KR20230021120A - 호흡기 병원체의 검출을 위한 샘플링 키트 및 검출방법 - Google Patents

호흡기 병원체의 검출을 위한 샘플링 키트 및 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 호흡기 병원체의 검출을 위한 샘플링 키트 및 검출방법에 관한 것으로서, 종래의 방법인 비인두강 스왑을 이용하는 검출과 비교하여 양성율이 동등 이상이면서 자가 샘플링을 가능하게 하는 이점을 갖는다.

Description

호흡기 병원체의 검출을 위한 샘플링 키트 및 검출방법
관련출원에 대한 교차참조
본 특허출원은 2020년 7월 14일에 대한민국 특허청에 출원된 대한민국 특허출원 제2020-0087107호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원들의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
기술분야
본 발명은 호흡기 병원체의 검출을 위한 샘플링 키트 및 검출방법에 관한 것이다.
호흡기 질환은 특히 어린이, 노인 및 면역력이 약화된 사람들에서 심각한 사망률을 유발한다. 감염을 제어하고 적절한 환자 관리를 위해 원인 병원체(causative pathogen)를 확인하는 것이 매우 중요하다. 호흡기 병원체 검사는 분자진단 기술, 특히 실시간 PCR이 개발되면서 급속도로 발달하였다. 실시간 PCR은 전통적인 방법보다 매우 민감하며 빠르고 다양한 병원체를 동시에 검출할 수 있다.
분자진단에 의한 호흡기 병원체 검사를 위해 다양한 상기도(upper respiratory tract, URT) 샘플과 하기도(lower respiratory tract) 샘플이 사용되고 있다.
일반적으로, 상기도 샘플로서, 비인두강 스왑(nasopharyngeal swab) 샘플 및 구인두 스왑(oropharyngeal swab) 샘플이 널리 사용되고 있다. 한편, 하기도 샘플로서 객담(sputum) 및 기관지 세척액(bronchoalveolar lavage, BAL) 샘플이 사용되고 있다.
최근에는 SARS-CoV-2가 전세계적으로 유행하면서 실시간 PCR 진단 키트가 크게 각광을 받고 있다. 코로나바이러스 진단을 위해 상기도 샘플로서 비인두강 스왑(nasopharyngeal swab) 샘플 및 구인두 스왑(oropharyngeal swab) 샘플이 사용되고 있고, 하기도 샘플로서 객담 및 기관지 세척액이 사용되고 있다. 상기 비인두 스왑 샘플 및 구인두 스왑 샘플은 면봉을 이용하여 비인두와 구인두에서 각각 분비물을 채취하고 이를 운반배지에 보관하며, 상기 객담은 식염수로 입 안을 헹군 다음 무균 용기에 객담을 채취하고 보관한다.
하지만, 하기도 샘플은 수집하기 어렵고 핵산 추출 전에 전처리가 필요할 수 있으며, 특히, 객담 샘플은 환자가 실질적으로 기침 증상을 나타내지 않거나 마른 기침을 나타내는 감염 초기 단계에는 적용가능하지 않다. 비인두강 스왑과 구인두 스왑에 의한 샘플링은 전문가들에 의해 실시되어야 하는 한계가 있고 에어로졸-생성 샘플링 방식이어서 위험성이 있다.
상술한 당업계의 상황 하에서, 새로운 샘플링 방식이 도입된 호흡기 병원체의 검사방법에 대한 요구가 당업계에 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 호흡기 병원체를 검출할 수 있는 새로운 프로토콜의 검출방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 전비강 스왑 검체 및 타액 검체를 수득하고 이들을 같이 검체수송 배지에 함침시킨 다음 상기 검체수송 배지로부터 수득한 핵산분자를 이용하여 핵산증폭반응을 실시하는 새로운 호흡기 병원체의 검출 프로토콜을 완성하였다. 본 발명의 방법은, 종래의 방법인 비인두강 스왑을 이용하는 검출과 비교하여 양성율이 동등 이상이면서 자가 샘플링을 가능하게 하는 이점을 갖는다.
따라서, 본 발명의 목적은 호흡기 병원체 검출방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 호흡기 병원체 검출을 위한 샘플링 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 호흡기 병원체의 검출용 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 호흡기 병원체를 검출하기 위한 샘플링 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위와 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 호흡기 병원체의 검출방법을 제공한다:
(a) 전비강 스왑(nostril swab) 검체 및 타액 검체가 같이 딥핑(dipping)되어 있는 검체수송배지(transport medium) 및 핵산증폭반응 조성물을 이용하여 핵산증폭반응을 실시하는 단계; 및
(b) 상기 핵산증폭반응의 결과를 분석하여 상기 호흡기 병원체의 존재 여부를 결정하는 단계.
본 발명자들은 호흡기 병원체를 검출할 수 있는 새로운 프로토콜의 검출방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 전비강 스왑 검체 및 타액 검체를 수득하고 이들을 같이 검체수송 배지에 함침시킨 다음 상기 검체수송 배지로부터 수득한 핵산분자를 이용하여 핵산증폭반응을 실시하는 새로운 호흡기 병원체의 검출 프로토콜을 완성하였다. 본 발명의 방법은, 종래의 방법인 비인두강 스왑을 이용하는 검출과 비교하여 양성율이 동등 이상이면서 자가 샘플링을 가능하게 하는 이점을 갖는다.
본 발명의 검출방법을 각 단계에 따라 설명하면 다음과 같다:
단계 (a): 전비강 스왑(nostril swab) 검체 및 타액 검체를 이용한 핵산증폭반응
전비강 스왑(nostril swab) 검체 및 타액 검체가 같이 딥핑(dipping)되어 있는 검체수송배지(transport medium) 및 핵산증폭반응 조성물을 이용하여 핵산증폭반응을 실시한다.
본 발명에서 이용되는 검체는 전비강 스왑 검체 및 타액 검체이다.
본 명세서에서 용어 “전비강 스왑 검체”는 전비강에 스왑 도구를 적용하여 얻어진 전비강에 있는 생검체가 흡착된 스왑 검체를 의미하며, 비인두 스왑 검체와 구별되는 검체이다. 예를 들어, 도 2a를 참조하여 설명하면, 전비강에 스왑 도구를 삽입하고(예컨대, 2-3 cm 삽입), 스왑을 부드럽게 10-15초 동안 돌리면서 전비강의 안쪽 부분에서 생검체를 채취한다. 용어 “전비강 스왑 검체”는 상기 비강 스왑 검체(nasal swab sample)가 상술한 바와 같이 스왑 도구를 전비강에 적용함으로써 수득되는 한 “비강 스왑 검체(nasal swab sample)”와 서로 교환적으로 사용된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 전비강 스왑 검체는 하나의 스왑 도구를 두 개의 전비강에 모두 적용하여 수득된다.
본 발명에서 이용되는 타액 검체는 뱉는 행위를 통해서 수득된 검체(spitted saliva sample) 및 타액 스왑 도구를 적용하여 수득된 검체를 포함할 수 있다.
뱉는 행위를 통해서 수득된 검체(spitted saliva sample)는 검체 수송배지가 있는 용기에 직접 타액을 뱉거나 또는 깔대기(funnel)를 통해 검체 수송배지가 있는 용기에 타액을 뱉어서 얻을 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 타액 검체는 타액 스왑(saliva swab) 검체이다.
본 명세서에서 용어 “타액 스왑 검체”는 스왑 도구를 이용하여 타액을 채취하여 얻어진 검체를 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 타액 스왑 검체는 스왑 도구를 설상부분 또는 설하부분(sublingual part)에 적용하여 수득된다.
예를 들어, 스왑 도구를 혀의 표면에 적용하여 스왑 도구의 섬유층에 타액이 충분히 흡수되도록 하거나 혀의 말단부터 타액을 모은 후 스왑 도구의 섬유층에 타액이 충분히 흡수되도록 하여 타액 스왑 검체를 수득할 수 있다(참조: 도 2b).
또는, 설하부분을 스와핑 하면서 타액이 충분히 흡수 되도록 하여 타액 스왑 검체를 수득할 수 있다(참조: 도 2b).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 타액 스왑 검체는 스왑 도구를 설하부분에 적용하여 수득한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 타액 스왑 검체는 스왑 도구를 볼 안쪽(inside of cheek), 치은(gingiva) 및/또는 구개(palate)에 적용하여 수득될 수 있다.
본 명세서에서 용어 “타액 스왑 검체”는 구강 스왑 검체 또는 구강 타액 스왑 검체 또한 주로 타액을 채취하기 위하여 상술한 바와 같이 적절한 부분에 스왑 도구를 적용하여 수득되는 한, 구강 스왑 검체 또는 구강 타액 스왑 검체와 서로 교환적으로 사용된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 전비강 스왑 검체 및 타액 스왑 검체는 두 개의 스왑 도구 각각을 전비강 및 혀에 적용하여 수득된다. 택일적으로, 전비강 스왑 검체 및 타액 스왑 검체는 하나의 스왑 도구를 전비강 및 이어서 혀에 적용하여 수득된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 전비강 스왑 검체 및 타액 검체는 자가 샘플링을 통해 수득된다. 전비강 스왑 검체 및 타액 검체는 전문가의 관여 없이도 일반인들에 의해 용이하게 실시되어 얻을 수 있는 검체이며, 이에 자가 샘플링에 의해서도 분자진단에 필요한 유효한 검체를 얻을 수 있다.
본 발명에서 이용되는 스왑의 전체적인 형상은 당업계에 공지된 형상을 가질 수 있다(참조: 미국 특허 제10327741호). 예를 들어, 상기 스왑은 지지체 부분(support part) 및 섬유층이 형성되어 있는 헤드 부분을 포함한다.
도 1은 본 발명에서 이용될 수 있는 전비강 스왑 및/또는 타액 스왑의 예시적인 도면이다. 스왑(1)은 지지체 부분(10) 및 섬유층이 형성된 헤드 부분(11)을 포함한다. 헤드 부분(11)은 섬유층과 함께 타원형의 형상을 가질 수 있다. 스왑(1)은 절단점(12)을 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 전비강 스왑 및/또는 타액 스왑의 헤드 부분은 타원형이다. 타원형 형상의 섬유층은 횡장축(horizontal long axis) 부분(111)과 횡단축(horizontal short axis) 부분(112)을 포함한다.
본 명세서에서, 스왑의 헤드 부분을 언급하면서 사용되는 용어 “횡장축 부분”은 타원형 형상의 섬유층에서 스왑의 길이 방향의 종축에 대한 수직 축들 중 최장의 축 길이를 나타내는 부분을 의미하며, “횡단축 부분”은 상기 종축에 대한 수직 축들 중 상기 최장의 축 길이를 나타내는 부분을 제외한 나머지 축 부분을 의미한다.
스왑의 섬유층은 타원형 형상을 가지므로, 섬유층에서 최장의 축 길이를 나타내는 축은 장축(long axis)을 나타내고, 최단의 축 길이를 나타내는 축은 단축(short axis)을 나타내며, 장축 및 단축의 양 말단은 꼭짓점을 나타낸다.
횡장축 부분(111)에서 섬유층의 두께가 가장 크고, 장축의 꼭짓점으로 접근할수록 횡단축 부분(112)의 섬유층의 두께가 작아지며, 상기 장축의 꼭짓점에서 상기 횡단축 부분(112)의 섬유층의 두께가 가장 작다.
본 명세서에서 섬유층이 형성되어 있는 헤드 부분의 두께는 섬유층이 형성되어 있는 헤드 부분에서 스왑의 길이 방향의 종축에 대한 수직 축의 길이를 나타낸다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 전비강 스왑 및/또는 타액 스왑은 지지체 부분 및 섬유층이 형성되어 있는 타원형의 헤드 부분을 포함하며, 헤드 부분은 횡장축(horizontal long axis) 부분과 횡단축(horizontal short axis) 부분을 가지며, 횡장축 부분에서 헤드 부분 두께는 3.8-6.0 mm이고, 횡단축 부분에서의 헤드 부분 두께는 2.0-3.5 mm이다.
보다 구체적으로, 전비강 스왑 및/또는 타액 스왑은 지지체 부분 및 섬유층이 형성되어 있는 타원형의 헤드 부분을 포함하며, 헤드 부분은 횡장축(horizontal long axis) 부분과 횡단축(horizontal short axis) 부분을 가지며, 횡장축 부분에서 헤드 부분 두께는 4.8-5.2 mm이고, 횡단축 부분에서의 헤드 부분 두께는 2.8-3.2 mm이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 섬유층 형성에 사용되는 섬유는 3.00-3.50의 Dtex 값, 보다 구체적으로 3.30-3.35의 Dtex 값을 가질 수 있다.
상술한 헤드 부분의 두께 및 Dtex 값은 전비강 스왑 및 타액 스왑이 적합한 흡수능을 갖도록 하고, 검체수송 배지에 딥핑되는 경우 적합한 방출능을 갖도록 한다.
섬유층의 섬유는 수친화성 특성을 갖는 물질이며, 예를 들어 폴리에스테르, 폴리아미드 및 카튼(cotton)을 포함한다. 섬유층은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 형성될 수 있으며, 예를 들어 플록킹 방법에 의해 섬유층이 형성될 수 있다.
검체채취된 전비강 스왑 및 타액 스왑을 용기에 있는 검체수송 배지에 딥핑, 즉 함침 시킨다. 이러한 딥핑에 의해 스왑에 포함되어 있는 검체가 검체수송 배지로 방출된다. 일반적으로 스왑이 딥핑된 검체수송 배지를 포함하는 용기는, 핵산증폭반응을 실시하는 장소로 수송된다.
본 발명에서 이용될 수 있는 검체수송 배지는 두 가지 배지를 포함한다: 세포 보존성 배지(cell maintenance buffer) 및 세포 비활성 배지(cell inactivation buffer)(즉, 세포 파쇄 배지).
본 명세서에서 용어 “세포 보존성 배지”는 검체 내의 세포가 파쇄 되지 않도록 유지하는 배지를 의미한다.
본 발명에서 이용될 수 있는 세포 보존성 배지는 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 세포 보존성 배지도 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 세포 보존성 배지는 식염수-기반 용액(saline-based solution) 또는 균형 염(balanced salt) 용액-기반 배지이다.
보다 구체적으로, 본 발명에 이용되는 식염수-기반 용액(saline-based solution)은 PBS(phosphate buffered saline) 또는 노말 식염수(normal saline)이다.
본 발명에 이용되는 균형 염(balanced salt) 용액-기반 배지는 당업계에서 통상적으로 이용되는 균형 염 용액을 포함할 수 있다. 예를 들어, 균형 염 용액은 알세버스 용액(Alsever's solution), 얼스 균형 염 용액(Earle's balanced salt solution), 게이스 균형 염 용액(Gey's balanced salt solution), 행크스 균형 염 용액(Hanks' balanced salt solution), 퍽스 균형 염 용액(Puck's balanced salt solution), 링거스 균형 염 용액(Ringer's balanced salt solution), 심스 균형 염 용액(Simm's balanced salt solution) 및 타이로드스 균형 염 용액(Tyrode's balanced salt solution)을 포함한다.
본 발명에 이용되는 균형 염(balanced salt) 용액-기반 배지는 상술한 균형 염 용액에 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 다른 성분들은 소혈청 알부민, 시스테인, 수크로스 및 글루탐산을 포함한다.
본 발명에서 이용되는 세포 비활성 배지 즉 파쇄적 배지는 검체, 예컨대 바이러스를 파쇄하여 바이러스의 내의 핵산분자가 배지로 방출되도록 하고, 단백질 성분을 변성시키고 DNase 및 RNase를 불활성화 시키며, 상기 핵산분자의 인테그러티(integrity)는 유지하도록 하는 배지이다.
보다 구체적으로, 본 발명에서 이용되는 검체수송 배지로서의 세포 비활성 배지는 (i) 카오트로픽제(chaotropic agent)를 포함하며, 보다 더 구체적으로 (i) 카오트로픽제(chaotropic agent) 이외에 (ⅱ) 디터전트(detergent); (ⅲ) 환원제; 및 (ⅳ) 킬레이터로 구성된 군으로 선택되는 최소 1개 이상의 성분을 추가적으로 포함하며, 보다 더욱 더 구체적으로 (i) 카오트로픽제(chaotropic agent) 이외에 (ⅱ) 디터전트(detergent); (ⅲ) 환원제; 및 (ⅳ) 킬레이터를 포함한다. 선택적으로 상기 세포 비활성 배지는 (ⅴ) 완충액을 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 키오트로픽제는 구아니딘 티오시아네이트(guanidine thiocyanate), 구아니딘 이소시아네이트(guanidine isocyanate), 구아니딘 하이드로클로라이드(guanidine hydrochloride) 및 포타슘 티오시아네이트(potassium thiocyanate)이고, 보다 구체적으로, 구아니딘 티오시아네이트(guanidine thiocyanate)이다. 키오트로픽제는 미생물 세포(microbial cell)을 오픈(open)시켜 세포 라이시스(cell lysis)를 유도하고 DNA and RNA가 방출(release) 되도록 하고, 핵산분자가 뉴클레아제(nuclease)에 의해 분해(degradation) 되는 것을 억제한다.
구체적으로, 상기 디터젼트는 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate), 리튬 도데실 설페이트(lithium dodecyl sulfate), 소듐 타우로디옥시콜레이트(sodium taurodeoxycholate), 소듐 타우로콜레이트(sodium taurocholate), 소듐 글리코콜레이트(sodium glycocholate), 소듐 디옥시콜레이트(sodium deoxycholate), 소듐 콜레이트(sodium cholate), 소듐 알킬벤젠 설포네이트(sodium alkylbenzene sulfonate), 폴리소르베이트(polysorbate), 트리톤 X-100(Triton X-100) 또는 N-라우로일 사코신(N-lauroyl sarcosine)이다.
구체적으로, 상기 킬레이터는 에틸렌글리콜테트라아세트산(ethylene glycol tetraacetic acid), 하이드록시에틸에틸렌디아민트리아세트산(hydroxyethylethylenediaminetriacetic acid), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(diethylene triamine pentaacetic acid), N,N-비스(카르복시메틸)글라이신(N,N-bis(carboxymethyl)glycine), 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic), 무수시트레이트(citrate anhydrous), 소듐 시트레이트(sodium citrate), 칼슘 시트레이트(calcium citrate), 암모늄 시트레이트(ammonium citrate), 암모늄 바이시트레이트(ammonium bicitrate), 시트르산(citric acid), 디암모늄 시트레이트(diammonium citrate), 페릭 암모늄 시트레이트(ferric ammonium citrate) 또는 리튬 시트레이트(lithium citrate)이다.
구체적으로, 상기 완충액은 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(tris(hydroxymethyl)aminomethane), 시트레이트(citrate), 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid), N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄설폰산(N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid), 1,3-비스(트리스(하이드록시메틸)메틸 아미노)프로판(1,3-bis(tris(hydroxymethyl)methyl amino)propane), 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진 에탄설폰산(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine ethanesulfonic acid), 3-(N-모르폴리노)프로판설폰산(3-(N-morpholino)propanesulfonic acid), 하이드록시에틸피페라진에탄설폰산(hydroxyethyl piperazine ethane sulfonic acid), 바이카보네이트(bicarbonate) 및 포스페이트(phosphate)이다.
구체적으로, 상기 환원제는 2-메르캅토에탄올(2-mercaptoethanol), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(tris(2-carboxyethyl)phosphine), 디티오트레이톨(dithiothreitol), 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide) 및 소듐 하이드록사이드(sodium hydroxide)이다.
본 발명에서 이용되는 검체수송 배지에서, 키오트로픽제는 배지 100 중량부에 대하여 5-30 중량부의 양으로 포함될 수 있으며, 디터젼트는 1-15 중량부, 킬레이터는 0.1-5 중량부, 완충액은 2-10 중량부, 환원제는 0.1-3 중량부의 양으로 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 검체수송 배지로서의 세포 비활성 배지는 호흡기 감염 병원체의 파쇄에 의한 비활성화 기능과 상기 파쇄된 병원체로부터 방출된 핵산물질(구체적으로, DNA 또는 RNA, 보다 구체적으로 RNA)의 안정화 기능을 한다.
선택적으로, 상기 검체수송 배지는 pH 인디케이터(예컨대, 페놀 레드, 브로모크레졸 퍼플 및 브로모티몰 블루)를 추가적으로 포함하며, 보다 구체적으로 페놀 레드를 포함한다. 상기 pH 인디케이터는 검체수송 배지의 박테리아 감염 여부를 모니터링 할 수 있도록 한다.
검체수송배지를 이용하여 핵산증폭반응을 실시한다. 검체수송배지는 핵산증폭반응에 세 가지 방식으로 적용될 수 있다:
첫 번째 방식에 따르면, 검체수송배지를 어떠한 전처리 없이 직접 핵산증폭반응에 적용한다. 예컨대, 통상의 직접 PCR(direct PCR) 방법에 따라 검체수송배지를 핵산증폭반응 조성물에 첨가하여 PCR을 실시할 수 있다.
두 번째 방식에 따르면, 검체수송배지를 열처리(인큐베이션)을 한 후 인큐베이션 결과물을 핵산증폭반응에 적용한다.
구체적으로, 전비강 스왑 검체 및 타액 검체가 같이 딥핑되어 있는 검체수송배지는 핵산증폭반응에 이용되기 전에 60℃ 내지 100℃(보다 구체적으로, 95℃ 내지 100℃)에서 1분 내지 25분 동안(보다 구체적으로, 1분 내지 15분 동안) 인큐베이션(incubation) 처리되며, 상기 인큐베이션 결과물을 이용하여 상기 핵산증폭반응을 실시한다. 이 경우, 핵산증폭반응에 이용되는 검체수송배지는 인큐베이션 전 또는 후에 2배 내지 10배(보다 구체적으로, 3배 내지 5배)로 희석되어 핵산증폭반응에 적용할 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 전비강 스왑 검체 및 타액 검체가 같이 딥핑되어 있는 검체수송배지는 60℃ 내지 100℃(보다 구체적으로, 95℃ 내지 100℃)에서 1분 내지 25분 동안(보다 구체적으로, 1분 내지 15분 동안) 인큐베이션(incubation) 처리된다. 인큐베이션을 통하여 상기 검체를 용해(lysis)시킬 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 전비강 스왑 검체 및 타액 검체가 같이 딥핑되어 있는 검체수송배지를 용기에 분주한 다음, 인큐베이션을 실시할 수 있다. 예컨대, 상기 전비강 스왑 검체 및 타액 검체가 같이 딥핑되어 있는 검체수송배지에서 5 ㎕ 내지 40 ㎕가 용기로 분주될 수 있다.
다른 구현예에 따르면, 상기 검체를 포함하는 수송 배지는 별도의 분주 없이, 검체가 채취되어 보관되는 처음 용기에 담긴 상태로 인큐베이션을 실시할 수 있다. 이로부터 일부를 분주하여 핵산증폭반응 조성물과 혼합할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 검체를 포함하는 검체수송배지는 희석 없이 인큐베이션에 사용될 수 있다.
다른 구현예에 따르면, 상기 검체를 포함하는 검체수송배지는 인큐베이션 전에 물 또는 버퍼로 희석될 수 있다. 예컨대, 별도의 분주 없이, 인큐베이션을 실시하는 경우에는 상기 검체를 포함하는 검체수송배지에 물 또는 버퍼를 첨가하여 희석할 수 있으며, 상기 검체를 포함하는 검체수송배지를 용기에 분주한 다음, 인큐베이션을 실시할 경우에는 상기 검체를 포함하는 검체수송배지를 분주하는 용기에 희석을 위한 물 또는 버퍼가 미리 담겨 있거나, 검체를 포함하는 검체수송배지를 용기에 분주한 다음, 물 또는 버퍼를 첨가할 수 있다.
상기 희석은 상기 검체수송배지를 상기 핵산증폭반응 조성물과 혼합하여 반응 시, 검체수송배지 내에 존재할 수 있는 반응 저해물질의 저해 작용을 약화시킨다.
일 구현예에 있어서, 검체가 점성이 높을 경우(예컨대, 타액), 상기 점성이 높은 검체를 희석하여 검체의 점성을 낮춘 다음, 인큐베이션을 실시함으로써, 검체의 용해를 용이하게 할 수 있다.
희석에 사용되는 물은 예를 들어, 정제수, nuclease-free-water(예컨대, RNase-free water), 증류수일 수 있다.
희석에 사용되는 버퍼는 예를 들어, TE 버퍼일 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 핵산증폭 반응에 사용되는 검체수송배지는 핵산증폭 반응에 적용 전 2배 내지 10배로 희석될 수 있다. 구체적으로, 상기 수송배지는 2배 내지 8배, 2배 내지 7배, 2배 내지 6배, 2배 내지 5배, 2배 내지 4배 또는 3배 내지 5배로 희석될 수 있으며, 보다 구체적으로, 2배 내지 4배 또는 3배 내지 5배로 희석될 수 있다. 예컨대, 검체수송배지를 2배로 희석할 경우, 상기 검체수송배지와 물(또는 버퍼)을 1:1로 혼합하여 2배로 희석할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “검체의 용해(lysis)”는 검체(예컨대, 도말물, 타액 등)에 포함되어 있는 세포, 박테리아, 바이러스 등의 막이나 벽을 용해하는 것을 포함한다.
일 구현예에 있어서, 상기 검체의 점성은 검체 채취물 자체(예컨대, 도말물(스왑 검체)일 경우, 도말용 봉(swab)에 묻어있는 콧물 자체의 점성)에 대한 점성을 나타내거나 채취된 검체가 보관되어 있는 용액(예컨대, 상기 도말용 봉에 묻어있는 콧물이 풀어져 있는 검체수송배지) 상의 점성을 의미할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 인큐베이션 온도는 95℃ 이상, 96℃ 이상, 97℃ 이상, 98℃ 이상 또는 99℃ 이상이다. 일 구현예에 따르면, 상기 인큐베이션 온도는 100℃ 이하 또는 99℃ 이하이다.
일 구현예에 따르면, 상기 인큐베이션 온도는 97℃ 내지 100℃, 97℃ 내지 99℃, 97℃ 내지 98℃, 98℃ 내지 100℃ 또는 98℃ 내지 99℃ 이다.
일 구현예에 따르면, 상기 인큐베이션 온도는 98℃이다.
상기 인큐베이션 온도는 검체의 용해물을 얻을 수 있는 온도로 선택될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 인큐베이션은 1분 이상, 2분 이상 또는 3분 이상 실시될 수 있다. 일 구현예에 따르면, 상기 인큐베이션은 25분 이하 또는 23분 이하 또는 20분 이하 실시될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 인큐베이션은 1분 내지 25분, 1분 내지 20분, 1분 내지 15분, 2분 내지 25분, 2분 내지 20분, 2분 내지 15분, 3분 내지 25분, 3분 내지 20분 동안, 또는 3분 내지 15분 동안 실시 될 수 있다.
상기 인큐베이션 시간은 상기 인큐베이션 온도에서 검체 내에 존재하는 타겟 핵산의 분해(degradation)를 방지하는 시간으로 선택될 수 있다.
예컨대, 상대적으로 점성이 높은 검체는 상대적으로 점성이 낮은 검체 대비 더 긴 시간 동안 인큐베이션을 실시하는 반면, 상대적으로 점성이 낮은 검체는 상대적으로 점성이 높은 검체 대비 더 짧은 시간 동안 인큐베이션을 실시함으로써, 핵산의 분해를 방지할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 검체가 도말물(스왑 검체)인 경우, 상기 인큐베이션은 2분 내지 4분 동안 실시될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 검체가 도말물(스왑 검체)인 경우, 상기 인큐베이션은 3분 동안 실시될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 검체가 타액인 경우, 상기 인큐베이션은 18분 내지 22분 동안 실시될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 검체가 타액인 경우, 상기 인큐베이션은 20분 동안 실시될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 검체가 점성이 높을 경우(예컨대, 타액), 상기 점성이 높은 검체를 프로테이나제 K로 처리하여 검체의 점성을 낮춘 다음, 인큐베이션을 실시함으로써, 검체의 용해를 용이하게 할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 본 명세서에서 선택된 온도 및 반응 시간만으로 검체 내 세포, 박테리아, 바이러스 등의 막이나 벽을 용해(lysis)할 수 있으므로, 별도의 용해용 물질의 사용이 요구되지 않는다.
상기 인큐베이션 온도 및 시간은 세포, 박테리아, 바이러스 등의 막이나 벽을 용해하면서, 검체 내에 존재하는 타겟 핵산의 분해(degradation)를 방지하는 한도 내에서 다양하게 선택될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 인큐베이션은 95℃ 내지 100℃에서 1분 내지 25분 동안 실시될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 인큐베이션은 95℃ 내지 100℃에서 2분 내지 20분 동안 실시될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 인큐베이션은 97℃ 내지 100℃에서 2분 내지 25분 동안 실시될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 인큐베이션은 97℃ 내지 100℃에서 2분 내지 20분 동안 실시될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 인큐베이션은 98℃ 내지 100℃에서 2분 내지 25분 동안 실시될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 인큐베이션은 98℃ 내지 100℃에서 2분 내지 20분 동안 실시될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 인큐베이션은 98℃에서 2분 내지 25분 동안 실시될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 인큐베이션은 98℃에서 2분 내지 20분 동안 실시될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 검체가 도말물(스왑 검체)인 경우, 상기 인큐베이션은 97℃ 내지 100℃에서 2분 내지 4분 동안 실시될 수 있으며, 구체적으로, 98℃에서 3분 동안 실시될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 검체가 타액인 경우, 상기 인큐베이션은 97℃ 내지 100℃에서 18분 내지 22분 동안 실시될 수 있으며, 구체적으로, 98℃에서 20분 동안 실시될 수 있다.
본 명세서에서 선택된 인큐베이션 온도 및 인큐베이션 시간은 추가적인 핵산의 추출(extraction) 프로세스 없이, 효율적으로 검체의 용해물을 얻고, 타겟 핵산의 분해를 억제할 수 있는 조건이다. 나아가 타겟 핵산이 주형으로써 작동(working)하는데 최적화된 상태를 만들어 줄 수 있는 조건이다. 특히, 타겟 핵산이 RNA인 경우, 본 명세서에서 선택된 인큐베이션 온도 및 인큐베이션 시간이 타겟 RNA로부터 cDNA를 잘 만들 수 있는 조건이다.
일 구현예에 있어서, 상기 인큐베이션은 10 ㎕ 내지 60 ㎕의 부피로 실시될 수 있다. 상기 부피는 상기 검체를 포함하는 검체수송배지가 희석되지 않은 상태의 부피이거나 또는 상기 검체수송배지가 희석된 상태의 부피일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 방법은 자동 분주 시스템(예컨대, Liquid Handler)을 이용하여 분주할 수 있다. 예컨대, 리퀴드 핸들러(liquid handler)를 이용하여 10 ㎕/s 내지 400 ㎕/s 의 유속(flow rate)로 분주될 수 있으며, 구체적으로, 10 ㎕/s 내지 300 ㎕/s, 10 ㎕/s 내지 200 ㎕/s, 10 ㎕/s 내지 100 ㎕/s, 20 ㎕/s 내지 100 ㎕/s, 20 ㎕/s 내지 80 ㎕/s, 20 ㎕/s 내지 70 ㎕/s, 30 ㎕/s 내지 80 ㎕/s, 30 ㎕/s 내지 70 ㎕/s 또는 30 ㎕/s 내지 60 ㎕/s 로 분주될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
세 번째 방식에 따르면, 전비강 스왑 검체 및 타액 검체가 같이 딥핑되어 있는 검체수송배지는 핵산증폭반응에 이용되기 전에 핵산 분리과정이 적용되며, 상기 핵산 분리과정에서 분리된 핵산분자를 이용하여 상기 핵산증폭반응을 실시한다.
상기 핵산 분리과정은, 예를 들어 자성입자-기반 분리방법에 따라 실시할 수 있다(참조: 미국 특허 제6027945호 및 제7517969호). 예를 들어, 라이시스 버퍼, 바인딩 버퍼, 워싱 버퍼 및 용출 버퍼로 구성된 핵산분자 분리용 버퍼를 순서대로 이용하여 핵산분자를 분리할 수 있다. 보다 구체적으로, 검체수송배지에 키오트로픽제(예컨대, guanidine thiocyanate) 및 디터젼트(예컨대, Tween-20)을 포함하는 라이시스 버퍼를 처리하여 검체 내의 바이러스 또는 박테리아를 파쇄하고, 파쇄 결과물에 자성입자를 포함하는 바인딩 버퍼를 처리하여 핵산분자를 자성입자 표면에 결합시킨 다음 에탄올을 포함하는 워싱 버퍼로 자성입자를 세척한 다음 용출 버퍼를 처리하여 자성입자 표면에 결합된 핵산분자를 분리시킨다.
핵산증폭반응은, 타겟에 혼성화 되는 프라이머 및 프로브를 이용할 수 있다.
본 발명에 이용되는 프로브 또는 프라이머는 타겟 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는다. 본 명세서에서 용어 “상보적(complementary)”은 어떤 특정한 혼성화(hybridization) 또는 어닐링 조건 하에서 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서 용어 “상보적”은 용어 “완전 상보적(perfectly complementary)”과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15-40 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.
프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 상술한 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 이러한 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다.
본 명세서에 기재된 용어“증폭”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification; TMA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction(CP-PCR), 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR), 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification(NASBA), 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허출원 제09/854,317호에 기술되어 있다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
호흡기 병원체는 대부분 RNA를 지놈으로 갖고 있다. 이 경우, 시료 내의 RNA를 주형으로 하고 RNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다. 분리된 RNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다. 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 이어, 유전자 증폭 반응을 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다.
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 써머스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus, Taq), 써머스 써머필러스(Thermus thermophilus, Tth), 써머스 필리포르미스(Thermus filiformis), 써미스 플라부스(Thermis flavus), 써모코커스 리터랄리스(Thermococcus literalis), 및 피로코커스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus, Pfu)를 포함한다.
중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용하는 핵산증폭반응은 실시간 핵산증폭반응이다.
상기 실시간 핵산증폭반응은 타겟 핵산 서열의 증폭산물(amplicon)인 이합체(duplex)에 비특이적으로 인터칼레이팅되는 비특이적 형광염료를 이용하여 행할 수 있다.
또한, 실시간 핵산증폭반응은 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화하는 표지된 프로브를 이용할 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 헤어핀 구조를 형성하는 이중 표지된 프로브를 이용하는 분자 비콘(Molecular beacon) 방법(Tyagi et al, Nature Biotechnology v.14 Mar. 1996), 공여체(donor) 또는 수여체(acceptor)로 단일 표지된 두 개의 프로브를 이용하는 혼성화 프로브(Hybridization probe) 방법(Bernad et al, 147-148 Clin Chem 2000; 46) 및 단일 표지된 올리고뉴클레오티드를 이용하는 Lux 방법(미국특허 제 7,537,886호), 이중 표지된 프로브의 혼성화 뿐만 아니라 DNA 중합효소의 5'-뉴클레아제 활성에 의한 이중 표지된 프로브의 절단반응을 이용하는 TaqMan 방법(미국특허 제5,210,015호 및 제5,538,848호)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 실시간 핵산증폭반응은 타겟 핵산서열의 존재에 의존적으로 형성된 이합체를 이용하여 행할 수 있다. 상기 타겟 핵산서열의 존재에 의존적으로 형성되는 이합체는 증폭반응에 의해 형성되는 타겟 서열의 증폭산물 그 자체는 아니며, 타겟 핵산서열의 증폭에 비례하여 그 양이 증가하는 이합체이다. 타겟 핵산서열의 존재에 의존적으로 형성되는 이합체는 다양한 방법에 따라 얻을 수 있으며, 예컨대 WO 2012/096523에 개시된 PTOCE (PTO Cleavage and Extension) 방법에 의해 얻을 수 있으며, 상기 특허문헌들은 본 명세서에 참조문헌으로 삽입된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 핵산증폭반응 조성물은 프라이머, 프로브 및 효소를 포함한다. 상기 핵산증폭반응 조성물은 완충액, dNTP, KCl 및 MgCl2를 포함한다. 예를 들어, 핵산증폭반응 조성물은 40 mM TrisㆍCl(pH 8.8), 100 mM KCl, 4 mM MgCl2 및 400 μM dNTP를 포함할 수 있다. 본 발명의 핵산증폭반응 조성물에 포함되는 효소는 Taq DNA 중합효소(구체적으로, 핫 스타트 Taq DNA 중합효소) 및 역전사효소를 포함하며, 보다 구체적으로 핫 스타트 Taq DNA 중합효소, 역전사효소, UDG(Uracil DNA glycosylase) 및 RI(RNase inhibitor)를 포함한다. 상기 핫 스타트 Taq DNA 중합효소는 화학적 변형 핫 스타트 Taq DNA 중합효소(참조: Paul N, et al., Hot start PCR. Methods in Molecular Biology. Humana Press. 630:301-18(2010)), 항체-기반 핫 스타트 Taq DNA 중합효소(Paul N, et al., Hot start PCR. Methods in Molecular Biology. Humana Press. 630:301-18(2010)) 및 압타머-기반 핫 스타트 Taq DNA 중합효소(Birch DE, et al., Simplified hot start PCR. Nature 381:445-446(1996))를 포함한다. 본 발명에서 이용되는 역전사효소는 당업계에서 통상적으로 이용되는 역전사효소이고, 구체적으로 MMLV-기반 열안정성 역전사효소이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 핵산증폭반응 조성물은 프라이머, 프로브 및 효소(핫 스타트 Taq DNA 중합효소, MMLV-기반 열안정성 역전사효소 및 UDG)를 포함한다.
일반적으로 핵산증폭반응에는 핵산증폭 반응의 유효성(validity)을 결정하기 위하여 IC(internal control)을 이용한다. 본 발명에서는 두 가지 IC를 이용하여, 핵산증폭 반응뿐만 아니라 전비강 스왑 검체 및 타액 검체의 샘플링(sampling) 유효성을 결정할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면,핵산증폭반응 조성물은 상기 호흡기 병원체의 핵산분자, 내재 IC(endogenous IC) 및 외래 IC(exogenous IC)를 증폭하기 위한 프라이머를 포함하며, 상기 내재 IC는 상기 전비강 스왑 검체 및 타액 검체의 샘플링(sampling) 유효성(validity)을 결정하고 상기 외래 IC는 상기 핵산증폭 반응의 유효성을 결정하는데 이용된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면,상기 내재 IC는 RNase P 유전자, 베타글로빈 유전자, GAPDH 유전자, 베타 액틴 유전자, PPIA 유전자, RPS9 유전자, RPS15A 유전자 또는 UXT 유전자이고, 상기 외래 IC는 박테리오파지 MS2 또는 아무어드(armoured) RNA이다.
단계 (b): 호흡기 병원체 존재 여부의 결정
최종적으로, 상기 핵산증폭반응의 결과를 분석하여 상기 호흡기 병원체의 존재 여부를 결정한다.
예를 들어, 실시간 핵산증폭반응의 시그널을 실시간으로 검출하여 특정 역치값(threshold value) 이상의 시그널이 관찰되면 호흡기 병원체가 존재한다고 결정한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에 의해 검출되는 호흡기 병원체는 호흡기 바이러스 및/또는 호흡기 박테리아이다.
예를 들어, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 (예컨대, 인플루엔자 A 바이러스 및 인플루엔자 B 바이러스), RSV(respiratory syncytial virus)(예컨대, RSV A 및 RSV B), 아데노바이러스, 엔테로바이러스, PIV(parainfluenza virus)(예컨대, PIV 1, PIV 2, PIV 3 및 PIV 4), MPV(metapneumovirus), 보카바이러스, 라이노바이러스, 코로나바이러스(예컨대, CoV NL63, CoV 229E, CoV OC43, CoV HKU1, SARS-CoV, MERS-CoV, SARS-CoV-2, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, Legionella pneumophila, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Bordetella pertussis 및/또는 Bordetella parapertussis에 의한 감염을 판정한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 인플루엔자 바이러스, RSV(respiratory syncytial virus), 아데노바이러스, 엔테로바이러스, PIV(parainfluenza virus), MPV(metapneumovirus), 보카바이러스, 라이노바이러스 및/또는 코로나바이러스를 포함하는 호흡기 바이러스에 의한 감염을 판정한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 방법은 SARS-CoV-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)에 의한 감염을 판정한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면,상기 핵산증폭반응 조성물은 SARS-CoV-2의 RdRP 유전자, S 유전자 및 N 유전자 중 최소 하나, 보다 구체적으로 최소 둘, 보다 더 구체적으로 3개의 유전자의 증폭에 이용되는 프라이머를 포함하며, RdRP 유전자, S 유전자 및 N 유전자 중 최소 하나(보다 구체적으로 최소 둘, 보다 더 구체적으로 3개)가 양성으로 측정되는 경우 SARS-CoV-2의 병원체가 존재하는 것으로 결정한다.
택일적으로, 상기 핵산증폭반응 조성물은 SARS-CoV-2의 E 유전자, RdRP 유전자, S 유전자 및 N 유전자 중 최소 하나, 보다 구체적으로 최소 둘, 보다 더 구체적으로 3개, 보다 더욱 더 구체적으로 4개의 유전자의 증폭에 이용되는 프라이머를 포함하며, E 유전자 및 N 유전자의 최소 하나(보다 구체적으로 최소 둘) 그리고 RdRP 유전자 및 S 유전자의 최소 하나가 양성으로 측정되는 경우 SARS-CoV-2의 병원체가 존재하는 것으로 결정한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 100-500 RNA 카피/반응의 LoD(Limit of Detection) 값을 나타내는 실시간 핵산증폭반응에 의해 실시된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 호흡기 병원체 검출을 위한 샘플링 키트를 제공한다: (a) 전비강 스왑; (b) 타액 샘플링 도구; 및 (b) 검체 수송배지(transport medium)를 포함하는 용기.
본 발명의 샘플링 키트는 상술한 본 발명의 방법을 실시하는데 이용되는 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 타액 샘플링 도구는 타액 스왑(saliva swab)이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 샘플링 키트는 자가 샘플링용 키트이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 타액 스왑은 설상부분 또는 설하부분(sublingual part)에 적용된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 전비강 스왑 및/또는 타액 스왑은 지지체 부분 및 섬유층이 형성되어 있는 타원형의 헤드 부분을 포함하며, 헤드 부분은 횡장축(horizontal long axis) 부분과 횡단축(horizontal short axis) 부분을 가지며, 횡장축 부분에서 헤드 부분 두께는 3.8-6.0 mm이고, 횡단축 부분에서의 헤드 부분 두께는 2.0-3.5 mm이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 전비강 스왑 및/또는 타액 스왑은 지지체 부분 및 섬유층이 형성되어 있는 타원형의 헤드 부분을 포함하며, 헤드 부분은 횡장축(horizontal long axis) 부분과 횡단축(horizontal short axis) 부분을 가지며, 횡장축 부분에서 헤드 부분 두께는 4.8-5.2 mm이고, 횡단축 부분에서의 헤드 부분 두께는 2.8-3.2 mm이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 섬유층의 섬유는 3.00-3.50의 Dtex 값을 갖는다. 보다 구체적으로, 상기 섬유층의 섬유는 3.30-3.35의 Dtex 값을 갖는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 검체수송배지는 세포 보존성 배지 또는 세포 비활성 배지이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 세포 보존성 배지는 식염수-기반 용액(saline-based solution) 또는 균형 염(balanced salt) 용액-기반 배지이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 식염수-기반 용액(saline-based solution)은 PBS(phosphate buffered saline) 또는 노말 식염수(normal saline)이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면,상기 세포 비활성 배지는 (i) 카오트로픽제(chaotropic agent)를 포함한다. 보다 구체적으로, 상기 세포 비활성 배지는 (ⅱ) 디터전트(detergent); (ⅲ) 환원제; 및 (ⅳ) 킬레이터로 구성된 군으로 선택되는 최소 1개 이상의 성분을 추가적으로 포함한다. 선택적으로 상기 세포 비활성 배지는 (ⅴ) 완충액을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 검체 수송배지는 여기에 상기 전비강 스왑 및 타액 샘플링 도구에 의해 샘플링된 검체가 함침된 경우, 핵산증폭 반응에 핵산 분리과정 없이 이용된다.
선택적으로, 상기 검체수송 배지는 pH 인디케이터(예컨대, 페놀 레드, 브로모크레졸 퍼플 및 브로모티몰 블루)를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 호흡기 병원체의 검출용 키트를 제공한다:
(a) 상술한 본 발명의 샘플링 키트; 그리고
(b) (i) 상기 호흡기 병원체의 핵산분자를 증폭하기 위한 프라이머, (ii) 상기 호흡기 병원체의 핵산분자에 혼성화 되는 프로브 및 (iii) DNA 중합효소를 포함하는 효소를 포함하는 실시간 핵산증폭반응 조성물.
본 발명의 호흡기 병원체의 검출용 키트는 상술한 본 발명의 방법을 실시하는데 이용되는 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 효소는 핫 스타트 Taq 중합효소 및 역전사 효소를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 핵산증폭반응 조성물은 내재 IC(endogenous IC) 및 외래 IC(exogenous IC)를 증폭하기 위한 프라이머를 추가적으로 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 내재 IC는 RNase P 유전자, 베타글로빈 유전자, GAPDH 유전자, 베타 액틴 유전자, PPIA 유전자, RPS9 유전자, RPS15A 유전자 또는 UXT 유전자이고, 상기 외래 IC는 박테리오파지 MS2 또는 아무어드(armoured) RNA이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 호흡기 병원체는 호흡기 바이러스 및/또는 호흡기 박테리아이다. 보다 구체적으로, 상기 호흡기 바이러스는 인플루엔자 바이러스, RSV(respiratory syncytial virus), 아데노바이러스, 엔테로바이러스, PIV(parainfluenza virus), MPV(metapneumovirus), 보카바이러스, 라이노바이러스 및/또는 코로나바이러스이다. 보다 더 구체적으로, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 호흡기 병원체의 핵산분자는 SARS-CoV-2의 RdRP 유전자, S 유전자 및 N 유전자 중 최소 하나의 유전자이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 호흡기 병원체를 검출하기 위한 샘플링 방법을 제공한다:
(a) 상기 본 발명의 샘플링 키트를 이용하여 전비강 스왑 검체 및 타액 검체를 수득하는 단계; 및
(b) 상기 전비강 스왑 검체 및 상기 타액 검체를 하나의 용기에 있는 검체 수송배지(transport medium)에 함침시키는 단계.
본 발명의 샘플링 방법은 상술한 본 발명의 샘플링 키트를 이용하는 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 종래의 방법인 비인두강 스왑은 스왑하는 도구가 별도로 필요하고 전문가에 의해서만 시료 채취가 가능하며 에어로졸-생성 샘플링(aerosol-generating sampling) 방식이어서 시료 채취자가 상당한 감염위험에 노출되는 문제점이 있다. 반면, 본 발명에서의 스왑 검체 및 타액 검체(예컨대, 타액 스왑 검체)는 일반인들이 자가 샘플링을 할 수 있는 방식이면서 비(non)-에어로졸-생성 샘플링 방식이어서, 샘플링의 안전성과 편의성을 크게 개선시킬 수 있다.
(b) 전비강 스왑 검체 및 타액 검체(예컨대, 타액 스왑 검체)를 같이 이용하는 경우, 종래의 방법인 비인두강 스왑과 비교하여 동등한 양성율을 나타내면서 자가 샘플링을 가능하도록 한다.
(c) 본 발명의 방법을 핵산 분리과정 없이 실시하는 경우, 핵산 분리과정에 따른 문제점(검사시간의 장기화, 핵산 분리시약 및 장비의 필요성)을 개선한다.
도 1은 본 발명에 이용되는 전비강 스왑 및/또는 타액 스왑을 예시적으로 보여준다.
도 2a는 전비강 스왑을 이용하여 검체를 채취하는 요령을 예시적으로 보여준다.
도 2b는 타액 스왑을 이용하여 검체를 채취하는 요령을 예시적으로 보여준다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 첨부된 청구항에 제시된 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.
실시예
본 발명에서 제시하는 프로토콜에 따라 SARS-CoV-2 검출을 실시하였다.
구체적으로, 창원경상대병원에서 SARS-CoV-2 감염 의심환자 혹은 SARS-CoV-2 검사 결과 양성 확진 판정을 받은 환자를 대상으로(양성 70명, 음성 30명) 비인두 스왑(swab) 검체, 및 콤보 스왑(Combo-swab) 검체 (전비강 스왑 검체 및 타액 스왑 검체의 조합)를 채취하여 각각 분리 핵산 또는 crude 핵산에 대하여 실시간 역전사(Real-time Reverse-transcription) PCR 검사(Seegene Inc.의 Allplex™ SARS-CoV-2 Assay, Allplex™ SARS-CoV-2/FluA/FluB/RSV Assay)를 시행하였다. SARS-CoV-2 검출에 있어 각 유형의 검체 별 임상적 성능을 비교하였고, 상기 환자들에 의해 자가 채취된 콤보 스왑 검체에 대한 검사 결과와 전문가인 의료진에 의해 채취된 콤보 스왑 검체에 대한 검사 결과를 비교하였다.
비인두 스왑 검체는 기존에 병원에서 사용하던 방법으로 대상 환자로부터 채취하였다.
전비강 스왑 검체 및 타액 스왑 검체는 다음과 같이 채취하였다: ALLTM (SG 메디칼 Inc.)에 동봉된 전비강 스왑 및 타액 스왑 도구를 이용하여 검체를 채취하였다.
상기 전비강 스왑을 전비강에 2-3 cm 삽입하고 20초 동안 부드럽게 회전하면서 스와빙을 하여 전비강 스왑 검체를 얻었다. 한 쪽 전비강에서 스와빙을 한 다음, 다른 전비강에서 스와빙을 하였다. 이어, 타액 스왑을 설하 부분에 적용하여 타액이 충분히 스왑의 섬유층에 흡수되도록 스와빙을 하여 타액 스왑 검체를 얻었다. 상기 타액 스왑 검체가 충분한 양으로 얻어지지 않은 경우, 상기 타액 스왑을 이용하여 볼 안쪽(inside of cheek), 치은(gingiva) 및/또는 구개(palate)로부터 추가적으로 타액 스왑 검체를 수득하였다. 그 다음, 전문가들에 의해 채취된 상기 전비강 스왑 검체 및 타액 스왑 검체 모두 바이러스 인테그러티(integrity)를 보존하기 위해서 행크스 균형 염 기반 배지(Hanks' balanced salt-based medium)인 검체수송배지(ALLTM, SG 메디칼 Inc.)에 함침시켰다. 환자들에 의해 채취된 전비강 스왑 검체 및 타액 스왑 검체 모두 식염수 배지(saline medium)에 함침시켰다.
또한, 비인두 스왑 검체도 검체수송배지(ALLTM, SG 메디칼 Inc.)에 함침시켰다.
이어, 검체수송배지를 열처리 하거나 핵산 분리과정을 거쳐서 RT-PCR 반응물에 첨가할 타겟 핵산을 얻었다.
열처리에 의한 타겟 핵산(이하, “Crude 핵산”이라 한다)의 수득은, 비인두 스왑 검체 및 콤보 스왑 검체가 각각 함침된 검체수송배지를 3배 희석하고 98℃에서 3분 동안 인큐베이션을 하여 수득하였다.
핵산 분리는 ㈜씨젠의 STARMag 96X4 Universal Cartridge Kit (Cat. No. 744300.4.UC384, Seegene Inc.) 및 자동 핵산 추출 장비 Microlab NIMBUS (Cat. No. 65415-02, Hamilton)를 이용하여 실시하였다. 핵산 분리는 상기 핵산 분리 시약의 제조사 및 상기 장치 작동 매뉴얼에 따라 실시하였다. 비인두 스왑 검체, 및 콤보 스왑 검체가 각각 함침된 검체수송배지 300 μl를 이용하여 핵산 분리를 실시하였다(이하, “분리 핵산”이라 한다).
상기 Crude 핵산 또는 분리 핵산을 이용한 RT-PCR 반응은 다중 One-step RT-PCR 제품인 AllplexTM SARS-CoV-2 Assay((주)씨젠) 또는 Allplex™ SARS-CoV-2/FluA/FluB/RSV Assay((주)씨젠)를 이용하여 실시하였다. AllplexTM SARS-CoV-2 Assay 제품은 Sarbecovirus와 SARS-CoV-2의 타겟 유전자 E gene, SARS-CoV-2의 타겟 유전자 RdRP gene, S gene 및 N gene 검출용 one-step RT-PCR 제품이고, Allplex™ SARS-CoV-2/FluA/FluB/RSV Assay 제품은 SARS-CoV-2의 타겟 유전자(RdRP 유전자, S 유전자 및 N 유전자), A형 인플루엔자 바이러스, B형 인플루엔자 바이러스 및 호흡기세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus)를 검출하기 위한 one-step RT-PCR 제품이다.
AllplexTM SARS-CoV-2 Assay 제품을 이용하는 경우에는, Crude 핵산 또는 분리 핵산 5 ㎕, 효소(화학적 변형 핫 스타트 Taq polymerase, RTase, UDG 및 RI 포함) 5 ㎕, RNase-free Water 5 ㎕ 및 SARS2 MOM (Oligo mix) 5 ㎕를 사용하여 20 ㎕의 최종 부피로 RT-PCR 반응의 반응 혼합물을 제조하였다. 상기 제조된 반응 혼합물을 각각 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켜 50℃에서 20분간 반응시킨 다음, 95℃에서 15분간 활성화 시키고(preactivated), 95℃에서 10초, 60℃에서 15초, 72℃에서 10초 과정을 45 사이클 반복하였다. 상기 실험은 2회씩 반복하여 평균 Ct 값을 얻었다.
Allplex SARS-CoV-2 Assay에서 해당 분석물(analytes) 및 분석 결과 해석은 다음과 같이 정리하였다:
형광단(Fluorophores) 분석물(Analytes)
FAM E 유전자
HEX 내부 대조군(IC)
Cal Red 610 RdRP/S 유전자
Quasar 670 N 유전자
분석물 Ct 값 결과
타겟 ≤ 40 검출(+)
> 40 검출되지 않음(-)
내부 대조군(IC) ≤ 40 검출(+)
> 40 검출되지 않음(-)
타겟 케이스1 케이스2 케이스3 케이스4 케이스5 케이스6 케이스7
IC +/- +/- +/- +/- +/- + -
E 유전자 + +/- - +/- + - -
RdRP/S 유전자 + - + + - - -
N 유전자 + + + - - - -
해석 SARS-CoV-2
검출 		SARS-CoV-2
미결정(inconclusive) 		SARS-CoV-2
검출되지 않음		 무효(invalid)
AllplexTM SARS-CoV-2/FluA/FluB/RSV Assay 제품을 이용하는 경우에는, Crude 핵산 5 ㎕, 효소(화학적 변형 핫 스타트 Taq polymerase, RTase, UDG 및 RI 포함) 5 ㎕, RNase-free Water 5 ㎕ 및 SC2FabR MOM (Oligo mix) 5 ㎕를 사용하여 20 ㎕의 최종 부피로 RT-PCR 반응의 반응 혼합물을 제조하였고, 분리 핵산 10 ㎕, 효소(화학적 변형 핫 스타트 Taq polymerase, RTase, UDG 및 RI 포함) 5 ㎕, 및 SC2FabR MOM (Oligo mix) 5 ㎕를 사용하여 20 ㎕의 최종 부피로 RT-PCR 반응의 반응 혼합물을 제조하였다. 상기 제조된 반응 혼합물을 각각 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켜 50℃에서 20분간 반응시킨 다음, 95℃에서 15분간 활성화 시키고(preactivated), 95℃에서 10초, 60℃에서 40초, 72℃에서 20초 과정을 3 사이클 반복하고, 95℃에서 10초, 60℃에서 15초, 72℃에서 10초 과정을 42 사이클 반복하였다. 시그널 검출은 매 사이클의 60℃ 및 72℃에서 실시하였다. 상기 실험은 2회씩 반복하여 평균 Ct 값을 얻었다.
Allplex SARS-CoV-2/FluA/FluB/RSV Assay에서 해당 분석물(analytes) 및 분석 결과 해석은 다음과 같이 정리하였다:
형광단 분석물
그래프 1 그래프 2
FAM S 유전자 RSV
HEX RdRP 유전자 Flu B
Cal Red 610 N 유전자 Flu A
Quasar 670 엔도(endo) IC 엑소(exo) IC
상기 Allplex SARS-CoV-2/FluA/FluB/RSV Assay 제품은 PTOCE 기술(WO 2012/096523)을 이용하여 개발되었다. 그래프 1은 60℃에서 검출된 실시간 PCR 증폭 곡선을 나타내고, 그래프 2는 72℃에서 검출된 실시간 PCR 증폭 곡선을 나타낸다.
결과 타겟
FAM(Ct) HEX(Ct) Cal Red 610(Ct) Quasar 670(Ct)
S 유전자 RSV RdRP Flu B N 유전자 Flu A Endo IC Exo IC
검출(+) ≤ 38 ≤ 38 ≤ 40 ≤ 38 ≤ 38 ≤ 38 ≤ 38 ≤ 38
검출되지 않음(-) > 38 > 38 > 40 > 38 > 38 > 38 > 38 > 38
S 유전자 RdRP 유전자 N 유전자 SARS-CoV-2 결과 해석
+ + + SARS-CoV-2 검출
+ + - SARS-CoV-2 미결정
+ - +
- + +
+ - -
- + -
- - +
- - - SARS-CoV-2 검출되지 않음
타겟 결과 Endo IC 결과 Exo IC 결과 결과 해석
+ + + 타겟 검출
- +
+ -
- + + 타겟 검출되지 않음
- + 무효
+ - 무효
+/- - - 무효
SARS-CoV-2 검출에 있어, 비인두 스왑 검체 대비 콤보 스왑 검체의 임상적 성능의 비교 결과는 아래 표 8에 정리하였다:
검체 종류 Assay 핵산 비인두 스왑 검체 대비 임상적 성능
민감도 특이도 일치율(overall agreement)
콤보 스왑 Assay 1 분리 핵산 91.38% 100% 94.32%
Crude 핵산 82.93% 100% 90.14%
Assay 2 분리 핵산 87.72% 100% 91.95%
Crude 핵산 80.43% 100% 88.16%
콤보 스왑-셀프(self) Assay 1 분리 핵산 89.66% 100% 93.18%
Crude 핵산 90.24% 100% 90.24%
Assay 2 분리 핵산 84.21% 100% 89.66%
Crude 핵산 73.91% 100% 84.21%
상기 표 8에서 콤보 스왑은 의료진이 채취한 콤보 스왑 검체를 나타내고, 콤보 스왑-셀프(self)는 환자들에 의해 자가 채취한 콤보 스왑 검체를 나타낸다. 그리고, AllplexTM SARS-CoV-2 Assay는 Assay 1로 나타내었고, AllplexTM SARS-CoV-2/FluA/FluB/RSV Assay는 Assay 2로 나타내었다.
실험 결과, 전비강 스왑 검체와 타액 스왑 검체를 같이(콤보 스왑 검체) 이용한 경우, 비인두강 스왑 검체를 이용한 경우와 비교하여 분리 핵산에 대해서 Assay 1은 93.18-94.32%의 일치율을 보였으며, Assay 2는 89.66-91.95%의 일치율을 보여서, SARS-CoV-2에 대하여 동등한 양성율을 나타내었다.
한편, 전비강 스왑 검체와 타액 스왑 검체(콤보 스왑 검체)로부터 얻은 분리 핵산을 이용한 경우 SARS-CoV-2에 대하여 양성의 시그널을 얻을 수 있었다. 또한, 전비강 스왑 검체와 타액 스왑 검체(콤보 스왑 검체)로부터 Crude 핵산을 이용한 경우에도 SARS-CoV-2에 대하여 양성의 시그널을 얻을 수 있었으나, 분리 핵산과 비교하여 민감도 및 일치율이 소폭 떨어지는 양상이다. 상술한 감소된 민감도 및 일치율이 분리 핵산이 아닌 Crude 핵산을 이용하였다는 것을 고려하면, 매우 흥미로운 결과이다.
비인두 swab 검체의 경우, 자가 채취가 불가능 하여 피험자가 의료기관을 직접 방문하여 검사자(의료인)가 검체 채취를 진행해야 하는 불편함이 있었다. 그러나, 상기 표 8의 콤보 스왑-셀프(self)에 대한 결과에서 볼 수 있듯이, 민감도 및 일치율에 다소 차이가 있으나 검체 안정성에는 이상이 없으므로, 자가 채취한 콤보 스왑 검체의 이용 가능성을 확인할 수 있었다. 이의 적용과 더불어 피험자의 이동 동선 축소 및 채취 시간 단축, 의료인력 절감 등의 효과를 볼 수 있을 것으로 예상된다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (33)

  1. 다음의 단계를 포함하는 호흡기 병원체의 검출방법:
    (a) 전비강 스왑(nostril swab) 검체 및 타액 검체가 같이 딥핑(dipping)되어 있는 검체수송배지(transport medium) 및 핵산증폭반응 조성물을 이용하여 핵산증폭반응을 실시하는 단계; 및
    (b) 상기 핵산증폭반응의 결과를 분석하여 상기 호흡기 병원체의 존재 여부를 결정하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 타액 검체는 타액 스왑(saliva swab) 검체인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 전비강 스왑(nostril swab) 검체 및 타액 검체는 자가 샘플링을 통해 수득되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 전비강 스왑 검체는 하나의 스왑 도구를 두 개의 전비강에 모두 적용하여 수득된 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 2 항에 있어서, 상기 타액 스왑 검체는 스왑 도구를 설상부분 또는 설하부분(sublingual part)에 적용하여 수득된 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 타액 스왑 검체는 스왑 도구를 설하부분(sublingual part)에 적용하여 수득된 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 2 항에 있어서, 상기 전비강 스왑 검체 및 타액 스왑 검체는 두 개의 스왑 도구 각각을 전비강 및 혀에 적용하여 수득된 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 2 항에 있어서, 상기 전비강 스왑 검체 및 타액 스왑 검체는 하나의 스왑 도구를 전비강 및 이어서 혀에 적용하여 수득된 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 검체수송배지는 세포 보존성 배지 또는 세포 비활성 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 세포 보존성 배지는 식염수-기반 용액(saline-based solution) 또는 균형 염(balanced salt) 용액-기반 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 전비강 스왑 검체 및 타액 검체가 같이 딥핑되어 있는 검체수송배지는 핵산증폭반응에 이용되기 전에 핵산 분리과정이 적용되며, 상기 핵산 분리과정에서 분리된 핵산분자를 이용하여 상기 핵산증폭반응을 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 전비강 스왑 검체 및 타액 검체가 같이 딥핑되어 있는 검체수송배지는 핵산증폭반응에 이용되기 전에 60℃ 내지 100℃에서 1분 내지 25분 동안 인큐베이션(incubation) 처리되며, 상기 인큐베이션 결과물을 이용하여 상기 핵산증폭반응을 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 핵산증폭반응에 이용되는 상기 검체수송배지는 핵산증폭반응에 적용하기 전에 2배 내지 10배로 희석되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 호흡기 병원체는 호흡기 바이러스 및/또는 호흡기 박테리아인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 호흡기 바이러스는 인플루엔자 바이러스, RSV(respiratory syncytial virus), 아데노바이러스, 엔테로바이러스, PIV(parainfluenza virus), MPV(metapneumovirus), 보카바이러스, 라이노바이러스 및/또는 코로나바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항에 있어서, 상기 핵산증폭반응은 실시간 핵산증폭반응인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1 항에 있어서, 상기 핵산증폭반응 조성물은 프라이머, 프로브 및 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 16 항에 있어서, 상기 핵산증폭반응 조성물은 SARS-CoV-2의 RdRP 유전자, S 유전자 및 N 유전자 중 최소 하나의 유전자의 증폭에 이용되는 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 다음을 포함하는 호흡기 병원체 검출을 위한 샘플링 키트: (a) 전비강 스왑; (b) 타액 샘플링 도구; 및 (b) 검체 수송배지(transport medium)를 포함하는 용기.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 타액 샘플링 도구는 타액 스왑(saliva swab)인 것을 특징으로 하는 키트.
  22. 제 20 항에 있어서, 상기 샘플링 키트는 자가 샘플링용 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
  23. 제 21 항에 있어서, 상기 타액 스왑은 설상부분 또는 설하부분(sublingual part)에 적용되는 것을 특징으로 키트.
  24. 제 20 항에 있어서, 상기 검체수송배지는 세포 보존성 배지 또는 세포 비활성 배지인 것을 특징으로 하는 키트.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 세포 보존성 배지는 식염수-기반 용액(saline-based solution) 또는 균형 염(balanced salt) 용액-기반 배지인 것을 특징으로 하는 키트.
  26. 제 20 항에 있어서, 상기 검체 수송배지는 여기에 상기 전비강 스왑 및 타액 샘플링 도구에 의해 샘플링된 검체가 함침된 경우, 핵산증폭 반응에 핵산 분리과정 없이 이용되는 것을 특징으로 하는 키트.
  27. 다음을 포함하는 호흡기 병원체의 검출용 키트:
    (a) 상기 제 20 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항의 샘플링 키트; 그리고
    (b) (i) 상기 호흡기 병원체의 핵산분자를 증폭하기 위한 프라이머, (ii) 상기 호흡기 병원체의 핵산분자에 혼성화 되는 프로브 및 (iii) DNA 중합효소를 포함하는 효소를 포함하는 실시간 핵산증폭반응 조성물.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 효소는 핫 스타트 Taq 중합효소 및 역전사 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  29. 제 27 항에 있어서, 상기 호흡기 병원체는 호흡기 바이러스 및/또는 호흡기 박테리아인 것을 특징으로 하는 키트.
  30. 제 29 항에 있어서, 상기 호흡기 바이러스는 인플루엔자 바이러스, RSV(respiratory syncytial virus), 아데노바이러스, 엔테로바이러스, PIV(parainfluenza virus), MPV(metapneumovirus), 보카바이러스, 라이노바이러스 및/또는 코로나바이러스인 것을 특징으로 하는 키트.
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)인 것을 특징으로 하는 키트.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 호흡기 병원체의 핵산분자는 SARS-CoV-2의 RdRP 유전자, S 유전자 및 N 유전자 중 최소 하나의 유전자인 것을 특징으로 하는 키트.
  33. 다음의 단계를 포함하는 호흡기 병원체를 검출하기 위한 샘플링 방법:
    (a) 상기 제 20 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항의 샘플링 키트를 이용하여 전비강 스왑 검체 및 타액 검체를 수득하는 단계; 및
    (b) 상기 전비강 스왑 검체 및 상기 타액 검체를 하나의 용기에 있는 검체 수송배지(transport medium)에 함침시키는 단계.
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