替换为1％的硬脂基三甲基季铵盐酸盐，其他各组分和浓度与实施例2相同。
对比例4
本对比例中的游离DNA提取试剂盒与实施例2中的游离DNA提取试剂盒的唯一的区别为：将裂解液中1％的对壬基苯氧基丙基磺酸钠(NP)替换为1％的单硬脂酸甘油酯，其他各组分和浓度与实施例2相同。
对比例5
本对比例中的游离DNA提取试剂盒与实施例2中的游离DNA提取试剂盒的唯一的区别为：将裂解液中对壬基苯氧基丙基磺酸钠的浓度降至0.1％，其他各组分和浓度与实施例2相同。
对比例6
本对比例中的游离DNA提取试剂盒与实施例2中的游离DNA提取试剂盒的唯一的区别为：将裂解液中对壬基苯氧基丙基磺酸钠的浓度提高至2.2％，其他各组分和浓度与实施例2相同。
对比例7
本对比例中的游离DNA提取试剂盒与实施例2中的游离DNA提取试剂盒的唯一的区别为：裂解液中不包括对壬基苯氧基丙基磺酸钠和异丙醇酰胺，其他各组分和浓度与实施例2相同。
实验例1
本实验例采用样本包括血清样本和血浆样本，分别使用实施例1、对比例1-2中提供的游离DNA提取试剂盒在天隆GeneRotex96核酸自动提取仪上按照发明内容中所述方法对从协议医院收集来的普通人血清样本和血浆样本进行游离DNA提取，每个实验设置3个平行实验。提取得到的DNA产物使用ThermoFisher Qubit 3.0荧光计及HS dsDNA定量试剂盒进行检测。游离DNA提取的结果数据结果如下表3所示：
表3血清、血浆样本游离DNA提取结果
由表3结果可知，当表面活性剂异丙醇酰胺的浓度过低(低于0.2％)或过高(高于2％)时，游离DNA提取得率均会下降，这说明本发明裂解液中表面活性剂异丙醇酰胺或其他组分的含量应严格地控制在本发明所要求的范围内，含量过低或过高都会导致核酸提取或纯化的效果变差。
实验例2
本实验例采用样本包括从协议医院收集来的普通人血清样本和血浆样本，分别使用实施例2、对比例3-7中提供的游离DNA提取试剂盒在天隆GeneRotex96核酸自动提取仪上按照发明内容中所述方法对血清样本和血浆样本进行游离DNA提取，每个实验设置3个平行实验。提取得到的DNA产物使用ThermoFisher Qubit 3.0荧光计及HS dsDNA定量试剂盒进行检测。游离DNA提取的结果数据结果如下表4所示：
表4血清、血浆样本游离DNA提取结果
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由表4结果可知，在本试剂盒体系中，不同种类的抗静电剂在本发明试剂盒体系内对于游离DNA提取的产物得率不同，对于磁珠法核酸提取试剂体系，除耗材的静电消除，也需克服分子间特定化的静电力，阴离子型抗静电剂对壬基苯氧基丙基磺酸钠相较于其他两种抗静电剂，静电消除效果好，从而对于游离DNA提取的产物得率更高。同时，当对壬基苯氧基丙基磺酸钠的浓度过低(低于0.2％)或过高(高于2％)时，游离DNA提取得率均会下降，这说明本发明裂解液中阴离子型抗静电剂对壬基苯氧基丙基磺酸钠或其他组分的含量应严格地控制在本发明所要求的范围内，含量过低或过高都会导致核酸提取或纯化的效果变差。另外，试剂盒中同时加入阴离子型抗静电剂对壬基苯氧基丙基磺酸钠和表面活性剂异丙醇酰胺，且对壬基苯氧基丙基磺酸钠和异丙醇酰胺在优选的浓度条件的共同作用，对游离DNA的提取效率最佳。
实验例3
本实验例采用天根D2000 DNA Marker进行琼脂糖凝胶电泳实验，并分别使用实施例2、对比例3-4中提供的游离DNA提取试剂盒对D2000 DNA Marker提取后进行琼脂糖凝胶电泳实验。实验结果如图1所示。
由图1结果可知，对于磁珠法核酸提取试剂体系，除耗材的静电消除，也需克服DNA分子间特定化的静电力。非离子抗静电剂如单硬脂酸甘油酯的消除静电效果不如离子型抗静电剂，而离子型抗静电剂中，阳离子型抗静电剂如硬脂基三甲基季铵盐酸盐的热稳定性较差；阴离子型抗静电剂对壬基苯氧基丙基磺酸钠相较于其他两种抗静电剂，静电消除效果更稳定、更好，针对小片段DNA的提取效果更优。此外，阴离子型抗静电剂对壬基苯氧基丙基磺酸钠可以替换为聚丙烯酸钠、顺丁烯二酸酐或聚苯乙烯苯磺酸。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
Claims (10)
1.一种游离DNA提取裂解液，其特征在于，所述裂解液包括表面活性剂；所述表面活性剂包括异丙醇酰胺、SDS、TritonX-100或Tween 20。
2.根据权利要求1所述的裂解液，其特征在于，所述裂解液还包括阴离子型抗静电剂；所述阴离子型抗静电剂包括对壬基苯氧基丙基磺酸钠、聚丙烯酸钠、顺丁烯二酸酐或聚苯乙烯苯磺酸。
3.根据权利要求2所述的裂解液，其特征在于，所述裂解液中表面活性剂的质量百分含量为0.2％-2％；
和/或，所述裂解液中阴离子型抗静电剂的质量百分含量为0.2％-2％。
4.根据权利要求3所述的裂解液，其特征在于，所述裂解液还包括1-100mmol/L的柠檬酸钠、5-50mmol/L的EDTA、0.5-2.5mol/L的NaCl、0.5-5mol/L的盐酸胍和质量百分含量为1％-4％的Span-80。
5.一种游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-4中任意一项所述的裂解液。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括洗涤液A；
和/或，所述试剂盒还包括洗涤液B。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液A包括10-100mmol/L的柠檬酸钠、5-20mmol/L的EDTA、0.5-2mol/L的NaCl、质量百分含量为0.1％-0.5％的月桂醇聚氧乙烯醚、0.5-2mol/L的盐酸胍和30％-90％体积比的异丙醇或无水乙醇；
和/或，所述洗涤液B包括0.5-5mmol/L的氢氧化钠。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括洗脱液；
和/或，所述试剂盒还包括磁珠和磁珠稀释液；
和/或，所述试剂盒还包括助沉剂。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述洗脱液包括0.1-100mmol/L的柠檬酸钠；
和/或，所述磁珠包括携带官能团的磁珠，所述磁珠浓度为15mg/ml；
和/或，所述磁珠稀释液包括0.5-5mol/L的氯化钠；
和/或，所述助沉剂包括0.1-10mg/mL的PolyA。
10.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括蛋白酶K溶液，所述蛋白酶K溶液包括丝氨酸蛋白酶K。
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