JP2024516736A - ウイルス変異株検出 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株の迅速な検出を可能にする、組成物および方法を提供する。本発明は、既知のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株の迅速なＰＣＲ検出および識別のための、組成物および方法を提供する。例えば、変異株特異的プライマーを使用して、本明細書において開示される方法および組成物は、Ｂ．１．１．７（英国）変異株、Ｐ．１（ブラジルおよび日本）変異株、Ｂ．１．３５１（南アフリカ）変異株、ならびにＢ．１．４２９／４２７（カリフォルニア）変異株（本明細書において集合的に、懸念すべき変異株（ＶＯＣ）と呼ばれる）を検出し、これらの間を識別する。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２１年５月６日に出願された米国特許仮出願第６３／１８５，０１５号の優先権および利益を主張し、その内容はその全体が本明細書において援用される。
（技術分野）

本発明は、一般的には診断方法に関連し、より詳細には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株の迅速なＰＣＲ検出のための組成物および方法に関連する。

（背景）
接触伝染病の急速な世界的蔓延は、大きな医療上の課題を提示する。例えば、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の急速な蔓延は、世界的パンデミックをもたらし、迅速で早期の検出の重要性を強調している。このパンデミックが進行するにつれて、より多くの新規な感染性変異株が蔓延している。これらの変異株は、予後がより不良であるより重症の疾患を引き起こし得、重要なことには、処置に対して異なって反応し得る。したがって、迅速な早期検出および現在の変異株同定が、成功する処置にとって重要である。

多くの感染性疾患についての従来の検出技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用を含む。ＰＣＲは、目的のＤＮＡ（ＤＮＡ標的）の特異的な領域を選択的に増幅するために使用される技術である。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを検出するための種々のリアルタイムＰＣＲアッセイ（定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）とも呼ばれる）が世界規模で開発されており、種々のウイルス遺伝子またはウイルス領域を標的としている。しかし、それらのアッセイは、懸念すべき変異株のうちの一部を検出しない可能性があり、検出する場合に、野生型と懸念すべき変異株との間を識別可能ではない可能性がある。その後、診断が失敗して、その変異株がさらに蔓延するのを許容し得、検出した場合に、野生型感染と誤同定したことに起因して、正しい処置が遅れ得る。

現在のｑＰＣＲ検出アプローチの別の欠点は、それらが、ウイルス検査プロトコルの一部として、核酸を臨床サンプルから分離および精製する初期工程に依存することである。例えば、ＲＮＡの相対的定量化のためのｑＰＣＲの適用は、典型的には、（１）サンプルからの全ＲＮＡの分離および精製；（２）その物質の溶出および可能な濃縮；ならびに（３）相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生じる逆転写（ＲＴ）反応における精製ＲＮＡの使用（その後、この相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）はｑＰＣＲ反応のために利用される）を、必要とする。

従来の方法においてＰＣＲを経る前に必要とされるこの初期の核酸の分離および精製工程（すなわち、抽出工程）は、この診断プロセスにおける主要な障害を構成する。その理由は、これが、手作業で面倒でありかつ高価であるままであり、偶発的な混入および人為的誤りの機会をさらに増加するからである。さらに、高需要期間には、核酸抽出供給の不足は、このようなウイルス検出方法の限界を悪化させ得る。したがって、病原体の正確で特異的で迅速な診断のための改善された方法が、必要とされる。

（概要）
本発明は、既知のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株の迅速なＰＣＲ検出および識別のための、組成物および方法を提供する。例えば、変異株特異的プライマーを使用して、本明細書において開示される方法および組成物は、Ｂ．１．１．７（英国）変異株、Ｐ．１（ブラジルおよび日本）変異株、Ｂ．１．３５１（南アフリカ）変異株、ならびにＢ．１．４２９／４２７（カリフォルニア）変異株（本明細書において集合的に、懸念すべき変異株（ＶＯＣ）と呼ばれる）を検出し、これらの間を識別する。変異株は、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染よりも感染性であり得、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染よりも重症の疾患を引き起こし得、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染とは異なる処置を必要とし得る。したがって、変異株の迅速なＰＣＲ同定を提供することによって、本発明の組成物および方法は、時間がかかり高価である配列決定を必要とすることなく、正確な処置が迅速に届けられることを可能にする。

特定の実施形態において、抽出なしの検出および分析の技術が、本発明の変異株特異的プライマーとともに使用される。それらの技術は、生体サンプルを処理し、後の増幅および／または検出のために利用可能な核酸を提供し、同時に初期核酸抽出工程の必要性を排除する、組成物を含む。本発明の組成物としては、例えば、目的のサンプルと混合された場合に、初期核酸抽出（すなわち、核酸の分離および精製）を必要とすることなく、直接的な核酸の増幅および分析のために適切な核酸をそのサンプルから調製可能である、サンプルの輸送および調製のための独特な緩衝液組成物が挙げられる。一局面において、本発明は、ウイルス検出のための従来のアプローチを回避し、その従来のアプローチは、産業的ＲＮＡ抽出のキットおよび技術を使用するＲＮＡ抽出工程を含む。その代わりに、本発明にしたがえば、サンプル検査は直接的であり、その抽出工程を回避する。

好ましい実施形態において、本発明の組成物および方法は、サンプルの調製および検査のために必要とされた工程の数を減少させること、および時間がかかり費用もかかる配列決定の必要性を回避することによって、従来のウイルス検査および検出のアプローチを改善する。次に、ＶＯＣを検出し処置を適宜調整するために必要とされた時間が、大いに減少され、患者の予後を改善する。

本発明の特定の局面は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株を検出するための方法を含む。好ましい方法は、核酸を含む生体サンプルを提供する工程；野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸の増幅を行うことなく、１種または複数種の標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に特異的なプライマーを用いてその核酸を増幅する工程；およびその増幅する工程において生成されたアンプリコンを分析して、その１種または複数種の標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株の存在を検出する工程を含む。

特定の実施形態において、方法は、その増幅する工程の前に、１種または複数種の標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株および野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を増幅するプライマーを使用することによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の存在を検出する工程をさらに含む。その１種または複数種の標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株は、Ｂ．１．１．７、Ｐ．１、Ｂ．１．３５１、Ｂ．１．４２９／４２７、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の他の変異株からなる群より選択され得る。そのプライマーは２種またはそれより多い標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に特異的であり得る。特定の実施形態において、そのプライマーは３種またはそれより多い標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に特異的であり得る。

その３種またはそれより多い標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株としては、Ｂ．１．１．７、Ｐ．１、およびＢ．１．３５１が挙げられ得る。一例において、そのプライマーはＯＲＦ－１Ａ領域を標的とする。特定の実施形態において、そのプライマーは、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と比較したＯＲＦ－１Ａ領域の３６７５～３５６７７位における欠失を標的とする。例示的なプライマーは配列番号１および配列番号２を含む。一部の実施形態において、その増幅する工程は、配列番号３を含むプローブを使用する定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を含む。

特定の実施形態において、その標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株はＢ．１．１．７を含み、そのプライマーはＳ領域を標的とする。そのプライマーは、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と比較したＳ領域の６９～７０位における欠失を標的とし得る。例示的なプライマーは配列番号４および配列番号５を含む。その増幅する工程は、配列番号６を含むプローブを使用する定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を含み得る。

種々の実施形態において、その標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株はＢ．１．３５１を含み、そのプライマーは、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と比較したＧ２５５６３Ｔ置換またはＧ２８８８７Ｔ置換を標的とする。例示的なプライマーは、配列番号１９および配列番号２０を含むか、または配列番号２２および配列番号２３を含む。この例において、その増幅する工程は、配列番号２１または配列番号２４を含むプローブを使用する定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を含む。

一部の実施形態において、標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株はＢ．１．４２９／４２７を含み、そのプライマーは、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と比較したＧ２７８９０Ｔ／Ｇ２７９８７Ｔ置換またはＧ２８１９１Ｔ／Ａ２８２７２Ｔ置換を標的とする。例示的なプライマーは、配列番号２５および配列番号２６を含むか、または配列番号２８および配列番号２９を含む。この例において、その増幅する工程は、配列番号２７または配列番号３０を含むプローブを使用する定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を含む。

特定の実施形態において、方法は、ヌクレアーゼフリー水と抗真菌剤と抗生物質とリボヌクレアーゼインヒビターと還元剤とを含む緩衝液組成物中に、その生体サンプルを混合する工程をさらに含む。その増幅する工程は、その核酸の事前抽出を行うことなくその緩衝液中でその核酸に対して実施される。その生体サンプルは任意の体液であり得る。その体液は、唾液、喀痰（ｓｐｕｔｕｍ）、粘液、痰（ｐｈｌｅｇｍ）、および尿からなる群より選択される。特定の実施形態において、その還元剤はトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液である。例示的な抗真菌剤はアムホテリシンＢを含み、例示的な抗生物質はペニシリン－ストレプトマイシンを含む。その生体サンプルは、鼻スワブまたは咽頭スワブによって取得され得る。方法は、その増幅する工程の前に、その緩衝液組成物と混合された生体サンプルを熱不活化する工程をさらに含み得る。その生体サンプルと緩衝液組成物との混合物は、約９５℃まで約５分間加熱され得る。

一部の実施形態において、その生体サンプルは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有すると疑われる対象から取得され、方法は、その１種または複数種の標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株の検出された存在に基づいて処置レジメンを選択する工程をさらに含む。その処置レジメンは、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染について推奨される処置レジメンとは異なり得る。

本発明の方法は、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来する核酸を増幅することなく、１種または複数種の標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に由来する核酸を選択的に増幅するプライマーセットを利用する。特定の局面において、本発明のプライマーセットは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の検出と、野生型と既知変異株との組の間での感染型の同定とを同時に行うための多重分析のためのアレイに配置される。種々の実施形態において、そのアレイは、各ウェルが、単一の生体サンプルにおける１種または複数種の特定の変異株のｑＰＣＲ検出のための異なるプライマー－プローブセットを含む、複数のウェルを含み得る。

図１は、変異株特異的検出のための種々のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株中の標的領域を列挙し、列挙された変異株を標的とするプライマー－プローブセットを列挙する。

図２は、種々のＶＯＣについての変異標的をマッピングする。

図３は、Ｎ１領域を標的とする単一のプライマーセットを使用する、野生型およびＶＯＣ変異株の両方の迅速なＰＣＲ検出の結果を示す。

図４は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムにおける共通変異のマップを示す。

図５は、Ｂ．１．１．７陽性コントロールに曝露された場合の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの４つの異なる共通変異領域を標的とするプライマー－プローブセットについてのＣｑ値を示す。

図６は、野生型陽性コントロールに曝露された場合の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの４つの異なる共通変異領域を標的とするプライマー－プローブセットについてのＣｑ値を示す。

図７は、野生型陽性コントロールおよびＢ．１．１．７陽性コントロールについてのＮ領域変異を標的とするプライマーの比較Ｃｑ値を示す。

図８は、野生型陽性コントロールおよびＢ．１．１．７陽性コントロールについてのＯＲＦ１ａ領域変異を標的とするプライマーの比較Ｃｑ値を示す。

図９は、野生型陽性コントロールおよびＢ．１．１．７陽性コントロールについてのＳ領域変異を標的とするプライマーの第１のセットの比較Ｃｑ値を示す。

図１０は、野生型陽性コントロールおよびＢ．１．１．７陽性コントロールについてのＳ領域変異を標的とするプライマーの第２のセットの比較Ｃｑ値を示す。

図１１は、本発明の方法および組成物を使用するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株の迅速なＰＣＲ検出のＮＧＳ検証の結果を示す。

図１２は、サンプルにおける特定のＶＯＣ感染を決定するための例示的なフローチャートを示す。

（詳細な説明）
接触伝染病（例えば、既知および未知の両方の、インフルエンザ、普通感冒、潜在的に致死性のウイルス、または微生物疾患もしくはウイルス疾患）の蔓延に関する懸念が増加中である。２０１９年に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の大流行が、世界的なパンデミックおよび呼吸器疾患の大流行をもたらし、多数の死をもたらした。その後、数種の懸念すべき変異株が発生し、それらは、増大した伝染率、より重症の疾患およびより不良な予後、ならびに異なる処置反応によって特徴付けられた。これらの変異株は、新たな感染の波を駆動し、現在の検査を使用したそれらの変異株の検出性および現在のワクチンに対するそれらの変異株の反応性に関して懸念を引き起こしている。さらに、これらの変異株は処置に対して異なって反応してより重症の疾患を引き起こし得るので、単にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を迅速で安価に同定するのではなく、その感染がＶＯＣの１種によるものであるか否かを迅速で安価に同定する必要性が、緊急に存在する。さらに、それらの種々の変異株の蔓延を追跡することが、パンデミックを理解し克服する際に有益であり、安価で迅速な変異株検査は、それを行うための価値ある道具を提供する。

本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株の迅速な検出（抽出なしの直接的ＰＣＲ技術によるものを含む）を可能にする組成物および方法を提供する。より詳細には、本発明は、野生型ウイルスを増幅することなく１種または複数種のＶＯＣを選択的に増幅するためのプライマーセットを含む組成物を提供し、それによって、時間および費用のかかる配列決定を必要とすることなく変異株の迅速な診断および同定を可能にする。種々の実施形態において、現在既知である４種のＶＯＣのうちのどれが生体サンプルに存在するのか迅速に同定するためのワークフローおよびプライマー－プローブセットが、開示される。特定の実施形態において、複数の同定検査が単一サンプルに対して同時に実施され得るように、プライマーの種々のセットがアレイまたは多重化分析に含まれ得る。本発明の方法は、実験室が利用可能ではない場合でさえ病原体を迅速で正確に同定するための、ポイントオブケア溶液を提供する。

特定の実施形態において、生体サンプルを処理し、後のＰＣＲアッセイのために利用可能なＤＮＡを提供し、同時に初期ＲＮＡ抽出工程の必要性を排除するための方法が、提供される。本発明の方法は、目的のサンプルと混合された場合に、初期核酸抽出（すなわち、核酸の分離および精製）を必要とすることなく核酸の増幅および分析のために直接使用され得る核酸をそのサンプルから調製可能である、サンプルの輸送および調製のための独特な緩衝液組成物を使用し得る。臨床サンプルがその独特な緩衝液組成物中に提供された後に、ウイルス粒子は、加熱またはその緩衝液中での直接溶解のいずれかによって不活化され得る。その後、その不活化サンプルは、本発明のＶＯＣ特異的プライマー－プローブセットを使用する、下流のｑＰＣＲ診断検査のために使用され得る。

急速な複製および世界規模の高い感染率が、野生型ウイルスとは異なる懸念される伝染特徴または感染特徴を示す、上記のＶＯＣを含む数種のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株の発生をもたらしている。共通して観察される数個の変異が図４にマッピングされている。

例示的なプライマーセットが図１に列挙されており、図１は、それらが選択的に増幅／検出するＶＯＣ、それらが標的とする変異株配列、ならびにフォワードプライマー、リバースプライマー、およびプローブ配列を含む。

種々の実施形態において、Ｂ．１．１．７、Ｐ．１、Ｂ．１．３５１、および他の変異株が、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスと比較した３６７５～３６７７位における欠失を標的とするプライマー－プローブセットを使用して、一緒に検出され得る。その変異を標的とする、配列番号１（フォワード）および配列番号２（リバース）を有する例示的なプライマーが、配列番号３を含むプローブとともに図１に提供される。これらのＶＯＣに対する処置方法は同様であるので、迅速な反応のために、さらなる識別は必要とされない可能性があり、または延期され得る。したがって、本明細書において記載される迅速なｑＰＣＲ検査を使用する、患者がそれらの３種のＶＯＣのうちの１種を有するという決定は、その患者を処置するための時間的制約がある価値ある情報を提供し得、同時に、多重検査または配列決定に関係する時間および費用を最小化し得る。本発明が標準的な型のウイルス配列よりも変異株を優先的に増幅することに部分的には基づくという点で、本発明は発生する変異株に容易に適用可能であることを、当業者は理解する。本発明を新規な変異株に適用するために必要なことは、発見された変異株を選択する配列の同定だけである。

特定の実施形態において、Ｂ．１．１．７変異株が、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスと比較した６９～７０位における欠失を標的とするプライマー－プローブセットを使用して、検出される。その変異を標的とする、配列番号４（フォワード）および配列番号５（リバース）を有する例示的なプライマーが、配列番号６を含むプローブとともに図１に提供される。

特定の実施形態において、Ｂ．１．１．７変異株が、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスと比較した１４４Ｙ欠失を標的とするプライマー－プローブセットを使用して、検出される。その変異を標的とする、配列番号７（フォワード）および配列番号８（リバース）を有する例示的なプライマーが、配列番号９を含むプローブとともに図１に提供される。

特定の実施形態において、Ｂ．１．１．７変異株が、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスと比較した２８２８０位におけるＧＡＴ＞ＣＡＴ変異を標的とするプライマー－プローブセットを使用して、検出される。その変異を標的とする、配列番号１０（フォワード）および配列番号１１（リバース）を有する例示的なプライマーが、配列番号１２を含むプローブとともに図１に提供される。

特定の実施形態において、Ｐ．１変異株およびＢ．１．３５１変異株が、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスと比較したＥ４８４Ｋ置換を標的とするプライマー－プローブセットを使用して、一緒に検出され得る。その変異を標的とする、配列番号１３（フォワード）および配列番号１４（リバース）を有する例示的なプライマーが、配列番号１５を含むプローブとともに図１に提供される。

特定の実施形態において、Ｐ．１変異株およびＢ．１．３５１変異株が、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスと比較したＥ４８４Ｋ置換およびＮ５９１Ｙ置換を標的とするプライマー－プローブセットを使用して、一緒に検出され得る。その変異を標的とする、配列番号１６（フォワード）および配列番号１７（リバース）を有する例示的なプライマーが、配列番号１８を含むプローブとともに図１に提供される。

特定の実施形態において、Ｂ．１．３５１変異株が、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスと比較したＧ２５５６３Ｔ置換を標的とするプライマー－プローブセットを使用して、検出される。その変異を標的とする、配列番号１９（フォワード）および配列番号２０（リバース）を有する例示的なプライマーが、配列番号２１を含むプローブとともに図１に提供される。

特定の実施形態において、Ｂ．１．３５１変異株が、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスと比較したＣ２８８８７Ｔ置換を標的とするプライマー－プローブセットを使用して、検出される。その変異を標的とする、配列番号２２（フォワード）および配列番号２３（リバース）を有する例示的なプライマーが、配列番号２４を含むプローブとともに図１に提供される。

特定の実施形態において、Ｂ．１．４２９／４２７変異株が、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスと比較したＧ２７８９０Ｔ置換およびＧ２７９８７Ｔ置換を標的とするプライマー－プローブセットを使用して、検出される。その変異を標的とする、配列番号２５（フォワード）および配列番号２６（リバース）を有する例示的なプライマーが、配列番号２７を含むプローブとともに図１に提供される。

特定の実施形態において、Ｂ．１．４２９／４２７変異株が、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスと比較したＧ２８１９１Ｔ置換およびＡ２８２７２Ｔ置換を標的とするプライマー－プローブセットを使用して、検出される。その変異を標的とする、配列番号２８（フォワード）および配列番号２９（リバース）を有する例示的なプライマーが、配列番号３０を含むプローブとともに図１に提供される。

特定の実施形態において、Ｂ．１．４２９／４２７変異株が、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスと比較したＬ４５２Ｒ（Ｔ２２９１７Ｇ）置換を標的とするプライマー－プローブセットを使用して、検出される。その変異を標的とする例示的なプライマーは、ＴＧＧＴＡＡＴＴＡＴＡＡＴＴＡＣＣＧＧＴ（フォワード、配列番号３１）、ＡＣＴＧＡＡＡＴＣＴＡＴＣＡＧＧＣＣＧＧＴＡＧＣＡＣ（リバース、配列番号３２）を含み得、プローブはＡＡＡＣＣＴＴＣＡＡＣＡＣＣＡＴＴＡＣＡＡＧＧ（配列番号３３）を含み得る。

上記の変異が図２においてこれらの４種のＶＯＣの各々にマッピングされており、どの標的変異がどのＶＯＣについて陽性の結果または陰性の結果を生じるかを示す。

上記のＯｒｆ－ｍｕｔプライマー（例えば、配列番号１および２）または１種よりも多くの変異株を一緒に検出する他の任意のプライマーを使用して変異株Ｂ．１．１．７、変異株Ｐ．１、または変異株Ｂ．１．３５１を検出した場合、その後、検出された変異株をさらに識別することが望ましいものであり得る。したがって、サンプルは、図１２に示されるワークフローに供され得る。サンプルは、Ｎ１プライマー、または一般的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための他の任意の手段を用いて、まず検査され得る。その感染が野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であるかまたはＶＯＣであるかを決定するために、その後そのサンプルは、上記のＯｒｆ－ｍｕｔプライマーを使用して検査され得る。その後、陽性の結果はＢ．１．１．７変異株、Ｐ．１変異株、またはＢ．１．３５１変異株のうちの１種の存在を示し、一方で、陰性の結果は野生型もしくは非ＶＯＣ変異株、またはＢ．１．４２９／４２７変異株による感染を示す。

Ｏｒｆ－ｍｕｔ陽性の結果の場合、そのサンプルは、Ｓ領域を標的とするプライマー（例えば、ｄｅｌ６９－７０を標的とするＳ１－ｍｕｔプライマー）を用いて検査され得る。そこでの陽性の結果は、その感染がＢ．１．１．７変異株であることを示す。陰性の結果が見出された場合、その後そのサンプルは、上記で列挙されたＢ．１．３５１特異的プライマーを用いて検査され得、そこで陽性の結果はその感染がＢ．１．３５１変異株によることを示し、陰性の結果はその感染がＰ．１であることを示す。

Ｏｒｆ－ｍｕｔ陰性の結果が得られた場合、そのサンプルは上記で列挙されたＢ．１．４２９／４２７特異的プライマーを用いて検査され得、陽性の結果はその変異株による感染を示し、陰性の結果は野生型感染または他の非ＶＯＣ変異株を示す。したがって、この例示的なフローチャートを通して行うことによって、特定のＶＯＣ感染が、最大３回の迅速なｑＰＣＲ反応で同定され得る。種々の実施形態において、上記のフローチャートの工程は、多重分析を使用して同時に実行され得る。例えば、マルチウェルプレートまたはアレイが使用され得、そこでは、所定のサンプルについてのすべての検査結果が一度に決定され得るように、別々のウェルまたは別々の位置にある別々のプライマーセットにサンプルが導入され得る。あるいは、各々のウェルまたは位置は、これら４種のＶＯＣのうちの１種のみに特異的なプライマーセットを含み得る。特定の実施形態において、単一の反応混合物が、Ｏｒｆ－ｍｕｔプライマーおよびＢ．１．４２９／４２７特異的プライマーを使用して調製され得、その場合、いかなる陽性の結果もＶＯＣ感染を示す。

一般に、本発明のプライマー／プローブセットを使用するｑＰＣＲ検出のためのワークフローは、感染していると疑われる個体から生体サンプルを取得する工程を含む。サンプル収集の方法、および収集されたサンプルの型は、変化し得る。例えば、その生体サンプルは体液を含み得、その生体サンプルは、臨床的に許容可能な任意の様式で収集され得る。その体液サンプルは、その疾患の徴候もしくは症状を示すか、またはその疾患について検査で陽性であった他者との交流が原因でその疾患に罹患したと疑われるかのいずれかである患者から、一般的には収集される。上記の方法は、発見された任意の変異株または変異株の組合せの検出に適用可能である。

体液は、例えば、ヒトまたは他の哺乳動物に由来する、任意の液体物質であり得る。そのような体液としては、粘液、血液、血漿、血清、血清派生物、胆汁、血液、母体血、痰、唾液、喀痰、汗、羊水、月経液（ｍｅｎｓｔｒｕａｌ ｆｌｕｉｄ）、乳腺液（ｍａｍｍａｒｙ ｆｌｕｉｄ）、卵巣の卵胞液、卵管液（ｆａｌｌｏｐｉａｎ ｔｕｂｅ ｆｌｕｉｄ）、腹水、尿、精液、および脳脊髄液（ＣＳＦ）（例えば、腰椎ＣＳまたは脳室ＣＳ）が挙げられるが、それらに限定はされない。サンプルはまた、細胞または生体物質を含む、媒体であり得る。サンプルはまた、血餅（例えば、血清が除去された後に全血から取得された血餅）であり得る。特定の実施形態において、そのサンプルは、対象から収集された、血液、唾液、または精液である。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２について、生体サンプルは一般的には鼻咽頭スワブもしくは咽頭スワブによって収集され、または一部の場合には、そのサンプルは唾液であり得る。次に、そのサンプルは後の分析のために調製される。そのサンプルの調製は、核酸の初期抽出を行うことなく核酸増幅のために適した核酸をその生体サンプルから調製可能な緩衝液組成物と、そのサンプルとを混合する工程を含み得る。

上記のとおり、多くのウイルス検査アプローチは、そのウイルス検査プロトコルの一部として、核酸を臨床サンプルから分離および精製する初期工程に依存する。例えば、目的のＲＮＡの相対的定量化のためのｑＰＣＲの適用の前には、（１）そのサンプルからの全ＲＮＡの分離および精製；（２）その物質の溶出および可能な濃縮；ならびに（３）相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生じる逆転写（ＲＴ）反応における精製ＲＮＡの使用（その後、この相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）はｑＰＣＲ反応のために利用される）が先行する。本発明のプライマー－プローブセットは、そのような方法を使用して調製されたＲＮＡに対して使用され得る。しかし、現在の方法においてＰＣＲを経る前に必要とされるこの初期の核酸の分離および精製工程（すなわち、抽出工程）は、この診断プロセスにおける主要な障害を構成する。その理由は、これが、手作業で面倒でありかつ高価であるままであり、偶発的な混入および人為的誤りの機会をさらに増加するからである。

したがって、好ましい実施形態において、その生体サンプルは、後のＰＣＲアッセイのために利用可能なＤＮＡを提供し、同時に初期ＲＮＡ抽出工程の必要性を排除するために、処理され得る。例えば、その生体サンプルと混合された場合に、初期核酸抽出（すなわち、核酸の分離および精製）を必要とすることなく核酸の増幅および分析のために直接使用されることが可能な核酸をそのサンプルから調製可能であるように、独特な緩衝液組成物がサンプル調製のために使用され得る。

野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出のための例示的なプライマーおよびプローブが、Ｃｈｉｎｅｓｅ ＣＤＣ（Ｎ遺伝子およびＯＲＦ１ａｂ遺伝子を標的とする）ならびにＷＨＯ（Ｅ遺伝子を標的とする）によって開示されており、Ｔａｏ Ｓら、２０２０およびＤｏｎｇ Ｉら、２０２０において提供されている。唾液サンプルおよび鼻咽頭サンプルのｄｄＰＣＲを使用する野生型ＣＯＶＩＤ－１９感染の検出のための本発明の組成物および方法は、それらに開示されたのと同じプライマーおよびプローブを使用することを企図する。さらに、一部の実施形態において、１種または複数種のＰＣＲアッセイを実施する工程は、リボヌクレアーゼＰ（ＲＮＰ）に特異的なプライマー－プローブセットを使用することを含む。

収集され本発明の独特な緩衝液組成物によって処理された生体検体（唾サンプルまたはスワブサンプル）中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＯＣからの核酸の定性的検出のために意図される抽出なしのリアルタイムＲＴ－ｑＰＣＲ検査のための例示的な方法が、以下に記載される。鼻咽頭スワブの場合、そのスワブは呼吸器粘膜の収集のために使用され、その後、本発明の独特な緩衝液組成物を含む許容可能な容器内に配置され、可能性のあるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス粒子のための輸送媒体およびサンプル調製媒体の両方として使用される。唾液の場合、患者は許容可能な容器に単に唾を吐き、その時点でその唾液は、その後、サンプル調製のためにその独特な緩衝液組成物を含む別の容器に移される。収集されその独特な緩衝液組成物内に提供されると、ウイルス粒子は、加熱またはその緩衝液中での直接溶解のいずれかによって不活化され得る。その後、その不活化サンプルは、従来のアプローチが依存する追加的ＲＮＡ抽出工程（分離および精製）を必要とすることなく、下流のｑＰＣＲ診断検査のために使用され得る。それどころかむしろ、調製されたサンプルは、ＲＴによるｃＤＮＡ合成およびｑＰＣＲによる検出が行われ得るＰＣＲプレート（９６／３８４ウェル）フォーマットに移され得る。したがって、産業的ＲＮＡ抽出キットを使用するＲＮＡ抽出工程を含む広く使用されているアプローチとは異なり、直接的サンプル検査は、抽出を省略することによってこのプロセスを回避する。

（実施例１－野生型コントロールおよびＢ．１．１．７変異体コントロールを検出することにおける変異体プライマー／プローブセットの比較）
ＶＯＣにおいて変異した種々の領域を標的とするプライマーセットを、開発した。Ｎ１領域を標的とする一般的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プライマー（例えば、図４のマッピングにおけるＣＯＶＩＤＦＡＳＴと示されているプライマー）を、野生型コントロールおよびＶＯＣコントロール（Ｂ．１．４２９／４２７を除く）に対するｑＰＣＲ検査のために使用し、図３で示される野生型ならびにＢ．１．１．７変異株、Ｂ．１．３５１変異株、およびＰ．１変異株の各々について検出可能なシグナルを提供することが見出された。

野生型とＶＯＣとの間を識別するために、図４に示される共通変異領域のいくつかを標的とするプライマーを設計した。例えば、Ｂ．１．１．７と野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との間を識別する試みにおいて、ＯＲＦ１ａ領域、Ｓ領域、およびＮ領域を指向する４種のプライマーセットを設計した。プロキシ（Ｐｒｏｘｙ）ＰＣＲを、両方の合成陽性コントロール（Ｔｗｉｓｔ、コントロール１４、および１５）を使用して実施した。図５～図１０は、野生型とＢ．１．１．７変異株との間を識別するためのそれらの４つの標的領域の有効性を示す。図５～図８は、種々のウイルス濃度でその４種のプライマーセットの各々を使用してシグナルを生成するために必要とされる定量サイクル（Ｃｑ）値を示す。図５に示されるとおり、その４種のプライマーセット（Ｎ領域、ＯＲＦ１ａ領域、およびＳ領域における変異を指向する）の各々が、Ｂ．１．１．７陽性コントロールを首尾よく検出した。しかし、図６に示されるとおり、Ｎ領域変異特異的プライマーは、野生型陽性コントロールにも反応した。図７は、Ｎ領域変異プライマーが野生型およびＢ．１．１．７の存在下で差次的シグナルを生成しなかったこともさらに示す。したがって、Ｎ領域変異を標的とするプライマーは、野生型感染とＶＯＣ感染との間を識別することに成功しない。しかし、図８（Ｏｒｆ－ｍｕｔを標的とするプライマー）、図９（Ｓ１－ｍｕｔを標的とするプライマー）、および図１０（Ｓ２－ｍｕｔを標的とするプライマー）において示されるとおり、すべてが野生型およびＢ．１．１．７について差次的シグナルを生成した。それらの３つのうち、Ｏｒｆ－ｍｕｔを標的とするプライマーは、Ｂ．１．１．７変異株を検出するために最大の反応性の対比を提示した。

（実施例２－ＯＲＦ１ａ変異株プライマーの検証）
表１は、２０２０年１１月１２日から２０２１年２月１８日までの５９個の陽性ＣＯＶＩＤ１９サンプル（２０２０年１１月１２日～２０２１年１月１０日のサンプル番号１～１７；２０２１年１月１８日のサンプル番号１８～４２；および２０２１年２月１２日～２０２１年２月１８日のサンプル番号４３～５９）についてのＰＣＲ検査結果を示す。検査したサンプルにおいて、ＶＯＣ（Ｂ．１．４２９／４２７は含まない）は検出されなかった。これらの結果は、それらの時期の一般集団における検査した変異株の有病率（またはその欠如）と一致する。それらのサンプルを、Ｎ１領域を標的とする野生型プライマーセットならびにＯＲＦ１ａ領域に対する変異株特異的（Ｂ．１．１．７、Ｐ．１、およびＢ．１．３５１）変異を標的とする変異株特異的プライマーセットを使用して、検査した。
（表１）

表２は、Ｎ１領域を標的とする野生型プライマーセットならびにＯＲＦ１ａ領域に対する変異株特異的（Ｂ．１．１．７、Ｐ．１、およびＢ．１．３５１）変異を標的とする変異株特異的プライマーセットを使用した、２０２１年３月１６日の１４９個の陽性ＣＯＶＩＤ１９サンプルについてのＰＣＲ検査結果を示す。単一のＯｒｆ－ｍｕｔプライマーセットが、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とそれら３種のＢ．１．１．７変異株、Ｐ．１変異株、およびＢ．１．３５１変異株のいずれかとの間を首尾よく識別可能であり、それらの変異株の存在下でのみ閾値ｑＰＣＲシグナルを生成した。留意すべきことに、Ｂ．１．４２９／４２７の検出のためのプライマーは、この実験では使用しなかった。検出したこれら３種の変異株（Ｂ．１．１．７、Ｐ．１、およびＢ．１．３５１）は、一般集団において観察された変異株感染率に相応にして、３月１６日～４月７日の間に検査したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性患者のうちの約５２．２％（７２／１３８）において見出された。
（表２）

本発明の方法および組成物を使用するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株の迅速なＰＣＲ検出を検証するために、サンプルを、ＯＲＦ１ａ領域中の変異ならびにＳ領域中の変異を標的とする本発明のプライマーセット（Ｏｒｆ－ｍｕｔプライマーおよびＳ１－ｍｕｔプライマー）を用いて検査した。その後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の系統を次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって確認した。その結果を表３に示す。

第１のバッチについて、２つの時点で収集した２０個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性のペアとなった鼻－唾液検体（１０ペア）と１０個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陰性（唾液）サンプルとからなる、３０サンプルを使用した。サンプルは、ＤＮＡ Ｇｅｎｏｔｅｋデバイス（鼻スワブ用のＯＲ－１００および唾液用のＯＭ－５０５、現在のデバイス名ＯＲＥ－１００およびＯＭＥ－５０５）を用いて収集した。それらのサンプルは、２０２０年１１月１２日～２０２１年１月１０日に収集した。ＶＯＣは検出されなかった（含まなかったＢ．１．４２９／４２７を除く）。

１１個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性（迅速な唾液ＰＣＲ検査による７個および迅速な鼻スワブＰＣＲ検査による４個の）サンプルと９個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陰性（迅速な唾液ＰＣＲ検査による６個および迅速な鼻スワブＰＣＲ検査による３個の）サンプルとの、第２のバッチを検査した。それらのサンプルは、２０２１年１１月１２日から２０２１年２月１８日まで収集した。ＶＯＣ（Ｂ．１．４２９／４２７は除く）は検出されなかった。

３３個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性サンプル（迅速な唾液ＰＣＲ検査による２５個および迅速な鼻スワブＰＣＲ検査による８個）の第３のバッチを検査した。このバッチにおいて、２８個が、Ｏｒｆ－ｍｕｔ ＰＣＲの結果と一致した、ＶＯＣのうちの１種の系統名を有した。１２例のＯｒｆ－ｍｕｔ ＰＣＲ陽性症例のうち、１０例がＢ．１．１．７であり、１例がＰ１であり、１例がＢ．１．３５１であった。それらの１４例のＯｒｆ－ｍｕｔ ＰＣＲ陰性症例のうち、そのどれもＢ．１．１．７系統にも、Ｐ１系統にも、Ｂ．１．３５１系統にも属さなかった。それらの結果を以下の表３および図１１に示す。本発明の単一のＯｒｆ－ｍｕｔプライマーセットを使用すると、標的としたそれら３種のＶＯＣ（Ｂ．１．１．７、Ｐ１、またはＢ．１．３５１）の検出はＮＧＳの結果と陽性が１００％および陰性が１００％一致し、本発明の検出方法を確証した。
（表３）

（実施例３－唾液および鼻スワブの実施例）
以下は、本発明の方法にしたがうウイルス核酸の検出のための例示的なプロトコルを提供する。生体サンプルを取得する。生体サンプルとしてはヒトの体液が挙げられ得る。生体サンプルは臨床的に許容可能な任意の様式で収集し得る。

多くの呼吸器感染について、生体サンプルは一般的には鼻スワブまたは咽頭スワブによって収集し、または一部の場合には唾液である。他の例において、そのサンプルとしては、空気中で取得されたエアロゾルサンプルもしくは液滴、またはより好ましくは咳もしくはくしゃみによる液滴の排出により取得された液滴が挙げられ得る。
（現地（ｏｎ－ｓｉｔｅ）での唾液サンプルの収集）

唾液サンプルを、例えば、提供された滅菌容器中に個体に唾を吐かせることによって、それらの個体から収集し得る。唾液収集デバイスとしては、例えば、１０桁の一次元バーコードが側面に予め印刷され、ＤＡＴＡＭＡＴＲＩＸ二次元コードが底面にレーザーエッチングされた、スクリューキャップ（おねじ型）付きＮｅｓｔ １．９ｍｌ低温貯蔵バイアル（または「Ｎｅｓｔチューブ」）が挙げられ得、それを唾液サンプルの容器として使用する。唾液収集支援漏斗（Ｎｅｓｔ）を、そのＮｅｓｔバイアルと直列に使用する。
（実験室における唾液サンプルの受領および登録）

サンプルを実験室に輸送する。サンプルをバッグから取り出し、あらゆる漏出または損傷について受領受付にいる登録監督者が視覚的に調べる。その監督者による事前スクリーニング段階を合格したサンプルを、登録チームが使用する机上に移動する。その事前スクリーニング段階を合格しなかったサンプルは、さらなる調査のために取って置く。登録担当者は、そのＮｅｓｔチューブのバーコードをスキャンし、実験室情報管理システム（ＬＩＭＳ）によってコンピュータスクリーンに示される患者情報および同意ステータスを調べる。ＬＩＭＳにおいて完全な患者情報を備え漏出がないチューブ（すなわち、適格なサンプル）を、バーコード付き４８フォーマットラックに配置する。そのラック中のサンプルの位置は、ＬＩＭＳにおいて割り当てられた位置と一致するべきである。不適格なサンプルは別のバーコード付き４８フォーマットラックに配置し、登録監督者によるさらなる調査のために取って置く。その後、サンプル調製チームの臨床検査技師（ＭＬＳ）がそのサンプルを取り出すまで、サンプルのラックを６０ｒｐｍにて保持位置でプラットフォームロッカーに配置し得る。

（唾液反応緩衝液）
サンプル調製の一部として、その唾液サンプルを、唾液のために特別に調製した独特な緩衝液組成物（本明細書において唾液調製緩衝液と呼ぶ）と混合する。この唾液調製緩衝液の調製は、少なくとも以下の装置の使用を含む：安全キャビネットまたは層流フード（無菌環境を維持可能な作業領域）；滅菌済みの個別包装ピペット、ピペットチップ（例えば、１０ｍＬおよび２５ｍＬ）；ピペット・エイド；ピペッター（１ｍＬまたは２００μＬ）および対応するチップ；ならびに５０ｍｌの滅菌済みでヌクレアーゼフリーのＦａｌｃｏｎチューブ。例示的な唾液調製緩衝液は、以下の試薬／成分を含む：
・０．５Ｍ Ｂｏｎｄ－Ｂｒｅａｋｅｒ ＴＣＥＰ溶液、（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、中性ｐＨ）、滅菌済み、ＤＮａｓｅフリー・ＲＮａｓｅフリー・プロテアーゼフリーグレード、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号７７７２０、５ｍＬ；
・ＲＮａｓｅインヒビター、ヒト胎盤、４０，０００単位／ｍｌ、滅菌済み、ＤＮａｓｅフリー・ＲＮａｓｅフリーグレード、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｍ０３０７Ｌ、１０，０００単位、２５０μｌ／チューブ；
・アムホテリシンＢ溶液、脱イオン水中２５０μｇ／ｍｌ、滅菌済み、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ２９４２、１００ｍｌ（または真菌の混入および増殖を防止するために適切な濃度の類似の抗真菌剤）；
・ペニシリン－ストレプトマイシン溶液、１００×、ペニシリン（１０，０００ＩＵ）とストレプトマイシン（１０，０００μｇ／ｍｌ）との１００倍作業濃度の混合物、滅菌済み、Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３０－００２－ＣＩ（または細菌の混入および増殖を防止するために適切な濃度の類似の抗生物質）；
・ヌクレアーゼフリー水、滅菌済み、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｓｉｇｍａ、Ｗ４５０２、ＤＮａｓｅフリー・ＲＮａｓｅフリー・プロテアーゼフリーグレード；ならびに
・消毒薬（例えば、７０％エタノール）。

唾液調製緩衝液の調製は、標準的な生物学および／または臨床上の実験室の実務および手順にしたがい、安全キャビネットまたは層流フードにおいて実施する。

その成分の調製は、少なくとも以下の工程を含む：適切な消毒薬で作業面を清浄にする；作業面に配置する前に試薬瓶を消毒する；滅菌済みの５０ｍＬ Ｆａｌｃｏｎチューブにヌクレアーゼフリー水を４０ｍＬ分注し、室温にて保管する；（滅菌済みの５ｍｌコーニングチューブに）４ｍｌ／チューブのアムホテリシンＢを分注し、－２０℃にて保管する；（滅菌済みのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに）１ｍｌ／チューブのペニシリン／ストレプトマイシンを分注し、－２０℃にて保管する；実験室が管理するノートにロットの情報および調製を記録する。

唾液調製緩衝液の調製は、少なくとも以下の工程を含む：
１．適切な消毒薬で作業面を清浄にする；
２．作業面に置く前に試薬瓶を消毒する（ＲＮａｓｅインヒビター以外を分注する）
３．例えば、（１０００回の検査用に）５ｍＬの緩衝液を調製するために、
３．１．滅菌済みの１５ｍＬファルコンチューブに４．３ｍＬのヌクレアーゼフリー水を添加する；
３．２．４００μＬのＴＣＥＰを添加する；
３．３．滅菌済みのピペットを使用して、５０μｌのＲＮａｓｅインヒビターを添加する；
３．４．チューブ１本分のアムホテリシンおよびチューブ１本分のペニシリン／ストレプトマイシンを解凍し、滅菌済みのピペットを使用して、２００μＬのアムホテリシンおよび５０μＬのペニシリン／ストレプトマイシンをその１５ｍＬファルコンチューブに無菌的に添加する；
４．実験室が管理するノートにロットの情報および調製を記録する；
５．実験室の適切なＩＤ（例えば、ロット番号）を割り当てる；
６．そのチューブのキャップをしっかり閉め、チューブを反転することによって完全に混合する；
７．ＱＣサンプル用に１００μｌの媒体を抜き出す；
８．その瓶に
唾液反応緩衝液
実験室ＩＤ：（実験室の適切なＩＤ（例えば、Ｓｕｍｍｉｔ緩衝液１としてＳＴＢ１）を挿入する）
ＤＯＭ：（現在の製造日を挿入する）
有効期限：（製造日から１か月後の日付を挿入する）
２℃～８℃にて保管する
と表示を付ける；
９．２℃～８℃にて保管し、ｓａｌｉｖａＦＡＳＴ検査を実施する際に各検査につき５μｌを３０μＬの唾液および５μＬのプロテイナーゼＫと一緒に添加する；
１０．無菌性チェックを実施する。

（唾液サンプルの調製）
サンプル調製チームのＭＬＳは、ロッカーにある登録されたサンプルのラックを取り出し、検査のためにそれらを調製するためにそのラックをサンプル調製室に持って来る。ＭＬＳは、１０μＬ／ウェルのサンプル調製ミックス（ＳＰＭ）を含む、調製済みの９６ウェルサンプル調製プレート（ＳＰＰ）を持って来る。このＳＰＭは、唾液調製緩衝液およびプロテアーゼ（プロテイナーゼＫ）を含む。具体的には、この９６ウェルＳＰＰは、マルチチャンネルイコライザーまたはＶｉａｆｌｏｗ（Ｉｎｔｅｇｒａ）を使用して各ウェルに分配された、１ウェル当たり１０μＬのＳＰＭ（５μＬ唾液調製緩衝液および５μＬプロテイナーゼＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を含む。サンプルのキャップを、安全キャビネットの内部で半自動化６チャンネルデキャッパー（Ｂｒｏｏｋｓ）または自動化４８フォーマットデキャッパー（Ｂｒｏｏｋｓ）を用いて開ける。この６チャンネルデキャッパーを使用する場合には、そのキャップキャリアラックにキャップを一時的に置く。Ｅ１－ＣｌｉｐＴｉｐ電子マルチチャンネル（８チャンネル）イコライザーを使用して、約３０μＬの唾液を、その４８ウェルラックのチューブから、１０μＬのＳＰＭを含む９６ウェルＳＰＰに移し、十分にピペッティングする。４８ウェルラック２個分のサンプルが、１個分の９６ウェルＳＰＰを満たす。サンプルに再びキャップを閉める（６チャンネルデキャッパーを使用する場合は一度に６個、または自動化４８フォーマットデキャッパーを使用する場合は一度に４８個）。デジタルマイクロプレートシェーカーに５００ＲＰＭにて１分間そのプレートを配置することによって、その唾液とＳＰＭとを十分に混合する。そのプレートをｍｉｎｉＡｍｐ ９６ウェルＰＣＲ装置に９５℃にて５分間置き、４℃にて保持する。その後、すべてのラックのサンプルを一時的サンプル保管領域に運ぶ。それらのサンプルのうち、反復検査を必要とするどのサンプルも、この一時的サンプル保管領域から同定する。反復検査は１回だけ可能である。失敗した場合は、新たなサンプルを要求する。余ったサンプルは、将来の使用のために－８０℃にて保管する。

（ＰＣＲ試薬の調製およびプレートの構築（唾液検査））
ＰＣＲマスターミックスを含むプレート（本明細書においてＰＣＲマスターミックスプレート（ＰＭＭＰ）と呼ぶ）は、マルチチャンネルイコライザーまたはＶｉａｆｌｏｗ（Ｉｎｔｅｇｒａ）を使用して９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレートの各ウェルに分配された、１２．５μＬのＰＣＲマスターミックスを含む。このＰＣＲマスターミックスは、１０μＬのＬｕｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌプローブ１ステップ反応ミックス、１μＬのＬｕｎａ Ｗａｒｍｓｔａｒｔ ＲＴ酵素ミックス、および１．５μＬのプライマー／プローブセットから構成される。この１．５μＬのプライマー／プローブセットは、５０．２５μＬの各１００μＭのプライマーおよびプローブストックを５２４μＬのＩＤＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５）に添加することによって、ＶＯＣ特異的プライマー、Ｎプライマー、および／またはＲＮＰプライマーのいずれかの６．７μＭ作業ストック、ならびに１．７μＭのＦＡＭ標識Ｎ１プローブ、ＡＴＴＯ－６４７標識ＲＮＰプローブ、または上記のＶＯＣ特異的標識プローブのうちの１種として生成する。例示的なＶＯＣ特異的プライマーおよびプローブを図１および上記に列挙する。

分子チームのＭＬＳは、９６ウェルまたは３８４ウェルのＰＭＭＰを各自の個々のＰＣＲワークステーションに配置し、唾液サンプル調製工程から得た７．５μＬの処理済み唾液サンプルを、そのＰＭＭＰの指定された各ウェルに添加する。その後、その処理済み唾液サンプルをピペッティングにより上記のＰＣＲマスターミックスと混合し、泡を生じさせるのを回避するように注意を払う。その後、そのＭＬＳは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２および／または１種もしくは複数種のＶＯＣについての陽性コントロール（ＩＤＴ合成２０１９－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－Ｎコントロール、４０００コピー／μＬまたは１種もしくは複数種のＶＯＣ陽性コントロール）ならびに陰性コントロール（ＩＤＴ Ｈｓ－ＲＰＰ３０コントロール、４０００コピー／μＬ）、ならびにテンプレートなしのコントロール（ＮＴＣ－水）を、そのコントロールについて指定したＰＣＲウェル（プレート１つ当たり１個の陽性コントロール、１個の陰性コントロール、およびＮＴＣ）に７．５μＬ添加し、ピペッティングにより混合して、泡を生じさせるのを回避する。その後、そのＭＬＳは、そのＰＭＭＰの上に透明なプラスチックｑＰＣＲフィルムを置き、そのフィルムをプレートシーラーで密封し、プレート遠心機で短時間遠心分離して泡を除去する。

（ＰＣＲ温度プロファイル（増幅領域）（唾液検査））
そのプレートをＢｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸまたはＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ＰＣＲ装置に装填し、マスターファイルの「ＳＴ－ＣＯＶ－ＰＣＲプロトコル」を開き、以下の熱サイクル条件を実行する：
１．工程１：５５℃で１０分間、１サイクル；
２．工程２：９５℃で１分間、１サイクル；および
工程３：９５℃で１０秒間、６０℃で３０秒間（これに加えて、Ｎ１標的についてのＦＡＭチャンネルおよびＲＮＰ標的についてのＣｙ５チャンネルの両方でのプレート読取り）を４０サイクル。

（データの解釈（ＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ ｏｐｕｓ ９６ウェルフォーマット）（唾液検査））
Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸはＣｑ値を報告する。その際、このＣｑ値ファイル（ｃｓｖファイル）をＰＣＲ装置からＯｖＤｘ ＬＩＭＳへとエクスポートする。このＣｑ値の解釈（検出（ＤＥＴＥＣＴＥＤ）、非検出（ＮＯＴ ＤＥＴＥＣＴＥＤ）および無効（ＩＮＶＡＬＩＤ））をＯｖＤｘ ＬＩＭＳへとエクスポートする。（そのウェルにおいてＶＯＣ特異的プライマー－プローブセットによって決定した）３６以下のＣｑは、標的ＶＯＣについて陽性と解釈する。

（現地での鼻スワブ（外鼻孔）サンプルの収集）
鼻スワブ収集デバイスは、鼻スワブサンプルに特異的な独特な緩衝液組成物（本明細書で以後はスワブ輸送緩衝液と呼ぶ）１ｍｌを充填した１．９ｍｌ Ｎｅｓｔチューブ（これはその鼻スワブサンプルの容器として使用する）を含み、Ｎｅｓｔによる口腔／鼻孔スワブを使用して患者の外鼻孔をふき取り、その後、スワブ輸送緩衝液を充填したＮｅｓｔチューブの内部に配置する。

鼻スワブ（外鼻孔）は、その収集場所を監督する機関によって指定された熟練の医療従事者の監督下で収集すべきである。その収集を監督する医療従事者は、アルコールベースの消毒剤または無香料石鹸と水とで手を清浄にし、適切なＰＰＥ（ガウン、手袋、フェイスマスク、および／またはフェイスシールド）を着るべきである。収集の前に、患者に指示書（例えば、ＦＤＡによって推奨されるこの指示書（ｈｔｔｐｓ：／／ｔｉｎｙｕｒｌ．ｃｏｍ／ｎａｓａｌｓｗａｂ１－２））を提示する。その医療従事者は、すべての患者情報（名前、生年月日、および状態報告規則により必要とされる追加情報を含む）が収集前に適切に記入されていることを確実にする。その後、その医療従事者は、患者に、研究同意書を吟味して（Ｏｖａｔｉｏｎによって提供される）研究への参加または不参加を決定するように依頼する。最後に、その医療従事者は、予め印刷されたバーコード表示をスキャンして、それを、すでに収集された患者情報に紐付け、その後、その患者により使用されるＮｅｓｔチューブにその表示を配置する。

その医療従事者はそのＮｅｓｔチューブのキャップを外し、患者自身の外鼻孔から各鼻孔につき１０回ふき取るよう患者に指示し、そのチューブの内部でそのスワブの近位ブレイクポイントを折る。その医療従事者はそのＮｅｓｔチューブのキャップを元に戻し、そのキャップをしっかり締めることを確実に行う。この収集プロセス中にいくらかサンプルがこぼれた場合は、その医療従事者はアルコールワイプまたは同等物を使用してそのチューブの外側を拭いて、混入を防ぐ。その後、そのサンプルは、実験室へ輸送する前に室温下で個々のバッグに配置する。

そのスワブサンプル収集を監督する医療従事者は、各患者のサンプルを取り扱った後は、アルコールベースの手用消毒剤を使用すべきである。

（実験室におけるスワブサンプルの受領および登録）
サンプルを実験室に輸送する。サンプルをバッグから取り出し、あらゆる漏出または損傷について受領受付にいる登録監督者が視覚的に調べる。その監督者による事前スクリーニング段階を合格したサンプルを、登録チームが使用する机上に移動する。その事前スクリーニング段階を合格しなかったサンプルは、さらなる調査のために取って置く。登録担当者は、そのＮｅｓｔチューブのバーコードをスキャンし、実験室情報管理システム（ＬＩＭＳ）によってコンピュータスクリーンに示される患者情報および同意ステータスを調べる。ＬＩＭＳにおいて完全な患者情報を備え漏出がないチューブ（すなわち、適格なサンプル）を、ラックに配置する。そのラック中のサンプルの位置は、ＬＩＭＳにおいて割り当てられた位置と一致するべきである。不適格なサンプルは別のラックに配置し、登録監督者によるさらなる調査のために取って置く。その後、サンプル調製チームの臨床検査技師（ＭＬＳ）がそのサンプルを取り出すまで、サンプルのラックを６００ｒｐｍにて保持位置でプラットフォームロッカーに配置し得る。

（スワブ調製緩衝液）
サンプル調製の一部として、そのスワブサンプルを、スワブサンプルのために特別に調製した独特な緩衝液組成物（本明細書においてスワブ調製緩衝液と呼ぶ）と混合する。このスワブ調製緩衝液の調製は、少なくとも以下の装置の使用を含む：安全キャビネットまたは層流フード（無菌環境を維持可能な作業領域）；滅菌済みの個別包装ピペット、ピペットチップ（例えば、１０ｍＬおよび２５ｍＬ）；ピペット・エイド；ピペッター（１ｍＬまたは２００μＬ）および対応するチップ；５０ｍｌの滅菌済みでヌクレアーゼフリーのＦａｌｃｏｎチューブ；Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆリピーター（５０ｍＬ容量）；１．９ｍｌ Ｃｒｙｏｖｉａｌチューブ（Ｎｅｓｔ）；Ｎｅｓｔチューブラック；ならびにスクリューキャップチューブデキャッパー装置（Ｂｒｏｏｋｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
このスワブ輸送緩衝液の調製は、少なくとも以下の試薬／成分の使用をさらに含む：
・１０×ＴＢＥ緩衝液（トリス－ホウ酸－ＥＤＴＡ、ｐＨ８．２～８．４）、滅菌済み、ＤＮａｓｅフリー・ＲＮａｓｅフリー・プロテアーゼフリーグレード、Ｆｉｓｈｅｒ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ、カタログ番号ＢＰ１３３３２０、２０Ｌ；
・ＲＮａｓｅインヒビター、ヒト胎盤、４０，０００単位／ｍｌ、滅菌済み、ＤＮａｓｅフリー・ＲＮａｓｅフリーグレード、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｍ０３０７Ｌ、１０，０００単位、２５０μｌ／チューブ；
・アムホテリシンＢ溶液、脱イオン水中２５０μｇ／ｍｌ、滅菌済み、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ２９４２、１００ｍｌ（または真菌の混入および増殖を防止するために適切な濃度の類似の抗真菌剤）；
・ペニシリン－ストレプトマイシン溶液、１００×、ペニシリン（１０，０００ＩＵ）とストレプトマイシン（１０，０００μｇ／ｍｌ）との１００倍作業濃度の混合物、滅菌済み、Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３０－００２－ＣＩ（または細菌の混入および増殖を防止するために適切な濃度の類似の抗生物質）；
・ヌクレアーゼフリー水、滅菌済み、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｓｉｇｍａ、Ｗ４５０２、ＤＮａｓｅフリー・ＲＮａｓｅフリー・プロテアーゼフリーグレード；ならびに
・消毒薬（例えば、７０％エタノール）。

その成分の調製は少なくとも以下の工程を含む：適切な消毒薬で作業面を清浄にする；作業面に配置する前に試薬瓶を消毒する；５００ｍｌ／瓶の１０×ＴＢＥ緩衝液を滅菌済みの５００ｍｌ Ｃｏｒｎｉｎｇ瓶に分注し、室温にて保管する；８９４．９５ｍｌ／瓶のヌクレアーゼフリー水を滅菌済みの１Ｌ Ｃｏｒｎｉｎｇ瓶に分注し、室温にて保管する；（滅菌済みの５ｍｌ Ｃｏｒｎｉｎｇチューブに）４ｍｌ／チューブのアムホテリシンＢ溶液を分注し、－２０℃にて保管する；（滅菌済みＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに）１ｍｌ／チューブのペニシリン／ストレプトマイシンを分注し、－２０℃にて保管する；実験室が管理するノートにロットの情報および調製を記録する。
このスワブ調製緩衝液の調製は、少なくとも以下の工程を含む：
１．適切な消毒薬で作業面を清浄にする；
２．作業面に置く前に試薬瓶を消毒する（ＲＮａｓｅインヒビター以外を分注する）
３．例えば、１ＩＬのウイルス輸送緩衝液を調製するために、
３．１．１瓶分のヌクレアーゼフリー水（８９４．９５ｍｌ／瓶）を持ってくる；
３．２．滅菌済みの５０ｍｌファルコンチューブを使用して、１００ｍｌの１０×ＴＢＥ緩衝液を添加する；
３．３．滅菌済みのピペットを使用して、５０μｌのＲＮａｓｅインヒビターを添加する；
３．４．チューブ１本分のアムホテリシンＢ溶液およびチューブ１本分のペニシリン／ストレプトマイシンを解凍し、滅菌済みのピペットを使用して、４ｍｌのアムホテリシンおよび１ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンをその瓶に無菌的に添加する。
４．実験室が管理するノートにロットの情報および調製を記録する；
５．実験室の適切なＩＤ（例えば、ロット番号）を割り当てる；
６．そのチューブのキャップをしっかり閉め、チューブを反転することによって完全に混合する；
７．ＱＣサンプル用に１００μｌの媒体を抜き出す；
８．その瓶に
スワブ輸送緩衝液
実験室ＩＤ：（実験室の適切なＩＤ（例えば、Ｓｕｍｍｉｔ緩衝液２としてＳＴＢ２）を挿入する）
ＤＯＭ：（現在の製造日を挿入する）
有効期限：（製造日から１か月後の日付を挿入する）
２℃～８℃にて保管する
と表示を付ける；
９．アリコートに分配するまで２℃～８℃にて保管する；
１０．Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆリピーター（５０ｍＬ容量）およびＢｒｏｏｋｓデキャッパーを使用して、１ｍＬの調製済みのスワブ調製緩衝液を個々の滅菌済みの１．９ｍｌスクリューキャップ付きチューブ（Ｎｅｓｔ）に分注する；
１１．無菌性チェックを実施する；
１２．チューブと、その瓶に残っているあらゆる緩衝液とを２℃～８℃にて保管する。

（スワブサンプルの調製）
サンプル調製チームのＭＬＳは、ロッカーにある登録されたサンプルのラックを取り出し、検査のためにそれらを調製するためにそのラックをサンプル調製室に持って来る。ＭＬＳは、５μＬ／ウェルのプロテアーゼ（プロテイナーゼＫ）を含む、調製済みの９６ウェルサンプル調製プレート（ＳＰＰ）を持ってくる。具体的には、この９６ウェルＳＰＰは、マルチチャンネルイコライザーまたはＶｉａｆｌｏｗ（Ｉｎｔｅｇｒａ）を使用して各ウェルに分配された、１ウェル当たり５μＬのプロテイナーゼＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を含む。サンプルのキャップを、安全キャビネットの内部で半自動化６チャンネルデキャッパー（Ｂｒｏｏｋｓ）または自動化４８フォーマットデキャッパー（Ｂｒｏｏｋｓ）を用いて開ける。この６チャンネルデキャッパーを使用する場合には、そのキャップキャリアラックにキャップを一時的に置く。Ｅ１－ＣｌｉｐＴｉｐ電子マルチチャンネル（８チャンネル）イコライザーを使用して、約３５μＬのスワブサンプルを、その４８ウェルラックのチューブから、５μＬのプロテイナーゼＫを含む９６ウェルＳＰＰに移し、十分にピペッティングする。４８ウェルラック２個分のサンプルが、１個分の９６ウェルＳＰＰを満たす。サンプルに再びキャップを閉める（６チャンネルデキャッパーを使用する場合は一度に６個、または自動化４８フォーマットデキャッパーを使用する場合は一度に４８個）。デジタルマイクロプレートシェーカーに５００ＲＰＭにて１分間そのプレートを配置することによって、そのスワブサンプルとプロテイナーゼＫとを十分に混合する。そのプレートをｍｉｎｉＡｍｐ ９６ウェルＰＣＲ装置に９５℃にて５分間置き、４℃にて保持する。その後、すべてのラックのサンプルを一時的サンプル保管領域に運ぶ。それらのサンプルのうち、反復検査を必要とするどのサンプルも、この一時的サンプル保管領域から同定する。反復検査は１回だけ可能である。失敗した場合は、新たなサンプルを要求する。余ったサンプルは、将来の使用のために－８０℃にて保管する。

（ＰＣＲ試薬の調製およびプレートの構築（スワブ検査））
ＰＣＲマスターミックスを含むプレート（本明細書においてＰＣＲマスターミックスプレート（ＰＭＭＰ）と呼ぶ）は、マルチチャンネルイコライザーまたはＶｉａｆｌｏｗ（Ｉｎｔｅｇｒａ）を使用して９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレートの各ウェルに分配された、１２．５μＬのＰＣＲマスターミックスを含む。このＰＣＲマスターミックスは、１０μＬのＬｕｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌプローブ１ステップ反応ミックス、１μＬのＬｕｎａ Ｗａｒｍｓｔａｒｔ ＲＴ酵素ミックス、および野生型またはＶＯＣ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出のためのプライマー／プローブセット１．５μＬから構成される。この１．５μＬのＮ１／ＲＮＰプライマー／プローブは、５０．２５μＬの各１００μＭのプライマーおよびプローブストックを５２４μＬのＩＤＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５）に添加することによって、プライマーの６．７μＭ作業ストックおよびそのプライマーと関連する標識プローブ１．７μＭとして生成する。

分子チームのＭＬＳは、９６ウェルまたは３８４ウェルのＰＭＭＰを各自の個々のＰＣＲワークステーションに配置し、スワブサンプル調製工程から得た７．５μＬの処理済みスワブサンプルを、そのＰＭＭＰの指定された各ウェルに添加する。その後、その処理済みスワブサンプルをピペッティングにより上記のＰＣＲマスターミックスと混合し、泡を生じさせるのを回避するように注意を払う。その後、そのＭＬＳは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはそのＶＯＣについての陽性コントロール（ＩＤＴ合成２０１９－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－Ｎコントロール、４０００コピー／μＬまたは１種もしくは複数種のＶＯＣ陽性コントロール）ならびに陰性コントロール（ＩＤＴ Ｈｓ－ＲＰＰ３０コントロール、４０００コピー／μＬ）、ならびにテンプレートなしのコントロール（ＮＴＣ－水）を、そのコントロールについて指定したＰＣＲウェル（プレート１つ当たり１個の陽性コントロール、１個の陰性コントロール、およびＮＴＣ）に７．５μＬ添加し、ピペッティングにより混合して、泡を生じさせるのを回避する。その後、そのＭＬＳは、そのＰＭＭＰの上に透明なプラスチックｑＰＣＲフィルムを置き、そのフィルムをプレートシーラーで密封し、プレート遠心機で短時間遠心分離して泡を除去する。

（ＰＣＲ温度プロファイル（増幅領域）（スワブ検査））
そのプレートをＢｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸまたはＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ＰＣＲ装置に装填し、マスターファイルの「ＳＴ－ＣＯＶ－ＰＣＲプロトコル」を開き、以下の熱サイクル条件を実行する：
１．工程１：５５℃で１０分間、１サイクル；
２．工程２：９５℃で１分間、１サイクル；および
工程３：９５℃で１０秒間、６０℃で３０秒間（これに加えて、Ｎ１標的についてのＦＡＭチャンネルおよびＲＮＰ標的についてのＣｙ５チャンネルの両方でのプレート読取り）を４０サイクル。

（データの解釈（ＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ ｏｐｕｓ ９６ウェルフォーマット）（スワブ検査））
Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸはＣｑ値を報告する。その際、このＣｑ値ファイル（ｃｓｖファイル）をＰＣＲ装置からＯｖＤｘ ＬＩＭＳへとエクスポートする。このＣｑ値の解釈（検出（ＤＥＴＥＣＴＥＤ）、非検出（ＮＯＴ ＤＥＴＥＣＴＥＤ）および無効（ＩＮＶＡＬＩＤ））をＯｖＤｘ ＬＩＭＳへとエクスポートする。（そのウェルにおいてＶＯＣ特異的プライマー－プローブセットによって決定した）３６以下のＣｑは、標的ＶＯＣについて陽性と解釈する。

（参照による援用）
特許、特許出願、特許公開物、雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツなどの他の文献の参照および引用が、本開示の全体を通じて行われた。そのような文献はすべて、実質的にその全体が参照によって本明細書により本明細書中に援用される。

（等価物）
本明細書において示され記載されているものに加えて、本発明の種々の改変およびその多くのさらなる実施形態が、本明細書において引用された科学文献および特許文献の参照を含む本明細書の全内容から当業者には明らかになる。本明細書における主題は、その種々の実施形態およびその等価物において本発明の実施に適合され得る重要な情報、例示および指針を含む。

Claims (50)

1. 核酸を含む生体サンプルを取得する工程；
   野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸の増幅を行うことなく、１種または複数種の標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に特異的なプライマーを用いて該核酸を増幅する工程；および
   該増幅する工程において生成されたアンプリコンを分析して、該１種または複数種の標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株の存在を検出する工程
   を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株を検出するための方法。
2. 前記増幅する工程の前に、前記１種または複数種の標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株および野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を増幅するプライマーを使用することによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の存在を検出する工程
   をさらに含む、請求項２に記載の方法。
3. 前記１種または複数種の標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株が、Ｂ．１．１．７、Ｐ．１、Ｂ．１．３５１、およびＢ．１．４２９／４２７からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
4. 前記プライマーが２種またはそれより多い標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に特異的である、請求項１に記載の方法。
5. 前記プライマーが３種またはそれより多い標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に特異的である、請求項４に記載の方法。
6. 前記３種またはそれより多い標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株がＢ．１．１．７、Ｐ．１、およびＢ．１．３５１である、請求項５に記載の方法。
7. 前記プライマーがＯＲＦ－１Ａ領域を標的とする、請求項６に記載の方法。
8. 前記プライマーが、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と比較した前記ＯＲＦ－１Ａ領域の３６７５～３５６７７位における欠失を標的とする、請求項７に記載の方法。
9. 前記プライマーが配列番号１および配列番号２を含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記増幅する工程が、配列番号３を含むプローブを使用する定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記１種または複数種の標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株がＢ．１．１．７を含み、前記プライマーがＳ領域を標的とする、請求項３に記載の方法。
12. 前記プライマーが、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と比較した前記Ｓ領域の６９～７０位における欠失を標的とする、請求項１１に記載の方法。
13. 前記プライマーが配列番号４および配列番号５を含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記増幅する工程が、配列番号６を含むプローブを使用する定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記１種または複数種の標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株がＢ．１．３５１を含み、前記プライマーが、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と比較したＧ２５５６３Ｔ置換またはＧ２８８８７Ｔ置換を標的とする、請求項３に記載の方法。
16. 前記プライマーが配列番号１９および配列番号２０を含むかまたは配列番号２２および配列番号２３を含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記増幅する工程が、配列番号２１または配列番号２４を含むプローブを使用する定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記１種または複数種の標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株がＢ．１．４２９／４２７を含み、前記プライマーが、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と比較したＧ２７８９０Ｔ／Ｇ２７９８７Ｔ置換またはＧ２８１９１Ｔ／Ａ２８２７２Ｔ置換を標的とする、請求項３に記載の方法。
19. 前記プライマーが配列番号２５および配列番号２６を含むかまたは配列番号２８および配列番号２９を含む、請求項１８に記載の方法。
20. 前記増幅する工程が、配列番号２７または配列番号３０を含むプローブを使用する定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を含む、請求項１９に記載の方法。
21. ヌクレアーゼフリー水と抗真菌剤と抗生物質とリボヌクレアーゼインヒビターと還元剤とを含む緩衝液組成物中に、前記生体サンプルを混合する工程
    をさらに含み、
    前記増幅する工程が、前記核酸の事前抽出を行うことなく該緩衝液中で該核酸に対して実施される、請求項１に記載の方法。
22. 前記生体サンプルが体液である、請求項１に記載の方法。
23. 前記体液が、唾液、喀痰、粘液、痰、および尿からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
24. 前記還元剤がトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液である、請求項２１に記載の方法。
25. 前記抗真菌剤がアムホテリシンＢを含み、前記抗生物質がペニシリン－ストレプトマイシンを含む、請求項２１に記載の方法。
26. 鼻スワブまたは咽頭スワブによって前記生体サンプルを取得する工程
    をさらに含む、請求項１に記載の方法。
27. 前記増幅する工程の前に、前記緩衝液組成物と混合された前記生体サンプルを熱不活化する工程
    をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
28. 前記生体サンプルと緩衝液組成物との混合物が９５℃まで５分間加熱される、請求項２７に記載の方法。
29. 前記生体サンプルが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有すると疑われる対象に由来し、
    前記方法が、
    前記１種または複数種の標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株の検出された存在に基づいて処置レジメンを選択する工程
    をさらに含む、請求項１に記載の方法。
30. 前記処置レジメンが、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染について推奨される処置レジメンとは異なる、請求項２９に記載の方法。
31. 野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来する核酸を増幅することなく、１種または複数種の標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に由来する核酸を選択的に増幅するプライマーセット。
32. 前記１種または複数種の標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株が、Ｂ．１．１．７、Ｐ．１、Ｂ．１．３５１、およびＢ．１．４２９／４２７からなる群より選択される、請求項３１に記載のプライマーセット。
33. ２種またはそれより多い標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に特異的である、請求項３１に記載のプライマーセット。
34. ３種またはそれより多い標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に特異的である、請求項３３に記載のプライマーセット。
35. 前記３種またはそれより多い標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株がＢ．１．１．７、Ｐ．１、およびＢ．１．３５１である、請求項３４に記載のプライマーセット。
36. ＯＲＦ－１Ａ領域を標的とする、請求項３５に記載のプライマーセット。
37. 野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と比較した前記ＯＲＦ－１Ａ領域の３６７５～３５６７７位における欠失を標的とする、請求項３６に記載のプライマーセット。
38. 配列番号１および配列番号２を含む、請求項３７に記載のプライマーセット。
39. 配列番号３を含む、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）のためのプローブ
    をさらに含む、請求項３８に記載のプライマーセット。
40. 前記１種または複数種の標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株がＢ．１．１．７を含み、前記プライマーセットがＳ領域を標的とする、請求項３２に記載の方法。
41. 野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と比較した前記Ｓ領域の６９～７０位における欠失を標的とする、請求項４０に記載のプライマーセット。
42. 配列番号４および配列番号５を含む、請求項４１に記載のプライマーセット。
43. 配列番号６を含む、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）のためのプローブ
    をさらに含む、請求項４２に記載のプライマーセット。
44. 前記１種または複数種の標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株がＢ．１．３５１を含み、前記プライマーセットが、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と比較したＧ２５５６３Ｔ置換またはＧ２８８８７Ｔ置換を標的とする、請求項３２に記載のプライマーセット。
45. 配列番号１９および配列番号２０を含むかまたは配列番号２２および配列番号２３を含む、請求項４４に記載のプライマーセット。
46. 配列番号２１または配列番号２４を含む、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）のためのプローブ
    をさらに含む、請求項４５に記載のプライマーセット。
47. 前記１種または複数種の標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株がＢ．１．４２９／４２７を含み、前記プライマーセットが、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と比較したＧ２７８９０Ｔ／Ｇ２７９８７Ｔ置換またはＧ２８１９１Ｔ／Ａ２８２７２Ｔ置換を標的とする、請求項３２に記載のプライマーセット。
48. 配列番号２５および配列番号２６を含むかまたは配列番号２８および配列番号２９を含む、請求項４７に記載のプライマーセット。
49. 配列番号２７または配列番号３０を含む、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）のためのプローブ
    をさらに含む、請求項４８に記載のプライマーセット。
50. ウイルス核酸を含むサンプルを取得する工程；
    既知ウイルスの変異株のみを選択的に増幅するプライマーを用いて該核酸を増幅する工程；
    該増幅する工程におけるアンプリコンの生成によって、該ウイルスの変異株の存在を検出する工程
    を含む、ウイルスの変異株を検出するための方法。