CN109762874B

CN109762874B - 核酸助沉剂、孕妇血浆游离dna提取试剂盒及方法

Info

Publication number: CN109762874B
Application number: CN201811648760.8A
Authority: CN
Inventors: 姬晓勇; 潘晓西; 汪彦荣; 王建伟; 伍启熹; 刘倩; 唐宇
Original assignee: Beijing Youxun Medical Devices Co ltd
Current assignee: Beijing Youxun Medical Devices Co ltd
Priority date: 2018-12-30
Filing date: 2018-12-30
Publication date: 2023-04-25
Anticipated expiration: 2038-12-30
Also published as: CN109762874A

Abstract

本发明公开了一种核酸助沉剂、孕妇血浆游离DNA提取试剂盒及方法。其中，该核酸助沉剂包含：0.5μg/μL~1μg/μL Carrier RNA、1μg/μL~5μg/μL多聚腺苷酸、2~5μg/μL糖原、0.2~0.5mol/L醋酸钠、1~2μg/μL线性丙烯酰胺和H₂O。本发明的核酸助沉剂，可与常规的裂解结合液、洗涤缓冲液、洗脱液等结合使用，显著提高孕妇血浆游离DNA提取效率的同时对下游实验（PCR、高通量测序实验）无不利影响，对高通量测序的生物信息学分析无干扰。

Description

核酸助沉剂、孕妇血浆游离DNA提取试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种核酸助沉剂、孕妇血浆游离DNA提取试剂盒及方法。

背景技术

1997年，有学者发现了孕妇外周血中存在着胎儿游离DNA(cf DNA)，并于孕5周开始缓慢释放进入母体外周血中，孕7周左右即可检测，在分娩后2h内迅速消失。它的这些特性使其成为理想的产前诊断材料。无创产前基因检测(Noninvasive Prenatal Testing，NIPT)就是利用大规模平行测序技术对母体外周血中的游离DNA进行低深度全基因组测序，获取胎儿染色体信息的方法。目前，据国内外数据表明，NIPT已可以成功检测21-三体综合征、18-三体综合征、13-三体综合征。基于孕妇血浆游离DNA的产前诊断方法，只需要在妊娠早期抽取孕妇外周血便可进行多种疾病的产前诊断，克服了传统产前诊断手段具有创伤性及可实施时间晚等缺点，使产前诊断的安全更具有保障。但是由于其含量少，且多为小片段DNA分子等特点，提取较为困难，丢失量大，检验灵敏度较低，尤其对于高通量测序检测，低核酸提取效率容易造成建库失败，限制了其在临床诊断中的应用。

孕妇血浆游离DNA提取的方法有很多种，传统的酚－氯仿法尽管提取含量较多，但所需样本量较大，且有毒溶剂用量多，操作复杂，步骤烦琐，容易发生污染，需要消耗较多的人力及时间。目前使用比较多的孕妇血浆游离DNA提取方法是磁珠法和离心柱法，离心柱法提取需要离心机进行离心操作，不适用于自动化提取。而磁珠法提取能够实现自动化、大批量操作；具有操作简单、用时短等优势，通过在提取过程中添加核酸助沉剂，可以增加核酸的提取得率，但是目前添加核酸助沉剂的市售cfDNA提取试剂盒，或是对核酸提取得率影响甚微，或是对下游实验有抑制作用，而限制其大规模临床应用。

发明内容

本发明旨在提供一种核酸助沉剂、孕妇血浆游离DNA提取试剂盒及方法，以提高孕妇血浆游离DNA提取效率。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种核酸助沉剂。该核酸助沉剂包含：0.5μg/μL～1μg/μL Carrier RNA、1μg/μL～5μg/μL多聚腺苷酸、2～5μg/μL糖原、0.2～0.5mol/L醋酸钠、1～2μg/μL线性丙烯酰胺和H₂O。

进一步地，所述多聚腺苷酸的残基数为2100～10000nt，所述线性丙烯酰胺的重均分子量为100万～500万。

根据本发明的另一个方面，提供了一种孕妇血浆游离DNA提取试剂盒。该孕妇血浆游离DNA提取试剂盒包括上述任一种核酸助沉剂。

进一步地，孕妇血浆游离DNA提取试剂盒还包括磁珠悬浮液、裂解结合液、蛋白酶K、蛋白酶溶解缓冲液、第一漂洗液、第二漂洗液和洗脱液。

进一步地，裂解结合液包含1％～10％的十二烷基硫酸钠、2～5mol/L的异硫氰酸胍、40～80mmol/L pH＝7.5的Tris-HCl、1～10mmol/L pH＝7.5的EDTA、体积百分比为0.5～7％的Trition X-100、0.1～1mol/L的NaCl。

进一步地，蛋白酶溶解缓冲液包含40～70mmol/L Tris-HCl和8～12mmol/LCaCl₂。

进一步地，第一漂洗液包含100～500mmol/L的Tris-HCl、50～80mmol/LEDTA、2～5mol/L异硫氰酸胍、体积百分比为40～65％的乙醇，第一漂洗液pH＝8.0；优选的，第二漂洗液包含5～20mmol/L的Tris-HCl、体积百分比为70～85％的乙醇，第二漂洗液pH＝8.0。

进一步地，洗脱液包含10～20mmol/L的Tris-HCl或纯化水。

根据本发明的再一方面，提供了一种孕妇血浆游离DNA提取方法。该孕妇血浆游离DNA提取方法采用上述任一种孕妇血浆游离DNA提取试剂盒进行孕妇血浆游离DNA提取。

进一步地，包括以下步骤：1)预先将180mg蛋白酶K预先溶于9mL蛋白酶溶解缓冲液中形成蛋白酶K溶液，向离心管中加入35～45μL蛋白酶K溶液和35～45μL磁珠悬浮液；2)转移600μL血浆样品至含离心管中；3)加入800～1000μL裂解结合液至离心管中，涡旋混匀15秒；4)加入1μL核酸助沉剂，涡旋混匀15秒，室温颠倒混匀15分钟；5)转移至磁力架上，静置3分钟吸附磁珠，吸弃溶液；6)加入500～600μL第一漂洗液，涡旋混匀15秒；7)转移至磁力架上，静置2分钟吸附磁珠，吸弃溶液；8)加入500～600μL第二漂洗液，涡旋混匀15秒；9)转移至磁力架上，静置3分钟吸附磁珠，吸弃溶液；10)重复步骤8)和9)一次；11)离心，收集管离心管壁上的液滴，转移至磁力架上，吸弃溶液；12)空气干燥10分钟；13)加30～40μL的洗脱液或纯化水，涡旋打散磁珠，室温放置5～10分钟，期间旋涡震荡2～3次加速DNA溶解；14)转移至磁力架上，静置3分钟，转移溶解的DNA至新的离心管中保存，溶解的DNA即为孕妇血浆游离DNA。

本发明的核酸助沉剂，可与常规的裂解结合液、洗涤缓冲液、洗脱液等结合使用，显著提高孕妇血浆游离DNA提取效率的同时对下游实验(PCR、高通量测序实验)无不利影响，对高通量测序结果的生物信息学分析无干扰。对于高通量测序实验，由于cfDNA提取得率的提高，降低了建库失败率，同时降低了血浆用量，更易实现自动化提取，实现多样本同时平行检测，节约人力、时间成本。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了本发明实施例1中市售试剂盒提取样本1的cfDNA构建文库峰图；以及

图2示出了本发明实施例1中本发明方法提取样本1的cfDNA构建文库峰图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

根据本发明一种典型的实施方式，提供了一种核酸助沉剂。该核酸助沉剂包含：0.5μg/μL～1μg/μL Carrier RNA、1μg/μL～5μg/μL多聚腺苷酸、2～5μg/μL糖原、0.2～0.5mol/L醋酸钠、1～2μg/μL线性丙烯酰胺和H₂O。

优选的，多聚腺苷酸的残基数为2100～10000nt，线性丙烯酰胺的重均分子量为100万～500万，提高助沉能力。

在核酸提取的过程中，加入以显著提高核酸的得率，尤其对于提取降解的低浓度DNA样品时效果更为显著。多种载体分子和盐溶液可被用于提取过程中的核酸沉淀，包括糖原、线性聚丙烯酰胺、醋酸钠和Carrier RNA(载体RNA)等。其中载体RNA的作用机理目前尚不明确，可能的原因是：与二氧化硅结合的DNA数量与裂解液中核酸的总体浓度成正比，随着载体分子的加入增加了整体核酸浓度，这可能会增加与二氧化硅结合的DNA数量，从而提高DNA的产量。此外，在提取过程中，由于DNA与二氧化硅和管壁的非特异性结合，导致DNA丢失。当载体RNA与DNA竞争这些结合位点时，这可能减少提取过程中的DNA损失。线性聚丙酰胺是一种对微量核酸提取非常有效的中性载体，可以回收低至20bp大小的DNA片段，有效增加小段DNA的核酸提取效率，目前聚丙酰胺已经被应用于多种分子生物学实验中，并表现出了良好的惰性，所以将其作为核酸提取过程中的分子载体，对下游实验无不利影响。超纯糖原做为核酸沉淀过程中载体，在100μl感受态细胞中包含8μg超纯糖原，并不会影响其转化效率，糖原浓度≤2mg/mL的逆转录体系中，对逆转录无影响。

本发明通过将不同载体分子和盐溶液作为助沉剂，进行核酸提取效率测试和对下游实验影响评估，综合考虑其协同作用，最终选择4种载体分子和1种盐溶液作为助沉剂的主要组成部分，并优化了不同成分的添加比例及浓度。

根据本发明一种典型的实施方式，提供了一种孕妇血浆游离DNA提取试剂盒。该试剂盒包括上述任一种核酸助沉剂。

本发明的核酸助沉剂，可与常规的裂解结合液、洗涤缓冲液、洗脱液等结合使用，显著提高孕妇血浆游离DNA提取效率的同时对下游实验(PCR、高通量测序)无不利影响，对高通量测序结果的生物信息学分析无干扰。对于高通量测序实验，由于cfDNA提取得率的提高，降低了建库失败率，同时降低了血浆用量，更易实现自动化提取，实现多样本同时平行检测，节约人力、时间成本。

优选的，为了使用方便，孕妇血浆游离DNA提取试剂盒还包括磁珠悬浮液、裂解结合液(本发明一实施方式中称之为裂解结合液F)、蛋白酶K、蛋白酶溶解缓冲液、第一漂洗液(本发明一实施方式中称之为漂洗液W1)、第二漂洗液(本发明一实施方式中称之为漂洗液W2)和洗脱液。

更优选的，裂解结合液包含1％～10％的十二烷基硫酸钠、2～5mol/L的异硫氰酸胍、40～80mmol/L pH＝7.5的Tris-HCl、1～10mmol/L pH＝7.5的EDTA、体积百分比为0.5～7％的Trition X-100、0.1～1mol/L的NaCl。该裂解结合液也称之为裂解结合液F，该裂解结合液F能够充分发挥裂解功能，具有裂解彻底的优点。

更优选的，蛋白酶溶解缓冲液包含40～70mmol/L Tris-HCl和8～12mmol/LCaCl₂。该蛋白酶溶解缓冲液具有溶解效率高，对DNA无损伤优点。

更优选的，第一漂洗液包含100～500mmol/L的Tris-HCl、50～80mmol/LEDTA、2～5mol/L异硫氰酸胍、体积百分比为40～65％的乙醇，第一漂洗液pH＝8.0；该第一洗涤液也称为漂洗液W1，该漂洗液W1具有洗涤效率高的优点。更优选的，第二漂洗液包含5～20mmol/L的Tris-HCl、体积百分比为70～85％的乙醇，所述第二漂洗液pH＝8.0也称为漂洗液W2；更优选的，洗脱液包含10～20mmol/L的Tris-HCl。

根据本发明一种典型的实施方式，提供了一种孕妇血浆游离DNA提取方法。该方法采用如上述任一种孕妇血浆游离DNA提取试剂盒进行孕妇血浆游离DNA提取。该试剂盒能够显著提高孕妇血浆游离DNA提取效率的同时对下游实验(PCR、高通量测序)无不利影响，对高通量测序结果的生物信息学分析无干扰。

优选的，包括以下步骤：1)预先将180mg蛋白酶K预先溶于9mL蛋白酶溶解缓冲液中形成蛋白酶K溶液，向离心管中加入35～45μL蛋白酶K溶液和35～45μL磁珠悬浮液；2)转移600μL血浆样品至含离心管中；3)加入800～1000μL裂解结合液F至离心管中，涡旋混匀15秒；4)加入1μL核酸助沉剂，涡旋混匀15秒，室温颠倒混匀15分钟；5)转移至磁力架上，静置3分钟吸附磁珠，吸弃溶液；6)加入500～600μL漂洗液W1，涡旋混匀15秒；7)转移至磁力架上，静置2分钟吸附磁珠，吸弃溶液；8)加入500～600μL漂洗液W2，涡旋混匀15秒；9)转移至磁力架上，静置3分钟吸附磁珠，吸弃溶液；10)重复步骤8)和9)一次；11)离心，收集管离心管壁上的液滴，转移至磁力架上，吸弃溶液；12)空气干燥10分钟；13)加30～40μL的洗脱液或灭菌水，涡旋打散磁珠，室温放置5～10分钟，期间旋涡震荡2～3次加速DNA溶解；14)转移至磁力架上，静置3分钟，转移溶解的DNA至新的离心管中保存，溶解的DNA即为孕妇血浆游离DNA。

下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。下面实施例中未写明的试剂或方法可采用本发明常规的试剂或技术手段实现。

实施例1

取4例孕妇血浆样本(编号样本1、样本2、样本3和样本4)，各取600μL分别用本实施例中的试剂盒和市售试剂盒进行提取实验。

本实施例试剂盒组成：

1.磁珠悬浮液G购于美基生物科技有限公司；

2.裂解结合液F：5％的十二烷基硫酸钠、终浓度为3.5mol/L的异硫氰酸胍、终浓度为60mmol/L的Tris-HCl(pH7.5)、终浓度为5mmol/L的EDTA(pH＝7.5)、体积百分比为4％的Trition X-100、终浓度为0.5mol/L的NaCl；

3.蛋白酶K购于美基生物科技有限公司；

4.蛋白酶溶解缓冲液：50mmol/L Tris-HCl和10mmol/LCaCl₂；

5.漂洗液W1：300mmol/L的Tris-HCl、65mmol/L EDTA、3.5mol/L异硫氰酸胍、体积百分比为56％的乙醇，(pH＝8.0)；

6.漂洗液W2：10mmol/L的Tris-HCl、体积百分比为80％的乙醇，pH＝8.0)；

7.洗脱液：10mmol/L的Tris-HCl；

8.核酸助沉剂组分详见表1。

表1

	名称	浓度
			1	Carrier RNA	0.75μg/μL
2	多聚腺苷酸	3μg/μL
			3	超纯糖原	3.5μg/μL
4	醋酸钠	0.35mol/L
			5	线性丙烯酰胺	1.5μg/μL

本实施例孕妇血浆游离DNA提取方法：

1)在2mL离心管中，加入40μL Proteinase K和40μL磁珠悬浮液G。

2)转移600μL血浆样品至含蛋白酶K的离心管中。

3)加入900μL裂解结合液F至样品中，涡旋混匀15秒。

4)加入助沉剂1μL，涡旋混匀15秒，室温颠倒混匀15分钟。

5)转移至磁力架上，静置3分钟吸附磁珠，吸弃所有溶液。

6)加入550μL漂洗液W1，涡旋混匀15秒。

7)转移至磁力架上，静置2分钟吸附磁珠。小心吸弃所有溶液。

8)加入550μL漂洗液W2，涡旋混匀15秒。

9)转移至磁力架上，静置3分钟吸附磁珠，小心吸弃所有溶液。

10)重复第8-9步一次。

11)短暂离心，收集管壁上的液滴，转移至磁力架上，小心吸弃所有溶液。

12)空气干燥10分钟。

13)加35μL的TE缓冲液或灭菌水，涡旋打散磁珠。室温放置5～10分钟，其间旋涡震荡2～3次加速DNA溶解。

14)转移至磁力架上，静置3分钟。转移DNA溶液至新的1.5mL离心管中。

将所有的提取的cfDNA(孕妇血浆游离DNA)Qubit定量后，全部进行文库构建及上机测序，分析文库产出，GC含量，Q30和21号染色体(chr21)的Z值。

实施例2

取4例孕妇血浆样本(编号样本5、样本6、样本7和样本8)，各取600μL分别用本试剂盒和市售试剂盒进行提取实验。

本试剂盒组成(端点)：

1.磁珠悬浮液G购于美基生物科技有限公司；

2.裂解结合液F：1％的十二烷基硫酸钠、终浓度为2mol/L的异硫氰酸胍、终浓度为40mmol/L的Tris-HCl(pH7.5)、终浓度为1mmol/L的EDTA(pH＝7.5)、体积百分比为0.5％的Trition x-100、终浓度为0.1mol/L的NaCl；

3.蛋白酶K购于美基生物科技有限公司；

4.蛋白酶溶解缓冲液：40mmol/L Tris-Hcl和8mmol/LCaCl₂；

5.漂洗液W1：100mmol/L的Tris-HCl、50mmol/L EDTA、2mol/L异硫氰酸胍、体积百分比为40％的乙醇，(pH＝8.0)；

7.洗脱液：10mmol/L的Tris-HCl；

8.核酸助沉剂组分详见表2。

表2

	名称	浓度
			1	Carrier RNA	<![CDATA[0.5μg/<u>μL</u>]]>
2	多聚腺苷酸	<![CDATA[1μg/<u>μL</u>]]>
			3	超纯糖原	<![CDATA[2μg/<u>μL</u>]]>
4	醋酸钠	0.2mol/L
			5	线性丙烯酰胺	<![CDATA[1μg/<u>μL</u>]]>

本实施例孕妇血浆游离DNA提取方法：

1)在2mL离心管中，加入35μL Proteinase K和35μL磁珠悬浮液G。

2)转移600μL血浆样品至含蛋白酶K的离心管中。

3)加入800μL裂解结合液F至样品中，涡旋混匀15秒。

4)加入助沉剂1μL，涡旋混匀15秒，室温颠倒混匀15分钟。

5)转移至磁力架上，静置3分钟吸附磁珠，吸弃所有溶液。

6)加入500μL漂洗液W1，涡旋混匀15秒。

8)加入500μL漂洗液W2，涡旋混匀15秒。

10)重复第8～9步一次。

12)空气干燥10分钟。

13)加30μL的TE缓冲液或灭菌水，涡旋打散磁珠。室温放置5～10分钟，其间旋涡震荡2～3次加速DNA溶解。

实施例3

取2例孕妇血浆样本(编号样本9和样本10)，取600μL分别用本实施例中的试剂盒和市售试剂盒进行提取实验。

本实施例试剂盒组成：

1.磁珠悬浮液G购于美基生物科技有限公司；

2.裂解结合液F：10％的十二烷基硫酸钠、终浓度为5mol/L的异硫氰酸胍、终浓度为80mmol/L的Tris-HCl(pH7.5)、终浓度为10mmol/L的EDTA(pH＝7.5)、体积百分比为7％的Trition X-100、终浓度为1mol/L的NaCl；

3.蛋白酶K购于美基生物科技有限公司；

4.蛋白酶溶解缓冲液：70mmol/L Tris-Hcl和12mmol/LCaCl₂；

5.漂洗液W1：500mmol/L的Tris-HCl、80mmol/L EDTA、5mol/L异硫氰酸胍、体积百分比为65％的乙醇，(pH＝8.0)；

6.漂洗液W2：20mmol/L的Tris-HCl、体积百分比为85％的乙醇，pH＝8.0)；

7.洗脱液：20mmol/L的Tris-HCl；

8.核酸助沉剂组分详见表3。

表3

	名称	浓度
			1	Carrier RNA	<![CDATA[1<u>μg</u>/<u>μL</u>]]>
2	多聚腺苷酸	<![CDATA[5<u>μg</u>/<u>μL</u>]]>
			3	超纯糖原	<![CDATA[5<u>μg</u>/<u>μL</u>]]>
4	醋酸钠	0.5mol/L
			5	线性丙烯酰胺	<![CDATA[2<u>μg</u>/<u>μL</u>]]>

本实施例孕妇血浆游离DNA提取方法：

1)在2mL离心管中，加入45μL Proteinase K和45μL磁珠悬浮液G。

2)转移600μL血浆样品至含蛋白酶K的离心管中。

3)加入1000μL裂解结合液F至样品中，涡旋混匀15秒。

4)加入助沉剂1μL，涡旋混匀15秒，室温颠倒混匀15分钟。

5)转移至磁力架上，静置3分钟吸附磁珠，吸弃所有溶液。

6)加入600μL漂洗液W1，涡旋混匀15秒。

8)加入600μL漂洗液W2，涡旋混匀15秒。

10)重复第8-9步一次。

12)空气干燥10分钟。

13)加40μL的TE缓冲液或灭菌水，涡旋打散磁珠。室温放置5～10分钟，其间旋涡震荡2～3次加速DNA溶解。

对以上10例孕妇血浆样本的cfDNA提取、文库构建和高通量测序结果汇总分析：见表4、表5和图1：市售试剂盒(Magbead Free-Circulating DNA Kit，康为世纪，CW2522)提取cfDNA构建文库峰图(样本1)、图2：本发明方法提取cfDNA构建文库峰图(样本1)。

表4：市售试剂盒提取cfDNA进行高通量测序结果

表5：本实施例试剂盒和方法提取cfDNA进行高通量测序结果

结果表明：本发明方法可以显著提高核酸提取得率，对高通量测序结果进行生物信息分析，两者的文库产出、GC含量、Q30和Z值相差不大(P＞0.05)，说明本发明的提取方法不影响后续实验及结果。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种孕妇血浆游离DNA提取方法，其特征在于，采用孕妇血浆游离DNA提取试剂盒进行孕妇血浆游离DNA提取；

孕妇血浆游离DNA提取试剂盒包括核酸助沉剂、磁珠悬浮液、裂解结合液、蛋白酶K、蛋白酶溶解缓冲液、第一漂洗液、第二漂洗液和洗脱液；

所述核酸助沉剂包含：0.5μg/μL ~1μg/μL Carrier RNA、1μg/μL~5μg/μL多聚腺苷酸、2~5μg/μL糖原、0.2~0.5mol/L醋酸钠、1~2μg/μL线性丙烯酰胺和H₂O；所述多聚腺苷酸的残基数为2100~10000nt，所述线性丙烯酰胺的重均分子量为100万~500万；

所述裂解结合液包含1%~10%的十二烷基硫酸钠、2~5mol/L的异硫氰酸胍、40~80 mmol/L pH=7.5的Tris-HCl、1~10 mmol/L pH=7.5的EDTA、体积百分比为0.5~7%的Trition X-100、0.1~1 mol/L的NaCl；

所述蛋白酶溶解缓冲液包含40~70 mmol/L Tris-HCl和8~12 mmol/LCaCl₂；

所述第一漂洗液包含100~500 mmol/L的Tris-HCl、50~80mmol/LEDTA、2~5mol/L异硫氰酸胍和体积百分比为40~65%的乙醇，所述第一漂洗液pH=8.0；

所述第二漂洗液包含5~20 mmol/L的Tris-HCl、体积百分比为80~85%的乙醇，所述第二漂洗液pH=8.0；

所述洗脱液包含10~20mmol/L的Tris-HCl或纯化水。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）预先将180 mg 蛋白酶K预先溶于9 mL蛋白酶溶解缓冲液中形成蛋白酶K溶液，向离心管中加入35~45μL所述蛋白酶 K溶液和35~45μL 磁珠悬浮液；

2）转移600μL血浆样品至含所述离心管中；

3）加入800~1000μL 裂解结合液至所述离心管中，涡旋混匀15秒；

4）加入1μL核酸助沉剂，涡旋混匀15秒，室温颠倒混匀15分钟；

5）转移至磁力架上，静置3分钟吸附磁珠，吸弃溶液；

6）加入500~600μL 第一漂洗液，涡旋混匀15秒；

7）转移至磁力架上，静置2分钟吸附磁珠，吸弃溶液；

8）加入500~600μL 第二漂洗液，涡旋混匀15秒；

9）转移至磁力架上，静置3分钟吸附磁珠，吸弃溶液；

10）重复步骤8）和9）一次；

11）离心，收集管所述离心管壁上的液滴，转移至磁力架上，吸弃溶液；

12）空气干燥10分钟；

13）加30~40μL的洗脱液或纯化水，涡旋打散磁珠，室温放置5~10分钟，期间旋涡震荡2~3次加速DNA溶解；

14）转移至磁力架上，静置3分钟，转移溶解的DNA至新的离心管中保存，所述溶解的DNA即为孕妇血浆游离DNA。