CN112899268B - 一种磁珠法病毒核酸提取试剂盒 - Google Patents

一种磁珠法病毒核酸提取试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种磁珠法病毒核酸提取试剂盒，包含裂解液、磁珠、清洗液I、清洗液II、洗脱液。所述裂解液含有三氯化铝六水合物、非离子表面活性剂、缓冲液、柠檬酸钠、结合剂、巯基乙醇；所述的磁珠为超顺磁性氧化硅纳米磁性微珠；所述清洗液I为盐酸胍、非离子表面活性剂、PVP、EDTA、硫代硫酸钾、异丙醇；所述清洗液II为70％乙醇；所述洗脱液包含缓冲液、EDTA。与常规的病毒核酸提取方法相比，本发明不需单独加入结合液，实现裂解和结合的同时进行，操作步骤简单，有效缩短提取时间，提高了病毒提取效率。

Description

一种磁珠法病毒核酸提取试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种磁珠法病毒核酸提取试剂盒。
背景技术
在分子生物学实验中，核酸提取是一项最基本且最重要的环节，核酸提取的产量、纯度及完整性直接关系到下游核酸检测、生物学研究或其他新产品开发的成败。磁珠法核酸提取方法是指以超顺磁性氧化硅纳米磁性微珠(以下简称磁珠)为载体，通过磁珠在高盐溶液中吸附核酸，经过磁性分离和漂洗杂质后，在低盐溶液中核酸从磁珠表面解吸附的原理进行核酸提取的方法。该方法不需离心，操作简单，便于高通量、自动化操作，可以使核酸提取效率显著升高，已成为目前新兴的核酸提取技术。
目前市面上磁珠法的核酸提取试剂盒一般使用胍盐进行裂解，胍盐能溶解蛋白质，导致细胞破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离。但胍盐在实际裂解过程中所需裂解时间较长，且裂解液与结合液在不同时间加入，同时需配合蛋白酶K进行裂解，导致普遍具有核酸提取时间过长，提取效率较低的弊端。
发明内容
本发明提供一种能够有效缩短时间并提高病毒提取效率的磁珠法病毒核酸提取试剂盒。该试剂盒包括裂解液、磁珠、清洗液I、清洗液II、洗脱液，其中：
所述裂解液的成分和含量如下：
Figure BDA0002975283340000011
Figure BDA0002975283340000021
所述磁珠为超顺磁性氧化硅纳米磁性微珠；
所述清洗液I的成分和含量如下：
Figure BDA0002975283340000022
所述清洗液II为70％乙醇；
所述洗脱液的成分和含量如下：
缓冲液 0.02-0.03mol/L
EDTA 0.002-0.03mol/L。
进一步的，所述非离子表面活性剂为NP-40、Tween-20、Triton-X100中的一种或多种。
进一步的，所述缓冲液为PH7.0-8.0Tris-HCl、磷酸缓冲液中的一种。
进一步的，所述结合剂为异丙醇。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.可以快速、简单、通用的从血液、动物组织、环境样本、唾液、鼻液、拭子中分离纯化病毒的核酸，整个提取过程仅需裂解、清洗1、清洗2、洗脱4个步骤，缩短了提取时间，克服了现有方法步骤繁多的缺点。
2.裂解液中包含结合剂，磁珠预封装进入裂解液中，裂解与结合步骤一步完成，在同一个孔位中三氯化铝六水合物在裂解病毒蛋白结构的同时，结合剂异丙醇沉淀核酸，核酸可更快的吸附在磁珠上。
3.本试剂盒裂解液中的三氯化铝六水合物具有超强的裂解能力，不需配合蛋白酶K进行裂解，省去了蛋白酶K需要低温运输的麻烦，操作更为简单。
4.自动化应用时每一步骤的反应试剂可以预先灌装入对应的反应仓内，使用时只需将样本加入指定反应仓，即可放入仪器中开始提取操作。更适用于全自动核酸提取应用。
附图说明
图1为本发明的磁珠法病毒核酸提取试剂盒中实施例1提取的不同浓度的新冠假病毒的扩增曲线图；
图2为本发明的磁珠法病毒核酸提取试剂盒中实施例1提取的浓度为1×105copies/ml的2019-nCOV假病毒的扩增曲线图；
图3为本发明的磁珠法病毒核酸提取试剂盒中实施例1提取的健康人咽拭子保存液游离DNA作为模板，扩增人内参RP30基因的扩增曲线图；
图4为本发明的磁珠法病毒核酸提取试剂盒中实施例1提取的新冠假病毒和人内参假病毒混合物核酸作为模板，经过三重荧光定量PCR扩增后的扩增曲线图；
图5为本发明的磁珠法病毒核酸提取试剂盒中实施例1试剂提取的假病毒梯度核酸扩增曲线图；
图6为本发明的磁珠法病毒核酸提取试剂盒中实施例1逗点生物试剂提取的假病毒梯度核酸扩增曲线图；
图7为本发明的磁珠法病毒核酸提取试剂盒中实施例2提取的不同浓度的新冠假病毒的扩增曲线图；
图8为本发明的磁珠法病毒核酸提取试剂盒中实施例2提取浓度为1×105copies/ml的2019-nCOV假病毒的扩增曲线图；
图9为本发明的磁珠法病毒核酸提取试剂盒中实施例2提取的健康人咽拭子保存液游离DNA作为模板，扩增人内参RP30基因的扩增曲线图；
图10为本发明的磁珠法病毒核酸提取试剂盒中实施例2提取的新冠假病毒和人内参假病毒混合物核酸作为模板，经过三重荧光定量PCR扩增后的扩增曲线图；
图11为本发明的磁珠法病毒核酸提取试剂盒中实施例2试剂提取的假病毒梯度核酸扩增曲线图；
图12为本发明的磁珠法病毒核酸提取试剂盒中实施例2逗点生物试剂提取的假病毒梯度核酸扩增曲线图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例和附图进行详细描述。
实施例1：
本实施例的一种磁珠法病毒核酸提取试剂盒，其裂解液、清洗液I、清洗液II、洗脱液按以下配方配制，磁珠购自洛阳爱森生物科技有限公司。其中：
裂解液的成分和含量如下：
Figure BDA0002975283340000041
磁珠为超顺磁性氧化硅纳米磁性微珠；
清洗液I的成分和含量如下：
Figure BDA0002975283340000042
Figure BDA0002975283340000051
清洗液II为70％乙醇；
洗脱液的成分和含量如下：
PH7.0-8.0Tris-HCl 0.02mol/L
EDTA 0.002mol/L。
1.实验1：从2019-nCOV假病毒中提取不同浓度的病毒RNA
本实施例的样本准备过程如下：样本为2019-nCOV假病毒，购买自复百澳(苏州)生物科技有限公司。本发明在应用于RNA提取过程中，所有试剂均使用1‰DEPC处理的超纯水配制，所有耗材均无RNA酶污染。
具体稀释过程：取100ul浓度为1×108copies/ml的2019-nCOV假病毒稀释为1ml浓度为1×107copies/ml的假病毒。再取100ul浓度为1×107copies/ml的2019-nCOV假病毒稀释为1ml浓度为1×106copies/ml的假病毒。依此类推，最终得到浓度梯度为1×107copies/ml、1×106copies/ml、1×105copies/ml、1×104copies/ml、1×103copies/ml、1×102copies/ml的假病毒。使用96深孔板按以下表格预分装试剂：
Figure BDA0002975283340000052
将1-6号假病毒样本分别加入A1～H1/A7～H7孔中，每种浓度进行3次重复，在核酸提取仪上进行核酸提取。核酸提取仪使用公司自产的BNP32核酸提取仪。提取程序如下：
Figure BDA0002975283340000053
Figure BDA0002975283340000061
提取完成后，取A5～H5/A11～H11孔位的洗脱液得到RNA。
以提取得到的RNA为模板，使用扩增N基因的引物对和探针进行荧光定量PCR实验。一步法RT-qPCR试剂购自索莱宝TaqMan One Step RT-qPCR Kit(货号T2210)。按试剂盒说明书配制RT-PCR反应体系：25×One Step RT-qPCR RTase mix 1μl，5×One Step RT-qPCRBuffer 5.0μl，上游引物2ul，下游引物2ul，荧光探针1ul，提取好的RNA 5μl，无核酸酶水4.5ul。使用朗基Q1000荧光定量PCR仪进行实时荧光RT-PCR反应，反应程序如下：
Figure BDA0002975283340000062
N基因的引物对和探针序列见下表：
N-F gcagagacagaagaaaca
N-R actgctcatggattgttg
N-P aactgtgactcttcttcctgctgc
其中，N-P探针5’端荧光基团为6-FAM，3’端荧光基团TAMRA-N。
结果分析：
结果表明：使用本发明提取的不同浓度的新冠假病毒其重复性和梯度性都较好(图1)。
2.实验2：从2019-nCOV假病毒中提取病毒RNA
本实施例的样本准备过程如下：样本为2019-nCOV假病毒，购买自复百澳(苏州)生物科技有限公司。本发明应用于RNA提取过程中，所有试剂均使用1‰DEPC处理的超纯水配制，所有耗材均无RNA酶污染。具体稀释过程：将浓度为1×108copies/ml的2019-nCOV假病毒稀释至1×105copies/ml。共进行15次重复提取。使用96深孔板按以下表格预分装试剂：
Figure BDA0002975283340000063
Figure BDA0002975283340000071
将假病毒样本加入A1～H1/A7～H7孔中，在核酸提取仪上进行15次重复提取。实验中使用的核酸提取仪公司自产的BNP32核酸提取仪。提取程序同实验1。
提取完成后，取A5～H5/A11～H11孔位的洗脱液得到RNA。
以提取得到的RNA为模板，使用扩增N基因的引物对和探针进行荧光定量PCR实验，一步法RT-qPCR试剂购自索莱宝TaqMan One Step RT-qPCR Kit(货号T2210)。按试剂盒说明书配制RT-PCR反应体系：25×One Step RT-qPCR RTase mix 1μl，5×One Step RT-qPCRBuffer 5.0μl，上游引物2ul，下游引物2ul，荧光探针1ul，提取好的RNA 5μl，无核酸酶水4.5ul。使用朗基Q1000荧光定量PCR仪进行实时荧光RT-PCR反应。反应程序同实验1。
N基因的引物对和探针序列见下表：
N-F gcagagacagaagaaaca
N-R actgctcatggattgttg
N-P aactgtgactcttcttcctgctgc
其中，N-P探针5’端荧光基团为6-FAM，3’端荧光基团TAMRA-N。
结果表明：使用本发明提取的浓度为1×105copies/ml的2019-nCOV假病毒均一性较好(图2)。
3.实验3：从健康人咽拭子中提取核酸
本实施例的样本准备过程如下：样本为人RP30内参假病毒，使用96深孔板按以下表格预分装试剂：
Figure BDA0002975283340000072
使用公司自产的一次性病毒采样器(灭活型)，采集健康人的咽拭子后投入病毒采样器中，静置1小时后，取200ul病毒保存液加入试剂板的A1～H1/A7～H7孔中，共进行6次重复提取。实验过程中使用的核酸提取仪为公司自产的BNP32核酸提取仪。提取程序同实验1。
提取完成后，取A5～H5/A11～H11孔位的洗脱液得到基因组DNA。
以提取得到的基因组DNA为模板，使用人内参基因RP30的引物和探针进行荧光定量PCR实验，一步法RT-qPCR试剂购自索莱宝TaqMan One Step RT-qPCR Kit(货号T2210)。按试剂盒说明书配制RT-PCR反应体系：25×One Step RT-qPCR RTase mix 1μl，5×OneStep RT-qPCR Buffer 5.0μl，上游引物2ul，下游引物2ul，荧光探针1ul，提取好的RNA 5μl，无核酸酶水4.5ul。使用朗基Q1000荧光定量PCR仪进行实时荧光RT-PCR反应。反应程序同实验1。
RP30内参基因的引物对和探针序列见下表：
RP30-F CAAGTAAGTTTCTCCGAATCCC
RP30-R GCTGAAGTCCCATGACCGT
RP30-P CAACTGGAGGTAGAGACGGACTGCG
其中，RP30-P探针5’端荧光基团为VIC，3’端荧光基团BHQ1。
结果表明：使用本发明提取的健康人咽拭子保存液游离DNA作为模板，扩增人内参RP30基因，可以得到良好的扩增效果(图3)。
4.实验4：从咽拭子和假病毒混合物中提取核酸
本实施例的样本准备过程如下：样本为2019-nCOV假病毒和人RP30内参假病毒的混合物，假病毒购买自复百澳(苏州)生物科技有限公司。使用96深孔板按以下表格预分装试剂：
Figure BDA0002975283340000081
将假病毒样本加入A1～H1/A7～H7孔中，在核酸提取仪上进行15次重复提取。实验过程中使用的核酸提取仪为公司自产的BNP32核酸提取仪。提取程序同实验1。
提取完成后，取A5～H5/A11～H11孔位的洗脱液得到核酸。
以提取得到的核酸为模板，使用扩增新冠ORF1ab、N、人RP30靶点的引物对和探针进行荧光定量PCR实验，一步法RT-qPCR试剂购自索莱宝TaqMan One Step RT-qPCR Kit(货号T2210)。按试剂盒说明书配制RT-PCR反应体系：25×One Step RT-qPCR RTase mix 1μl，5×One Step RT-qPCR Buffer 5.0μl，上游引物2ul，下游引物2ul，荧光探针1ul，提取好的RNA 5μl，无核酸酶水4.5ul。使用博日FQD-96A荧光定量PCR仪进行实时荧光RT-PCR反应。反应程序同实验1。
RP30内参基因的引物对和探针序列见下表：
RP30-F CAAGTAAGTTTCTCCGAATCCC
RP30-R GCTGAAGTCCCATGACCGT
RP30-P CAACTGGAGGTAGAGACGGACTGCG
其中，RP30-P探针5’端荧光基团为VIC，3’端荧光基团BHQ1。
N基因的引物对和探针序列见下表：
N-F gcagagacagaagaaaca
N-R actgctcatggattgttg
N-P aactgtgactcttcttcctgctgc
其中，N-P探针5’端荧光基团为6-FAM，3’端荧光基团TAMRA-N。
ORF1ab基因的引物对和探针序列见下表：
ORF1ab-F agtggagtatggctacata
ORF1ab-R tggctcaaactcttcttc
ORF1ab-P aatcaccttcttcttcatcctcatctgg
其中，ORF1ab-P探针5’端荧光基团为ROX，3’端荧光基团BHQ2。
结果表明：使用本发明提取的新冠假病毒和人内参假病毒混合物核酸，经荧光定量PCR方法分析后，可以得到良好的扩增效果，且均一性很好。具体见图4。
5.实验5：本实施例配制的试剂盒和逗点生物试剂盒对比
本实施例的样本准备过程如下：样本为2019-nCOV假病毒，购买自复百澳(苏州)生物科技有限公司。本发明在应用于RNA提取过程中，所有试剂均用1‰DEPC处理的超纯水配制，所有耗材均无RNA酶污染。
具体稀释过程：取100ul浓度为1×108copies/ml的2019-nCOV假病毒稀释至1ml浓度为1×107copies/ml的假病毒。再取100ul浓度为1×107copies/ml的2019-nCOV假病毒稀释至1ml浓度为1×106copies/ml的假病毒。以此类推，最终稀释出浓度梯度分别为1×107copies/ml、1×106copies/ml、1×105copies/ml、1×104copies/ml、1×103copies/ml、1×102copies/ml的假病毒。
分别使用深圳逗点生物科技有限公司生产的病毒DNA/RNA提取试剂盒与本实施例配制的试剂盒分别进行提取。
逗点生物试剂按以下表格分装试剂：
Figure BDA0002975283340000101
本发明试剂按以下表格预分装试剂：
Figure BDA0002975283340000102
逗点生物试剂提取：将1-6号假病毒样本分别加入逗点生物试剂板的A1～H1/A7～H7孔中，每种浓度进行3个重复，样本加入完成后，在每孔中加入20ul蛋白酶K，蛋白酶K浓度为20mg/ml。完成后在核酸提取仪上进行核酸提取。实验过程中使用的核酸提取仪为公司自产的BNP32核酸提取仪。提取程序如下：
Figure BDA0002975283340000103
Figure BDA0002975283340000111
提取完成后，取A5～H5/A11～H11孔位的洗脱液得到RNA。
本发明试剂提取：将1-6号假病毒样本分别加入A1～H1/A7～H7孔中，每种浓度进行3个重复，在核酸提取仪上进行核酸提取。实验过程中使用的核酸提取仪为公司自产的BNP32核酸提取仪。提取程序同实验1。
提取完成后，取A5～H5/A11～H11孔位的洗脱液得到RNA。
以提取得到的RNA为模板，使用扩增N基因的引物对和探针进行荧光定量PCR实验，一步法RT-qPCR试剂购自索莱宝TaqMan One Step RT-qPCR Kit(货号T2210)。按试剂盒说明书配制RT-PCR反应体系：25×One Step RT-qPCR RTase mix 1μl，5×One Step RT-qPCRBuffer 5.0μl，上游引物2ul，下游引物2ul，荧光探针1ul，提取好的RNA 5μl，无核酸酶水4.5ul。使用朗基Q1000荧光定量PCR仪进行实时荧光RT-PCR反应，反应程序同实验1。
N基因的引物对和探针序列见下表：
N-F GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT
N-R CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG
N-P TTGCTGCTGCTTGACAGATT
其中，N-P探针5’端荧光基团为6-FAM，3’端荧光基团TAMRA-N。结果表明：使用本发明提取的不同浓度新冠假病毒核酸与逗点生物试剂提取的新冠假病毒核酸进行荧光定量PCR后对比发现，本发明提取的核酸作为模板进行扩增后，其CT值较逗点的试剂均提前3个CT值左右(图5，图6)。
6.实验6：本实施例的试剂盒和逗点生物试剂盒的稳定性对比
在室温下，无腐蚀性气体的避光环境中分别贮存本实施例的试剂盒和逗点生物试剂盒(对比例)，检测实施例1和对比例1试剂盒的稳定性。实施例1和对比例1的试剂盒每月选取同一样本测定三次，取CT平均值，与新鲜的实施例1和对比例1的试剂盒的检测结果进行比对，从而确定试剂盒的稳定时间。
样本使用106浓度新冠假病毒，测定ORF1ab靶点的CT值。
表1稳定性试验结果
时间 实施例1 新鲜的实施例1 对比例1 新鲜的对比例1
6个月 23.81 23.76 26.03 26.08
7个月 23.78 23.80 26.12 26.12
8个月 23.56 23.77 26.34 26.32
9个月 23.99 24.05 26.25 26.33
10个月 24.03 23.99 26.31 26.24
11个月 24.12 24.03 26.16 26.15
12个月 24.01 23.96 26.58 26.48
13个月 23.98 23.87 27.34 26.31
14个月 24.11 24.02 28.56 26.12
15个月 24.13 23.95 31.25 26.22
由表1可以看出，本实施例的试剂盒在室温，无腐蚀性气体的避光环境中贮存15个月稳定。对比例的试剂盒贮存12个月稳定，到第13个月时，稳定性急剧下降。
实施例2：
本实施例的一种磁珠法高效提取病毒核酸的提取试剂盒，裂解液、清洗液I、清洗液II、洗脱液按以下配方配制，磁珠购自洛阳爱森生物科技有限公司。其中：
裂解液的成分和含量如下：
Figure BDA0002975283340000121
磁珠为超顺磁性氧化硅纳米磁性微珠；
清洗液I的成分和含量如下：
Figure BDA0002975283340000122
Figure BDA0002975283340000131
清洗液II为70％乙醇；
洗脱液的成分和含量如下：
磷酸缓冲液 0.02mol/L
EDTA 0.002mol/L。
实验1：从2019-nCOV假病毒中提取不同浓度的病毒RNA
操作步骤同实施例1中实验1，本实施例提取的不同浓度的新冠假病毒重复性与梯度性效果见图7所示。
实验2：从2019-nCOV假病毒中提取病毒RNA
操作步骤同实施例1中实验2，本发明提取浓度为1×106copies/ml 2019-nCOV假病毒均一性较好。具体见图8。
实验3：从健康人咽拭子中提取核酸
操作步骤同实施例1中实验3，本发明提取的健康人咽拭子保存液游离DNA作为模板，扩增人内参RP30基因具有较好的均一性效果，具体见图9。
实验4：从咽拭子和假病毒混合物中提取核酸
操作步骤同实施例1中实验4，本发明提取的新冠假病毒和人内参假病毒混合物核酸，经荧光定量PCR方法分析后，可以得到良好的扩增效果，且均一性很好。具体见图10。
实验5：本实施例配制的试剂盒和逗点生物试剂盒对比
操作步骤同实施例1中实验5，本发明提取的不同浓度的新冠假病毒核酸与逗点生物试剂提取的假病毒核酸进行荧光定量PCR后对比发现，本发明提取的核酸作为模板进行扩增后，其CT值较逗点的试剂均提前3个CT值左右。具体见图11，图12。
实验6：本实施例的试剂盒和逗点生物试剂盒对比稳定性
在室温下，无腐蚀性气体的避光环境中分别贮存本实施例的试剂盒和逗点生物试剂盒(对比例)，检测实施例2和对比例2试剂盒的稳定性。实施例2和对比例2的试剂盒每月选取同一样本测定三次，取CT平均值，与新鲜的实施例2和对比例2的试剂盒的检测结果进行比对，从而确定试剂盒的稳定时间。样本使用浓度为106copies/ml的新冠假病毒，测定ORF1ab靶点的CT值。
表2稳定性试验结果
时间 实施例2 新鲜的实施例2 对比例2 新鲜的对比例2
6个月 23.68 23.54 26.38 26.14
7个月 23.52 23.82 26.72 26.21
8个月 24.02 24.14 26.82 26.35
9个月 23.98 23.86 26.84 26.42
10个月 23.84 23.57 26.54 26.42
11个月 23.85 23.78 26.53 26.38
12个月 24.01 24.01 26.38 26.27
13个月 23.96 23.85 27.54 26.22
14个月 23.58 23.64 28.92 26.54
15个月 24.03 24.08 31.98 26.66
由表2可以看出，本实施例的试剂盒在室温，无腐蚀性气体的避光环境中贮存15个月稳定。对比例的试剂盒贮存12个月稳定，到第13个月时，稳定性急剧下降。

Claims (2)

1.一种磁珠法病毒核酸提取试剂盒，其特征在于，包括裂解液、磁珠、清洗液I、清洗液II、洗脱液共五种成分，其中：
所述裂解液的成分和含量如下：
Figure FDA0003684917630000011
所述磁珠为超顺磁性氧化硅纳米磁性微珠；
所述清洗液I的成分和含量如下：
Figure FDA0003684917630000012
所述清洗液II为70％乙醇；
所述洗脱液的成分和含量如下：
缓冲液 0.02～0.03mol/L
EDTA 0.002～0.03mol/L；
所述非离子表面活性剂为NP-40、Tween-20、Triton-X100中的一种或多种；
所述结合剂为异丙醇。
2.根据权利要求1所述的磁珠法病毒核酸提取试剂盒，其特征在于：所述缓冲液为pH7.0-8.0Tris-HCl、磷酸缓冲液中的一种。
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