JP2024509588A - 抽出不要の病原体試験方法 - Google Patents
抽出不要の病原体試験方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2024509588A JP2024509588A JP2023555274A JP2023555274A JP2024509588A JP 2024509588 A JP2024509588 A JP 2024509588A JP 2023555274 A JP2023555274 A JP 2023555274A JP 2023555274 A JP2023555274 A JP 2023555274A JP 2024509588 A JP2024509588 A JP 2024509588A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- saliva
- samples
- swab
- sample
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 244000052769 pathogen Species 0.000 title claims description 24
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 title claims description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title description 75
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 146
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 104
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 81
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 81
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 81
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 63
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 31
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 21
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 141
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 70
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 claims description 64
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 27
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 26
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 21
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 17
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 claims description 10
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 claims description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 10
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 claims description 9
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 claims description 8
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 claims description 8
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 claims description 8
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 6
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 claims description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 4
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000012984 antibiotic solution Substances 0.000 claims description 4
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 claims description 4
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 claims description 4
- PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 3-[bis(2-carboxyethyl)phosphanyl]propanoic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 claims description 3
- 101710141795 Ribonuclease inhibitor Proteins 0.000 claims description 3
- 229940122208 Ribonuclease inhibitor Drugs 0.000 claims description 3
- 102100037968 Ribonuclease inhibitor Human genes 0.000 claims description 3
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 3
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 3
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 claims description 3
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 claims description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 2
- 101150013191 E gene Proteins 0.000 claims description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims 1
- 239000006177 biological buffer Substances 0.000 claims 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 claims 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 52
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 26
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 abstract description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 8
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 abstract description 5
- 239000006163 transport media Substances 0.000 abstract description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 175
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 60
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 47
- 108090000621 Ribonuclease P Proteins 0.000 description 45
- 102000004167 Ribonuclease P Human genes 0.000 description 42
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 42
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 36
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 36
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 36
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 34
- 238000011304 droplet digital PCR Methods 0.000 description 22
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 22
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 21
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 19
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 19
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 19
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 18
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 14
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 13
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 description 13
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 12
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 12
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 12
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 12
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 11
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 11
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 10
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 10
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 9
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 9
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 9
- 238000010340 saliva test Methods 0.000 description 9
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 9
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 9
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 7
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 7
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 7
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 7
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 238000007837 multiplex assay Methods 0.000 description 7
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 7
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 7
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 7
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 6
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 6
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 6
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 5
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 5
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 4
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 4
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 4
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 4
- 210000001533 respiratory mucosa Anatomy 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 4
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 4
- 229930183010 Amphotericin Natural products 0.000 description 3
- QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N Amphotericin A Natural products OC1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C=CC=CC=CC=CCCC=CC=CC(C)C(O)C(C)C(C)OC(=O)CC(O)CC(O)CCC(O)C(O)CC(O)CC(O)(CC(O)C2C(O)=O)OC2C1 QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 3
- 208000034657 Convalescence Diseases 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 3
- 229940009444 amphotericin Drugs 0.000 description 3
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 3
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 3
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 239000000120 Artificial Saliva Substances 0.000 description 2
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 2
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 2
- 241001647372 Chlamydia pneumoniae Species 0.000 description 2
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 2
- 206010018612 Gonorrhoea Diseases 0.000 description 2
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 2
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 2
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 2
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 2
- 241000713196 Influenza B virus Species 0.000 description 2
- 241000589242 Legionella pneumophila Species 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 2
- 241000579048 Merkel cell polyomavirus Species 0.000 description 2
- 208000005647 Mumps Diseases 0.000 description 2
- 241000202934 Mycoplasma pneumoniae Species 0.000 description 2
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 2
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 2
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 2
- 241000580858 Simian-Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 241000224527 Trichomonas vaginalis Species 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 2
- 208000001786 gonorrhea Diseases 0.000 description 2
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 229940115932 legionella pneumophila Drugs 0.000 description 2
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 2
- 208000010805 mumps infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 231100000989 no adverse effect Toxicity 0.000 description 2
- 238000005580 one pot reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 2
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 2
- 208000006379 syphilis Diseases 0.000 description 2
- 238000002627 tracheal intubation Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000228257 Aspergillus sp. Species 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000494545 Cordyline virus 2 Species 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 1
- 241000589989 Helicobacter Species 0.000 description 1
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 101000622427 Homo sapiens Vang-like protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000622430 Homo sapiens Vang-like protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 206010062717 Increased upper airway secretion Diseases 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 101710086015 RNA ligase Proteins 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102100023517 Vang-like protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100023520 Vang-like protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000000436 anus Anatomy 0.000 description 1
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 210000003756 cervix mucus Anatomy 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 210000001733 follicular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002175 menstrual effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000013188 needle biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000002445 nipple Anatomy 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- 208000026435 phlegm Diseases 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 210000004915 pus Anatomy 0.000 description 1
- 238000012113 quantitative test Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 206010041232 sneezing Diseases 0.000 description 1
- 238000012421 spiking Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 description 1
- 239000007762 w/o emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/26—Infectious diseases, e.g. generalised sepsis
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本発明は、抽出不要の直接的なＰＣＲ技術を介した感染症の迅速、正確、頑強、および低コストの診断を可能にする組成物および方法を提供する。本発明は、生物試料中の核酸の迅速で抽出不要の検出および分析のための組成物および方法を提供する。より具体的には、本発明は、最初の核酸抽出工程を必要とせずに、生物試料を処理して有用な核酸をその後の増幅および／または検出（例えば、次世代シーケンシングテクノロジーを使用）に提供するための組成物を提供する。さらに、本発明の組成物は、典型的にはＰＣＲを妨害するウイルス輸送培地を必要としない。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年３月９日出願の米国仮出願第６３／１５８，６８５号および２０２１年１１月８日出願の米国仮出願第６３／２７７，０６１号（各々の内容全体が、本明細書中で参考として援用される）に基づく優先権および利益を主張する。
本出願は、２０２１年３月９日出願の米国仮出願第６３／１５８，６８５号および２０２１年１１月８日出願の米国仮出願第６３／２７７，０６１号（各々の内容全体が、本明細書中で参考として援用される）に基づく優先権および利益を主張する。
技術分野
本発明は、一般に、抽出不要で病原体の試験および検出を実施するための診断方法、より具体的には、組成物および方法に関する。
本発明は、一般に、抽出不要で病原体の試験および検出を実施するための診断方法、より具体的には、組成物および方法に関する。
背景
感染症の世界的拡大は、ヘルスケア上の大きな問題である。例えば、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が急拡大して世界的規模のパンデミックをもたらしており、感染症の迅速かつ早期の検出が重要になってきている。
感染症の世界的拡大は、ヘルスケア上の大きな問題である。例えば、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が急拡大して世界的規模のパンデミックをもたらしており、感染症の迅速かつ早期の検出が重要になってきている。
多くの感染症のための現在の検出技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する。ＰＣＲは、目的のＤＮＡ（ＤＮＡ標的）の特異的領域を選択的に増幅させるために使用される技術である。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの検出のための種々のリアルタイムＰＣＲアッセイ（定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）とも称される）は、世界的に開発されており、これらは、標的とされるウイルスの遺伝子または領域が異なっている。
現在のＰＣＲ法は、感染症の検出および診断が可能であるが、これらの方法には欠点がある。１つの顕著な欠点は、現在のアプローチがウイルス試験プロトコールの一部として臨床試料から核酸を単離および精製する最初の工程に依存するという点である。例えば、ＲＮＡを相対的に定量するためにｑＰＣＲを適用するためには、典型的には、以下を必要とする：（１）試料からの総ＲＮＡの単離および精製；（２）材料の溶離および可能な限りの濃縮；および（３）逆転写（ＲＴ）反応において精製されたＲＮＡを使用して相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成し、次いで、これをｑＰＣＲ反応に利用すること。
従来の方法においてＰＣＲを実施する前に必要とされる最初の核酸の単離および精製工程（すなわち、抽出工程）は、依然として手作業であるために多くの労力を要しかつ高額であり、偶然の汚染および人為的エラーの危険性をさらに高めるので、診断プロセスにおいて大きな障壁となっている。さらに、需要が高まっているときに、核酸抽出用品が不足すると、そのようなウイルス検出法の実施がさらに制限され得る。
要旨
本発明は、生物試料中の核酸の迅速で抽出不要の検出および分析のための組成物および方法を提供する。より具体的には、本発明は、最初の核酸抽出工程を必要とせずに、生物試料を処理して有用な核酸をその後の増幅および／または検出（例えば、次世代シーケンシングテクノロジーを使用）に提供するための組成物を提供する。さらに、本発明の組成物は、典型的にはＰＣＲを妨害するウイルス輸送培地を必要としない。本発明の組成物は、例えば、試料の輸送および調製のための固有の緩衝液組成物を含み、この組成物は、目的の試料と混合したときに、最初の核酸抽出（すなわち、核酸の単離および精製）を必要とせずに直接的に複製および分析するための試料由来の核酸を調製することができる。
本発明は、生物試料中の核酸の迅速で抽出不要の検出および分析のための組成物および方法を提供する。より具体的には、本発明は、最初の核酸抽出工程を必要とせずに、生物試料を処理して有用な核酸をその後の増幅および／または検出（例えば、次世代シーケンシングテクノロジーを使用）に提供するための組成物を提供する。さらに、本発明の組成物は、典型的にはＰＣＲを妨害するウイルス輸送培地を必要としない。本発明の組成物は、例えば、試料の輸送および調製のための固有の緩衝液組成物を含み、この組成物は、目的の試料と混合したときに、最初の核酸抽出（すなわち、核酸の単離および精製）を必要とせずに直接的に複製および分析するための試料由来の核酸を調製することができる。
本発明によれば、試料の試験は、核酸抽出工程を用いずに試料を直接試験する。その代わりに、臨床試料が固有の緩衝液組成物中に提供された後に、核酸を、下流のｑＰＣＲ、ｒｔＰＣＲ、および／またはＮＧＳベースの診断試験のために直接使用する。本発明は、特定の病原体の検出のために必要とされるＤＮＡまたはＲＮＡの検出に有用である。検出のための標的核酸は、ヒト、病原体、または寄生虫の配列であり得る。
好ましい実施形態では、本発明の組成物および方法は、試料の調製および試験に必要な工程数を減らすことによって従来の病原体の試験および検出アプローチを改良する。それにより、ウイルス試験に必要な時間が大幅に減少し、その結果、検査所要時間および結果の送達がより早くなる。さらに、本発明は、労働および消耗品の費用が削減され、試料の交差汚染および作業者の試料感染がさらに抑えられる。
本発明は、任意の病原体または病原体の組み合わせに適用可能である。したがって、本発明は、ウイルス核酸、細菌核酸、または他の病原体由来配列（例えば、寄生虫、真菌、原生動物などに由来する）の検出に有用である。下記のように、本発明は、異なる病原体由来の核酸の検出および／または同定に合わせた緩衝液を提供する。さらに、本発明は、単一のアッセイにおける複数の病原体型の検出を意図する。例えば、本発明の方法は、単一試料中の複数の呼吸器ウイルス（例えば、インフルエンザおよびＳＡＲＳ）を検出可能である。
１つの態様では、ウイルス感染を検出する方法を提供する。本発明の方法は、ウイルス、細菌、および他の感染（インフルエンザウイルスおよびパラインフルエンザウイルス、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、麻疹、ムンプス、アデノウイルス、コロナウイルス、ＨＰＶ、ＨＩＶ、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）、サイトメガロウイルス、レンサ球菌、細菌インフルエンザ（例えば、インフルエンザ菌）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、性行為細菌感染（例えば、クラミジア、淋病、梅毒）、結核、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ Ｐｙｌｏｒｉ、真菌（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎ）、およびＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ならびに寄生虫（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）が挙げられるが、これらに限定されない）の検出に有用である。例示的な方法としては、個体から生物試料を得ることが挙げられる。本発明により、核酸抽出工程を必要とする従来のアプローチが回避される。臨床試料は固有の緩衝液組成物中に提供され、試料中の核酸が、下流のｑＰＣＲ、ｒｔＰＣＲ、またはＮＧＳベースの診断試験のために使用される。本発明は、試料に応じて必要とされるＤＮＡまたはＲＮＡの検出に有用である。本発明の目的のために、標的核酸は、ヒトゲノム配列、ヒト転写配列、任意の病原体配列（ウイルス、細菌など）、真菌配列、または寄生虫配列であり得る。
本発明は、任意の生物試料（例えば、任意の組織試料または体液試料）と用いるために適用可能である。最も注目すべきは、試料は、唾液試料（患者が適切な採取容器に吐き出すことによって採取する）または呼吸粘膜（鼻咽頭スワブまたは咽頭スワブを介して採取）である。しかしながら、試料としては、血液、尿、脳脊髄液、膿、便、性器分泌物（膣分泌物、乳頭吸引物が挙げられる）、汗、涙液、針生検流動物、および他の排出試料も挙げられる。例えば、ある特定のウイルス感染、特に性感染（ＳＴＩ）に関連する感染症を試験する場合、生物試料を、従来の手段によって採取し得る。特に、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の検出のために試験を実施する場合、被験体の肛門および／または性器由来の生物試料（すなわち、組織および／または体液（ｂｏｄｉｌｙ ｆｌｕｉｄ））を、スワブなどを介して採取し得る。主な採取手段としては、液体試料（例えば、唾液および／または他の分泌物）またはスワビング（例えば、鼻咽頭スワブ）が挙げられる。
好ましい方法は、試料を、核酸を最初に抽出することなく、核酸増幅に好適な生物試料から核酸を調製することができる本発明の緩衝液組成物と混合する工程をさらに含む。生物試料と緩衝液との混合の際に、緩衝液により、試料中の核酸を、典型的な抽出（単離および精製）工程を必要とせずに、その後の核酸分析（すなわち、ＰＣＲを介した増幅）に容易に利用可能である。緩衝液組成物は、一般に、試料のタイプに特異的である。例えば、唾液試料を試験する場合、緩衝液組成物は、ヌクレアーゼフリー水、抗真菌剤溶液、抗生物質溶液、リボヌクレアーゼ阻害剤、および還元剤溶液を含む。鼻咽頭試料を試験する場合、緩衝液組成物は、ヌクレアーゼフリー水、抗真菌剤溶液、抗生物質溶液、リボヌクレアーゼ阻害剤、およびトリス－ホウ酸－ＥＤＴＡ緩衝液を含む。さらに、また、鼻咽頭試料のための緩衝液組成物は、輸送培地としての機能を果たし、緩衝液組成物を含む適切な採取容器内にスワブを直接入れる。細菌試料および真菌試料のための緩衝液は、必要に応じて、抗生物質および／または抗真菌剤を構成要素として使用しなくてよい。しかしながら、抗生物質は細菌細胞に対して作用することが意図されるが、細菌核酸には作用しないので、例えば、緩衝液中に抗生物質が存在しても、細菌核酸の抽出不要の分析は妨げられない。
方法は、ウイルス、細菌、または他の病原体由来の核酸を検出するために調製した核酸に対して１またはそれを超えるＰＣＲアッセイを実施する工程をさらに含み、その際に、患者が感染しているかを診断することができる。ＰＣＲアッセイの実施工程は、ウイルス核酸特異的プライマー－プローブセットの使用を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス核酸特異的プライマー－プローブセットは、ウイルスのＮ遺伝子、ＯＲＦｌａｂ遺伝子、およびＥ遺伝子のうちの１つまたは複数を標的にする。さらに、いくつかの実施形態では、ＰＣＲアッセイを実施する工程は、リボヌクレアーゼＰ（ＲＮＰ）に特異的なプライマー－プローブセットの使用を含む。また、本明細書中に開示の抽出方法は、核酸の供給源に依存しないので、ヒトのゲノム配列またはＲＮＡ配列の検出に有用である。
いくつかの実施形態では、方法は、ウイルス核酸を定量する工程をさらに含む。例えば、１またはそれを超えるＰＣＲアッセイの実施は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）およびデジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）（ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）が含まれ得る）のうちの少なくとも１つの実施を含む。患者の診断に加えて、方法は、ウイルス核酸量に基づいてウイルス感染の重症度を決定する工程をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、連続した時点で前記患者から得た複数の生物試料中のウイルス核酸量を比較し、経時的なウイルス核酸量の増加または減少に基づいて疾患の進行を決定する工程をさらに含み得る。本発明の方法は、ウイルス核酸の同一性または量に基づいて疾患アウトカムを予想する工程をさらに含み得る。また、本発明の本方法を使用して、一連の処置または予後診断のための情報が得られる場合がある。例えば、結果を使用して、適切な治療上の手順または臨床上の手順を決定することができる。
いくつかの実施形態では、同一試料由来の複数の分析物を検出する方法を提供する。特に、いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の抽出不要の直接的なＰＣＲ技術にしたがって、同一の生物試料中の複数のウイルス感染を検出する。例えば、本発明の方法を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのコロナウイルス感染を検出することができる一方で、別の呼吸器病原体（インフルエンザウイルスなど）も検出できる。他の実施形態では、ウイルス、細菌、および／または他の感染症の組み合わせ（呼吸器ウイルス、インフルエンザウイルスおよびパラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、麻疹、ムンプス、アデノウイルス、コロナウイルス、ＨＰＶ、ＨＩＶ、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス、レンサ球菌、細菌インフルエンザ（例えば、インフルエンザ菌）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、性行為細菌感染（例えば、クラミジア、淋病、梅毒）、結核、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ Ｐｙｌｏｒｉ、真菌（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎ）、およびＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ならびに寄生虫（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）が挙げられるが、これらに限定されない）を、同一の生物試料から検出することができる。
詳細な説明
本発明は、抽出不要の直接的なＰＣＲ技術を介した感染症の迅速な診断を可能にする組成物および方法を提供する。より具体的には、本発明は、最初のＲＮＡ抽出工程を必要とせずに、生物試料を処理し、その後のＰＣＲアッセイに有用なＤＮＡを提供するための組成物を提供する。
本発明は、抽出不要の直接的なＰＣＲ技術を介した感染症の迅速な診断を可能にする組成物および方法を提供する。より具体的には、本発明は、最初のＲＮＡ抽出工程を必要とせずに、生物試料を処理し、その後のＰＣＲアッセイに有用なＤＮＡを提供するための組成物を提供する。
本発明の組成物は、目的の試料を混合するときに、最初の核酸抽出（すなわち、核酸の単離および精製）を必要とせずに試料由来の核酸を核酸の増幅および分析のために直接使用することが可能な試料の輸送および調製のための固有の緩衝液を含む。したがって、市販のＲＮＡ抽出キットおよび技術を使用したＲＮＡ抽出工程を含む従来のアプローチと異なり、本発明の直接試料試験は、抽出工程を省くことによってこのプロセスを回避する。
結果として、本発明の組成物および方法は、工程を削減し、効率を上げることによって従来の病原体試験および検出アプローチを改善する。病原体試験に必要な時間が大幅に削減され、それにより、検査所要時間が短くなり、かつ結果が迅速に送達される。さらに、本発明は、労働および消耗品の費用が削減され、試料の交差汚染および作業者の試料感染がさらに抑えられる。
本明細書中に記載の方法が種々の感染症（細菌、真菌、寄生虫、またはウイルスが挙げられる）の診断に有用であることに注目すべきである。しかしながら、説明および例を簡潔かつ容易にするために、抽出不要の直接ＰＣＲアプローチによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２診断のための方法を以下に記載する。同一の手順が、細菌、真菌、または寄生虫の感染に有用である。
例示的な病原体（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、重度の症状および死亡に至る呼吸器疾患（新型コロナウイルス感染症２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）と称される）の大流行の原因と同定されたウイルスである。無症候性の拡大は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と共通している。したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在をモニタリングし、その拡大を予防するために、可能な限り早期および迅速に感染を検出することが極めて重要である。本発明の方法は、ＰＣＲアッセイに依存する従来のウイルス検出法で典型的に必要とされる試料調製中の工程数を削減することによって、ウイルス感染（すなわち、患者内のウイルスの存在）を迅速に検出する。
一般に、本発明を使用するためのワークフローは、感染の疑いのある個体から生物試料を得ることを含む。試料の採取方法および採取される試料のタイプは、試験される特定の疾患に依存し得る。例えば、生物試料は、体液を含んでよく、任意の臨床的に許容され得る様式で採取され得る。液体試料は、一般に、症状を示すか、試験によって疾患について陽性であった他者と接触した疑いのある患者から採取される。
体液は、例えば、ヒトまたは他の哺乳動物由来の液状物質であり得る。かかる体液としては、粘液、血液、血漿、血清、血清誘導体、胆汁、血液、母体血液、たん、唾液、痰、汗、羊水、月経液、乳房液、卵巣の卵胞液、ファロピウス管液、腹腔液、尿、精液、および脳脊髄液（ＣＳＦ）（腰椎または脳室のＣＳＦなど）が挙げられるが、これらに限定されない。また、試料は、細胞または生物学的物質を含む培地であり得る。また、試料は、血餅、例えば、血清を除去した後に全血から得られる血餅であり得る。ある特定の実施形態では、試料は、被験体から採取された血液、唾液、または精液である。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２について、生物試料を、一般に、鼻咽頭スワブまたは咽頭スワブを介して採取するか、いくつかの場合、試料は唾液であり得る。次に、試料を、その後の分析のために調製する。試料の調製は、核酸の最初の抽出を行わずに、核酸増幅に適切な生物試料から核酸を調製することができる緩衝液組成物と試料を混合することを含む。
前述したように、現在のウイルス試験アプローチは、ウイルス試験プロトコールの一部としての最初に臨床試料から核酸を単離および精製する工程に依存する。例えば、目的のＲＮＡの相対的定量のためのｑＰＣＲの適用前に、以下を行う：（１）試料からの総ＲＮＡの単離および精製；（２）材料の溶離および可能な限りの濃縮；および（３）逆転写（ＲＴ）反応において精製されたＲＮＡを使用して相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成し、次いで、これをｑＰＣＲ反応に利用すること。現在の方法においてＰＣＲの実施前に必要とされる最初の核酸の単離および精製工程（すなわち、抽出工程）は、依然として手作業であるために多くの労力を要しかつ高額であり、偶然の汚染および人為的エラーが起こる機会をさらに増やすので、診断プロセスにおいて大きな障壁となっている。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、Ｋ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓ（米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号（本明細書中で参考として援用される））の方法を指す。プライマーを、種々の方法（当該分野で周知の方法を使用した適切な配列のクローニングおよび直接的な化学合成（Ｎａｒａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６８：９０（１９７９）；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６８：１０９（１９７９））が挙げられるが、これらに限定されない）によって調製することができる。また、プライマーを、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓｉｇｍａ、およびＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなどの事業者から得ることができる。増幅または配列決定のためのアダプターもしくはバーコード、またはこれらの組み合わせを、断片化された核酸に付着させてもよい。かかる分子を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）などから購入してもよい。ある特定の実施形態では、かかる配列を、リガーゼなどの酵素を用いてテンプレート核酸分子に付着させる。好適なリガーゼとしては、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）から商業的に入手可能なＴ４ ＤＮＡリガーゼおよびＴ４ ＲＮＡリガーゼが挙げられる。ライゲーションには、平滑末端または相補的な突出末端を使用してよい。
デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）は、従来のポリメラーゼ連鎖反応法の改良版であり、核酸ストランド（ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡが挙げられる）を直接定量し、クローニングによって増幅するために使用することができる。ｄＰＣＲでは、試料を多数の区分に分離し、各区分で各々反応を行い、それにより、標準的なＰＣＲ技術で認められるように試料全体についての単一の値が得られるのとは対照的に、各区分における蛍光分析によって標的ＤＮＡを高感度に定量可能である。
ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）は、前述の区分がナノリットルサイズの油中水滴型乳濁液の液滴からなり、例えば、ドロップレットフローサイトメトリーを使用してＰＣＲ反応および蛍光検出を行うことができるｄＰＣＲ法である。ｄｄＰＣＲのために液滴を作出して読み出す方法は、他所に詳述されているが（Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，’Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ：ｂｒｅａｋｉｎｇ ｔｈｅ ｏｎｅ ｔａｒｇｅｔ ｐｅｒ ｃｏｌｏｒ ｂａｒｒｉｅｒ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ’，Ｌａｂ Ｃｈｉｐ，１１：２１６７－２１７４，２０１１を参照のこと）、基本的には、各液滴は個別の反応ウェルのように働き、サーマルサイクリング後、各液滴の１つ１つの蛍光強度を、フローサイトメーターのような通過装置で読み取り、ピーク蛍光強度を記録する。
本発明の組成物および方法を使用して任意の病原体に特異的な核酸を検出することができるが、好ましい実施形態では、呼吸器病原体が検出標的である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などの呼吸器病原体の検出のための例示的なプライマーおよびプローブは、記載されている（例えば、Ｔａｏ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，２０２０およびＤｏｎｇ，Ｉ ｅｔ ａｌ．２０２０を参照のこと）。唾液試料および鼻咽頭試料のｄｄＰＣＲを使用したＣＯＶＩＤ－１９感染の検出のための本発明の組成物および方法は、前述の文献中で考察されたものと同一のプライマーおよびプローブを使用することを意図する。さらに、いくつかの実施形態では、１またはそれを超えるＰＣＲアッセイを実施する工程は、リボヌクレアーゼＰ（ＲＮＰ）に特異的なプライマー－プローブセットの使用を含む。
例えば、本発明の方法で使用されるプライマーおよびプローブは、ＣＤＣ２０１９－ｎＣｏＶリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ診断パネル（ＣＤＣウェブサイト：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ／２０１９－ｎｃｏｖ／ｌａｂ／ｒｔ－ｐｃｒ－ｐａｎｅｌ－ｐｒｉｍｅｒ－ｐｒｏｂｅｓ．ｈｔｍｌ、最終更新日：２０２０年６月６日にて公表）に列挙され、かつ関連のあるプライマーおよびプローブを含み得る。本発明では、かかるプライマーおよびプローブとしては、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）によって提供されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２研究使用限定ｑＰＣＲプライマーおよびプローブが挙げられ得るが、これらに限定されない。例えば、かかるプライマー／プローブとしては、以下が挙げられる：ｎＣＯＶ＿Ｎ１順方向プライマー（カタログ番号１０００６８３０）；ｎＣＯＶ＿Ｎ１逆方向プライマー（カタログ番号１０００６８３１）；ｎＣＯＶ＿Ｎ１プローブ（カタログ番号１０００６８３２）；ＲＮａｓｅＰ順方向プライマー（カタログ番号１０００６８３６）；ＲＮａｓｅＰ逆方向プライマー（カタログ番号１０００６８３７）；およびＲＮａｓｅＰ（ＡＴＴＯ（商標）６４７）プローブ（カタログ番号１０００７０６２）。
ウイルスが感染しているとの個体の診断に加えて、本発明の方法は、ウイルス核酸量に基づいてウイルス感染の重症度を決定する工程をさらに含み得る。例えば、本発明の方法は、疾患の重症度および／または進行と直接相関し得るウイルス量を評価するのに有用である。いくつかの実施形態では、方法は、連続した時点で前記患者から得た複数の生物試料中のウイルス核酸量を比較し、経時的なウイルス核酸量の増加または減少に基づいて疾患の進行を決定する工程をさらに含み得る。また、本発明の方法を使用して、ウイルス核酸量に基づいて疾患アウトカムおよび／または重症度を予測することができる。疾患アウトカムは、挿管法、ＩＣＵ入院、退院、挿管法までの時間、退院までの時間、および死亡のうちの１つまたは複数から選択される。
図１は、本発明の固有の緩衝液組成物によって採取および処理した生物標本（スピット試料またはスワブ試料）中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の核酸の定量的検出を意図する抽出不要のリアルタイムＲＴ－ｑＰＣＲ試験の図による概観を示す。鼻咽頭スワブの場合、スワブを使用して呼吸粘膜を採取し、次いで、潜在的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス粒子のための輸送培地および試料調製培地の両方として使用される本発明の固有の緩衝液組成物を含む許容され得る容器内に入れる。唾液の場合、患者が許容され得る容器に唾液を単純に吐き出し、その時点で、次いで、唾液を試料調製のための固有の緩衝液組成物を含む別の容器に移すであろう。固有の緩衝液組成物内に回収され、提供される際に、ウイルス粒子は、加熱によるか、緩衝液中での直接的な溶解のいずれかによって不活化され得る。次いで、不活化された試料を、従来のアプローチが依存するさらなるＲＮＡ抽出工程（単離および精製）を必要とせずに、下流のｑＰＣＲ診断試験のために使用することができる。むしろ、調製された試料は、ＰＣＲ－プレート（９６／３８４ウェル）フォーマットに移され、このフォーマットにおいて逆転写（ＲＴ）によるｃＤＮＡ合成およびｑＰＣＲによる検出が実施され得る。したがって、市販のＲＮＡ抽出キットを使用するＲＮＡ抽出工程を含む広く使用されているアプローチと異なり、直接的な試料試験は、抽出を省略することによってこのプロセスを回避する。
図２は、ウイルス感染の疑いのある患者から採取された試料１０２およびウイルス感染に関連するウイルス核酸が存在するかどうかを決定するために試料に対して１またはそれを超えるアッセイを実施することができる装置２００への試料のローディングを示す。本明細書中により詳細に記載するように、ウイルス感染の疑いのある（またはウイルス感染しているかウイルス感染の疑いのある１人またはそれを超える者と濃厚接触している）患者から得た（１２）試料１０２（唾液または呼吸粘膜）を、好適な容器１０４に含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、試料を、ねじ蓋付きクリオバイアルなどの遠心管などの所有の容器に採取および保存し得る。好ましくは、ねじ蓋付きの１．９ｍｌクリオバイアルを使用する。漏斗または唾液採取の補助具を使用して唾液採取を容易にし、近位側にブレークポイントを有する鼻腔スワブを使用し、それにより、使用後にチューブにスワブを挿入可能である。唾液および鼻腔スワブの両方に同一のチューブを使用することの利点は、下流操作における試料のアクセス、例えば、デキャッパーを使用した自動化を容易にすることである。ねじ蓋は、汚染防止に重要である。標準的なサイズのクリオバイアルは、試料をさらに移し替えることなく試料を直接貯蔵することが可能である。
図２は、ＰＣＲ－プレート１０６中への試料１０２のローディングをさらに示す。ローディングにより、試料調製１４が行われ得る（固有の緩衝液および／またはＰＣＲミックスへの試料の導入）。その時点で、次いで、プレート１０６を装置２００に導入することが可能であり、それにより、試料１０２に対して１またはそれを超えるＰＣＲアッセイを実施して、ウイルスに関連するウイルス核酸が存在するかどうかを決定することができる。特に、装置２００は、方法１０の事前工程（ウイルスＲＮＡの検出、ｃＤＮＡを産生するためのＲＮＡの逆転写、ｃＤＮＡの増幅（操作１６）、増幅工程由来のデータの解析（操作１８）、およびウイルス評価（操作２０）に関連する情報を提供するレポート３００の作成が挙げられるが、これらに限定されない）のうちの任意の１つを提供するように構成され得る。したがって、装置２００は、一般に、配列を検出し、そして／または標的核酸（複数可）または得られた断片をカウントするように構成される。この例では、複数の断片が存在するか予想される場合、フラグメントは、例えば、ｑＰＣＲによって定量され得る。得られたレポート３００は、アッセイに関連する特定のデータ（例えば、患者データ（すなわち、背景情報、属性および特徴、病歴、追跡情報）、試験データ（試験した試料がウイルスについて陽性または陰性のいずれであるか、陽性であるならば、さらなる測定基準（疾患の進行および予測される疾患アウトカムが挙げられる）が挙げられる）を含み得る。
抽出不要のＰＣＲは、プロテイナーゼＫ（ＰＫ）の消化効率に一部依存する。ＰＫが存在しない場合、ＤＮＡまたはＲＮＡの所望の試料が分解されるであろう。スワブまたは唾液マトリックスのいずれかにおけるＰＫ活性を最適にするために、種々の緩衝液の構成要素を試験した。これは、スワブ試料において特に重要である。未処理の唾液として採取および輸送することができる唾液と異なり、スワブ試料は、ウイルス輸送培地（ＶＴＭ）中に保存されなければならない。しかしながら、ＶＴＭ中の従来のスワブ試料は、通常、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試験のためにＲＮＡ抽出を必要とする。
本発明者らは、抽出不要のＰＣＲのために種々の緩衝液の構成要素、ＶＴＭ、および市販のスワブ採取デバイス－ＯＲ１００（ＤＮＡ Ｇｅｎｏｔｅｋ）を試験した。陰性スワブ試料を、健常人から採取し、各々の溶液に入れた。次いで、唾液試料用の唾液調製緩衝液（以下を参照のこと）とＰＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の混合物またはスワブ試料用のＰＫのみのいずれかを予め充填した９６ウェルプレート中に試料を分割することによって、ＰＫと混合した熱失活させたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに試料をスパイクした。唾液試料（ＳａｌｉｖａＦＡＳＴ）については、単一の唾液試料由来の３０μＬを、プレートの各々のウェル中で、５μＬの唾液調製緩衝液および５μＬのＰＫと混合した。スワブ試料（ＳｗａｂＦＡＳＴ）については、単一スワブ試料由来の３５μＬを、ウェルあたり５μＬのＰＫと混合した。次いで、調製された試料のプレートを、デジタルマイクロプレートシェーカーに５００ＲＰＭで１分間置き、次いで、熱失活のために９５℃で５分間サーマルサイクラー上に置いた。
図３Ａに示すように、ＰＢＳ、ＶＴＭ、およびＯＲ１００中のスワブ試料は、Ｎ１領域に陽性シグナルを生じなかった。陽性シグナルのうち、本発明のウイルス輸送緩衝液（ＶＴＢ）のための緩衝液の構成要素を含むトリス－ホウ酸－ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝液中の人為的スワブ試料は、最も強い定量サイクル（Ｃｑ）値が得られた。同様に、種々の緩衝液の構成要素、未処理唾液、および市販の唾液採取デバイス－ＯＭ５０５（ＤＮＡＧｅｎｏｔｅｋ）を、抽出不要のＰＣＲのために試験した。図３Ｂに示すように、ＯＭ５０５中の人為的唾液試料は、Ｎ１領域で陽性シグナルを生じなかった。陽性シグナルのうちで、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）緩衝液の条件下の人為的唾液試料は、最も強いＣｑ値を生じ、この緩衝液を使用して、ＳａｌｉｖａＦＡＳＴプロトコールのＰＫ効率を改善する。
ウイルス輸送緩衝液（ＶＴＢ）の安定性
異なる温度および時間でＶＴＢ安定性を試験した。高い方の温度では、ＶＴＢを４℃、室温、および３７℃で３２週間置き、陰性スワブ試料を異なる濃度の熱失活させたＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルス中にスパイクし、４週間毎に試験した。３２週間の結果を図４Ａに示す。同様に、低温では、ＶＴＢを、－８０℃、－２０℃、および４℃に、本原稿時点で３週間置き、陰性スワブ試料を、異なる濃度の熱失活させたＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルス中にスパイクし、毎週試験した。３週間目の結果を、図４Ｂに示す。異なる濃度（４、４０、４００、４０００コピー／μＬ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２人為的試料についてのＮ１プライマー／プローブでのＣｑ値は、全ての実験保存温度にわたって一定のままであった。
異なる温度および時間でＶＴＢ安定性を試験した。高い方の温度では、ＶＴＢを４℃、室温、および３７℃で３２週間置き、陰性スワブ試料を異なる濃度の熱失活させたＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルス中にスパイクし、４週間毎に試験した。３２週間の結果を図４Ａに示す。同様に、低温では、ＶＴＢを、－８０℃、－２０℃、および４℃に、本原稿時点で３週間置き、陰性スワブ試料を、異なる濃度の熱失活させたＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルス中にスパイクし、毎週試験した。３週間目の結果を、図４Ｂに示す。異なる濃度（４、４０、４００、４０００コピー／μＬ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２人為的試料についてのＮ１プライマー／プローブでのＣｑ値は、全ての実験保存温度にわたって一定のままであった。
抽出不要のＰＣＲ試験の分析的検証
鼻腔スワブ標本および唾液標本についての抽出不要のＲＴ－ｑＰＣＲアッセイの分析的妥当性を確立するために、ＲＮＡ抽出を用いた場合と用いない場合のＲＴ－ｑＰＣＲ試験由来の結果を比較した（図５Ａ～５Ｄを参照のこと）。次に、検出限界（ＬｏＤ）研究を行ってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の最低検出可能濃度を決定し、この濃度において、全真陽性試料のうちのおよそ９５％が試験で陽性であった（図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、および５Ｄを参照のこと）。
鼻腔スワブ標本および唾液標本についての抽出不要のＲＴ－ｑＰＣＲアッセイの分析的妥当性を確立するために、ＲＮＡ抽出を用いた場合と用いない場合のＲＴ－ｑＰＣＲ試験由来の結果を比較した（図５Ａ～５Ｄを参照のこと）。次に、検出限界（ＬｏＤ）研究を行ってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の最低検出可能濃度を決定し、この濃度において、全真陽性試料のうちのおよそ９５％が試験で陽性であった（図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、および５Ｄを参照のこと）。
ＲＮＡ抽出を使用した場合または使用しない場合のＲＴ－ｑＰＣＲの結果：
図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、および５Ｄに示すように、スワブ試料または唾液試料のいずれかにおいて抽出不要のＲＴ－ｑＰＣＲ法がＲＮＡ抽出を用いるＲＴ－ｑＰＣＲ法と等価であることを実証するために、以下の３つの方法を、異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２濃度で比較した：（１）ＲＮＡ抽出を用いずに分析した、緩衝液を混合した人為的試料（スワブまたは唾液）（左側の青色の棒グラフ）；（２）ＲＮＡ抽出を用いて分析した人為的試料（スワブまたは唾液）（中央の橙色の棒グラフ）；および（３）ＲＮＡ抽出を用いて分析した、ＤＮＡ Ｇｅｎｏｔｅｋデバイス（スワブについてはＯＲ－１００および唾液についてはＯＭ－５０５）を用いて採取した人為的試料（スワブまたは唾液）（右側の灰色の棒グラフ）。両方の標本タイプについて各々のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２濃度（１、１０、１００、１０００、１００００コピー／μＬ）で行った３つの方法についてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２遺伝子のＮ１領域（図５Ａおよび５Ｂ）およびＲＮＰ遺伝子（図５Ｃおよび５Ｄ）のプライマー／プローブでのＣｑ値は、全ての比較対象にわたってＣｑ値を用いた場合に同一の定性的試験結果および類似の定量的試験結果を示す。
図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、および５Ｄに示すように、スワブ試料または唾液試料のいずれかにおいて抽出不要のＲＴ－ｑＰＣＲ法がＲＮＡ抽出を用いるＲＴ－ｑＰＣＲ法と等価であることを実証するために、以下の３つの方法を、異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２濃度で比較した：（１）ＲＮＡ抽出を用いずに分析した、緩衝液を混合した人為的試料（スワブまたは唾液）（左側の青色の棒グラフ）；（２）ＲＮＡ抽出を用いて分析した人為的試料（スワブまたは唾液）（中央の橙色の棒グラフ）；および（３）ＲＮＡ抽出を用いて分析した、ＤＮＡ Ｇｅｎｏｔｅｋデバイス（スワブについてはＯＲ－１００および唾液についてはＯＭ－５０５）を用いて採取した人為的試料（スワブまたは唾液）（右側の灰色の棒グラフ）。両方の標本タイプについて各々のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２濃度（１、１０、１００、１０００、１００００コピー／μＬ）で行った３つの方法についてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２遺伝子のＮ１領域（図５Ａおよび５Ｂ）およびＲＮＰ遺伝子（図５Ｃおよび５Ｄ）のプライマー／プローブでのＣｑ値は、全ての比較対象にわたってＣｑ値を用いた場合に同一の定性的試験結果および類似の定量的試験結果を示す。
検出限界（ＬｏＤ）：
最初に、濃度範囲が１～１００，０００コピー／μＬの熱失活させたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの１０倍連続希釈した人為的試料を、ＳｗａｂＦＡＳＴおよびＳａｌｉｖａＦＡＳＴの個別の実施においてそれぞれ使用した（図６Ａを参照のこと）。ＬｏＤの範囲を、各標本タイプについて０、２、４、６、８、１０、５０、および１００コピー／μＬの濃度レベルに連続希釈した人為的試料の６つのレプリケートを使用してさらに狭めた。仮のＬｏＤを４コピー／μＬとした。
最初に、濃度範囲が１～１００，０００コピー／μＬの熱失活させたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの１０倍連続希釈した人為的試料を、ＳｗａｂＦＡＳＴおよびＳａｌｉｖａＦＡＳＴの個別の実施においてそれぞれ使用した（図６Ａを参照のこと）。ＬｏＤの範囲を、各標本タイプについて０、２、４、６、８、１０、５０、および１００コピー／μＬの濃度レベルに連続希釈した人為的試料の６つのレプリケートを使用してさらに狭めた。仮のＬｏＤを４コピー／μＬとした。
この濃度レベルで２０のレプリケートを使用してＬｏＤを確認した。結果は、アッセイのＬｏＤが４コピー／μＬであることが定められ、この濃度で、スワブおよび唾液の両方について、レプリケートの９５％超の試験結果が陽性であった（２０／２０）（図６Ｂを参照のこと）。
抽出不要のＰＣＲ試験の臨床的検証
ＲＮＡ抽出を使用した場合または使用しない場合のＲＴ－ｑＰＣＲの結果：
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の陽性および陰性の臨床試料を、ＲＮＡ抽出を用いる場合または用いない場合（ＣＯＶＩＤＦａｓｔ）で試験した。３８のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性および３１の陰性スワブ試料を半分に分割し、ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイを、ＲＮＡ抽出を用いる場合または用いない場合で実施した。陽性一致率（ＰＰＡ）および陰性一致率（ＮＰＡ）は、共に１００％である（以下の表１Ａを参照のこと）。
ＲＮＡ抽出を使用した場合または使用しない場合のＲＴ－ｑＰＣＲの結果：
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の陽性および陰性の臨床試料を、ＲＮＡ抽出を用いる場合または用いない場合（ＣＯＶＩＤＦａｓｔ）で試験した。３８のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性および３１の陰性スワブ試料を半分に分割し、ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイを、ＲＮＡ抽出を用いる場合または用いない場合で実施した。陽性一致率（ＰＰＡ）および陰性一致率（ＮＰＡ）は、共に１００％である（以下の表１Ａを参照のこと）。
同様に、８２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性試料および１７１の陰性唾液試料を半分に分割し、ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイを、ＲＮＡ抽出を用いる場合または用いない場合で実施した。ＰＰＡおよびＮＰＡは、それぞれ、９８．８％および９９．４％である（以下の表１Ｂを参照のこと）。
別の抽出不要のアッセイ（ＳａｌｉｖａＤｉｒｅｃｔ）に対する臨床的検証：
また、ＣＯＶＩＤＦａｓｔ試験を、ＳａｌｉｖａＤｉｒｅｃｔに対しても臨床的に検証した。ＳｗａｂＦＡＳＴを、同一患者由来の対のＳａｌｉｖａＤｉｒｅｃｔ試験を使用して検証し、ＳａｌｉｖａＦＡＳＴを、ＳａｌｉｖａＤｉｒｅｃｔのために採取した同一の唾液試料を使用して検証した。コミュニティメンバー由来の１７９の対の臨床試料（すなわち、各々の試験被験体が、１つの唾液試料および１つの前鼻孔スワブ試料を提供した）を、ＳｗａｂＦＡＳＴによって分析し、ＳａｌｉｖａＤｉｒｅｃｔと比較した。ＰＰＡおよびＮＰＡは、それぞれ、８３．３％および９９．４％である（以下の表２Ａを参照のこと）。
また、ＣＯＶＩＤＦａｓｔ試験を、ＳａｌｉｖａＤｉｒｅｃｔに対しても臨床的に検証した。ＳｗａｂＦＡＳＴを、同一患者由来の対のＳａｌｉｖａＤｉｒｅｃｔ試験を使用して検証し、ＳａｌｉｖａＦＡＳＴを、ＳａｌｉｖａＤｉｒｅｃｔのために採取した同一の唾液試料を使用して検証した。コミュニティメンバー由来の１７９の対の臨床試料（すなわち、各々の試験被験体が、１つの唾液試料および１つの前鼻孔スワブ試料を提供した）を、ＳｗａｂＦＡＳＴによって分析し、ＳａｌｉｖａＤｉｒｅｃｔと比較した。ＰＰＡおよびＮＰＡは、それぞれ、８３．３％および９９．４％である（以下の表２Ａを参照のこと）。
同様に、４０の未処理唾液臨床試料を、ＳａｌｉｖａＦＡＳＴによって分析し、独立したＳａｌｉｖａＤｉｒｅｃｔ認定ＣＬＩＡ臨床検査室によって実施されたＳａｌｉｖａＤｉｒｅｃｔと比較した。ＰＰＡおよびＮＰＡは、それぞれ、９５％および１００％である（以下の表２Ｂを参照のこと）。
唾液および鼻腔スワブの例
本発明の方法によるウイルス核酸の検出のためのプロトコールの例を以下に提供する。生物試料を入手し、この試料は、ヒト体液（ｂｏｄｉｌｙ ｆｌｕｉｄ）を含む場合があり、任意の臨床的に許容され得る様式で採取され得る。
本発明の方法によるウイルス核酸の検出のためのプロトコールの例を以下に提供する。生物試料を入手し、この試料は、ヒト体液（ｂｏｄｉｌｙ ｆｌｕｉｄ）を含む場合があり、任意の臨床的に許容され得る様式で採取され得る。
多数の呼吸器感染について、生物試料は、一般に、鼻腔スワブまたは咽頭スワブ、または、いくつかの場合、唾液によって採取される。他の例では、試料は、大気中から、より好ましくは、咳またはくしゃみによる液滴の排出によって得たエアロゾル試料または液滴を含み得る。
唾液試料の採取：
唾液試料を、例えば、提供された滅菌容器への吐き出しによって個体から採取し得る。唾液採取デバイスは、例えば、１．９ｍｌのねじ蓋付きの（外ねじ式）保存チューブまたはバイアルを含み得る。保存チューブは、特に、研究所、地域、および自動化過程の間でデータを共有する場合のトラッキングおよびトレーサビリティに有用な機械可読ラベルであるバーコードまたは他の識別マークをさらに含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、保存チューブは、側面に予め印刷された１０桁の一次元バーコードおよび底部にレーザーでエッチングされたＤＡＴＡＭＡＴＲＩＸ二次元コードを含み、このチューブを唾液試料の容器として使用した。唾液採取補助漏斗（Ｎｅｓｔ）または唾液採取補助具（Ｓａｌｉｍｅｔｒｉｃｓ）を、試料保存チューブと連携して使用した。いくつかの実施形態では、保存チューブは、Ｂｒｏｏｋｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ提供のＦｌｕｉｄＸトリコード化Ｎｅｘｔ Ｇｅｎ Ｊａｃｋ １．９ｍｌ試料保存チューブおよび／またはＡｚｅｎｔａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ提供の０．５ｍｌトリコード化チューブを含む。
唾液試料を、例えば、提供された滅菌容器への吐き出しによって個体から採取し得る。唾液採取デバイスは、例えば、１．９ｍｌのねじ蓋付きの（外ねじ式）保存チューブまたはバイアルを含み得る。保存チューブは、特に、研究所、地域、および自動化過程の間でデータを共有する場合のトラッキングおよびトレーサビリティに有用な機械可読ラベルであるバーコードまたは他の識別マークをさらに含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、保存チューブは、側面に予め印刷された１０桁の一次元バーコードおよび底部にレーザーでエッチングされたＤＡＴＡＭＡＴＲＩＸ二次元コードを含み、このチューブを唾液試料の容器として使用した。唾液採取補助漏斗（Ｎｅｓｔ）または唾液採取補助具（Ｓａｌｉｍｅｔｒｉｃｓ）を、試料保存チューブと連携して使用した。いくつかの実施形態では、保存チューブは、Ｂｒｏｏｋｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ提供のＦｌｕｉｄＸトリコード化Ｎｅｘｔ Ｇｅｎ Ｊａｃｋ １．９ｍｌ試料保存チューブおよび／またはＡｚｅｎｔａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ提供の０．５ｍｌトリコード化チューブを含む。
検査室での唾液試料の受け取りおよび受け入れ：
試料を検査室に輸送し、バッグから取り出し、任意の漏れまたは損傷について目視にて検査した。プレスクリーニング工程を通過した試料を、検査室に移動させた。保存チューブ上のバーコードを、ラボ情報管理システム（ＬＩＭＳ）によってスクリーニングした。ＬＩＭＳ中に完全な患者情報を有し、かつ漏れのないチューブ（すなわち、要件を満たした試料）を、バーコード化された４８－フォーマットラックに入れた。
試料を検査室に輸送し、バッグから取り出し、任意の漏れまたは損傷について目視にて検査した。プレスクリーニング工程を通過した試料を、検査室に移動させた。保存チューブ上のバーコードを、ラボ情報管理システム（ＬＩＭＳ）によってスクリーニングした。ＬＩＭＳ中に完全な患者情報を有し、かつ漏れのないチューブ（すなわち、要件を満たした試料）を、バーコード化された４８－フォーマットラックに入れた。
唾液反応緩衝液：
試料調製の一部として、唾液試料を、唾液のために特別に調製された固有の緩衝液組成物（本明細書中で唾液調製緩衝液と称される）と混合した。唾液調製緩衝液の調製は、少なくとも以下の装置の使用を含む：バイオセーフティキャビネットまたは層流フード（無菌環境を維持することができる作業場）；個包装の滅菌ピペット、ピペットチップ（１０および２５ｍＬなど）；ピペットエイド；ピペッター、１ｍＬまたは２００μＬおよび対応するチップ；および５０ｍｌのヌクレアーゼフリーの滅菌Ｆａｌｃｏｎチューブ。
試料調製の一部として、唾液試料を、唾液のために特別に調製された固有の緩衝液組成物（本明細書中で唾液調製緩衝液と称される）と混合した。唾液調製緩衝液の調製は、少なくとも以下の装置の使用を含む：バイオセーフティキャビネットまたは層流フード（無菌環境を維持することができる作業場）；個包装の滅菌ピペット、ピペットチップ（１０および２５ｍＬなど）；ピペットエイド；ピペッター、１ｍＬまたは２００μＬおよび対応するチップ；および５０ｍｌのヌクレアーゼフリーの滅菌Ｆａｌｃｏｎチューブ。
例示的な唾液調製緩衝液は、以下の試薬／構成要素を含む：
・０．５ＭのＢｏｎｄ－Ｂｒｅａｋｅｒ ＴＣＥＰ溶液（（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、中性ｐＨ）、滅菌、ＤＮａｓｅ、Ｒｎａｓｅ、およびプロテアーゼ非含有グレード、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号７７７２０、５ｍＬ）；
・ＲＮａｓｅ阻害剤（ヒト胎盤、４０，０００単位／ｍｌ、滅菌、Ｄｎａｓｅ、Ｒｎａｓｅ非含有グレード、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｍ０３０７Ｌ、１０，０００単位、２５０ｕｌ／チューブ）；
・アンホテリシンＢ溶液（脱イオン水中２５０μｇ／ｍｌ、滅菌、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ２９４２、１００ｍｌ（または真菌の汚染および成長を防止するのに適切な濃度の類似の抗真菌剤））；
・ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（１００×、作業濃度の１００倍のペニシリン（１０，０００ＩＵ）およびストレプトマイシン（１０，０００μｇ／ｍｌ）の混合物、滅菌、Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３０－００２－ＣＩ（または細菌の汚染および成長を防止するのに適切な濃度の類似の抗生物質）；
・ヌクレアーゼフリー水（滅菌、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｓｉｇｍａ、Ｗ４５０２、Ｄｎａｓｅ、Ｒｎａｓｅ、およびプロテアーゼ非含有グレード）；および
・消毒薬（７０％エタノールなど）。
・０．５ＭのＢｏｎｄ－Ｂｒｅａｋｅｒ ＴＣＥＰ溶液（（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、中性ｐＨ）、滅菌、ＤＮａｓｅ、Ｒｎａｓｅ、およびプロテアーゼ非含有グレード、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号７７７２０、５ｍＬ）；
・ＲＮａｓｅ阻害剤（ヒト胎盤、４０，０００単位／ｍｌ、滅菌、Ｄｎａｓｅ、Ｒｎａｓｅ非含有グレード、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｍ０３０７Ｌ、１０，０００単位、２５０ｕｌ／チューブ）；
・アンホテリシンＢ溶液（脱イオン水中２５０μｇ／ｍｌ、滅菌、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ２９４２、１００ｍｌ（または真菌の汚染および成長を防止するのに適切な濃度の類似の抗真菌剤））；
・ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（１００×、作業濃度の１００倍のペニシリン（１０，０００ＩＵ）およびストレプトマイシン（１０，０００μｇ／ｍｌ）の混合物、滅菌、Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３０－００２－ＣＩ（または細菌の汚染および成長を防止するのに適切な濃度の類似の抗生物質）；
・ヌクレアーゼフリー水（滅菌、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｓｉｇｍａ、Ｗ４５０２、Ｄｎａｓｅ、Ｒｎａｓｅ、およびプロテアーゼ非含有グレード）；および
・消毒薬（７０％エタノールなど）。
成分の調製は、少なくとも以下の工程を含む：作業表面を適切な消毒薬で清潔にする；作業表面上に置く前に試薬瓶を消毒する；ヌクレアーゼフリー水を、５０ｍＬの滅菌Ｆａｌｃｏｎチューブ中に４０ｍＬ分割し、室温（ＲＴ）で保存する；アンホテリシンＢを４ｍｌ／チューブ（５ｍｌの滅菌ｃｏｒｎｉｎｇチューブ中）の量で分割し、－２０℃で保存する；ペニシリン／ストレプトマイシンを１ｍｌ／チューブ（滅菌エッペンドルフチューブ中）の量で分割し、－２０℃で保存する。
唾液調製緩衝液の調製は、少なくとも以下の工程を含む：
１．作業表面を適切な消毒薬で清潔にする；
２．作業表面上に置く前に試薬瓶（分割量、ＲＮａｓｅを除く）を消毒する；
３．例えば、５ｍＬの緩衝液（試験１０００回分）を調製するために：
３．１．１５ｍＬの滅菌ｆａｌｃｏｎチューブ中に、４．３ｍＬのヌクレアーゼフリー水を添加する；
３．２．４００ｕＬのＴＣＥＰを添加する；
３．３．滅菌ピペットを使用して、５０ｕｌのＲＮａｓｅ阻害剤を添加する；
３．４ アンホテリシンのチューブおよびペニシリン／ストレプトマイシンのチューブを解凍し、滅菌ピペットを使用して、２００ｕＬのアンホテリシンおよび５０ｕＬのペニシリン／ストレプトマイシンを１５ｍＬのｆａｌｃｏｎチューブに無菌的に添加する；
４．検査室で管理されているノートにロットに関する情報および調製を記録する；
５．検査室に適切な識別子を割り当てる（例えば、ロット番号）；
６．チューブにしっかりと蓋をし、チューブを反転させることによって完全に混合する；
７．ＱＣ試料のために１００ｕｌの培地を抜き取る；
８．ボトルを以下のようにラベリングする：
唾液反応緩衝液
Ｌａｂ ＩＤ：（サミットバッファー１としてのＳＴＢ１などの検査室に適切な識別子を挿入する）
ＤＯＭ：（製造日を挿入する）
有効期限：（製造日から１ヶ月後の日付を挿入する）
２～８℃で保存する
９．ＳａｌｉｖａＦＡＳＴ試験を実施する場合、２～８℃で保存し、３０ｕＬの唾液および５ｕＬのプロテイナーゼＫを共に５ｕｌ／各試験で添加する；
１０．無菌状態をチェックする。
１．作業表面を適切な消毒薬で清潔にする；
２．作業表面上に置く前に試薬瓶（分割量、ＲＮａｓｅを除く）を消毒する；
３．例えば、５ｍＬの緩衝液（試験１０００回分）を調製するために：
３．１．１５ｍＬの滅菌ｆａｌｃｏｎチューブ中に、４．３ｍＬのヌクレアーゼフリー水を添加する；
３．２．４００ｕＬのＴＣＥＰを添加する；
３．３．滅菌ピペットを使用して、５０ｕｌのＲＮａｓｅ阻害剤を添加する；
３．４ アンホテリシンのチューブおよびペニシリン／ストレプトマイシンのチューブを解凍し、滅菌ピペットを使用して、２００ｕＬのアンホテリシンおよび５０ｕＬのペニシリン／ストレプトマイシンを１５ｍＬのｆａｌｃｏｎチューブに無菌的に添加する；
４．検査室で管理されているノートにロットに関する情報および調製を記録する；
５．検査室に適切な識別子を割り当てる（例えば、ロット番号）；
６．チューブにしっかりと蓋をし、チューブを反転させることによって完全に混合する；
７．ＱＣ試料のために１００ｕｌの培地を抜き取る；
８．ボトルを以下のようにラベリングする：
唾液反応緩衝液
Ｌａｂ ＩＤ：（サミットバッファー１としてのＳＴＢ１などの検査室に適切な識別子を挿入する）
ＤＯＭ：（製造日を挿入する）
有効期限：（製造日から１ヶ月後の日付を挿入する）
２～８℃で保存する
９．ＳａｌｉｖａＦＡＳＴ試験を実施する場合、２～８℃で保存し、３０ｕＬの唾液および５ｕＬのプロテイナーゼＫを共に５ｕｌ／各試験で添加する；
１０．無菌状態をチェックする。
別の例示的な唾液調製緩衝液は、本質的に、少なくとも以下の試薬／構成要素／溶液を含む：
・４０μＭ ＴＣＥＰ溶液（０．５Ｍ Ｂｏｎｄ－Ｂｒｅａｋｅｒ ＴＣＥＰ溶液、（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、中性ｐＨ）、滅菌、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、およびプロテアーゼ非含有グレード、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号７７７２０、５ｍＬ）、それぞれ、水のＴＣＥＰに対する比１１．５：１からなる（例えば、４６ｍＬの水および４ｍＬのＴＥＣＰ）；
・ＴＰ－ＲＡＰ溶液（上記のＴＣＥＰ溶液＋さらなる構成要素）（４０μＭ ＴＣＥＰ溶液（およそ９４９μＬ）、ＲＮａｓｅ阻害剤（およそ１μＬ）、ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（およそ１０μＬ）、およびアンホテリシンＢ溶液（およそ４０μＬ）を含む）；および
・唾液プロテアーゼ緩衝液（上記のＴＰ－ＲＡＰ溶液＋プロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）（ＴＰ－ＲＡＰ溶液およびプロテイナーゼＫを１：１の比で含む（各々およそ５ｍＬ））。
・４０μＭ ＴＣＥＰ溶液（０．５Ｍ Ｂｏｎｄ－Ｂｒｅａｋｅｒ ＴＣＥＰ溶液、（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、中性ｐＨ）、滅菌、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、およびプロテアーゼ非含有グレード、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号７７７２０、５ｍＬ）、それぞれ、水のＴＣＥＰに対する比１１．５：１からなる（例えば、４６ｍＬの水および４ｍＬのＴＥＣＰ）；
・ＴＰ－ＲＡＰ溶液（上記のＴＣＥＰ溶液＋さらなる構成要素）（４０μＭ ＴＣＥＰ溶液（およそ９４９μＬ）、ＲＮａｓｅ阻害剤（およそ１μＬ）、ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（およそ１０μＬ）、およびアンホテリシンＢ溶液（およそ４０μＬ）を含む）；および
・唾液プロテアーゼ緩衝液（上記のＴＰ－ＲＡＰ溶液＋プロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）（ＴＰ－ＲＡＰ溶液およびプロテイナーゼＫを１：１の比で含む（各々およそ５ｍＬ））。
上記の成分の調製は、（本明細書中の前出の様式で）少なくとも以下の工程を含む：
１．０．５Ｍストック溶液から約４０μＭ ＴＣＥＰを調製する；
２．４ｍＬの０．５Ｍ ＴＣＥＰを４６ｍＬのヌクレアーゼフリー水に添加する；
３．最初に、４，７４５μＬの約４０μＭ ＴＣＥＰを１０ｍＬチューブに添加する；
４．２００μＬの希釈アンホテリシン（Ａｍｐｈｏｔｅｒｃｉｎ）－Ｂ溶液を添加する；
５．５０μＬの希釈ペニシリン（Ｐｅｎｎｉｃｉｌｉｎ）・ストレプトマイシン溶液を添加する；
６．５ｕＬのＮＥＢヒト胎盤由来ＲＮＡｓｅ阻害剤を添加する；
７．５，０００ｕＬ（５ｍＬ）のＰｒｏｍｅｇａプロテイナーゼ（Ｐｒｏｔｉｎａｓｅ）Ｋ溶液を添加する；
８．混合し、日付、名称、および期限をラベリングし、４℃で１ヶ月間まで保存する。
１．０．５Ｍストック溶液から約４０μＭ ＴＣＥＰを調製する；
２．４ｍＬの０．５Ｍ ＴＣＥＰを４６ｍＬのヌクレアーゼフリー水に添加する；
３．最初に、４，７４５μＬの約４０μＭ ＴＣＥＰを１０ｍＬチューブに添加する；
４．２００μＬの希釈アンホテリシン（Ａｍｐｈｏｔｅｒｃｉｎ）－Ｂ溶液を添加する；
５．５０μＬの希釈ペニシリン（Ｐｅｎｎｉｃｉｌｉｎ）・ストレプトマイシン溶液を添加する；
６．５ｕＬのＮＥＢヒト胎盤由来ＲＮＡｓｅ阻害剤を添加する；
７．５，０００ｕＬ（５ｍＬ）のＰｒｏｍｅｇａプロテイナーゼ（Ｐｒｏｔｉｎａｓｅ）Ｋ溶液を添加する；
８．混合し、日付、名称、および期限をラベリングし、４℃で１ヶ月間まで保存する。
唾液試料の調製：
分析用の各々のウェルは、１０μＬ／ウェルの試料調製ミックス（ＳＰＭ）を含んでいた。ＳＰＭは、唾液調製緩衝液およびプロテアーゼ（プロテイナーゼＫ）を含む。特に、９６ウェルＳＰＰは、マルチチャネルイコライザーまたはＶｉａｆｌｏｗ（Ｉｎｔｅｇｒａ）を使用して各々のウェルに分注された、１０μＬのＳＰＭ（５μＬ唾液調製緩衝液および５μＬプロテイナーゼＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ））／ウェルを含んでいた。バイオセーフティキャビネット内で半自動６チャネルデキャッパー（Ｂｒｏｏｋｓ）またはＨａｍｉｌｔｏｎ Ｉ．Ｄ．キャッパーを用いて試料のキャップを開けた。６チャネルデキャッパーを使用する場合、キャップをキャップキャリアラック上に一時的に置いた。およそ３０μＬの唾液を、Ｅｌ－ＣｌｉｐＴｉｐ電子マルチチャネル（８チャネル）イコライザーを使用して、４８ウェルラック中のチューブから、１０μＬのＳＰＭを含む９６ウェルＳＰＰに移し、十分にピペッティングした。試料の２つの４８ウェルラックは、１つの９６ウェルＳＰＰに収まるであろう。試料のキャップを再度閉めた（６チャネルデキャッパーを使用した場合には一度に６本、または自動化４８－フォーマットデキャッパーを使用した場合には一度に４８本）。唾液およびＳＰＭを、プレートをデジタルマイクロプレートシェーカー上に５００ＲＰＭで１分間置くことによって十分に混合した。プレートを、ｍｉｎｉＡｍｐ９６ウェルＰＣＲ装置上に９５℃で５分間置き、４℃で保持した。次いで、試料のラック全体を、一時試料保存エリアに移した。反復試験を必要とする試料のうちのいずれかを、一時試料保存エリアから同定した。反復試験は、１回のみ許容される。
分析用の各々のウェルは、１０μＬ／ウェルの試料調製ミックス（ＳＰＭ）を含んでいた。ＳＰＭは、唾液調製緩衝液およびプロテアーゼ（プロテイナーゼＫ）を含む。特に、９６ウェルＳＰＰは、マルチチャネルイコライザーまたはＶｉａｆｌｏｗ（Ｉｎｔｅｇｒａ）を使用して各々のウェルに分注された、１０μＬのＳＰＭ（５μＬ唾液調製緩衝液および５μＬプロテイナーゼＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ））／ウェルを含んでいた。バイオセーフティキャビネット内で半自動６チャネルデキャッパー（Ｂｒｏｏｋｓ）またはＨａｍｉｌｔｏｎ Ｉ．Ｄ．キャッパーを用いて試料のキャップを開けた。６チャネルデキャッパーを使用する場合、キャップをキャップキャリアラック上に一時的に置いた。およそ３０μＬの唾液を、Ｅｌ－ＣｌｉｐＴｉｐ電子マルチチャネル（８チャネル）イコライザーを使用して、４８ウェルラック中のチューブから、１０μＬのＳＰＭを含む９６ウェルＳＰＰに移し、十分にピペッティングした。試料の２つの４８ウェルラックは、１つの９６ウェルＳＰＰに収まるであろう。試料のキャップを再度閉めた（６チャネルデキャッパーを使用した場合には一度に６本、または自動化４８－フォーマットデキャッパーを使用した場合には一度に４８本）。唾液およびＳＰＭを、プレートをデジタルマイクロプレートシェーカー上に５００ＲＰＭで１分間置くことによって十分に混合した。プレートを、ｍｉｎｉＡｍｐ９６ウェルＰＣＲ装置上に９５℃で５分間置き、４℃で保持した。次いで、試料のラック全体を、一時試料保存エリアに移した。反復試験を必要とする試料のうちのいずれかを、一時試料保存エリアから同定した。反復試験は、１回のみ許容される。
ＰＣＲ試薬の調製およびプレートのセットアップ（唾液試験）：
ＰＣＲマスターミックス（本明細書中でＰＣＲマスターミックスプレート（ＰＭＭＰ）と称される）を含むプレートを使用し、このプレートは、マルチチャネルイコライザーまたはＶｉａｆｌｏｗ（Ｉｎｔｅｇｒａ）を使用して９６または３８４ウェルプレート上のプレートの各々のウェル中に分注された１２．５μＬのＰＣＲマスターミックスを含んでいた。ＰＣＲマスターミックスは、１０μＬのルナ・ユニバーサル・プローブ・ワンステップ反応ミックス、１μＬのルナ・ウォームスタート・ＲＴ酵素ミックス、および１．５μＬのＮ１／ＲＮＰプライマー／プローブから構成された。１．５μＬのＮ１／ＲＮＰプライマー／プローブを、５０．２５μＬの各々の１００μＭのプライマーおよびプローブストックを５２４μＬのＩＤＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５）に添加することによって、６．７μＭのＮ１プライマーおよびＲＮＰプライマーの作業ストック溶液および１．７μＭのＦＡＭ標識Ｎ１およびＡＴＴＯ－６４７標識ＲＮＰプローブとして作製した。
ＰＣＲマスターミックス（本明細書中でＰＣＲマスターミックスプレート（ＰＭＭＰ）と称される）を含むプレートを使用し、このプレートは、マルチチャネルイコライザーまたはＶｉａｆｌｏｗ（Ｉｎｔｅｇｒａ）を使用して９６または３８４ウェルプレート上のプレートの各々のウェル中に分注された１２．５μＬのＰＣＲマスターミックスを含んでいた。ＰＣＲマスターミックスは、１０μＬのルナ・ユニバーサル・プローブ・ワンステップ反応ミックス、１μＬのルナ・ウォームスタート・ＲＴ酵素ミックス、および１．５μＬのＮ１／ＲＮＰプライマー／プローブから構成された。１．５μＬのＮ１／ＲＮＰプライマー／プローブを、５０．２５μＬの各々の１００μＭのプライマーおよびプローブストックを５２４μＬのＩＤＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５）に添加することによって、６．７μＭのＮ１プライマーおよびＲＮＰプライマーの作業ストック溶液および１．７μＭのＦＡＭ標識Ｎ１およびＡＴＴＯ－６４７標識ＲＮＰプローブとして作製した。
９６ウェルまたは３８４ウェルＰＭＭＰをＰＣＲワークステーションに入れ、７．５μＬの唾液試料調製工程由来の処置済み唾液試料をＰＭＭＰの各々の指定のウェルに添加した。次いで、処置済み唾液試料を、ピペッティングによってＰＣＲマスターミックスと混合した。次いで、７．５μＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する正の対照（ＩＤＴ合成２０１９－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－Ｎ対照、４０００コピー／ｕＬ）および負の対照（ＩＤＴ Ｈｓ－ＲＰＰ３０対照、４０００コピー／ｕＬ）ならびにテンプレートなしの対照（ＮＴＣ－水）を、対照のための指定のＰＣＲウェルに添加し（プレートあたり１つの正の対照、１つの負の対照、およびＮＴＣ）、発泡を回避しながらピペッティングによって混合した。
ＰＣＲサーマルプロファイル（増幅領域）（唾液試験）：
プレートをＢｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸまたはＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏＰＣＲ装置にロードし、マスターファイル「ＳＴ－ＣＯＶ－ＰＣＲプロトコール」を開き、以下のサーモサイクラー条件で運転する：
１．工程１：５５℃で１０分間、１サイクル；
２．工程２：９５℃で１分間、１サイクル；および
工程３：９５℃で１０秒間、６０℃で３０秒間（＋Ｎ１標的のためのＦＡＭチャネルおよびＲＮＰ標的のためのＣｙ５チャネルの両方でのプレートの読み取り）を４０サイクル。
プレートをＢｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸまたはＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏＰＣＲ装置にロードし、マスターファイル「ＳＴ－ＣＯＶ－ＰＣＲプロトコール」を開き、以下のサーモサイクラー条件で運転する：
１．工程１：５５℃で１０分間、１サイクル；
２．工程２：９５℃で１分間、１サイクル；および
工程３：９５℃で１０秒間、６０℃で３０秒間（＋Ｎ１標的のためのＦＡＭチャネルおよびＲＮＰ標的のためのＣｙ５チャネルの両方でのプレートの読み取り）を４０サイクル。
データ解釈（ＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ ｏｐｕｓ９６ウェルフォーマット）（唾液試験）：
Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸはＣｑ値を報告し、ここでＣｑ値のファイル（ｃｓｖファイル）はＰＣＲ装置からＯｖＤｘ ＬＩＭＳにエクスポートされる。Ｃｑ値の解釈（検出、非検出、および無効）は、以下の基準にしたがってＯｖＤｘ ＬＩＭＳにエクスポートされるであろう：
Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸはＣｑ値を報告し、ここでＣｑ値のファイル（ｃｓｖファイル）はＰＣＲ装置からＯｖＤｘ ＬＩＭＳにエクスポートされる。Ｃｑ値の解釈（検出、非検出、および無効）は、以下の基準にしたがってＯｖＤｘ ＬＩＭＳにエクスポートされるであろう：
Ｎ１が検出された場合、結果は有効であり、ＲＮＰについての値と無関係に「検出」と返答される。Ｎ１が検出されず、かつＲＮＰが３５以下である場合、「非検出」という結果が返答される。ＲＮＰのＣｑ値が３５を超え、かつＮ１が３６を超える場合、試料は再試験に回される。再試験後、ＲＮＰが依然として３５を超える場合、供給者は、別の試料を採取するために連絡しなければならない。ＮａＮ＝非数。
鼻腔スワブ（前鼻孔）試料の採取：
鼻腔スワブ採取デバイスは、例えば、１．９ｍｌ保存チューブ（唾液試料採取に関して本明細書中の前に記載）を含む。保存チューブを、１ｍｌの鼻腔スワブ試料に特異的な固有の緩衝液組成物（以後、スワブ輸送緩衝液と称する）で満たし、この保存チューブを鼻腔スワブ試料の容器として使用するであろう；Ｎｅｓｔの口腔／鼻孔スワブを使用して患者の前鼻孔を拭い、その後にスワブ輸送緩衝液で満たした試料保存チューブに入れるであろう。
鼻腔スワブ採取デバイスは、例えば、１．９ｍｌ保存チューブ（唾液試料採取に関して本明細書中の前に記載）を含む。保存チューブを、１ｍｌの鼻腔スワブ試料に特異的な固有の緩衝液組成物（以後、スワブ輸送緩衝液と称する）で満たし、この保存チューブを鼻腔スワブ試料の容器として使用するであろう；Ｎｅｓｔの口腔／鼻孔スワブを使用して患者の前鼻孔を拭い、その後にスワブ輸送緩衝液で満たした試料保存チューブに入れるであろう。
スワブ調製緩衝液：
試料調製の一部として、スワブ試料を、スワブ試料のために特別に調製された固有の緩衝液組成物（スワブ調製緩衝液と称される）と混合した。スワブ調製緩衝液の調製は、少なくとも以下の装置の使用を含む：バイオセーフティキャビネットまたは層流フード（無菌環境を維持することができる作業場）；個包装の滅菌ピペット、ピペットチップ（１０および２５ｍＬなど）；ピペットエイド；ピペッター、１ｍＬまたは２００μＬおよび対応するチップ；５０ｍｌのヌクレアーゼフリーの滅菌Ｆａｌｃｏｎチューブ；Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆリピーター（容量５０ｍＬ）；１．９ｍｌ保存チューブ；チューブラック；および外ねじ式キャップチューブデキャッパー装置（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｓｔｏｒａｇｅ提供のＬａｂＥｌｉｔｅ Ｉ．Ｄ．キャッパーなど）。
試料調製の一部として、スワブ試料を、スワブ試料のために特別に調製された固有の緩衝液組成物（スワブ調製緩衝液と称される）と混合した。スワブ調製緩衝液の調製は、少なくとも以下の装置の使用を含む：バイオセーフティキャビネットまたは層流フード（無菌環境を維持することができる作業場）；個包装の滅菌ピペット、ピペットチップ（１０および２５ｍＬなど）；ピペットエイド；ピペッター、１ｍＬまたは２００μＬおよび対応するチップ；５０ｍｌのヌクレアーゼフリーの滅菌Ｆａｌｃｏｎチューブ；Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆリピーター（容量５０ｍＬ）；１．９ｍｌ保存チューブ；チューブラック；および外ねじ式キャップチューブデキャッパー装置（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｓｔｏｒａｇｅ提供のＬａｂＥｌｉｔｅ Ｉ．Ｄ．キャッパーなど）。
スワブ輸送緩衝液の調製は、少なくとも以下の試薬／構成要素の使用をさらに含む：
・１０×ＴＢＥ緩衝液（トリス－ホウ酸－ＥＤＴＡ、ｐＨ８．２～８．４）、滅菌、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、およびプロテアーゼ非含有グレード、Ｆｉｓｈｅｒ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ、カタログ番号ＢＰ１３３３２０、２０Ｌ；
・ＲＮａｓｅ阻害剤、ヒト胎盤、４０，０００単位／ｍｌ、滅菌、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ非含有グレード、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｍ０３０７Ｌ、１０，０００単位、２５０ｕｌ／チューブ；
・アンホテリシンＢ溶液（脱イオン水中２５０μｇ／ｍｌ、滅菌、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ２９４２、１００ｍｌ（または真菌の汚染および成長を防止するのに適切な濃度の類似の抗真菌剤））；
・ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（１００×、作業濃度の１００倍のペニシリン（１０，０００ＩＵ）およびストレプトマイシン（１０，０００μｇ／ｍｌ）の混合物、滅菌、Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３０－００２－ＣＩ（または細菌の汚染および成長を防止するのに適切な濃度の類似の抗生物質）；
・ヌクレアーゼフリー水、滅菌、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｓｉｇｍａ、Ｗ４５０２、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、およびプロテアーゼ非含有グレード；および
・消毒薬（７０％エタノールなど）。
・１０×ＴＢＥ緩衝液（トリス－ホウ酸－ＥＤＴＡ、ｐＨ８．２～８．４）、滅菌、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、およびプロテアーゼ非含有グレード、Ｆｉｓｈｅｒ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ、カタログ番号ＢＰ１３３３２０、２０Ｌ；
・ＲＮａｓｅ阻害剤、ヒト胎盤、４０，０００単位／ｍｌ、滅菌、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ非含有グレード、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｍ０３０７Ｌ、１０，０００単位、２５０ｕｌ／チューブ；
・アンホテリシンＢ溶液（脱イオン水中２５０μｇ／ｍｌ、滅菌、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ２９４２、１００ｍｌ（または真菌の汚染および成長を防止するのに適切な濃度の類似の抗真菌剤））；
・ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（１００×、作業濃度の１００倍のペニシリン（１０，０００ＩＵ）およびストレプトマイシン（１０，０００μｇ／ｍｌ）の混合物、滅菌、Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３０－００２－ＣＩ（または細菌の汚染および成長を防止するのに適切な濃度の類似の抗生物質）；
・ヌクレアーゼフリー水、滅菌、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｓｉｇｍａ、Ｗ４５０２、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、およびプロテアーゼ非含有グレード；および
・消毒薬（７０％エタノールなど）。
成分の調製は、少なくとも以下の工程を含む：作業表面を適切な消毒薬で清潔にする；作業表面上に置く前に試薬瓶を消毒する；１Ｌのヌクレアーゼフリー水をＳｉｇｍａ滅菌ボトル中に取り、これを容器として使用し、１０５．０５ｍｌの水を取り出し、３つの５０ｍＬのファルコンチューブに（各々のファルコンチューブが３４．５ｍｌの水を有するように）配分する；１０×ＴＢＥ緩衝液を、Ｃｏｒｎｉｎｇの５００ｍｌ滅菌ボトル中に５００ｍｌ／ボトルの量で分割し、ＲＴで保存する；ヌクレアーゼフリー水を、Ｃｏｒｎｉｎｇの１Ｌ滅菌ボトル中に８９４．９５ｍｌ／ボトルの量で分割し、ＲＴで保存する；アンホテリシンＢ溶液を４．４ｍｌ／チューブ（５ｍｌ滅菌Ｃｏｒｎｉｎｇチューブ中）の量で分割し、－２０℃で保存する；ペニシリン／ストレプトマイシンを、１．１ｍｌ／チューブ（滅菌エッペンドルフチューブ中）の量で分割し、－２０℃で保存する。
スワブ調製緩衝液の調製は、少なくとも以下の工程を含む：
１．作業表面を適切な消毒薬で清潔にする；
２．作業表面上に置く前に試薬瓶（分割量、ＲＮａｓｅを除く）を消毒する；
３．例えば、１．１Ｌのウイルス輸送緩衝液を調製するために：
３．１．１ボトルのヌクレアーゼフリー水（８９４．９５ｍｌ／ボトル）を用意する；
３．２．滅菌５０ｍｌファルコンチューブを使用して、１００ｍｌの１０×ＴＢＥ緩衝液を添加する；
３．３．滅菌ピペットを使用して、５５μｌのＲＮａｓｅ阻害剤を添加する；
３．４ アンホテリシンＢ溶液のチューブおよびペニシリン／ストレプトマイシンのチューブを解凍し、滅菌ピペットを使用して、４．４ｍｌのアンホテリシンおよび１．１ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンをボトルに無菌的に添加する。
４．検査室で管理されているノートにロットに関する情報および調製を記録する；
５．検査室に適切な識別子を割り当てる（例えば、ロット番号）；
６．チューブにしっかりと蓋をし、チューブを反転させることによって完全に混合する；
７．ＱＣ試料のために１００ｕｌの培地を抜き取る；
８．ボトルを以下のようにラベリングする：
スワブ輸送緩衝液
Ｌａｂ ＩＤ：（サミットバッファー２としてのＳＴＢ２などの検査室に適切な識別子を挿入する）
ＤＯＭ：（製造日を挿入する）
有効期限：（製造日から１ヶ月後の日付を挿入する）
２～８℃で保存する
９．アリコートに分注するまで２～８℃で保存する；
１０．Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆリピーター（容量５０ｍＬ）およびＢｒｏｏｋｓデキャッパーを使用して、１ｍＬの調整済みスワブ調製緩衝液を個別の滅菌済みの１．９ｍｌねじ蓋付きチューブ（Ａｚｅｎｔａ）に分割する；
１１．無菌状態をチェックする；
１２．チューブおよびボトル中に残存する任意の緩衝液を２～８℃で保存する。
１．作業表面を適切な消毒薬で清潔にする；
２．作業表面上に置く前に試薬瓶（分割量、ＲＮａｓｅを除く）を消毒する；
３．例えば、１．１Ｌのウイルス輸送緩衝液を調製するために：
３．１．１ボトルのヌクレアーゼフリー水（８９４．９５ｍｌ／ボトル）を用意する；
３．２．滅菌５０ｍｌファルコンチューブを使用して、１００ｍｌの１０×ＴＢＥ緩衝液を添加する；
３．３．滅菌ピペットを使用して、５５μｌのＲＮａｓｅ阻害剤を添加する；
３．４ アンホテリシンＢ溶液のチューブおよびペニシリン／ストレプトマイシンのチューブを解凍し、滅菌ピペットを使用して、４．４ｍｌのアンホテリシンおよび１．１ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンをボトルに無菌的に添加する。
４．検査室で管理されているノートにロットに関する情報および調製を記録する；
５．検査室に適切な識別子を割り当てる（例えば、ロット番号）；
６．チューブにしっかりと蓋をし、チューブを反転させることによって完全に混合する；
７．ＱＣ試料のために１００ｕｌの培地を抜き取る；
８．ボトルを以下のようにラベリングする：
スワブ輸送緩衝液
Ｌａｂ ＩＤ：（サミットバッファー２としてのＳＴＢ２などの検査室に適切な識別子を挿入する）
ＤＯＭ：（製造日を挿入する）
有効期限：（製造日から１ヶ月後の日付を挿入する）
２～８℃で保存する
９．アリコートに分注するまで２～８℃で保存する；
１０．Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆリピーター（容量５０ｍＬ）およびＢｒｏｏｋｓデキャッパーを使用して、１ｍＬの調整済みスワブ調製緩衝液を個別の滅菌済みの１．９ｍｌねじ蓋付きチューブ（Ａｚｅｎｔａ）に分割する；
１１．無菌状態をチェックする；
１２．チューブおよびボトル中に残存する任意の緩衝液を２～８℃で保存する。
スワブ試料の調製：
分析用の各々のウェルは、マルチチャネルイコライザーまたはＶｉａｆｌｏｗ（Ｉｎｔｅｇｒａ）を使用して各々のウェルに分注された、５μＬのプロテイナーゼＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ））／ウェルを含む。バイオセーフティキャビネット内で、例えば、半自動６チャネルデキャッパー（Ｂｒｏｏｋｓ）または自動化Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｉ．Ｄ．キャッパーを用いて試料のキャップを開けた。６チャネルデキャッパーを使用する場合、キャップをキャップキャリアラック上に一時的に置いた。およそ３５μＬのスワブ試料を、Ｅｌ－ＣｌｉｐＴｉｐ電子マルチチャネル（８チャネル）イコライザーを使用して、４８ウェルラック中のチューブから、５μＬのプロテイナーゼＫを含む９６ウェルＳＰＰに移し、十分にピペッティングした。試料の２つの４８ウェルラックは、１つの９６ウェルＳＰＰに収まるであろう。試料のキャップを再度閉めた（６チャネルデキャッパーを使用した場合には一度に６本、または自動化４８－フォーマットデキャッパーを使用した場合には一度に４８本）。スワブ試料およびプロテイナーゼＫを、プレートをデジタルマイクロプレートシェーカー上に５００ＲＰＭで１分間置くことによって十分に混合した。プレートを、ｍｉｎｉＡｍｐ９６ウェルＰＣＲ装置上に９５℃で５分間置き、４℃で保持する。次いで、試料のラック全体を、一時試料保存エリアに移した。
分析用の各々のウェルは、マルチチャネルイコライザーまたはＶｉａｆｌｏｗ（Ｉｎｔｅｇｒａ）を使用して各々のウェルに分注された、５μＬのプロテイナーゼＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ））／ウェルを含む。バイオセーフティキャビネット内で、例えば、半自動６チャネルデキャッパー（Ｂｒｏｏｋｓ）または自動化Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｉ．Ｄ．キャッパーを用いて試料のキャップを開けた。６チャネルデキャッパーを使用する場合、キャップをキャップキャリアラック上に一時的に置いた。およそ３５μＬのスワブ試料を、Ｅｌ－ＣｌｉｐＴｉｐ電子マルチチャネル（８チャネル）イコライザーを使用して、４８ウェルラック中のチューブから、５μＬのプロテイナーゼＫを含む９６ウェルＳＰＰに移し、十分にピペッティングした。試料の２つの４８ウェルラックは、１つの９６ウェルＳＰＰに収まるであろう。試料のキャップを再度閉めた（６チャネルデキャッパーを使用した場合には一度に６本、または自動化４８－フォーマットデキャッパーを使用した場合には一度に４８本）。スワブ試料およびプロテイナーゼＫを、プレートをデジタルマイクロプレートシェーカー上に５００ＲＰＭで１分間置くことによって十分に混合した。プレートを、ｍｉｎｉＡｍｐ９６ウェルＰＣＲ装置上に９５℃で５分間置き、４℃で保持する。次いで、試料のラック全体を、一時試料保存エリアに移した。
ＰＣＲ試薬の調製およびプレートのセットアップ（スワブ試験）：
ＰＣＲマスターミックス（本明細書中でＰＣＲマスターミックスプレート（ＰＭＭＰ）と称される）を含むプレートは、マルチチャネルイコライザーまたはＶｉａｆｌｏｗ（Ｉｎｔｅｇｒａ）を使用して９６または３８４ウェルプレート上のプレートの各々のウェル中に分注された１２．５μＬのＰＣＲマスターミックスを含む。ＰＣＲマスターミックスは、１０μＬのルナ・ユニバーサル・プローブ・ワンステップ反応ミックス、１μＬのルナ・ウォームスタート・ＲＴ酵素ミックス、および１．５μＬのＮ１／ＲＮＰプライマー／プローブから構成される。１．５μＬのＮ１／ＲＮＰプライマー／プローブを、５０．２５μＬの各々の１００μＭプライマーおよびプローブストックを５２４μＬのＩＤＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５）に添加することによって、６．７μＭのＮ１プライマーおよびＲＮＰプライマーの作業ストック溶液および１．７μＭのＦＡＭ標識Ｎ１およびＡＴＴＯ－６４７標識ＲＮＰプローブとして作製するであろう。
ＰＣＲマスターミックス（本明細書中でＰＣＲマスターミックスプレート（ＰＭＭＰ）と称される）を含むプレートは、マルチチャネルイコライザーまたはＶｉａｆｌｏｗ（Ｉｎｔｅｇｒａ）を使用して９６または３８４ウェルプレート上のプレートの各々のウェル中に分注された１２．５μＬのＰＣＲマスターミックスを含む。ＰＣＲマスターミックスは、１０μＬのルナ・ユニバーサル・プローブ・ワンステップ反応ミックス、１μＬのルナ・ウォームスタート・ＲＴ酵素ミックス、および１．５μＬのＮ１／ＲＮＰプライマー／プローブから構成される。１．５μＬのＮ１／ＲＮＰプライマー／プローブを、５０．２５μＬの各々の１００μＭプライマーおよびプローブストックを５２４μＬのＩＤＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５）に添加することによって、６．７μＭのＮ１プライマーおよびＲＮＰプライマーの作業ストック溶液および１．７μＭのＦＡＭ標識Ｎ１およびＡＴＴＯ－６４７標識ＲＮＰプローブとして作製するであろう。
９６ウェルまたは３８４ウェルＰＭＭＰをＰＣＲワークステーションに入れ、７．５μＬのスワブ試料調製工程由来の処置済みスワブ試料をＰＭＭＰの各々の指定のウェルに添加した。次いで、処置済みスワブ試料を、発泡しないように注意しながらピペッティングによってＰＣＲマスターミックスと混合する。次いで、ＭＬＳは、７．５μＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する正の対照（ＩＤＴ合成２０１９－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－Ｎ対照、４０００コピー／ｕＬ）および負の対照（ＩＤＴ Ｈｓ－ＲＰＰ３０対照、４０００コピー／μＬ）ならびにテンプレートなしの対照（ＮＴＣ－水）を対照のための指定のＰＣＲウェルに添加し（プレートあたり１つの正の対照、１つの負の対照、およびＮＴＣ）、発泡を回避しながらピペッティングによって混合する。次いで、ＭＬＳは、透明プラスチック製のｑＰＣＲフィルムをＰＭＭＰ上に配置し、プレートシーラーを用いてフィルムをシールし、プレート遠心機を用いて短時間スピンして泡を除去する。
ＰＣＲサーマルプロファイル（増幅領域）（スワブ試験）：
プレートをＢｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸまたはＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏＰＣＲ装置にロードし、マスターファイル「ＳＴ－ＣＯＶ－ＰＣＲプロトコール」を開き、以下のサーモサイクラー条件で運転する：
１．工程１：５５℃で１０分間、１サイクル；
２．工程２：９５℃で１分間、１サイクル；および
工程３：９５℃で１０秒間、６０℃で３０秒間（＋Ｎ１標的のためのＦＡＭチャネルおよびＲＮＰ標的のためのＣｙ５チャネルの両方でのプレートの読み取り）を４０サイクル。
プレートをＢｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸまたはＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏＰＣＲ装置にロードし、マスターファイル「ＳＴ－ＣＯＶ－ＰＣＲプロトコール」を開き、以下のサーモサイクラー条件で運転する：
１．工程１：５５℃で１０分間、１サイクル；
２．工程２：９５℃で１分間、１サイクル；および
工程３：９５℃で１０秒間、６０℃で３０秒間（＋Ｎ１標的のためのＦＡＭチャネルおよびＲＮＰ標的のためのＣｙ５チャネルの両方でのプレートの読み取り）を４０サイクル。
データ解釈（ＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ ｏｐｕｓ ９６ウェルフォーマット）（スワブ試験）：
Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸはＣｑ値を報告し、ここでＣｑ値のファイル（ｃｓｖファイル）はＰＣＲ装置からＯｖＤｘ ＬＩＭＳにエクスポートされる。Ｃｑ値の解釈（検出、非検出、および無効）は、以下の基準にしたがってＯｖＤｘ ＬＩＭＳにエクスポートされるであろう：
Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸはＣｑ値を報告し、ここでＣｑ値のファイル（ｃｓｖファイル）はＰＣＲ装置からＯｖＤｘ ＬＩＭＳにエクスポートされる。Ｃｑ値の解釈（検出、非検出、および無効）は、以下の基準にしたがってＯｖＤｘ ＬＩＭＳにエクスポートされるであろう：
Ｎ１が検出された場合、結果は有効であり、ＲＮＰについての値と無関係に「検出」と返答される。Ｎ１が検出されず、かつＲＮＰが３５以下である場合、「非検出」という結果が返答される。ＲＮＰのＣｑ値が３５を超え、かつＮ１が３６を超える場合、試料は再試験に回される。再試験後、ＲＮＰが依然として３５を超える場合、供給者は、別の試料を採取するために連絡しなければならない。ＮａＮ＝非数。
本発明者らは、予見的縦断研究においてＣＯＶＩＤ－１９患者由来の２３１の対応のある標本セットのＲＴ－ｑＰＣＲ試験によるウイルス量モニタリングを行った。以下の例について（実施例１）、以下の４つの標本タイプを評価した：鼻腔スワブ由来のＲＮＡ抽出物（ＳｗａｂＣＬＥＡＲ）、唾液由来のＲＮＡ抽出物（ＳａｌｉｖａＣＬＥＡＲ）、抽出なしの唾液（ＳａｌｉｖａＦＡＳＴ）、および抽出なしの唾液および鼻腔スワブの組み合わせ（Ｓｐｉｔ－Ｎ－Ｓｗａｂ）。鼻腔スワブおよび唾液は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出について比較可能な標本である。ウイルス量は一般に対応のある唾液と比較して鼻腔スワブで高かったが、この相違は感染の間に経時的に小さくなり、臨床的感度に影響を及ぼさなかった（図７、９、および１２を参照のこと）。鼻腔スワブと唾液の組み合わせに対して抽出不要の試験を行うと、抽出不要の唾液試験と比較してサイクル閾値（Ｃｔ）値がわずかに低くなり（図１３を参照のこと）、口腔と比較して鼻腔中のウイルス量がより高いことをさらに裏付けていた。
唾液由来のＲＮＡ抽出物が抽出不要の唾液と比較してウイルス量がわずかに多いことが実証されたにもかかわらず、対応のある標本間で優れた陽性の一致を示した（図１０を参照のこと）。これらの所見は、他者が観察しているように、ＲＮＡ抽出がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のためのＲＴ－ｑＰＣＲ試験で省略可能な工程であることを示唆している。抽出不要のＲＴ－ｑＰＣＲは、ＣＯＶＩＤ－１９パンデミック中の新規の臨床試験パラダイムに相当する。唾液は、他の呼吸器病原体に有用な新たに出現した標本タイプである。
実施例１
２０１９－ｎＣｏＶ ＣＤＣリアルタイムＲＴ－ｑＰＣＲアッセイを、唾液の抽出不要の試験のためにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシド遺伝子（Ｎ１およびＮ２）およびヒトリボヌクレアーゼＰ（ＲＮＰ）遺伝子を標的にするように修正した。アッセイの性能を、採取時の鼻腔スワブ由来のＲＮＡ抽出物、唾液、未処理唾液、および未処理唾液の鼻腔スワブとの組み合わせ由来のＲＮＡ抽出物（ＳｗａｂＣＬＥＡＲ（商標）、ＳａｌｉｖａＣＬＥＡＲ（商標）、ＳａｌｉｖａＦＡＳＴ（商標）、およびＳｐｉｔ－Ｎ－Ｓｗａｂ（商標）と命名）を使用して比較した。本発明者らは、抽出不要の唾液試験のためのＳａｌｉｖａＦＡＳＴの開発に注目し、ＳａｌｉｖａＦＡＳＴの検証にさらに注目した。
２０１９－ｎＣｏＶ ＣＤＣリアルタイムＲＴ－ｑＰＣＲアッセイを、唾液の抽出不要の試験のためにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシド遺伝子（Ｎ１およびＮ２）およびヒトリボヌクレアーゼＰ（ＲＮＰ）遺伝子を標的にするように修正した。アッセイの性能を、採取時の鼻腔スワブ由来のＲＮＡ抽出物、唾液、未処理唾液、および未処理唾液の鼻腔スワブとの組み合わせ由来のＲＮＡ抽出物（ＳｗａｂＣＬＥＡＲ（商標）、ＳａｌｉｖａＣＬＥＡＲ（商標）、ＳａｌｉｖａＦＡＳＴ（商標）、およびＳｐｉｔ－Ｎ－Ｓｗａｂ（商標）と命名）を使用して比較した。本発明者らは、抽出不要の唾液試験のためのＳａｌｉｖａＦＡＳＴの開発に注目し、ＳａｌｉｖａＦＡＳＴの検証にさらに注目した。
分析的検証を、ＣＯＶＩＤ－１９陰性の鼻腔スワブおよび唾液標本を種々の濃度のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の正の対照材料（２～１００ゲノム当量／マイクロリットル、ＧＥ／μＬ）でスパイクすることによって行った。これらの低ウイルス量でのアッセイ精度は、３０を超えるＮ１のＣｔ値に対応しており、変動係数は、それぞれ、ＳｗａｂＣＬＥＡＲについての１．０２～４．２６％およびＳａｌｉｖａＦＡＳＴについての０．９５～４．３３％の範囲であった（図７Ａを参照のこと）。ＳｗａｂＣＬＥＡＲと比較して、ＳａｌｉｖａＦＡＳＴは、一般に、低ウイルス量でのＣｔ値がより高く、鼻腔スワブのＲＮＡ抽出に由来するシグナルの増強または唾液マトリックスによる阻害が示唆された。予想通り、ＲＮＰのＣｔ値はより変動したが（内在性の宿主標的に基づく）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に影響されなかった（図９Ｂを参照のこと）。ＳａｌｉｖａＦＡＳＴの検出限界（ＬｏＤ）を、４ＧＥ／μＬと決定した（図９Ｃを参照のこと）。かかるデータは、抽出不要の唾液試験が鼻腔スワブ由来のＲＮＡ抽出物と比較して許容され得る分析性能を有することを示唆している。
標本採取から検査室での試験までの分析前の段階は、標本、輸送、および環境条件に関連する変動によって複雑化する。本発明者らは、ＳａｌｉｖａＦＡＳＴによって試験された試料の２週間後の安定性を評価した。検出可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ量は減少し、Ｎ１の平均Ｃｔは、４℃および－８０℃で保存された標本について、それぞれ、１．５６および１．８３増加する（図７Ｄおよび７Ｅを参照のこと）（ｎ＝８、ｐ＝０．００４およびｐ＝０．００８）。
鼻腔スワブ標本および唾液標本由来のＲＮＡ抽出物の臨床的検証
２０１９－ｎＣｏＶ ＣＤＣリアルタイムＲＴ－ｑＰＣＲアッセイの性能は、鼻腔スワブ由来のＲＮＡ抽出物を使用して、広く研究および確証されている。ＳａｌｉｖａＦＡＳＴの臨床的検証を開始するために、本発明者らは、１３７人の患者から対応のある鼻腔スワブおよび唾液標本を予め採取し、そのうちの１９人（１３．９％）がＣＯＶＩＤ－１９の診断を受けた。ＣＯＶＩＤ－１９患者は、回復期まで縦断試験を受け（図１５を参照のこと）、２３１の対応のある試料セットを得た。全ての標本タイプにおいて、検出可能な範囲全体にわたるウイルス量が実証され、Ｎ１のＣｔ値が３０を超える低ウイルス量標本が多数含まれていた（図８Ａおよび８Ｂを参照のこと）。ＲＮＰ宿主遺伝子シグナルは、ＣＯＶＩＤ－１９の状態と無関係に全ての標本タイプにわたって非常に一致していた（図８Ｂを参照のこと）。
２０１９－ｎＣｏＶ ＣＤＣリアルタイムＲＴ－ｑＰＣＲアッセイの性能は、鼻腔スワブ由来のＲＮＡ抽出物を使用して、広く研究および確証されている。ＳａｌｉｖａＦＡＳＴの臨床的検証を開始するために、本発明者らは、１３７人の患者から対応のある鼻腔スワブおよび唾液標本を予め採取し、そのうちの１９人（１３．９％）がＣＯＶＩＤ－１９の診断を受けた。ＣＯＶＩＤ－１９患者は、回復期まで縦断試験を受け（図１５を参照のこと）、２３１の対応のある試料セットを得た。全ての標本タイプにおいて、検出可能な範囲全体にわたるウイルス量が実証され、Ｎ１のＣｔ値が３０を超える低ウイルス量標本が多数含まれていた（図８Ａおよび８Ｂを参照のこと）。ＲＮＰ宿主遺伝子シグナルは、ＣＯＶＩＤ－１９の状態と無関係に全ての標本タイプにわたって非常に一致していた（図８Ｂを参照のこと）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ｑＰＣＲ試験に及ぼす標本タイプの影響を理解するために、ＳｗａｂＣＬＥＡＲおよびＳａｌｉｖａＣＬＥＡＲ（これらの両方はＲＮＡ抽出に依存する）によって試験された対応のある試料の間でＮ１のＣｔ値を比較した。最初の診断試料の比較により、ＳａｌｉｖａＣＬＥＡＲによって平均Ｃｔ値が５．８７増加することが明らかとなった（ｎ＝１９試料対、ｐ＜０．００１）。５日目までに、この相違は１．７４まで減少した（ｎ＝１６試料対、ｐ＝０．０３４）（図９Ｃおよび９Ｄを参照のこと）。診断から回復期までの疾患経過を通して、ＳｗａｂＣＬＥＡＲは、ＳａｌｉｖａＣＬＥＡＲと比較してウイルス量がわずかに高いことが明らかとなった（２９．７１±０．３０対３１．２３±０．２４、ｎ＝２２９試料対、ｐ＜０．００１、図９Ｅを参照のこと）。したがって、ＲＴ－ｑＰＣＲによるウイルス量は、口腔と比較して鼻腔で高く、この相違は感染の間に小さくなる。
標本タイプ間のウイルス量の相違は、臨床的感度に影響を及ぼす可能性がある。ＳｗａｂＣＬＥＡＲ標本とＳａｌｉｖａＣＬＥＡＲ標本との間の陽性一致および陰性一致を、ウイルス量によって評価した。本発明者らは、高ウイルス量をＣｔ３０未満（１００ＧＥ／μＬ超に相当する）と定義した（図７Ａを参照のこと）。高ウイルス量は、陽性一致率９８．８％と関連していた。低ウイルス量の標本は、陽性一致率が８８．７％であることが実証された（図９Ａおよび９Ｂを参照のこと）。ＣＯＶＩＤ－１９を持たない患者由来の対応のある標本の陰性一致率は、両方のレベルにおいて９９％を超えた。各々のアッセイにおいてＮ１とＮ２との間に中程度の相関が認められ（Ｒ２＝０．４５～０．４７、図９Ｆおよび９Ｇを参照のこと））、それに対して、ＲＮＰのＣｔ値は類似しており、標本間で一致していた（図９Ｈを参照のこと、ｐ＝０．８３９）。これらのデータは、鼻腔におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス量はより高いが、ＣＯＶＩＤ－１９の診断について鼻腔スワブおよび唾液標本の対由来のＲＮＡ抽出物の間において診断結果が非常に一致していることを示唆している。
抽出不要の唾液試験の臨床的検証
特にアルファ変異株のＣＯＶＩＤ－１９の症状を有するか、感染した個体との濃厚接触が既知の患者を、ＩＲＢ承認試験の一部として鼻腔スワブ標本および唾液標本を得るために採用した。ＣＯＶＩＤ－１９の状態を、ＦＤＡ ＥＵＡを得た代替法によって確認した。試験のための前鼻孔の鼻腔スワブ採取を、ＤＮＡＧｅｎｏｔｅｋ ＯＲＥ－１００デバイスを使用して行った。唾液採取を、ＤＮＡＧｅｎｏｔｅｋ ＯＭ－５０５デバイスまたはＦａｌｃｏｎ ５０ｍＬコニカルチューブまたは唾液採取用補助具（Ｓａｌｉｍｅｔｒｉｃｓ）を装着したクリオチューブのいずれかを使用して行った。また、患者は、鼻腔スワブを唾液中に入れた唾液と鼻孔スワブとの組み合わせの実施形態のための鼻腔スワブと唾液の組み合わせ標本を提供した。患者は、ウイルス排除および／または研究からの離脱まで、縦断的試料採取を受けた（図１５を参照のこと）。全ての試料を、７２時間以内に周囲温度で検査室に輸送し、検査室への受け入れ日に分析した。
特にアルファ変異株のＣＯＶＩＤ－１９の症状を有するか、感染した個体との濃厚接触が既知の患者を、ＩＲＢ承認試験の一部として鼻腔スワブ標本および唾液標本を得るために採用した。ＣＯＶＩＤ－１９の状態を、ＦＤＡ ＥＵＡを得た代替法によって確認した。試験のための前鼻孔の鼻腔スワブ採取を、ＤＮＡＧｅｎｏｔｅｋ ＯＲＥ－１００デバイスを使用して行った。唾液採取を、ＤＮＡＧｅｎｏｔｅｋ ＯＭ－５０５デバイスまたはＦａｌｃｏｎ ５０ｍＬコニカルチューブまたは唾液採取用補助具（Ｓａｌｉｍｅｔｒｉｃｓ）を装着したクリオチューブのいずれかを使用して行った。また、患者は、鼻腔スワブを唾液中に入れた唾液と鼻孔スワブとの組み合わせの実施形態のための鼻腔スワブと唾液の組み合わせ標本を提供した。患者は、ウイルス排除および／または研究からの離脱まで、縦断的試料採取を受けた（図１５を参照のこと）。全ての試料を、７２時間以内に周囲温度で検査室に輸送し、検査室への受け入れ日に分析した。
唾液をＲＮＡ抽出するとウイルス量が有意ではあるが無視できるほど増加し、ＳａｌｉｖａＦＡＳＴと比較して、ＳａｌｉｖａＣＬＥＡＲについてのＮ１のＣｔ値の平均増加は０．０７であった（図１０Ｃを参照のこと、ｎ＝２０２試料対、ｐ＝０．０４６）。ＳａｌｉｖａＣＬＥＡＲとＳａｌｉｖａＦＡＳＴとの間の陽性一致は、ウイルス量によって変動した。高ウイルス量の唾液標本（Ｎ１のＣｔ値が３０以下）から、ＳａｌｉｖａＣＬＥＡＲとＳａｌｉｖａＦＡＳＴとの間の陽性一致率１００．０％が実証された（図１０Ａを参照のこと、ｎ＝６５試料対）。低ウイルス量の唾液標本（Ｎ１のＣｔ値３０～３５）から、陽性一致率８１．８％が実証された（図１０Ｂを参照のこと、ｎ＝４４）。さらに、低ウイルス量のいくつかの標本では、ＳａｌｉｖａＣＬＥＡＲおよびＳａｌｉｖａＦＡＳＴは、代替法では検出されなかったＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が各々検出され（図１０Ｂを参照のこと）、ＲＮＡ抽出においてＲＮＡ濃度とＲＮＡ収量との間にトレードオフの関係があることが示唆された。アッセイ間のＮ１とＮ２との比較により、中程度の相関も実証された（図９Ｄおよび９Ｅを参照のこと、Ｎ１についてはＲ２＝０．５８、Ｎ２についてはＲ２＝０．４０）。これらのデータは、ＲＮＡ抽出が唾液を使用した信頼性のあるＣＯＶＩＤ－１９診断に必要ではないこと、および抽出不要の試験によって臨床的感度が損なわれないことを実証している。
プライマー／プローブセットの比較
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出のための２０１９－ｎＣｏＶ ＣＤＣアッセイを、ヌクレオカプシド遺伝子（Ｎ１およびＮ２）を標的にする２つのプライマー／プローブ対を使用して実施する。Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）のプライマーおよびプローブを使用したＣＤＣ２０１９新型コロナウイルス（２０１９－ｎＣｏＶ）リアルタイムＲＴ－ｑＰＣＲアッセイを実施した。簡潔に述べれば、このアッセイは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出のための２つのプライマー／プローブ（Ｎ１およびＮ２）およびリボヌクレアーゼＰ（ＲＮＰ）の検出のための１つのプライマー／プローブを含む。例えば、かかるプライマー／プローブとしては、以下が挙げられる：ｎＣＯＶ＿Ｎ１順方向プライマー（カタログ番号１０００６８３０）；ｎＣＯＶ＿Ｎ１逆方向プライマー（カタログ番号１０００６８３１）；ｎＣＯＶ＿Ｎ１プローブ（カタログ番号１０００６８３２）；ＲＮａｓｅＰ順方向プライマー（カタログ番号１０００６８３６）；ＲＮａｓｅＰ逆方向プライマー（カタログ番号１０００６８３７）；およびＲＮａｓｅＰ（ＡＴＴＯ（商標）６４７）プローブ（カタログ番号１０００７０６２）。プライマー／プローブ組み合わせの最終溶液の調製のための特異的な希釈物は、およそ６９８μＬのＩＤＴＥ（１０ｍＭのトリス、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）、６７μＬのＮ１－Ｆ、６７μＬのＮ１－Ｒ、１７μＬのＮ１－プローブ、６７μＬのＲＮＰ－Ｆ、６７μＬのＲＮＰ－Ｒ、および１７μＬのＲＮＰ－プローブを含む。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出のための２０１９－ｎＣｏＶ ＣＤＣアッセイを、ヌクレオカプシド遺伝子（Ｎ１およびＮ２）を標的にする２つのプライマー／プローブ対を使用して実施する。Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）のプライマーおよびプローブを使用したＣＤＣ２０１９新型コロナウイルス（２０１９－ｎＣｏＶ）リアルタイムＲＴ－ｑＰＣＲアッセイを実施した。簡潔に述べれば、このアッセイは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出のための２つのプライマー／プローブ（Ｎ１およびＮ２）およびリボヌクレアーゼＰ（ＲＮＰ）の検出のための１つのプライマー／プローブを含む。例えば、かかるプライマー／プローブとしては、以下が挙げられる：ｎＣＯＶ＿Ｎ１順方向プライマー（カタログ番号１０００６８３０）；ｎＣＯＶ＿Ｎ１逆方向プライマー（カタログ番号１０００６８３１）；ｎＣＯＶ＿Ｎ１プローブ（カタログ番号１０００６８３２）；ＲＮａｓｅＰ順方向プライマー（カタログ番号１０００６８３６）；ＲＮａｓｅＰ逆方向プライマー（カタログ番号１０００６８３７）；およびＲＮａｓｅＰ（ＡＴＴＯ（商標）６４７）プローブ（カタログ番号１０００７０６２）。プライマー／プローブ組み合わせの最終溶液の調製のための特異的な希釈物は、およそ６９８μＬのＩＤＴＥ（１０ｍＭのトリス、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）、６７μＬのＮ１－Ｆ、６７μＬのＮ１－Ｒ、１７μＬのＮ１－プローブ、６７μＬのＲＮＰ－Ｆ、６７μＬのＲＮＰ－Ｒ、および１７μＬのＲＮＰ－プローブを含む。
ＳｗａｂＣＬＥＡＲ試料およびＳａｌｉｖａＣＬＥＡＲ試料のＲＮＡ抽出を、ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して実施した。５０ｍＬファルコンチューブ中またはクリオチューブ中に採取された唾液試料を、抽出不要のＳａｌｉｖａＦＡＳＴ試験によって直接試験した。５μＬのスワブＲＮＡ抽出物、５μＬの唾液ＲＮＡ抽出物、または５μＬの未処理唾液を、９６ウェルプレート（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）中のＰＣＲマスターミックスに添加し、２０μＬの体積にした。ＲＴ－ｑＰＣＲを、ＣＦＸソフトウェアを備えたＢｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ ＣｏｎｎｅｃｔリアルタイムＰＣＲ検出システムによって実施した。サイクル条件は、５５℃で１０分間；９５℃で１分間；および９５℃で１０秒間（複数可）；ならびに６０℃で３０秒間を４５サイクルであった。分析的検証およびアッセイ対照のために、合成ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸を使用した（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
単一のアッセイ内のＮ１およびＮ２の性能の比較により、鼻孔スワブ（Ｒ２＝０．９７）、唾液（Ｒ２＝０．８３）、および抽出不要の試験（Ｒ２＝０．８２）において、本発明の方法の直線性の高さが明らかとなり（図１１Ａ～１１Ｃを参照のこと）、ほとんどのＣＯＶＩＤ－１９症例が類似のウイルス量評価を用いて両方の標的によって検出されることが示唆された。特に唾液においてＮ１はＮ２では見逃されたいくつかの低ウイルス量ＣＯＶＩＤ－１９の症例を検出したのに対して、Ｎ２からはさらなる診断値を得られなかった。
ＲＴ－ｑＰＣＲおよびｄｄＰＣＲによるウイルス量の定量
ＲＴ－ｑＰＣＲによるウイルス量の定量的正確度を評価するために、Ｎ１およびＮ２の同一のプライマーおよびプローブを使用したｄｄＰＣＲも、鼻腔スワブ標本および唾液標本由来のＲＮＡ抽出物に対して実施した。第１に、ＳａｌｉｖａＦＡＳＴについての検量線を作成した。
ＲＴ－ｑＰＣＲによるウイルス量の定量的正確度を評価するために、Ｎ１およびＮ２の同一のプライマーおよびプローブを使用したｄｄＰＣＲも、鼻腔スワブ標本および唾液標本由来のＲＮＡ抽出物に対して実施した。第１に、ＳａｌｉｖａＦＡＳＴについての検量線を作成した。
第１に、ｄｄＰＣＲによる定量的な正確度および精度を評価した。ＲＮＡ抽出後にスパイクした試料中に回収されたウイルス量は、鼻腔スワブについては３６．３～４７．０％および唾液については２８．９～４５．７％であった。鼻腔スワブおよび唾液由来の抽出物のｄｄＰＣＲによるＮ１およびＮ２の精度により、それぞれ、変動係数（ＣＶ）５．６～１２．３％および４．５～１９．１％が実証された（図７Ａを参照のこと）。Ｎ１およびＮ２による標本対におけるウイルス量の比較により、一般に、相関がないことが実証された（図１２Ｂおよび１２Ｃを参照のこと）。鼻腔スワブ標本では、Ｎ１において広い範囲のウイルス量が実証されたのに対して、同一の試料におけるＮ２ではプラトーであり（図１２Ｄおよび１２Ｅを参照のこと）、Ｎ２の性能が劣ることがさらに実証された。このパターンは唾液では認められず、全体的なウイルス量の低さに関連する可能性が高かった（図６Ｇ～Ｈ、Ｒ２＝０．８７）。
ＲＴ－ｑＰＣＲによるＣｔ値をｄｄＰＣＲによるウイルス量と比較することにより、両方の鼻腔スワブ標本について明確な感染点を有する対数パターンが明らかとなった（図６Ｅおよび６Ｈを参照のこと）。この感染点未満のＣｔ値は、両方のアッセイにおいて直線状の一致が実証され、鼻腔スワブ標本と比較して唾液標本がより良好に相関した。この感染点を超えるＣｔ値は、低ウイルス量に対応していた（１０ＧＥ／μＬ未満）（図６Ｆおよび６Ｉを参照のこと）。まとめると、これらのデータから、ウイルス量が鼻腔スワブ試料においてより高く、Ｃｔ値は約３０を超える場合にもはや定量的値ではないことが確認される。
鼻腔スワブおよび唾液の組み合わせ標本は、実行可能な標本タイプである
鼻腔スワブおよび唾液の組み合わせ標本（すなわち、Ｓｐｉｔ－Ｎ－Ｓｗａｂ）の抽出不要の試験を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出について評価した。ＣＯＶＩＤ－１９患者は、鼻腔スワブを浸漬させた唾液標本を提供した。これらの標本を、ＲＮＡ抽出を用いずに直接試験した。Ｓｐｉｔ－Ｎ－Ｓｗａｂにより、ＳｗａｂＣＬＥＡＲ比較してＣｔが１．６増加し（ｎ＝１０４標本対、ｐ＝０．０１１）、ＳａｌｉｖａＦＡＳＴと比較してＣｔが１．１減少したことが実証された（ｎ＝９０標本対、図９Ａを参照のこと、ｐ＜０．００１）（図７Ａ）。いくつかのＳｐｉｔ－Ｎ－Ｓｗａｂ標本において低ウイルス量が検出され、ＳａｌｉｖａＦＡＳＴ標本では陰性に適合した（図１３Ｃを参照のこと）を考慮すると、Ｓｐｉｔ－Ｎ－ＳｗａｂはＳａｌｉｖａＦＡＳＴの臨床的感度を改善し得る。これらのデータは、鼻腔スワブおよび唾液の組み合わせ標本が抽出不要の試験を実行可能であり、低ウイルス量で感染したＣＯＶＩＤ－１９患者における感度を増強し得ることが示唆される。
鼻腔スワブおよび唾液の組み合わせ標本（すなわち、Ｓｐｉｔ－Ｎ－Ｓｗａｂ）の抽出不要の試験を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出について評価した。ＣＯＶＩＤ－１９患者は、鼻腔スワブを浸漬させた唾液標本を提供した。これらの標本を、ＲＮＡ抽出を用いずに直接試験した。Ｓｐｉｔ－Ｎ－Ｓｗａｂにより、ＳｗａｂＣＬＥＡＲ比較してＣｔが１．６増加し（ｎ＝１０４標本対、ｐ＝０．０１１）、ＳａｌｉｖａＦＡＳＴと比較してＣｔが１．１減少したことが実証された（ｎ＝９０標本対、図９Ａを参照のこと、ｐ＜０．００１）（図７Ａ）。いくつかのＳｐｉｔ－Ｎ－Ｓｗａｂ標本において低ウイルス量が検出され、ＳａｌｉｖａＦＡＳＴ標本では陰性に適合した（図１３Ｃを参照のこと）を考慮すると、Ｓｐｉｔ－Ｎ－ＳｗａｂはＳａｌｉｖａＦＡＳＴの臨床的感度を改善し得る。これらのデータは、鼻腔スワブおよび唾液の組み合わせ標本が抽出不要の試験を実行可能であり、低ウイルス量で感染したＣＯＶＩＤ－１９患者における感度を増強し得ることが示唆される。
午前中の採取対午後の採取
ＣＯＶＩＤ－１９患者は、回復期およびウイルス排除の自然経過を観察するために症状の発現後２７日目まで縦断的モニタリングを受けた（図１５を参照のこと）。多くの対応のある試料セットを、同日の午前および午後に採取した。午前中と午後のＲＮＰのＣｔ値の比較により、Ｃｔ値がわずかにＳｗａｂＣＬＥＡＲにおいて０．６９、ＳａｌｉｖａＣＬＥＡＲにおいて１．１増加したことが実証され（図１４Ａおよび１４Ｂを参照のこと）、試料マトリックスの日変化が示唆された。しかしながら、この相違は、ＳａｌｉｖａＦＡＳＴでは認められなかった（図１４Ｃを参照のこと）。午前の唾液標本と比較して午後の標本は、ウイルス量が減少するという傾向があった。この変化はＳａｌｉｖａＦＡＳＴで最も顕著であり、Ｎ１については２．７８（ｐ＝０．０１１）およびＮ２については２．５８（ｐ＝０．０３１）のＣｔの増加が証明された（図１４Ｃを参照のこと）。概して、これらの予備データは、唾液マトリックスの日変化がＲＴ－ｑＰＣＲの臨床的感度に影響を及ぼし得るという可能性を高める。
ＣＯＶＩＤ－１９患者は、回復期およびウイルス排除の自然経過を観察するために症状の発現後２７日目まで縦断的モニタリングを受けた（図１５を参照のこと）。多くの対応のある試料セットを、同日の午前および午後に採取した。午前中と午後のＲＮＰのＣｔ値の比較により、Ｃｔ値がわずかにＳｗａｂＣＬＥＡＲにおいて０．６９、ＳａｌｉｖａＣＬＥＡＲにおいて１．１増加したことが実証され（図１４Ａおよび１４Ｂを参照のこと）、試料マトリックスの日変化が示唆された。しかしながら、この相違は、ＳａｌｉｖａＦＡＳＴでは認められなかった（図１４Ｃを参照のこと）。午前の唾液標本と比較して午後の標本は、ウイルス量が減少するという傾向があった。この変化はＳａｌｉｖａＦＡＳＴで最も顕著であり、Ｎ１については２．７８（ｐ＝０．０１１）およびＮ２については２．５８（ｐ＝０．０３１）のＣｔの増加が証明された（図１４Ｃを参照のこと）。概して、これらの予備データは、唾液マトリックスの日変化がＲＴ－ｑＰＣＲの臨床的感度に影響を及ぼし得るという可能性を高める。
インフルエンザおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの同時検出のための多重アッセイ
別の態様では、同一試料から複数の分析物を検出する方法を提供する。特に、いくつかの実施形態では、複数のウイルス感染を、本明細書中に記載の抽出不要の直接的なＰＣＲ技術にしたがって、同一の生物試料から検出することができる。例えば、本発明の方法を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのコロナウイルス感染を検出することができる一方で、別の呼吸器病原体（インフルエンザウイルスなど）も検出できる。
別の態様では、同一試料から複数の分析物を検出する方法を提供する。特に、いくつかの実施形態では、複数のウイルス感染を、本明細書中に記載の抽出不要の直接的なＰＣＲ技術にしたがって、同一の生物試料から検出することができる。例えば、本発明の方法を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのコロナウイルス感染を検出することができる一方で、別の呼吸器病原体（インフルエンザウイルスなど）も検出できる。
より具体的には、本発明は、多重アッセイ（ＦＬＵＶＩＤＦａｓｔ試験）を提供し、この試験は、本発明の固有の緩衝液組成物を介して採取および処理された上気道標本または下気道標本（スピット試料またはスワブ試料）中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ型ウイルス、および／またはインフルエンザＢ型ウイルスの核酸を同時に定量的に検出および識別することを意図するリアルタイムＲＴ－ｑＰＣＲ多重化試験である。
例示的なＦＬＵＶＩＤＦａｓｔ試験の実施方法は、生物試料を個体から得る工程を含む。生物試料は、任意の組織試料または体液試料、最も注目すべきは、唾液試料（例えば、患者が適切な採取容器に吐き出すことによって採取する）または呼吸粘膜（例えば、鼻咽頭スワブまたは咽頭スワブを介して採取）であり得る。かかる試料採取は、前述の実施例１を参照して記載の様式に類似の様式であり得る。
さらに、（ＣＯＶＩＤＦａｓｔ試験法に関して）前述の方法に類似して、多重アッセイにより、核酸抽出工程を必要とする従来のアプローチが回避され、その代わりに、試料を直接試験し、抽出プロセスを回避する。特に、臨床試料を固有の緩衝液組成物に提供し、試料中の核酸が、下流のｑＰＣＲ、ｒｔＰＣＲ、またはＮＧＳベースの診断試験のために直接使用される。固有の緩衝液組成物は、前に記載されている。
ＦＬＵＶＩＤＦａｓｔ試験のためにＰＣＲアッセイを実施する工程は、ウイルス核酸特異的プライマー－プローブセットの使用を含む。この例では、ＦＬＵＶＩＤＦａｓｔ試験で使用されるウイルス核酸特異的プライマー－プローブセットは、ＣＤＣインフルエンザＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｆｌｕ ＳＣ２）多重アッセイプライマーおよびプローブを含む（以下のＣＤＣウェブサイトで公表されている：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ／２０１９－ｎｃｏｖ／ｌａｂ／ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ－ｐｒｉｍｅｒ－ｐｒｏｂｅｓ．ｈｔｍｌ、最終更新日：、２０２１年７月１３日）。ＦＬＵＶＩＤＦａｓｔ試験は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）およびデジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）（ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）が挙げられ得る）のうちの少なくとも１つを実施することを含み得るウイルス核酸の定量をさらに含む。結果に基づいて、患者がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス、インフルエンザＡ型ウイルス、および／またはインフルエンザＢ型ウイルスに感染しているか、感染していないかを診断することができる。
ＦＬＵＶＩＤＦａｓｔ試験の臨床的検証：
ＦＬＵＶＩＤＦａｓｔアッセイを、日常的なＣＯＶＩＤ１９試験由来の４５０の残りの臨床スワブ試料に対して実施した。
ＦＬＵＶＩＤＦａｓｔアッセイを、日常的なＣＯＶＩＤ１９試験由来の４５０の残りの臨床スワブ試料に対して実施した。
ＦＬＵＶＩＤＦａｓｔ試験を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出のためのＣＯＶＩＤＦａｓｔ試験に対して臨床的に検証した。コミュニティメンバー由来の４５０対の臨床試料（すなわち、各々の試験被験体が１つの唾液試料および１つの前鼻孔スワブ試料を提供した）を、ＦＬＵＶＩＤＦａｓｔによって分析し、ＣＯＶＩＤＦａｓｔと比較した。ＰＰＡおよびＮＰＡは、それぞれ、９２．８６％および９９．２４％，である（以下の表３を参照のこと）。
ＦＬＵＶＩＤＦａｓｔ試験の結果、特に、インフルエンザＡ型およびインフルエンザＢ型を検出する能力を、以下の表４に提供する：
ＦＬＵＶＩＤＦａｓｔ（４重アッセイ）を、日常的なＣＯＶＩＤ１９試験由来の４５０の残りの臨床スワブ試料に対して実施した。表に示すように（表４）、インフルエンザＡ型が検出され、インフルエンザＢ型は検出されなかった。８つ全てのインフルエンザの症例は、インフルエンザＡ型のみであり、ＣＯＶＩＤ１９を重感染していなかった。インフルエンザＢ型が検出されてなかったことに対する１つの可能性のある理由は、ＣＤＣに報告された最近のインフルエンザ陽性試験から示唆される（図１６を参照のこと）。特に、発症率は、インフルエンザＡ型の９７．７％と比較してインフルエンザＢ型では非常に低く、２．３％である。したがって、使用した試験タイプと無関係に、インフルエンザＢ型陽性の臨床試料を見出すことは困難であり得る。ＦＬＵＶＩＤＦａｓｔ試験におけるインフルエンザＡ型の発症率は、米国の臨床検査室によってＣＤＣに報告された最新のサマリーに類似する（図１７中の週２０２２０４を参照のこと）。
本発明者らは、ＦＬＵＶＩＤＦａｓｔ試験がＣＤＣの現在のＦｌｕ－ＳＣ２多重アッセイよりもインフルエンザＡ型およびインフルエンザＢ型（ｉｎｆｌｕｅｎｚｅ Ｂ）を有効に検出することを見出した。特に、図１８Ａおよび１８Ｂは、ＲＮＡ抽出を必要とするＣＤＣインフルエンザＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｆｌｕ ＳＣ２）多重アッセイに対する、ＦＬＵＶＩＤＦａｓｔアッセイの抽出不要の方法によるインフルエンザＡ型およびインフルエンザＢ型の検出効率を比較したグラフである。図１８Ａおよび１８Ｂでは、インフルエンザＡ型コピーおよびインフルエンザＢ型コピーの異なる濃度でのＣｑ値を、比較のためにプロットしている。
図１９は、３～１０コピー／μＬの範囲の濃度でのインフルエンザＡ型およびインフルエンザＢ型の２０レプリケートならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２人為的試料の１０レプリケートを使用した検出限界（ＬｏＤ）の決定を示すチャートである。
参照による援用
本開示を通して、特許、特許出願、特許刊行物、雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツなどの他の文書が参照および引用されている。かかる文書は全て、あらゆる目的のためにその全体が本明細書中で参考として援用される。
本開示を通して、特許、特許出願、特許刊行物、雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツなどの他の文書が参照および引用されている。かかる文書は全て、あらゆる目的のためにその全体が本明細書中で参考として援用される。
均等物
本明細書に表示されて記載されたものに加えて、本発明の種々の修正およびその多くのさらなる実施形態は、本明細書中に引用された科学文献および特許文献の参照が含まれる本文書の全内容から当業者に明らかになるであろう。本明細書中の主題は、その種々の実施形態およびその均等物において本発明の実施に適合させることができる重要な情報、例示、およびガイダンスを含む。
本明細書に表示されて記載されたものに加えて、本発明の種々の修正およびその多くのさらなる実施形態は、本明細書中に引用された科学文献および特許文献の参照が含まれる本文書の全内容から当業者に明らかになるであろう。本明細書中の主題は、その種々の実施形態およびその均等物において本発明の実施に適合させることができる重要な情報、例示、およびガイダンスを含む。
Claims (21)
- 抽出不要の核酸分析方法であって、
生物試料を、ヌクレアーゼフリー水、抗真菌剤、抗生物質、リボヌクレアーゼ阻害剤、および還元剤を含む緩衝液組成物中で混合する工程；
前記核酸の事前抽出を行うことなく、標的核酸に特異的なプライマーを用いて前記緩衝液中で前記核酸を直接増幅させる工程；および
病原体の存在を検出するために前記増幅工程において産生されたアンプリコンを分析する工程
を含む、方法。 - 前記核酸が病原体である、請求項１に記載の方法。
- 前記病原体が、ウイルス、細菌、および真菌から選択される、請求項２に記載の方法。
- 前記核酸が、宿主生物の細胞に由来する、請求項１に記載の方法。
- 前記核酸がＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
- 前記分析する工程が、前記アンプリコンを配列決定することを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記生物試料が体液である、請求項１に記載の方法。
- 前記体液が、唾液、痰、粘液、たん、尿、血液、便、および性器分泌物からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
- 前記還元剤溶液が、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液である、請求項１に記載の方法。
- 前記抗真菌剤溶液がアンホテリシンＢ溶液を含み、前記抗生物質溶液がペニシリン・ストレプトマイシン溶液を含む、請求項１に記載の方法。
- 鼻腔スワブまたは咽頭スワブを介して前記生物試料を得る工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 膣スワブまたは直腸スワブを介して前記生物試料を得る工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 前記抗真菌剤溶液がアンホテリシンＢ溶液を含み、前記抗生物質溶液がペニシリン・ストレプトマイシン溶液を含む、請求項１に記載の方法。
- １またはそれを超えるＰＣＲアッセイを実施する前に、前記緩衝液組成物と混合された生物試料を熱失活させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 前記生物試料および緩衝液組成物の混合物を、９５℃に５分間加熱する、請求項１４に記載の方法。
- ウイルスが重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）である、請求項１に記載の方法。
- 前記核酸特異的プライマーが、ウイルスのＮ遺伝子、ＯＲＦｌａｂ遺伝子、およびＥ遺伝子のうちの１つまたは複数を標的にする、請求項１６に記載の方法。
- ウイルス核酸を定量する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 前記増幅工程が、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を含む、請求項１８に記載の方法。
- 連続した時点で前記患者から得た複数の生物試料中のウイルス核酸量を比較し、経時的なウイルス核酸量の増加または減少に基づいて疾患の進行を決定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
- ウイルス核酸量に基づいて疾患アウトカムを予想する工程をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US202163158685P | 2021-03-09 | 2021-03-09 | |
| US63/158,685 | 2021-03-09 | ||
| US202163277061P | 2021-11-08 | 2021-11-08 | |
| US63/277,061 | 2021-11-08 | ||
| PCT/US2022/019608 WO2022192440A1 (en) | 2021-03-09 | 2022-03-09 | Extraction-free pathogen testing methods |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2024509588A true JP2024509588A (ja) | 2024-03-04 |
Family
ID=83194638
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023555274A Pending JP2024509588A (ja) | 2021-03-09 | 2022-03-09 | 抽出不要の病原体試験方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220290210A1 (ja) |
| EP (1) | EP4305188A1 (ja) |
| JP (1) | JP2024509588A (ja) |
| CA (1) | CA3213108A1 (ja) |
| WO (1) | WO2022192440A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20220290210A1 (en) * | 2021-03-09 | 2022-09-15 | Robert E. Blomquist | Extraction-free pathogen testing methods |
| AU2022310030A1 (en) * | 2021-07-13 | 2024-02-01 | Summit Biolabs, Inc. | Devices and methods for extraction-free pathogen testing |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6777210B1 (en) * | 1998-09-24 | 2004-08-17 | Ambion, Inc. | Method and reagents for inactivating ribonucleases RNase A, RNase I and RNase T1 |
| US8519125B2 (en) * | 2009-05-11 | 2013-08-27 | Biomatrica, Inc. | Compositions and methods for biological sample storage |
| MX345557B (es) * | 2011-07-06 | 2017-02-02 | Quest Diagnostics Invest Inc | Amplificacion y deteccion directa de patogenos virales y bacteriales. |
| GB201812428D0 (en) * | 2018-07-31 | 2018-09-12 | Bg Res Ltd | Improved method for pathogen detection |
| IT202000006754A1 (it) * | 2020-03-31 | 2021-10-01 | Diasorin S P A | Saggi per la rivelazione di SARS-CoV-2 |
| CA3181788A1 (en) * | 2020-04-29 | 2021-11-04 | Shi-long LU | Viral testing in saliva |
| WO2022020886A1 (en) * | 2020-07-27 | 2022-02-03 | Microbio Pty Ltd | A detection method for viral replication |
| US20220290210A1 (en) * | 2021-03-09 | 2022-09-15 | Robert E. Blomquist | Extraction-free pathogen testing methods |
| EP4308724A1 (en) * | 2021-03-19 | 2024-01-24 | Becton, Dickinson and Company | Isothermal amplification of pathogens |
| EP4334024A1 (en) * | 2021-05-05 | 2024-03-13 | Salus Discovery, LLC | Stable interface systems and compositions |
| AU2022310030A1 (en) * | 2021-07-13 | 2024-02-01 | Summit Biolabs, Inc. | Devices and methods for extraction-free pathogen testing |
| US20230142838A1 (en) * | 2021-11-08 | 2023-05-11 | Summit Biolabs, Inc. | Devices and methods for nucleic acid extraction-free sti pathogen testing |
-
2022
- 2022-03-09 US US17/690,951 patent/US20220290210A1/en active Pending
- 2022-03-09 CA CA3213108A patent/CA3213108A1/en active Pending
- 2022-03-09 JP JP2023555274A patent/JP2024509588A/ja active Pending
- 2022-03-09 EP EP22767923.0A patent/EP4305188A1/en active Pending
- 2022-03-09 WO PCT/US2022/019608 patent/WO2022192440A1/en active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2022192440A1 (en) | 2022-09-15 |
| EP4305188A1 (en) | 2024-01-17 |
| CA3213108A1 (en) | 2022-09-15 |
| US20220290210A1 (en) | 2022-09-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2024509588A (ja) | 抽出不要の病原体試験方法 | |
| US20210332444A1 (en) | SARS-CoV-2 TEST KIT FOR RT-qPCR ASSAYS | |
| EP2426222A1 (en) | Generic buffer for amplification | |
| US20220042117A1 (en) | COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE SIMULTANEOUS DETECTION OF INFLUENZA A, INFLUENZA B, AND SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS 2 (SARS-CoV-2) | |
| US20230142838A1 (en) | Devices and methods for nucleic acid extraction-free sti pathogen testing | |
| KR20230021120A (ko) | 호흡기 병원체의 검출을 위한 샘플링 키트 및 검출방법 | |
| US20230026556A1 (en) | Devices and methods for extraction-free pathogen testing | |
| JP6641350B2 (ja) | 乾燥スポットに対する自動化ｈｉｖ−１ウイルス量検査方法 | |
| CA2491495C (en) | Storing and detecting nucleic acid administered to a solid carrier | |
| US20190360897A1 (en) | Biological sample preparation for testing | |
| CN113512598B (zh) | 百日咳杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针 | |
| JP2024516736A (ja) | ウイルス変異株検出 | |
| US20240150854A1 (en) | Methods and systems for detection of monkeypox virus | |
| do Carmo Silva et al. | Can a field molecular diagnosis be accurate? A performance evaluation of colorimetric RT-LAMP for the detection of SARS-CoV-2 in a hospital setting | |
| WO2024134572A1 (en) | Sequences and methods for crispr-based detection of omicron 5 variant of sars-cov-2 | |
| EP4136229A1 (en) | Sars-cov-2 test kit for rt-qpcr assays |