BR112021015031A2 - Métodos para detectar legionella - Google Patents

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Abstract

métodos para detectar legionella. a presente invenção fornece métodos para determinar se um paciente que exibe sintomas semelhantes aos de pneumonia se beneficiará do tratamento com agentes terapêuticos que inibem legionella sp. esses métodos são baseados na detecção de legionella sp. e/ou legionella pneumophila em uma amostra biológica. kits para uso na prática dos métodos também são fornecidos.

Description

MÉTODOS PARA DETECTAR LEGIONELLA CAMPO TÉCNICO
[001] A presente invenção fornece métodos para determinar se um paciente exibindo sintomas semelhantes aos de pneumonia se beneficiará do tratamento com agentes terapêuticos que inibem Legionella sp. e/ou Legionella pneumophila. Esses métodos são baseados em detectar Legionella sp. e Legionella pneumophila em uma amostra biológica, testando a presença do gene ssrA e do gene 16S, respectivamente. Kits para uso na prática dos métodos também são fornecidos.
ANTECEDENTES
[002] A seguinte descrição do antecedente da presente invenção é fornecida simplesmente para ajudar o leitor a compreender a invenção e não é admitida para descrever ou constituir o estado da técnica da presente invenção.
[003] Legionellas são bactérias Gram-negativas intracelulares facultativas encontradas em ambientes de solo e água, onde eles podem parasitar e proliferar dentro de protozoários. Como resultado, elas são contaminantes comuns de sistemas de água artificial, incluindo sistemas de ar condicionado, torres de resfriamento e banheiras de hidromassagem. Legionellas também são capazes de replicação em macrófagos alveolares e células epiteliais de mamíferos. Uma vez aerossolizada, a bactéria pode entrar no trato respiratório humano e causar pneumonia adquirida em comunidade, adquirida em viagens e adquirida nosocomialmente. Em alguns casos, as Legionellas podem causar a doença dos legionários, uma forma grave de pneumonia, ou febre de Pontiac, uma doença mais branda semelhante à gripe.
[004] Existem atualmente 50 espécies conhecidas compreendendo cerca de 70 sorogrupos distintos no gênero Legionella. Legionella pneumophila sorogrupo 1 é responsável pela maioria das infecções em humanos, mas a associação com doenças humanas foi relatada em mais de 20 das espécies dentro do gênero. A identificação de infecções causadas por L. pneumophila é particularmente importante porque esta espécie de Legionella está associado a doenças que resultam em morbidade grave e mortalidade.
[005] A cultura é considerada o “padrão ouro” para a detecção de Legionalla. No entanto, as legionellas são organismos de crescimento lento e fastidiosos. O diagnóstico sorológico também é comumente usado; no entanto, os diagnósticos sorológicos só podem ser feitos retrospectivamente e raramente influenciam o tratamento do paciente. Os testes de antígeno de urina são testes rápidos para o diagnóstico da doença dos legionários, mas são limitados por sua capacidade de detectar apenas um número limitado de sorogrupos de Legionella pneumophila. Os testes de amplificação de ácido nucleico existentes são suscetíveis à detecção de bactérias não Legionella incluindo espécies de Pseudomonas e espécies de Enterobacter.
[006] Assim, há uma necessidade substancial por métodos mais robustos, sensíveis e específicos que possam detectar e discriminar rapidamente entre Legionella sp. e Legionella pneumophila em uma única amostra biológica.
RESUMO
[007] A presente invenção fornece composições e métodos para detectar e discriminar entre Legionella sp. e Legionella pneumophila em uma única amostra biológica. Em um outro aspecto, os métodos e composições da presente tecnologia são úteis na seleção de um regime terapêutico ótimo para um indivíduo que exibe sintomas semelhantes aos de coqueluche. Os testes de amplificação de ácido nucleico (incluindo ensaios usando PCR em tempo real) são ferramentas atraentes para a detecção de legionellas em espécies clínicas, uma vez que são capazes de detectar todas as legionellas e fornecer resultados rápidos. Esses testes também são capazes de diferenciar entre espécies de L.
pneumophila e não-L. pneumophila. Isso é importante, uma vez que morbidade mais grave e mortalidade foram observadas com L. pneumophila.
[008] Por conseguinte, em alguns aspectos, são fornecidos na presente invenção métodos para detectar a presença de pelo menos uma espécie de Legionella em uma amostra biológica, os métodos compreendendo, consistindo em, ou consistindo essencialmente em: (a) fornecer um primeiro par de iniciadores adequado para amplificar um ácido nucleico alvo ssrA; fornecer um segundo par de iniciadores adequado para amplificar um ácido nucleico alvo rRNA 16S; amplificar o ácido nucleico alvo ssrA e o ácido nucleico alvo rRNA 16S, se presente; e detectar um ou mais produtos de amplificação produzidos na etapa (c); em que a presença do ácido nucleico alvo ssrA identifica a presença de pelo menos uma espécie de Legionella, e a presença do ácido nucleico alvo rRNA 16S identifica a presença de Legionella pneumophila.
[009] Em algumas modalidades dos métodos fornecidos na presente invenção, o primeiro par de iniciadores compreende pelo menos um iniciador degenerado. Em algumas modalidades, o primeiro par de iniciadores compreende um primeiro iniciador senso compreendendo 5’ TCGACGTGGGTTGCRAAACG 3’ (SEQ ID NO: 1) ou um complemento do mesmo. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o primeiro par de iniciadores compreende um primeiro iniciador antissenso compreendendo 5’ TATGACCGTTGATTCGATACC 3’ (SEQ ID NO: 2) ou um complemento do mesmo. Em algumas modalidades, o segundo par de iniciadores compreende pelo menos um iniciador degenerado. Em algumas modalidades, o segundo par de iniciadores compreende um segundo iniciador senso compreendendo 5’ TACCTACCCTTGACATACAGTG 3’ (SEQ ID NO: 4) ou um complemento do mesmo. Em algumas modalidades, o segundo par de iniciadores compreende um segundo iniciador antissenso compreendendo 5’ CTTCCTCCGGTTTGTCAC 3’ (SEQ
ID NO: 5) ou um complemento do mesmo.
[010] Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente contactar a amostra biológica com uma ou mais sondas de oligonucleotídeo capazes de hibridizar especificamente a um produto de amplificação ou um complemento do mesmo. Em algumas modalidades, a sonda de oligonucleotídeo é marcada de forma detectável. Em algumas modalidades, o marcador detectável é um marcador fluorescente. Em algumas modalidades, o marcador fluorescente é selecionado a partir do grupo que consiste em fluoresceína, Cy3, Cy5, Cy5.5 tetracloro-6-car-boxifluoresceína, 2,7-dimetoxi- 4,5-dicloro-6-carboxi-fluoresceína, Yakima Yellow, Texas Red, TYE 563, ROX, TEX 615, TYE 665, TYE 705 e hexacoloro-6-carboxifluoresceína. Em algumas modalidades, a sonda de oligonucleotídeo compreende adicionalmente pelo menos um quencher. Em algumas modalidades, o quencher é selecionado a partir do grupo que consiste em TAMRA, Black Hole Quencher, Deep Dark Quencher, ZEN, Iowa Black FQ, Iowa Black RQ e DABCYL. Em algumas modalidades, a sonda de oligonucleotídeo hibridiza especificamente a um produto de amplificação de ssrA e em que a sonda de oligonucleotídeo compreende 5’ TAAATATAAATGCAAACGATGAAAACTTTGC 3’ (SEQ ID NO: 3) ou um complemento do mesmo. Em algumas modalidades, a sonda de oligonucleotídeo hibridiza especificamente a um produto de amplificação de rRNA 16S e em que a sonda de oligonucleotídeo compreende 5’ CCAGCATGTGATGGTGGGGACTCTA 3’ (SEQ ID NO: 6) ou um complemento do mesmo.
[011] Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente a mistura de DNA de controle exógeno com a amostra biológica. Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente contactar a amostra biológica com um terceiro par de iniciadores adequado para amplificação de um ácido nucleico alvo controle exógeno e a amplificação do ácido nucleico alvo controle exógeno. Em algumas modalidades, o ácido nucleico alvo controle exógeno compreende SEQ ID NO: 20. Em algumas modalidades, o terceiro par de iniciadores consiste em um terceiro iniciador senso compreendendo 5’ GCTTCAGTACCTTCGGCTTG 3’ (SEQ ID NO: 17) e um terceiro iniciador antissenso compreendendo 5 'TTGCAGGCATCTCTGACAAC 3' (SEQ ID NO: 18). Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente contactar a amostra biológica com uma terceira sonda de oligonucleotídeo, em que a terceira sonda de oligonucleotídeo é marcada de forma detectável e compreende 5’ TGGCTCTTGGCGGTCCAGATG 3’ (SEQ ID NO: 19).
[012] Em algumas modalidades dos métodos fornecidos na presente invenção, a amplificação de PCR em tempo real é desempenhada em um disco de amplificação direta em conjunto com um termociclador integrado.
[013] Em algumas modalidades dos métodos fornecidos na presente invenção, a amostra biológica é uma amostra de lavado broncoalveolar, uma amostra de lavagem brônquica, uma amostra de escarro, uma amostra de aspirado ou lavagem nasofaríngea (NP), um swab nasal, ou um isolado bacteriano.
[014] Em um outro aspecto, são fornecidos na presente invenção kits para detectar a presença de pelo menos uma espécie de Legionella em uma amostra biológica, os kits compreendendo, consistindo em, ou consistindo essencialmente em: (a) um primeiro par de iniciadores que amplifica um ácido nucleico alvo ssrA; (b) um segundo par de iniciadores que amplifica um ácido nucleico alvo rRNA 16S; (c) uma primeira sonda de oligonucleotídeo capaz de hibridizar especificamente a um segmento do ácido nucleico alvo ssrA; e (d) uma segunda sonda de oligonucleotídeo capaz de hibridizar especificamente a um segmento do ácido nucleico alvo rRNA 16S; em que a primeira sonda de oligonucleotídeo e a segunda sonda de oligonucleotídeo são marcadas de forma detectável.
[015] Em algumas modalidades dos kits fornecidos na presente invenção, os kits compreendem adicionalmente um terceiro par de iniciadores que amplifica um ácido nucleico alvo controle. Em algumas modalidades, o primeiro par de iniciadores é capaz de hibridizar especificamente a um ácido nucleico alvo ssrA compreendendo nucleotídeos que são pelo menos 85-95% idênticos à SEQ ID NO: 7, ou um complemento do mesmo. Em algumas modalidades, o segundo par de iniciadores é capaz de hibridizar especificamente a um ácido nucleico alvo rRNA 16S compreendendo nucleotídeos que são pelo menos 85-95% idênticos à SEQ ID NO: 8, ou um complemento do mesmo.
[016] Em algumas modalidades dos kits fornecidos na presente invenção, o primeiro par de iniciadores compreende pelo menos um iniciador degenerado. Em algumas modalidades, o primeiro par de iniciadores compreende um primeiro iniciador senso compreendendo 5’ TCGACGTGGGTTGCRAAACG 3’ (SEQ ID NO: 1) ou um complemento do mesmo. Em algumas modalidades, o primeiro par de iniciadores compreende um primeiro iniciador antissenso compreendendo 5’ TATGACCGTTGATTCGATACC 3’ (SEQ ID NO: 2) ou um complemento do mesmo. Em algumas modalidades, o segundo par de iniciadores compreende pelo menos um iniciador degenerado. Em algumas modalidades, o segundo par de iniciadores compreende um segundo iniciador senso compreendendo 5’ TACCTACCCTTGACATACAGTG 3’ (SEQ ID NO: 4) ou um complemento do mesmo. Em algumas modalidades, o segundo par de iniciadores compreende um segundo iniciador antissenso compreendendo 5’ CTTCCTCCGGTTTGTCAC 3’ (SEQ ID NO: 5) ou um complemento do mesmo. Em algumas modalidades, a primeira sonda de ácido nucleico compreende 5’ TAAATATAAATGCAAACGATGAAAACTTTGC 3’ (SEQ ID NO: 3), ou um complemento do mesmo. Em algumas modalidades, a segunda sonda de ácido nucleico compreende 5’ CAACCAGCCGCTGCTGACGGTC 3’ (SEQ ID NO: 9), ou um complemento do mesmo.
[017] Em algumas modalidades dos kits fornecidos na presente invenção, o marcador detectável é um marcador fluorescente. Em algumas modalidades, o marcador fluorescente é selecionado a partir do grupo que consiste em fluoresceína, Cy3, Cy5, Cy5.5 tetracloro-6-car-boxifluoresceína, 2,7-dimetoxi- 4,5-dicloro-6-carboxi-fluoresceína, Yakima Yellow, Texas Red, TYE 563, ROX, TEX 615, TYE 665, TYE 705 e hexacoloro-6-carboxifluoresceína. Em algumas modalidades, pelo menos uma sonda de oligonucleotídeo compreende adicionalmente pelo menos um quencher. Em algumas modalidades, a sonda de oligonucleotídeo compreende dois quenchers. Em algumas modalidades, o quencher é selecionado a partir do grupo que consiste em TAMRA, Black Hole Quencher, Deep Dark Quencher, ZEN, Iowa Black FQ, Iowa Black RQ e DABCYL.
[018] Em um aspecto, é fornecida na presente invenção uma composição compreendendo uma sonda de oligonucleotídeo marcada de forma detectável compreendendo 5’ TAAATATAAATGCAAACGATGAAAACTTTGC 3’ (SEQ ID NO: 3). Em algumas modalidades, o marcador detectável é um marcador fluorescente. Em algumas modalidades, o marcador fluorescente é selecionado a partir do grupo que consiste em fluoresceína, Cy3, Cy5, Cy5.5 tetracloro-6-car- boxifluoresceína, 2,7-dimetoxi-4,5-dicloro-6-carboxi-fluoresceína, Yakima Yellow, Texas Red, TYE 563, ROX, TEX 615, TYE 665, TYE 705 e hexacoloro-6- carboxifluoresceína. Em algumas modalidades, a sonda de oligonucleotídeo compreende adicionalmente pelo menos um quencher. Em algumas modalidades, o quencher é selecionado a partir do grupo que consiste em TAMRA, Black Hole Quencher, Deep Dark Quencher, ZEN, Iowa Black FQ, Iowa Black RQ e DABCYL.
[019] Também são fornecidos na presente invenção métodos para selecionar um indivíduo exibindo sintomas semelhantes aos de pneumonia para tratamento com um agente terapêutico que inibe Legionella pneumophila, os métodos compreendendo, consistindo em, ou consistindo essencialmente em: (a) contactar uma amostra isolada do indivíduo com um primeiro par de iniciadores adequado para amplificar um ácido nucleico alvo ssrA; (b) contactar a amostra com o segundo par de iniciadores adequado para amplificar um ácido nucleico alvo rRNA 16S; (c) amplificar o ácido nucleico alvo ssrA e o ácido nucleico alvo rRNA 16S, se presente; e (d) detectar um ou mais produtos de amplificação produzidos na etapa (c); e (c); e (e) selecionar o indivíduo para tratamento com um agente terapêutico que inibe Legionella pneumophila se for detectado um produto de amplificação para o ácido nucleico alvo rRNA 16S.
[020] Em alguns aspectos, são fornecidos na presente invenção métodos para tratar um indivíduo com infecção por Legionella pneumophila, o método compreendendo, consistindo em, ou consistindo essencialmente em administrar um agente terapêutico que inibe Legionella pneumophila a um indivíduo selecionado um método compreendendo, consistindo em, ou consistindo essencialmente em: (a) contactar uma amostra isolada do indivíduo com um primeiro par de iniciadores adequado para amplificar um ácido nucleico alvo ssrA; (b) contactar a amostra com o segundo par de iniciadores adequado para amplificar um ácido nucleico alvo rRNA 16S; (c) amplificar o ácido nucleico alvo ssrA e o ácido nucleico alvo rRNA 16S, se presente; e (d) detectar um ou mais produtos de amplificação produzidos na etapa (c); e (c); e (e) selecionar o indivíduo para tratamento com um agente terapêutico que inibe Legionella pneumophila se for detectado um produto de amplificação para o ácido nucleico alvo rRNA 16S.
[021] Em algumas modalidades dos métodos fornecidos na presente invenção, o primeiro par de iniciadores compreende pelo menos um iniciador degenerado. Em algumas modalidades, o primeiro par de iniciadores compreende um primeiro iniciador senso compreendendo 5’ TCGACGTGGGTTGCRAAACG 3’ (SEQ ID NO: 1) ou um complemento do mesmo. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o primeiro par de iniciadores compreende um primeiro iniciador antissenso compreendendo 5’ TATGACCGTTGATTCGATACC 3’ (SEQ ID NO: 2) ou um complemento do mesmo. Em algumas modalidades, o segundo par de iniciadores compreende pelo menos um iniciador degenerado. Em algumas modalidades, o segundo par de iniciadores compreende um segundo iniciador senso compreendendo 5’ TACCTACCCTTGACATACAGTG 3’ (SEQ ID NO: 4) ou um complemento do mesmo. Em algumas modalidades, o segundo par de iniciadores compreende um segundo iniciador antissenso compreendendo 5’ CTTCCTCCGGTTTGTCAC 3’ (SEQ ID NO: 5) ou um complemento do mesmo.
[022] Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente contactar a amostra biológica com uma ou mais sondas de oligonucleotídeo capazes de hibridizar especificamente a um produto de amplificação ou um complemento do mesmo. Em algumas modalidades, a sonda de oligonucleotídeo é marcada de forma detectável. Em algumas modalidades, o marcador detectável é um marcador fluorescente. Em algumas modalidades, o marcador fluorescente é selecionado a partir do grupo que consiste em fluoresceína, Cy3, Cy5, Cy5.5 tetracloro-6-car-boxifluoresceína, 2,7-dimetoxi- 4,5-dicloro-6-carboxi-fluoresceína, Yakima Yellow, Texas Red, TYE 563, ROX, TEX 615, TYE 665, TYE 705 e hexacoloro-6-carboxifluoresceína. Em algumas modalidades, a sonda de oligonucleotídeo compreende adicionalmente pelo menos um quencher. Em algumas modalidades, o quencher é selecionado a partir do grupo que consiste em TAMRA, Black Hole Quencher, Deep Dark
Quencher, ZEN, Iowa Black FQ, Iowa Black RQ e DABCYL. Em algumas modalidades, a sonda de oligonucleotídeo hibridiza especificamente a um produto de amplificação de ssrA e em que a sonda de oligonucleotídeo compreende 5’ TAAATATAAATGCAAACGATGAAAACTTTGC 3’ (SEQ ID NO: 3) ou um complemento do mesmo. Em algumas modalidades, a sonda de oligonucleotídeo hibridiza especificamente a um produto de amplificação de rRNA 16S e em que a sonda de oligonucleotídeo compreende 5’ CCAGCATGTGATGGTGGGGACTCTA 3’ (SEQ ID NO: 6) ou um complemento do mesmo.
[023] Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente a mistura de DNA de controle exógeno com a amostra biológica. Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente contactar a amostra biológica com um terceiro par de iniciadores adequado para amplificação de um ácido nucleico alvo controle exógeno e a amplificação do ácido nucleico alvo controle exógeno. Em algumas modalidades, o ácido nucleico alvo controle exógeno compreende SEQ ID NO: 20. Em algumas modalidades, o terceiro par de iniciadores consiste em um terceiro iniciador senso compreendendo 5’ GCTTCAGTACCTTCGGCTTG 3’ (SEQ ID NO: 17) e um terceiro iniciador antissenso compreendendo 5 'TTGCAGGCATCTCTGACAAC 3' (SEQ ID NO: 18). Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente contactar a amostra biológica com uma terceira sonda de oligonucleotídeo, em que a terceira sonda de oligonucleotídeo é marcada de forma detectável e compreende 5’ TGGCTCTTGGCGGTCCAGATG 3’ (SEQ ID NO: 19).
[024] Em algumas modalidades dos métodos fornecidos na presente invenção, a amplificação de PCR em tempo real é desempenhada em um disco de amplificação direta em conjunto com um termociclador integrado.
[025] Em algumas modalidades dos métodos fornecidos na presente invenção, a amostra biológica é uma amostra de lavado broncoalveolar, uma amostra de lavagem brônquica, uma amostra de escarro, uma amostra de aspirado ou lavagem nasofaríngea (NP), um swab nasal, ou um isolado bacteriano.
[026] Em algumas modalidades dos métodos fornecidos na presente invenção, o agente terapêutico que inibe Legionella pneumophila é um ou mais agentes selecionados a partir do grupo que consiste em fluoroquinolonas, carbapenens, antibióticos macrolídeos, sulfametoxazol-trimetoprima, anticorpos específicos contra Legionella pneumophila, e vacinas específicas contra Legionella pneumophila. Em algumas modalidades dos métodos fornecidos na presente invenção, as fluoroquinolonas são selecionadas a partir do grupo que consiste em ciprofloxacino, gemifloxacino, levofloxacino, norfloxacino, ofloxacino, rovafloxacino, gatifloxacino, grepafloxacino, temafloxacino, lomefloxacino, esparfloxacino, enoxacino e moxifloxacino. Em algumas modalidades dos métodos fornecidos na presente invenção, os carbapenens são selecionados a partir do grupo que consiste em imipenem, meropenem, ertapenem, doripenem, panipenem, biapenem, razupenem (PZ- 601), tebipenem, lenapenem, tomopenem e tienpenem (Tienamicina). Em algumas modalidades dos métodos fornecidos na presente invenção, a vacina específica contra Legionella pneumophila é selecionada a partir do grupo que consiste em vacina contra Legionella pneumophila de células inteiras (wP) e vacina contra Legionella pneumophila acelular. Em algumas modalidades dos métodos fornecidos na presente invenção, os antibióticos macrolídeos são selecionados a partir do grupo que consiste em azitromicina (Zithromax), claritromicina (Biaxin), eritromicina (E-Mycin, Eryc, Ery-Tab, PCE, Pediazole, Ilosone), e roxitromicina.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[027] A presente invenção fornece métodos para determinar se um paciente exibindo sintomas semelhantes aos de pneumonia se beneficiará do tratamento com agentes terapêuticos que inibem Legionella sp. e/ou L. pneumophila. Esses métodos são baseados em detectar Legionella sp. e/ou L. pneumophila em uma amostra biológica por ensaio para a presença dos ácidos nucleicos alvo ssrA e de rRNA 16S, respectivamente, usando PCR em tempo real. Em algumas modalidades, os métodos compreendem: (a) fornecer um primeiro par de iniciadores adequado para amplificar um ácido nucleico alvo ssrA; fornecer um segundo par de iniciadores adequado para amplificar um ácido nucleico alvo rRNA 16S; amplificar o ácido nucleico alvo ssrA e o ácido nucleico alvo rRNA 16S, se presente; e detectar um ou mais produtos de amplificação produzidos na etapa (c); em que a presença do ácido nucleico alvo ssrA identifica a presença de pelo menos uma espécie de Legionella, e a presença do ácido nucleico alvo rRNA 16S identifica a presença de Legionella pneumophila. Kits para uso na prática dos métodos também são fornecidos. Definições
[028] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados na presente invenção têm o mesmo significado como comumente entendido por um técnico no assunto ao qual a presente tecnologia pertence.
[029] Conforme usado na presente invenção, a menos que indicado de outra forma, as formas singulares “um”, “uma” e “o/a” incluem referência ao plural. Assim, por exemplo, uma referência a “um oligonucleotídeo” inclui uma pluralidade de moléculas de oligonucleotídeo e uma referência a “um ácido nucleico” é uma referência a um ou mais ácidos nucleicos.
[030] Conforme usado na presente invenção, o termo “cerca de” em referência a um número é geralmente considerado como incluindo números que caem dentro de uma faixa de 1%-10% em qualquer direção (maior ou menor que) do número, a menos que indicado de outra forma ou evidente de outra forma a partir do contexto.
[031] Conforme usado na presente invenção, os termos “amplificar” ou “amplificação” em relação às sequências de ácido nucleico, referem-se a métodos que aumentam a representação de uma população de sequências de ácido nucleico em uma amostra. Cópias de uma sequência de ácido nucleico alvo particular gerada in vitro em uma reação de amplificação são chamados de “amplicons” ou “produtos de amplificação”. A amplificação pode ser exponencial ou linear. Um ácido nucleico alvo pode ser DNA (tal como, por exemplo, DNA genômico e cDNA) ou RNA. Embora os métodos exemplares descritos a seguir se refiram à amplificação usando a reação em cadeia de polimerase (PCR), vários outros métodos, tais como métodos isotérmicos, métodos de círculo rolante etc., são bem conhecidos pelo técnico no assunto. O técnico no assunto entenderá que esses outros métodos podem ser usados no lugar de, ou junto com, métodos de PCR. Vide, por exemplo, Saiki, “Amplification of Genomic DNA” in PCR PROTOCOLS, Innis et al., Eds., Academic Press, San Diego, CA 1990, pp 13-20; Wharam, et al., Nucleic Acids Res. 29(11):E54-E54 (2001).
[032] Uma “mistura de amplificação” conforme usada na presente invenção é uma mistura de reagentes que são usados em uma reação de amplificação de ácido nucleico, mas não contém iniciadores ou amostra. Uma mistura de amplificação compreende um tampão, dNTPs e uma DNA polimerase. Uma mistura de amplificação pode adicionalmente compreender pelo menos um dentre MgCl2, KCl, detergentes não iônicos e iônicos (incluindo detergentes catiônicos).
[033] Uma “mistura principal de amplificação” compreende uma mistura de amplificação e iniciadores para amplificar um ou mais ácidos nucleicos alvo,
mas não contém a amostra a ser amplificada.
[034] Os termos “complemento”, “complementar” ou “complementaridade”, tal como usados na presente invenção com referência a polinucleotídeos (ou seja, uma sequência de nucleotídeos, tal como um oligonucleotídeo ou um ácido nucleico alvo) referem-se às regras de emparelhamento de bases de Watson/Crick. O complemento de uma sequência de ácido nucleico, tal como usado na presente invenção, refere-se a um oligonucleotídeo que, quando alinhado com a sequência de ácido nucleico de modo que a extremidade 5 'de uma sequência seja emparelhada com a extremidade 3' da outra, está em “associação antiparalela”. Por exemplo, a sequência “5'-A-G-T-3 '“ é complementar à sequência “3'-T-C-A-5'.” Certas bases não comumente encontradas em ácidos nucleicos de ocorrência natural podem ser incluídas nos ácidos nucleicos descritos na presente invenção. Estes incluem, por exemplo, inosina, 7-deazaguanina, Ácidos Nucleicos Bloqueados (LNA) e Ácidos Nucleicos Peptídicos (PNA). A complementaridade não precisa ser perfeita; duplexes estáveis podem conter pares de bases incompatíveis, bases degenerativas ou não combinadas. Aqueles técnicos no assunto de tecnologia de ácido nucleico podem determinar a estabilidade de duplex empiricamente considerando uma série de variáveis incluindo, por exemplo, o comprimento do oligonucleotídeo, composição de base e sequência do oligonucleotídeo, força iônica e incidência de pares de bases incompatíveis. Uma sequência de complemento também pode ser uma sequência de RNA complementar à sequência de DNA ou à sua sequência de complemento, e também pode ser um cDNA.
[035] O termo “substancialmente complementar”, tal como usado na presente invenção, significa que duas sequências hibridizam sob condições de hibridização estringentes. O técnico no assunto entenderá que sequências substancialmente complementares não precisam hibridizar ao longo de todos os seus comprimentos. Em particular, as sequências substancialmente complementares podem compreender uma sequência contígua de bases que não hibridizam com uma sequência alvo, posicionada em 3’ ou 5' para uma sequência contígua de bases que hibridizam sob condições de hibridização estringentes com uma sequência alvo.
[036] Tal como usado na presente invenção, um “limiar de ciclo” (Ct) para um analito é o ciclo de PCR no qual o sinal de fluorescência cruza um limiar de fluorescência especificado. O Ct depende da eficiência de reação de amplificação que inclui o número de cópias de modelo inicial, lise de organismo, amplificação por PCR, hibridização ou clivagem de uma sonda fluorogênica e sensibilidade de detecção. O Ct fornece uma medida relativa da concentração do ácido nucleico alvo na reação de PCR. Muitos fatores além da concentração do ácido nucleico alvo podem impactar no valor absoluto de Ct. No entanto, os artefatos da mistura de reação ou do instrumento que alteram as medições de fluorescência associadas ao cálculo de Ct resultarão em alterações independentes de modelo no valor de Ct.
[037] Conforme usado na presente invenção, o termo “detectar” refere-se a determinar a presença de um ácido nucleico alvo na amostra. A detecção não requer que o método forneça 100% de sensibilidade e/ou 100% de especificidade.
[038] Tal como usado na presente invenção, o termo “amplificação direta” refere-se a uma reação de amplificação de ácido nucleico em que o ácido nucleico alvo é amplificado a partir da amostra sem purificação, extração ou concentração prévia.
[039] Tal como usado na presente invenção, o termo “extração” refere-se a qualquer ação realizada para remover ácidos nucleicos a partir de outro material (ácido não nucleico) presente na amostra. O termo extração inclui lise mecânica ou química, adição de detergente ou protease, ou precipitação e remoção de ácidos não nucleicos, tal como proteínas.
[040] O termo “fluoróforo”, tal como usado na presente invenção, refere- se a uma molécula que absorve luz em um determinado comprimento de onda (frequência de excitação) e, subsequentemente, emite luz de um comprimento de onda mais longo (frequência de emissão). O termo “fluoróforo doador”, tal como usado na presente invenção, significa um fluoróforo que, quando em estreita proximidade com uma fração de quencher, doa ou transfere energia de emissão para o quencher. Como resultado da doação de energia para a fração de quencher, o próprio fluoróforo doador emitirá menos luz em uma frequência de emissão particular do que ele teria na ausência de uma fração de quencher posicionada de perto.
[041] O termo “hibridizar”, como usado na presente invenção, refere-se a um processo em que duas fitas de ácido nucleico substancialmente complementares (pelo menos cerca de 65% complementares ao longo de um trecho de pelo menos 14 a 25 nucleotídeos, pelo menos cerca de 75% ou pelo menos cerca de 90% complementares) anelares entre si sob condições apropriadamente estringentes para formar um duplex ou heteroduplex por meio da formação de ligações de hidrogênio entre pares de bases complementares. As hibridizações são tipicamente e preferencialmente conduzidas com moléculas de ácido nucleico de comprimento de sonda, preferencialmente 15-100 nucleotídeos de comprimento, mais preferencialmente 18-50 nucleotídeos de comprimento. As técnicas de hibridização de ácido nucleico são bem conhecidas no estado da técnica. Vide, por exemplo, Sambrook, et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. Hibridização e a força da hibridização (ou seja, a força da associação entre os ácidos nucleicos) é influenciada por tais fatores como o grau de complementaridade entre os ácidos nucleicos, a estringência das condições envolvidas e o ponto de fusão térmico (Tm) do híbrido formado. Os técnicos no assunto entendem como estimar e ajustar a estringência das condições de hibridização de modo que as sequências tendo pelo menos um nível desejado de complementaridade hibridizarão de forma estável, enquanto aquelas com complementaridade inferior não irão. Para exemplos de condições e parâmetros de hibridização, vide, por exemplo, Sambrook, et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.; Ausubel, F. M. et al. 11994, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Secaucus, N.J. Em algumas modalidades, a hibridização específica ocorre sob condições de hibridização estringentes. Um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo (por exemplo, uma sonda ou um iniciador) que é específico para um ácido nucleico alvo irá “hibridizar” com o ácido nucleico alvo sob condições adequadas.
[042] Conforme usado na presente invenção, os termos “indivíduo”, “paciente” ou “sujeito” podem ser um organismo individual, um vertebrado, um mamífero ou um ser humano. Em uma modalidade preferencial, o sujeito, paciente ou indivíduo é um humano.
[043] Tal como usado na presente invenção, o termo “PCR multiplex” refere-se à geração simultânea de dois ou mais produtos de PCR ou amplicons no mesmo recipiente de reação. Cada produto de PCR é iniciado usando um par de iniciador distinto. Uma reação multiplex pode incluir adicionalmente sondas específicas para cada produto que são marcadas com diferentes frações detectáveis.
[044] Tal como usado na presente invenção, “oligonucleotídeo” refere-se a uma molécula que tem uma sequência de bases de ácido nucleico em uma cadeia principal composta principalmente por unidades monoméricas idênticas em intervalos definidos. As bases estão dispostas na cadeia principal de tal forma que podem se ligar a um ácido nucleico tendo uma sequência de bases que são complementares às bases do oligonucleotídeo. Os oligonucleotídeos mais comuns têm uma cadeia principal de unidades de fosfato de açúcar. Uma distinção pode ser feita entre os oligodesoxirribonucleotídeos que não têm um grupo hidroxila na posição 2 'e os oligoribonucleotídeos que têm um grupo hidroxila na posição 2'. Os oligonucleotídeos também podem incluir derivados, nos quais o hidrogênio do grupo hidroxila é substituído por grupos orgânicos, por exemplo, um grupo alila. Os oligonucleotídeos que funcionam como iniciadores ou sondas têm geralmente pelo menos cerca de 10-15 nucleotídeos de comprimento ou até cerca de 70, 100, 110, 150 ou 200 nucleotídeos de comprimento, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 15 a 25 nucleotídeos de comprimento. Os oligonucleotídeos usados como iniciadores ou sondas para amplificar especificamente ou detectar especificamente um determinado ácido nucleico alvo geralmente são capazes de hibridizar especificamente com o ácido nucleico alvo.
[045] Conforme usado na presente invenção, uma “espécie de Legionella” ou “Legionella sp.” refere-se a qualquer organismo microbiano do gênero Legionella. Em algumas modalidades, uma Legionella sp. é patogênica e capaz de causar pneumonia, doença dos legionários, febre de Pontiac ou uma condição relacionada em um indivíduo (por exemplo, um humano). Patógenos específicos incluem, por exemplo, L. anisa, L. birminghamensis, L. bozemanii (sorogrupo 1), L. bozemanii (sorogrupo 2), L. cardiaca, L. cherrii, L. cincinnatiensis, L. clemsonensis, L. dumoffii, L. feeleii (sorogrupo 1), L. feeleii (sorogrupo 2), L. gormanii, L. hackeliae (sorogrupo 1), L. hackeliae (sorogrupo 2), L. jordanis, L. lansingensis, L. longbeachae (sorogrupo 1), L. longbeachae (sorogrupo 2), L.
maceachernii, L. micdadei, L. oakridgensis, L. parisiensis, L. pneumophila (Philadelphia 1), L. pneumophila (Knoxville 1), L. pneumophila (Benidorm 030 E), L. pneumophila (France 5811), L. pneumophila (Allentown 1), L. pneumophila (OLDA), Legionella pneumophila (Oxford 4032 E), Legionella pneumophila (Bellingham), Legionella pneumophila (Heysham 1), Legionella pneumophila (Camperdown 1), Legionella pneumophila (Togus 1), Legionella pneumophila (Bloomington 2), Legionella pneumophila (Los Angeles), L. pneumophila (Portland1), L. pneumophila (Dallas 1E), L. pneumophila (Cambridge 1), L. pneumophila (Chicago 1), L. pneumophila (Chicago 8), L. pneumophila (Concord 3), Legionella pneumophila (IN-23-G1-C2), Legionella pneumophila (Leiden 1), L. pneumophila (797-PA-H), Legionella pneumophila (570-CO-H), Legionella pneumophila (82A3105), Legionella pneumophila (1169-MN-H), Legionella pneumophila (Lansing 3), L. rubrilucens, L. sainthelensi (serogroup 1), L. sainthelensi (serogroup 2), L. tucsonensis, e L. wadsworthii.
[046] Um “ácido nucleico de controle positivo” ou “controle de amplificação positiva interna”, tal como usado na presente invenção, é um ácido nucleico conhecido por estar presente em uma amostra em uma determinada quantidade ou nível. Em algumas modalidades, um ácido nucleico de controle positivo não está naturalmente presente em uma amostra e é adicionado à amostra antes de submeter a mistura de amostra de reação à reação em cadeia de polimerase em tempo real nos métodos revelados para detectar a presença de agentes patogênicos Legionella sp. em uma amostra.
[047] Tal como usado na presente invenção, o termo “iniciador” refere-se a um oligonucleotídeo, que é capaz de atuar como um ponto de iniciação da síntese de sequência de ácido nucleico quando colocado sob condições em que a síntese de um produto de extensão de iniciador que é complementar a uma fita de ácido nucleico alvo é induzida, ou seja, na presença de diferentes trifosfatos de nucleotídeos e uma polimerase em um tampão apropriado (“tampão” inclui pH, força iônica, cofatores, etc.) e em uma temperatura adequada. Um ou mais dos nucleotídeos do iniciador podem ser modificados, por exemplo, pela adição de um grupo metila, uma fração de biotina ou digoxigenina, um marcador fluorescente ou ao usar nucleotídeos radioativos. Uma sequência de iniciador não precisa refletir a sequência exata do modelo. Por exemplo, um fragmento de nucleotídeo não complementar pode ser ligado à extremidade 5’ do iniciador, com o restante da sequência de iniciador sendo substancialmente complementar à fita. O termo iniciador, tal como usado na presente invenção, inclui todas as formas de iniciadores que podem ser sintetizadas incluindo iniciadores de ácido nucleico de peptídeo, iniciadores de ácido nucleico bloqueados, iniciadores modificados com fosforotioato, iniciadores marcados e semelhantes. O termo “iniciador senso”, tal como usado na presente invenção, significa um iniciador que faz anelamento com a fita anti- sentido de DNA de fita dupla (dsDNA). Um “iniciador antissenso” faz anelamento com a fita senso de dsDNA.
[048] Os iniciadores têm tipicamente pelo menos 10, 15, 18 ou 30 nucleotídeos de comprimento ou até cerca de 100, 110, 125 ou 200 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, os iniciadores têm, preferencialmente, entre cerca de 15 a cerca de 60 nucleotídeos de comprimento e, mais preferencialmente, entre cerca de 25 a cerca de 40 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, os iniciadores têm 15 a 35 nucleotídeos de comprimento. Não há comprimento padrão para hibridização ótima ou amplificação da reação em cadeia de polimerase. Um comprimento ótimo para uma aplicação de iniciador particular pode ser facilmente determinado da maneira descrita em H. Erlich, PCR Technology, PRINCIPLES AND APPLICATION FOR DNA AMPLIFICATION, (1989).
[049] Uma “reação de extensão de iniciador” refere-se a uma reação sintética na qual um iniciador de oligonucleotídeo hibridiza a um ácido nucleico alvo e uma cópia complementar do ácido nucleico alvo é produzida pela adição de 3’ dependente de polimerase de nucleotídeos complementares individuais. Em algumas modalidades, a reação de extensão de iniciador é PCR.
[050] Conforme usado na presente invenção, o termo “par de iniciadores” se refere a um par de iniciadores senso e antissenso (ou seja, um par de iniciadores esquerdo e direito) que podem ser usados juntos para amplificar uma determinada região de um ácido nucleico de interesse.
[051] “Sonda”, como utilizado na presente invenção, refere-se ao ácido nucleico que interage com um ácido nucleico alvo através de hibridização. Uma sonda pode ser totalmente complementar a uma sequência de ácido nucleico alvo ou parcialmente complementar. O nível de complementaridade dependerá de muitos fatores baseados, em geral, na função da sonda. As sondas podem ser marcadas ou não marcadas, ou modificadas de uma série de maneiras bem conhecidas no estado da técnica. Uma sonda pode hibridizar especificamente a um ácido nucleico alvo. As sondas podem ser DNA, RNA ou um híbrido de RNA/DNA. As sondas podem ser oligonucleotídeos, cromossomos artificiais, cromossomos artificiais fragmentados, ácido nucleico genômico, ácido nucleico genômico fragmentado, RNA, ácido nucleico recombinante, ácido nucleico recombinante fragmentado, ácido nucleico peptídico (PNA), ácido nucleico bloqueado, oligômero de heterociclos cíclicos ou conjugados de ácido nucléico. As sondas podem compreender nucleobases modificadas, frações de açúcar modificadas e uniões internucleotídicas modificadas. Uma sonda pode ser usada para detectar a presença ou ausência de um ácido nucleico alvo metilado. As sondas têm tipicamente pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 75, 100 nucleotídeos ou mais de comprimento.
[052] Um “elemento de sonda”, tal como usado na presente invenção, se refere a um trecho de nucleotídeos que (a) está associado a um iniciador em que está conectado ou localizado adjacente à sequência de ácido nucleico de iniciador, e (b) hibridiza especificamente sob condições estringentes a uma sequência de ácido nucleico alvo a ser detectada.
[053] Tal como usado na presente invenção, o termo “sistema de detecção iniciador-sonda” refere-se a um método para PCR em tempo real. Em algumas modalidades, o sistema é um sistema de PCR baseado em Taqman e/ou um sistema PCR baseado em SCORPION. Em algumas modalidades, um sistema de detecção iniciador-sonda compreende pelo menos um iniciador senso, pelo menos um iniciador antissenso e pelo menos uma sonda de oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, a sonda de oligonucleotídeo é marcada de forma detectável. Em algumas modalidades, a sonda de oligonucleotídeo compreende um marcador detectável e uma fração de quencher.
[054] O termo “fração de quencher”, tal como usado na presente invenção, significa uma molécula que, em estreita proximidade com um fluoróforo doador, absorve a energia de emissão gerada pelo doador e dissipa a energia como calor ou emite luz de um comprimento de onda mais longo do que o comprimento de onda de emissão do doador. No último caso, o quencher é considerado como sendo um fluoróforo aceitador. A fração quenching pode agir através de quenching proximal (ou seja, colisional) ou por transferência de energia de ressonância de fluorescência (“FRET”) ou Förster. O quenching por FRET é geralmente usado em sondas TaqMan®, enquanto a quenching proximal é usado em sondas do tipo beacon molecular e Scorpion™. Exemplos não limitativos de quenchers incluem TAMRA, Black Hole Quencher, Deep Dark Quencher, ZEN, Iowa Black FQ, Iowa Black RQ e DABCYL.
[055] Uma “mistura de amostra de reação”, conforme usado na presente invenção, se refere a uma mistura contendo uma mistura principal de amplificação e uma amostra.
[056] Conforme usado na presente invenção, o termo “amostra” se refere a amostras clínicas obtidas de um paciente ou microrganismos isolados. Em modalidades preferenciais, uma amostra é obtida a partir de uma fonte biológica (ou seja, uma “amostra biológica”), tal como tecido, fluido corporal ou microrganismos coletados a partir de um indivíduo. As fontes de amostra incluem, mas não estão limitadas a, muco, escarro (processado ou não processado), lavado broncoalveolar (BAL), lavagem brônquica (BW), sangue, fluidos corporais, líquido cefalorraquidiano (CSF), urina, plasma, soro ou tecido (por exemplo, material de biópsia). As fontes de amostra preferenciais incluem BAL, BW e/ou swab de garganta ou lavagens nasais.
[057] O termo “sensibilidade”, tal como usado na presente invenção em referência aos métodos da presente tecnologia, é uma medida da capacidade de um método de detectar uma variante de sequência pré-selecionada em uma população heterogênea de sequências. Um método tem uma sensibilidade de S% para variantes de F% se, dada uma amostra em que a variante de sequência pré-selecionada está presente como pelo menos F% das sequências na amostra, o método pode detectar a sequência pré-selecionada com uma confiança pré- selecionada de C%, S% do tempo. A título de exemplo, um método tem uma sensibilidade de 90% para variantes de 5% se, dada uma amostra em que a sequência variante pré-selecionada está presente como pelo menos 5% das sequências na amostra, o método pode detectar a sequência pré-selecionada com uma confiança pré-selecionada de 99%, 9 de 10 vezes (F = 5%; C = 99%; S = 90%). Sensibilidades exemplares incluem pelo menos 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 e 99%.
[058] O termo “específico”, tal como usado na presente invenção em referência a um iniciador de oligonucleotídeo, significa que a sequência de nucleotídeos do iniciador tem pelo menos 12 bases de identidade de sequência com uma porção do ácido nucleico a ser amplificada quando o oligonucleotídeo e o ácido nucleico estão alinhados. Um iniciador de oligonucleotídeo que é específico para um ácido nucleico é aquele que, sob as condições de hibridização ou lavagem estringentes, é capaz de hibridizar ao alvo de interesse e não hibridizar substancialmente a ácidos nucleicos que não são de interesse. Níveis mais elevados de identidade de sequência são preferenciais e incluem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 85-95% e mais preferencialmente pelo menos 98% de identidade de sequência. A identidade de sequência pode ser determinada usando um programa de computador disponível comercialmente com uma configuração padrão que emprega algoritmos bem conhecidos no estado da técnica. Conforme usado na presente invenção, as sequências que têm “alta identidade de sequência” têm nucleotídeos idênticos em pelo menos cerca de 50% das posições de nucleotídeos alinhadas, preferencialmente pelo menos cerca de 60% das posições de nucleotídeos alinhadas e mais preferencialmente pelo menos cerca de 75% das posições de nucleotídeos alinhadas.
[059] “Especificidade”, tal como usado na presente invenção, é uma medida da capacidade de um método em distinguir uma variante de sequência pré-selecionada que realmente ocorre de artefatos de sequenciamento ou outras sequências intimamente relacionadas. É a capacidade de evitar detecções de falsos positivos. Detecções de falsos positivos podem surgir de erros introduzidos na sequência de interesse durante a preparação da amostra, erro de sequenciamento ou sequenciamento inadvertido de sequências intimamente relacionadas, como pseudo-genes ou membros de uma família de genes. Um método tem uma especificidade de X% se, quando aplicado a um conjunto de amostra de NTotal sequências, em que XVerdadeiro sequências são verdadeiramente variantes e XNão verdadeiro não são verdadeiramente variantes, o método seleciona pelo menos X% da variante não verdadeira como não variante. Por exemplo, um método tem uma especificidade de 90% se, quando aplicado a um conjunto de amostra de 1.000 sequências, em que 500 sequências são verdadeiramente variantes e 500 não são verdadeiramente variantes, o método seleciona 90% das 500 sequências não verdadeiramente variantes como não variante. Especificidades exemplares incluem pelo menos 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 e 99%.
[060] O termo “condições de hibridização estringentes”, tal como usado na presente invenção, se refere a condições de hibridização pelo menos tão estringentes quanto as seguintes: hibridização em 50% de formamida, SSC 5x, NaH2PO4 a 50 mM, pH 6,8, 0,5% de SDS, 0,1 mg/mL de DNA de espermatozoide de salmão sonicado, e 5x solução de Denhart em 42 C durante a noite; lavagem com SSC 2x, 0,1% de SDS a 45 C; e lavagem com 0,2x SSC, 0,1% d SDS a 45 C. Em outro exemplo, as condições de hibridização rigorosas não devem permitir a hibridização de dois ácidos nucleicos que diferem ao longo de um trecho de 20 nucleotídeos contíguos por mais do que duas bases.
[061] Tal como usado na presente invenção, “sistema de detecção PCR TaqMan“ se refere a um método para PCR em tempo real. Neste método, uma sonda TaqMan que hibridiza com o segmento de ácido nucleico amplificado é incluída na mistura principal de amplificação. A sonda TaqMan compreende um fluoróforo doador e um quencher em cada extremidade da sonda e em proximidade suficiente entre si para que a fluorescência do doador seja absorvida pelo quencher. No entanto, quando a sonda hibridiza com o segmento amplificado, a atividade de 5'-exonuclease da polimerase Taq cliva a sonda, assim, permitindo que o fluoróforo doador emita fluorescência que pode ser detectada.
[062] Os termos “ácido nucleico alvo” ou “sequência alvo”, como usados na presente invenção, se referem a uma sequência de ácido nucleico de interesse a ser detectada e/ou quantificada na amostra a ser analisada. O ácido nucleico alvo pode ser composto por segmentos de um cromossomo, um gene completo com ou sem sequência intergênica, segmentos ou porções de um gene com ou sem sequência intergênica, ou sequência de ácidos nucleicos cujas sondas ou iniciadores são projetados. Os ácidos nucleicos alvo podem incluir sequência(s) de tipo selvagem, uma mutação, deleção, inserção ou duplicação, elementos de repetição em tandem, um gene de interesse, uma região de um gene de interesse ou qualquer região a montante ou a jusante das mesmas. Os ácidos nucleicos alvo podem representar sequências alternativas ou alelos de um determinado gene. Os ácidos nucleicos alvo podem ser derivados de DNA genômico, cDNA ou RNA. Coleta e Preparação de Amostras Biológicas
[063] Os métodos e composições da presente tecnologia são úteis na detecção de Legionella sp. patogênicas por ensaio para sequências de ácido nucleico alvo correspondentes aos genes de ssrA e genes de rRNA 16S em uma amostra biológica obtida a partir de um indivíduo. Amostras para detecção de Legionella sp. patogênicas também podem compreender culturas de isolados bacterianos cultivados em meios apropriados para formar colônias, em que as culturas foram preparadas a partir de uma amostra biológica obtida a partir de um indivíduo.
[064] Os métodos revelados na presente invenção são úteis na detecção e quantificação de Legionella sp. patogênicas em amostras biológicas derivadas de sítios estéreis e/ou não estéreis. “Sítios estéreis” incluem fluidos corporais, como sangue completo, plasma, plasma livre de células, urina, líquido cefalorraquidiano, líquido sinovial, líquido pleural, líquido pericárdico, líquido intraocular, biópsias de tecido ou aspirados endotraqueais. tal como usado na presente invenção, “plasma livre de células” se refere a plasma contendo menos de 1% de células em volume. “Sítios não estéreis” incluem escarro, fezes, swabs de pele, swabs inguinais, swabs nasais e swabs de garganta. Em algumas modalidades, as amostras biológicas compreendem aspirados ou swabs de nasofaringe (NP) ou lavagens nasais. Em outras modalidades, as amostras biológicas compreendem culturas de bactérias isoladas cultivadas em meios apropriados para formar colônias. As amostras também podem incluir isolados bacterianos.
[065] Em algumas modalidades, a amostra é transportada ou armazenada em um tubo estéril contendo meio VCM ou M4. O meio VCM compreende Sais Balanceados de Hank, Albumina sérica bovina, L-Cisteína, Gelatina, Sacarose, Ácido L-Glutâmico, Tampão HEPES, Vancomicina, Anfotericina B, Colistina e, opcionalmente, Vermelho de Fenol. O meio M4 compreende gelatina, vancomicina, anfotericina B e colistina.
[066] Uma amostra biológica pode ser suspeita de conter Legionella sp. e/ou ácidos nucleicos patogênicos de uma ou mais Legionella sp patogênica. Além disso, uma amostra biológica pode ser obtida a partir de um indivíduo suspeito de estar infectado com uma ou mais Legionella sp patogênica. A amostra biológica pode ser contatada com uma mistura principal de amplificação para uso em uma plataforma de centrifugação microfluídica/microeletrônica.
[067] Em algumas modalidades, os métodos revelados empregam amostras biológicas não processadas, resultando, assim, em um processo direto e simplificado de amostra-a-resultado. Em outras modalidades, os métodos de detecção revelados na presente invenção serão eficazes se usados em ácido nucleico isolado (DNA ou RNA) purificado a partir de uma amostra biológica de acordo com quaisquer métodos bem conhecidos pelos técnicos no assunto. Se desejado, a amostra pode ser coletada ou concentrada por centrifugação e semelhantes. As células da amostra podem ser submetidas a lise, como por meio de tratamentos com enzimas, surfactantes térmicos, ultrassonicação ou uma combinação dos mesmos. Alternativamente, uma amostra biológica pode ser processada usando um kit de extração de ácido nucleico disponível comercialmente.
[068] Em algumas modalidades, um ou mais pares de iniciadores estão presentes em uma mistura principal de amplificação que compreende adicionalmente DNA polimerase, dNTPs e tampão de PCR antes de contactar com a amostra biológica. A amplificação dos genes de ssrA e genes de rRNA 16S ocorre preferencialmente em um formato multiplex. Alternativamente, também podem ser utilizadas reações de PCR individuais para cada sequência alvo. A amostra biológica pode ser contactada com o(s) par(es) de iniciador(es) e/ou com uma mistura principal de amplificação para formar uma mistura de amostra de reação em um disco de amplificação direta. Por exemplo, a amostra biológica pode ser contatada com a mistura principal de amplificação em um disco de amplificação direta, tal como o Disco de Amplificação Direta comercializado pela Focus Diagnostics, Inc. (Cypress, Califórnia, EUA) como parte dos ensaios de PCR em tempo real SIMPLEXA Direct para trabalhar em conjunto com o Ciclador Integrado 3M. Um disco de amplificação direta é um disco fino e circular contendo várias regiões designadas, cada uma das quais contém um poço para receber uma mixagem principal de amplificação e um poço associado para receber a amostra não processada de paciente. A mistura de reação de amostra é produzida no disco de amplificação direta mediante ou após a adição da mistura principal de amplificação e da amostra.
[069] Em algumas modalidades, a amostra biológica é isolada a partir de um indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo é um mamífero. Em algumas modalidades, o mamífero é um bovino, equino, suíno, felino, canino, murino, símio, rato ou humano. Em algumas modalidades, o indivíduo é um humano. Em modalidades particulares, o indivíduo é um paciente humano com um ou mais sintomas semelhantes aos de pneumonia. PCR em tempo real
[070] A amplificação de ácidos nucleicos alvo pode ser detectada por qualquer um de uma série de métodos bem conhecidos na técnica, tal como eletroforese em gel, cromatografia em coluna, hibridização com uma sonda, sequenciamento, análise de curva de fusão ou detecção “em tempo real”.
[071] Para a detecção em tempo real, os iniciadores e/ou sondas podem ser marcados de forma detectável para permitir diferenças na fluorescência quando os iniciadores são incorporados ou quando as sondas são hibridizadas, por exemplo, e amplificadas em um instrumento capaz de monitorar a mudança na fluorescência durante a reação. Os métodos de detecção em tempo real para amplificação de ácido nucleico são bem conhecidos e incluem, por exemplo, o sistema TaqMan®, sistema de iniciador Scorpion™ e uso de corantes intercalantes para ácido nucleico de fita dupla.
[072] No PCR quantitativo em tempo real, o acúmulo do produto de amplificação é medido continuamente tanto em diluições padrão de DNA alvo quanto em amostras contendo quantidades desconhecidas de DNA alvo. Uma curva padrão é construída ao correlacionar a concentração inicial de modelo nas amostras padrão com o número de ciclos de PCR™ (Ct) necessários para produzir uma concentração limite específica do produto. Nas amostras de teste, o acúmulo de produto PCR™ alvo é medido após o mesmo Ct, o que permite a interpolação da concentração de DNA alvo a partir da curva padrão.
[073] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos amplificados são detectados por hibridização com uma sonda específica. Podem ser usados oligonucleotídeos de sonda, complementares a uma porção da sequência alvo amplificada para detectar fragmentos amplificados. Em algumas modalidades, a hibridização pode ser detectada em tempo real. Em uma modalidade alternativa, a hibridização não é detectada em tempo real. Os ácidos nucleicos amplificados para cada uma das sequências alvo podem ser detectados simultaneamente (ou seja, no mesmo recipiente de reação, tal como PCR multiplex) ou individualmente (ou seja, em recipientes de reação separados). Em certas modalidades, vários ácidos nucleicos alvo são detectados simultaneamente, usando duas ou mais sondas oligonucleotídicas específicas de gene marcadas de forma distinta (por exemplo, através de diferentes frações detectáveis, tais como cor), uma que hibridiza à primeira sequência alvo e a outra que hibridiza com à segunda sequência alvo.
[074] Em algumas modalidades, os diferentes pares de iniciadores são marcados com diferentes frações detectáveis distinguíveis. Assim, por exemplo, os corantes fluorescentes HEX e FAM podem estar presentes em diferentes pares de iniciadores no PCR multiplex e associados aos amplicons resultantes. Em outras modalidades, o iniciador senso é marcado com uma fração detectável, enquanto o iniciador antissenso é marcado com uma fração detectável diferente, por exemplo corante FAM para um iniciador senso e corante HEX para um iniciador antissenso. O uso de diferentes frações detectáveis é útil para discriminar entre produtos amplificados que têm o mesmo comprimento ou são muito semelhantes em comprimento.
[075] Para ácidos nucleicos de sequência modificada, o alvo pode ser selecionado independentemente a partir da fita superior ou da fita inferior. Assim, todos os alvos a serem detectados podem compreender a fita superior, a fita inferior ou uma combinação de alvos de fita superior e de fita inferior.
[076] Um método geral para PCR em tempo real usa sondas fluorescentes, tais como as sondas TaqMan®, beacons moleculares e sondas-iniciador Scorpion. O PCR em tempo real quantifica a quantidade inicial do molde com mais especificidade, sensibilidade e reprodutibilidade do que outras formas de PCR quantitativo, que detectam a quantidade de produto amplificado final. O PCR em tempo real não detecta o tamanho do amplicon. As sondas empregadas nas tecnologias Scorpion™ e TaqMan® são baseadas no princípio de quenching de fluorescência e envolvem um fluoróforo doador e uma fração de quenching.
[077] O PCR em tempo real é desempenhado usando qualquer instrumento adequado capaz de detectar o acúmulo do produto de amplificação de PCR. Mais comumente, o instrumento é capaz de detectar fluorescência a partir de um ou mais marcadores fluorescentes. Por exemplo, a detecção em tempo real no instrumento (por exemplo, um detector de sequência ABI Real-Time PCR System 7500®) monitora a fluorescência e calcula a medida do sinal de repórter, ou valor Rn, durante cada ciclo de PCR. O ciclo limite, ou valor de Ct, é o ciclo no qual a fluorescência intercepta o valor limite. O valor limite pode ser determinado pelo software de sistema de detecção de sequência ou manualmente.
[078] Em algumas modalidades, as sondas empregadas são marcadas de forma detectável e a detecção é realizada pela detecção do marcador de sonda para cada produto de amplificação. Um quencher pode ser adicionalmente associado ao marcador detectável que evita a detecção do marcador antes da amplificação do alvo da sonda. As sondas TaqMan® são exemplos de tais sondas.
[079] Sondas TaqMan® (Heid et al., Genome Res. 6: 986-994, 1996) usam a atividade de exonuclease 5’ fluorogênica da Taq polimerase para medir a quantidade de sequências alvo em amostras de DNA. As sondas TaqMan® são oligonucleotídeos que contêm um fluoróforo doador geralmente em ou próximo da base 5’ e uma fração de quenching tipicamente em ou próximo da base 3'. A fração de quencher pode ser um corante, tal como TAMRA, ou pode ser uma molécula não fluorescente, tal como ácido 4-(4-dimetilaminofenilazo) benzóico (DABCYL). Vide Tyagi et al., 16 Nature Biotechnology 49-53 (1998). Quando irradiado, o doador fluorescente excitado transfere energia para a fração de quenching próxima por FRET em vez de fluorescência. Assim, a proximidade do doador e do quencher evita a emissão de fluorescência de doador enquanto a sonda está intacta.
[080] As sondas TaqMan® são projetadas para anelar a uma região interna de um produto de PCR. Quando a polimerase replica um modelo ao qual uma sonda TaqMan® está ligada, sua atividade de exonuclease 5’ cliva a sonda. Isso termina a atividade do inibidor (sem FRET) e o fluoróforo doador começa a emitir fluorescência que aumenta em cada ciclo proporcional à taxa de clivagem de sonda. O acúmulo de produto de PCR é detectado ao monitorar o aumento da fluorescência do corante repórter. Se o inibidor for um fluoróforo aceptor, então o acúmulo de produto de PCR pode ser detectado ao monitorar a diminuição em fluorescência do fluoróforo aceptor.
[081] Em certas modalidades, o PCR em tempo real é desempenhado usando um sistema de detecção bifuncional de iniciador-sonda (por exemplo, iniciadores Scorpion™). Com os iniciadores Scorpion, a detecção de produto de PCR e iniciação específica de sequência é obtida usando uma única molécula. O iniciador Scorpion mantém uma configuração de haste em laço no estado não hibridizado. O fluoróforo está ligado à extremidade 5 'e é quenched por uma fração acoplada à extremidade 3', embora em certas modalidades, esta disposição possa ser trocada. A porção 3’ da haste e/ou laço também contém a sequência que é complementar ao produto de extensão do iniciador e está ligada à extremidade 5' de um iniciador específico através de um monômero não amplificável. Após a extensão da fração de iniciador, a sequência de sonda específica é capaz de se ligar ao seu complemento dentro do amplicon estendido, assim, abrindo o laço de grampo. Isso evita que a fluorescência seja quenched e um sinal seja observado. Um alvo específico é amplificado pelo iniciador antissenso e a porção de iniciador Scorpion, resultando em um produto de extensão. Um sinal fluorescente é gerado devido à separação do fluoróforo a partir do quencher resultante da ligação do elemento de sonda do iniciador Scorpion ao produto de extensão.
[082] Em algumas modalidades, as sondas empregadas nos métodos revelados compreendem ou consistem em sequências de DNA marcadas com fluorescência curtas projetadas para detectar seções de sequência de DNA com uma variação genética, tal como as reveladas em French et al., Mol Cell Probes, 5(6):363-74 (2001), incorporado em sua totalidade na presente invenção por referência. HyBeacons® são um exemplo desse tipo de sonda.
[083] Em algumas modalidades do método, pelo menos um iniciador de cada par de iniciadores ou pelo menos uma sonda na reação de amplificação compreende uma fração detectável. Alternativamente, a fração detectável pode estar em uma sonda que está ligada ao iniciador, tal como com um iniciador- sonda. Em algumas modalidades, a fração ou marcador detectável é um fluoróforo. As frações fluorescentes adequadas incluem, mas não estão limitadas aos seguintes fluoróforos: Ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatostilbeno- 2,2'disulfônico, acridina e derivados (acridina, isotiocianato de acridina), Alexa Fluors (Alexa Fluor® 350, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® 555, Alexa Fluor® 568, Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 647 (Sondas Moleculares)), ácido 5-(2'-aminoetil) aminonaftaleno-1-sulfônico (EDANS), dissulfonato de 4- amino-N-[3-vinilsulfonil)fenil]naftalimida-3,5 (Lucifer Yellow VS), N-(4-anilino-1- naftil)maleimida, antranilamida, BODIPY® R-6G, BOPIPY® 530/550, BODIPY® FL, Brilliant Yellow, Cal Fluor Red 610® (CFR610), cumarina e derivados (cumarina,
7-amino-4-metilcumarina (AMC, Coumarin 120), 7-amino-4- trifluorometilcouluarina (Coumarin 151)), Cy2®, Cy3®, Cy3.5®, Cy5 ®, Cy5.5®, cianosina, 4',6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI), 5',5”-dibromopirogalol- sulfonaftaleína (Bromopyrogallol Red), 7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4- metilcumarina, pentaacetato de dietilenotriamina, ácido 4,4'- diisotiocianatodiidro-estilbeno-2,2'-dissulfônico, ácido 4,4'- diisotiocianatostilbeno-2,2'-dissulfônico, cloreto de 5-[dimetilamino]naftaleno- 1-sulfonil (DNS, cloreto de dansil), ácido 4-(4'-dimetilaminofenilazo)benzoico (DABCYL), 4-dimetilaminofenilazofenil-4'-isotiocianato (DABITC), EclipseTM (Epoch Biosciences Inc.), eosina e derivados (eosina, isotiocianato de eosina), eritrosina e derivados (eritrosina B, isotiocianato de eritrosina), etídium, fluoresceína e derivados (5-carboxifluoresceína (FAM), 5-(4,6-diclorotriazin-2-il) aminofluoresceína (DTAF), 2',7'-dimetoxi-4'5'-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE), fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC), hexacloro-6- carboxifluoresceína (HEX), QFITC (XRITC), tetraclorofluoresceína (TET), fluorescamina, IR144, IR1446, fósforos de lantamida, isotiocianato de Verde Malaquita, 4-metilumbeliferona, ortocresolftaleína, nitrotirosina, pararosanilina, Vermelho de Fenol, B-ficoeritrina, R-ficoeritrina, aloficocianina, o-ftaldialdeído, Oregon Green®, iodeto de propídio, pireno e derivados (pireno, pireno butirato, 1-pireno butirato succinimidila), QSY® 7, QSY® 9, QSY® 21, QSY® 35 (Sondas Moleculares), Reactive Red 4 (Cibacron® Brilliant Red 3B-A), rodamina e derivados (6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxirodamina (R6G), cloreto de lissamina rodamina B sulfonil, rodamina (Rod), rodamina B, rodamina 123, rodamina verde, isotiocianato de rodamina X, sulforodamina B, sulforodamina 101, drivado de cloreto de sulfonila do sulforodamina 101 (Texas Red), N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA), tetrametil rodamina, isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC), riboflavina, ácido rosólico,
derivados de quelato de térbio, Quasar 670® e VIC®.
[084] Os quenchers adequados são selecionados com base no espectro de fluorescência do fluoróforo particular. Os quenchers úteis incluem, por exemplo, os quenchers Black Hole™ BHQ-1, BHQ 2 e BHQ-3 (Biosearch Technologies, Inc.) e a série ATTO de quenchers (ATTO 540Q, ATTO 580Q e ATTO 612Q; Atto-Tec GmbH).
[085] Em algumas modalidades do método, a mistura de amostra de reação é submetida a condições de reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR) sob as quais cada um dos ácidos nucleicos alvo presentes na amostra biológica é amplificado e o(s) produto(s) amplificado(s) são detectados e medidos. Em algumas modalidades, a amostra biológica é carregada diretamente em um disco de amplificação direta sem uma preparação de espécie de extremidade frontal separada, seguido por detecção de PCR em tempo real e diferenciação de analitos alvo no mesmo disco. Em certas modalidades, a amplificação é desempenhada em um Disco de Amplificação Direta (um disco de 8 poços da Focus Diagnostics, Inc.). Em algumas modalidades, a amplificação de PCR em tempo real é desempenhada usando o ensaio de SIMPLEXA Direct em um disco de amplificação direta e a detecção é desempenhada usando um termociclador integrado, tal como o Ciclador Integrado 3M™ vendido pela 3M (St. Paul, Minn., EUA). O Ciclador Integrado 3M™ pode receber um Disco de Amplificação Direta e é capaz de desempenhar vários ensaios por disco. Este aparelho pode aquecer a >5° C por segundo e resfriar a >4° C por segundo. Os parâmetros de ciclo podem ser variados, dependendo do comprimento dos produtos de amplificação a serem estendidos. Em certas modalidades, um controle de amplificação positiva interna (IPC) pode ser incluído na amostra, utilizando iniciadores, sondas e/ou iniciadores-sondas de oligonucleotídeos.
Métodos Alternativos de Detecção de Ácidos Nucléicos Alvo
[086] Alternativamente, a detecção dos ácidos nucleicos alvo pode ocorrer ao medir a extremidade final da reação. Na detecção de extremidade final, o(s) amplicon(s) pode(m) ser detectado(s) separando primeiro os amplicons por tamanho e, então, detectando os amplicons separados por tamanho. A separação de amplicons de tamanhos diferentes pode ser realizada por eletroforese em gel, cromatografia em coluna, eletroforese capilar ou outros métodos de separação conhecidos no estado da técnica.
[087] O marcador detectável pode ser incorporado, associado ou conjugado a um ácido nucleico. O marcador pode ser ligado por braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o impedimento ou impacto estérico potencial em outras propriedades úteis ou desejadas. Vide, por exemplo., Mansfield, 9 Mol. Cell. Probes 145-156 (1995). Marcadores detectáveis podem ser incorporados em ácidos nucleicos por meios covalentes ou não covalentes, por exemplo, por transcrição, tal como por marcação de iniciador aleatório usando Klenow polimerase, ou tradução de entalhe, ou amplificação, ou equivalente como é conhecido na técnica. Por exemplo, uma base de nucleotídeo é conjugada a uma fração detectável, tal como um corante fluorescente, e então incorporada aos ácidos nucleicos durante síntese ou amplificação do ácido nucleico.
[088] Exemplos de outros marcadores úteis que auxiliam na detecção de ácidos nucleicos alvo incluem radioisótopos (por exemplo, 32P, 35S, 3H, 14C, 125I, 131 I), reagentes densos de elétrons (por exemplo, ouro), enzimas (por exemplo, peroxidase de rábano, beta-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), marcadores colorimétricos (por exemplo, ouro coloidal), marcadores magnéticos (por exemplo, Dynabeads™), biotina, dioxigenina ou haptenos e proteínas para as quais estão disponíveis anti-soros ou anticorpos monoclonais.
Outros marcadores incluem ligantes ou oligonucleotídeos capazes de formar um complexo com o receptor correspondente ou complemento de oligonucleotídeo, respectivamente. O marcador pode ser incorporado diretamente ao ácido nucleico a ser detectado ou pode ser ligado a uma sonda (por exemplo, um oligonucleotídeo) ou anticorpo que hibridiza ou se liga ao ácido nucleico a ser detectado.
[089] Em outras modalidades, análogos de nucleotídeos fluorescentes podem ser usados para marcar ácidos nucleicos, vide, por exemplo, Jameson, Methods. Enzymol. 278: 363-390 (1997); Zhu, Nucl. Acids Res. 22: 3418-3422 (1994). Patentes US 5,652,099 e 6,268,132 também descrevem análogos de nucleosídeos para incorporação em ácidos nucleicos, por exemplo, DNA e/ou RNA, ou oligonucleotídeos, através da síntese enzimática ou química para produzir oligonucleotídeos fluorescentes. A Patente US 5,135,717 descreve reagentes de ftalocianina e tetrabenztriazaporfirina para uso como marcadores fluorescentes.
[090] Em algumas modalidades, as sondas marcadas de forma detectável podem ser usadas em ensaios de hibridização incluindo, mas não se limitando a ensaios de Northern blot, Southern blot, microarranjo, dot blot ou slot blot e ensaios de hibridização in situ, como hibridização fluorescente in situ (FISH) para detectar uma sequência de ácido nucleico alvo em uma amostra biológica. Certas modalidades podem empregar métodos de hibridização para medir a expressão de um produto de gene polinucleotídeo, como mRNA. Os métodos para a condução de ensaios de hibridização de polinucleotídeos foram bem desenvolvidos no estado da técnica. Os procedimentos e condições do ensaio de hibridização variarão dependendo da aplicação e são selecionados de acordo com os métodos de ligação gerais conhecidos, incluindo aqueles referidos em: Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª Ed. Cold Spring
Harbor, NY, 1989); Berger e Kimmel Methods in Enzymology, Vol. 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (Academic Press, Inc., San Diego, Calif, 1987); Young e Davis, PNAS. 80: 1194 (1983). Ensaio de Rastreio de Legionella da Presente Tecnologia
[091] Em várias modalidades da presente invenção, iniciadores e sondas são usados nos métodos descritos na presente invenção para amplificar e detectar sequências de ácido nucleico alvo de espécies de Legionella patogênicas. Em certas modalidades, os ácidos nucleicos alvo podem incluir o gene de ssrA de todas as espécies de Legionella, e o gene de Legionella pneumophila rRNA 16S. Além disso, os iniciadores também podem ser usados para amplificar uma ou mais sequências de ácido nucleico controle.
[092] Os iniciadores e sondas da presente tecnologia são usados nos métodos descritos na presente invenção para amplificar e detectar um ácido nucleico alvo compreendendo SEQ ID NO: 7 correspondendo ao gene de ssrA e um ácido nucleico alvo compreendendo SEQ ID NO: 8 correspondendo ao gene de rRNA 16S. Em uma modalidade, o método envolve empregar pares de iniciadores especificamente direcionados aos genes de ssrA e rRNA 16S. Os ácidos nucleicos alvo descritos na presente invenção podem ser detectados individualmente ou em um formato multiplex, utilizando marcadores individuais para cada alvo.
[093] Iniciadores específicos, sondas e sondas-iniciadores para amplificação e detecção de todos ou um fragmento de um gene marcador específico para L. pneumophila incluem aqueles direcionados a sequências presentes em L. pneumophila, mas ausentes de outras espécies de Legionella. A detecção de um gene específico de L. pneumophila ajuda a distinguir uma amostra contendo L. pneumophila de uma que pode conter outra espécie de Legionella patogênica.
[094] Um gene marcador adequado é o gene de rRNA 16S (vide, por exemplo, GenBank Acesso N°. NC_002942.5) e é mostrado abaixo.
AACTGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCATGCTTAACACATGC AAGTCGAACGGCAGCATTGTCTAGCTTGCTAGACAGATGGCGAGTGGCGAACGGGT GAGTAACGCGTAGGAATATGCCTTGAAGAGGGGGACAACTTGGGGAAACTCAAGCT AATACCGCATAATGTCTGAGGACGAAAGCTGGGGACCTTCGGGCCTGGCGCTTTAAG ATTAGCCTGCGTCCGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAGGGCCTACCAAGGCGACGATC GGTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACT CCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCA ATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTGAGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTGGGGAGGAG GGTTGATAGGTTAAGAGCTGATTAACTGGACGTTACCCACAGAAGAAGCACCGGCTA ACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTG GGCGTAAAGGGTGCGTAGGTGGTTGATTAAGTTATCTGTGAAATTCCTGGGCTTAAC CTGGGACGGTCAGATAATACTGGTTGACTCGAGTATGGGAGAGGGTAGTGGAATTTC CGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGC TACCTGGCCTAATACTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAG ATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCAACTAGCTGTTGGTTATATGAAAATA ATTAGTGGCGCAGCAAACGCGATAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGAT TAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATT CGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACCCTTGACATACAGTGAATTTTGCAGAGATGC ATTAGTGCCTTCGGGAACACTGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTC GTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTATCCTTAGTTGCCAGCAT GTGATGGTGGGGACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGCGGGGA TGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCCG ATACAGAGGGCGGCGAAGGGGCGACCTGGAGCAAATCCTTAAAAGTCGGTCGTAGT CCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAAT CAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGG
GAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGATAGTCTAACCTTCGGGGGGACGTTTACCACGGTG T (SEQ ID NO: 8)
[095] A sequência de ácido nucleico do amplicon de rRNA 16S gerado usando os métodos revelados na presente invenção está sublinhada.
[096] Em algumas modalidades, o ácido nucleico de rRNA 16S alvo compreende 5’
TACCTACCCTTGACATACAGTGAATTTTGCAGAGATGCATTAGTGCCTTCGGGAACAC TGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTC
CCGTAACGAGCGCAACCCTTATCCTTAGTTGCCAGCATGTGATGGTGGGGACTCTAA GGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAG 3’ (SEQ ID NO: 9) ou um fragmento do mesmo.
[097] O iniciador exemplar e as sequências de sonda marcadas para amplificar e detectar o elemento de rRNA 16S incluem: Iniciador senso 5’ TAC CTA CCC TTG ACA TAC AGT G 3’ (SEQ ID NO: 4) Iniciador 5’ CTT CCT CCG GTT TGT CAC 3’ (SEQ ID NO: 5) antissenso 5’ CCA GCA TGT GAT GGT GGG GAC TCT A 3’ (SEQ ID Sonda NO: 6)
[098] O gene de ssrA codifica uma proteína de ligação de tmRNA e está presente em todas Legionella sp. Uma sequência de nucleotídeos exemplificativa não limitativa de ssrA é fornecida em GenBank N° de acesso. AE017354.1 (bp 3213808 a 3214278) e é mostrada abaixo. A sequência de ácido nucleico do amplicon de ssrA gerada usando os métodos revelados na presente invenção está sublinhada:
ATGTGGGCAGAAGTATTATCCAGCGATGCCTTTGCGCGCTTTGAGGAGGAAGGTATT TTCAACCCCAAAACTGGACATGACTTTTTAAAATCCATTCTGGAGGTAGGCGGCTCAA GAAAAGCAGCCGATGCTTTTGTTGAATTCAGAGGAAGACCCGCGACGATTGATGCCT TGCTGCGCCATAACGGGATTTTATAAAAACAGGACTTGCGCCCCCCAATCCTCTCGGT AAAACATTTTTTGCCTTGACCTTGGGGTTTTCCGTAAGTCCTGAAAATATATTCGGTAT GCTGGCGGGATTTTGCTTACATGCCGGCATTTTATGTTATAATTAAAGTGTACAGAAT GGGGGGCGACCTGGCTTCGACGTGGGTTGCAAAACCGGAAGTGCATGCCGAGAAGG AGATCTCTCGTAAATAAGACTCAATTAAATATAAATGCAAACGATGAAAACTTTGCTG GTGGGGAAGCTATCGCTGCCTAATAAGCACTTTAGTTAAACCATCACTGTGTACTGGC CAATAAACCCAGTATCCCGTTCGACCGAGCCCGCTTATCGGTATCGAATCAACGGTCA TAAGAGATAAGCTAGCGTCCTAATCTATCCCGGGTTATGGCGCGAAACTCAGGGAAT CGCTGTGTATCATCCTGCCCGTCGGAGGAGCCACAGTTAAATTCAAAAGACAAGGCT ATGCATGTAGAGCTAAAGGCAGAGGACTTGCGGACGCGGGTTCGATTCCCGCCGCCT CCACCAATTCATTATCCGATACAGTCCAATACCGGGTCTTTCCCAAATACCTGAATCTT CTACACATCTTGTTTATTCCAAACAAACATGATCAAATCACCTCTTTTTGAGGTATGTA TGGACTTAGCAGTTGAAGATACTACAGCATGGTCGGAAGCTATTTTTGGTTCAGTTGC TTTAGGGGATAAACGACTTACTCGTCGGTTAATTCAAATAGGCAAACAATTATCATCG ACGCCTGGTGGTTCTCTTTCAGGAAGTTGTGGAGGGCAGGATGCGCTTATAGAAGGT
AGTTATCGTTTTTTACGAAACAAACGAGTCACAGCGAATCAAATTGCAGAGGGTGGT T (SEQ ID NO: 7)
[099] Em algumas modalidades, o ácido nucleico alvo ssrA compreende 5’
TCGACGTGGGTTGCAAAACCGGAAGTGCATGCCGAGAAGGAGATCTCTCGTAAATAA GACTCAATTAAATATAAATGCAAACGATGAAAACTTTGCTGGTGGGGAAGCTATCGC
TGCCTAATAAGCACTTTAGTTAAACCATCACTGTGTACTGGCCAATAAACCCAGTATCC CGTTCGACCGAGCCCGCTTATCGGTATCGAATCAACGGTCATA 3’ (SEQ ID NO: 10) ou um fragmento do mesmo.
[100] O iniciador exemplar e as sequências de sonda marcadas para amplificar e detectar a sequência alvo de ssrA: Iniciador senso 5’ TCG ACG TGG GTT GCR AAA CG 3’ (SEQ ID NO: 1) 5’ TCG ACG TGG GTT GCA AAA CG 3’ (SEQ ID NO: 11)
5’ TCG ACG TGG GTT GCT AAA CG 3’ (SEQ ID NO: 12) 5’ TCG ACG TGG GTT GCC AAA CG 3’ (SEQ ID NO: 13) 5’ TCG ACG TGG GTT GCG AAA CG 3’ (SEQ ID NO: 14) Iniciador 5’ TAT GAC CGT TGA TTC GAT ACC3’ (SEQ ID NO: 2) antissenso Sonda 5’ TAA ATA TAA ATG CAA ACG ATG AAA ACT TTG C 3’ (SEQ ID NO: 3)
[101] Em algumas modalidades, o ensaio de detecção de ssrA não detecta espécies de bactéria não Legionella. Por exemplo, em algumas modalidades, o ensaio de ssrA compreende iniciadores e sondas de PCR que são específicos para Legionella sp. e não amplificam ácidos nucleicos derivados de um ou mais dos seguintes: Bacillus cereus, Chlamydophila pneumoniae, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumonia, RSV B, Mycoplasma pneumonia, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Moraxella catarrhalis Influenza A, Influenza B, Pseudomonas sp., e Enterobacter sp.
[102] Detecção qualitativa e diferenciação de Legionella sp. e L. pneumophila usando o método revelado pode utilizar pares de iniciadores, sondas marcadas e PCR em tempo real para amplificação e detecção dos genes de ssrA e rRNA 16S em um disco de amplificação direta com um sistema de ciclador integrado. Com este método, o DNA genômico alvo é especificamente amplificado e simultaneamente detectado por sondas marcadas com fluorescência na mesma reação.
[103] Em algumas modalidades, um ou mais dos iniciadores e/ou sondas usadas na presente invenção é um iniciador degenerado ou sonda, o que significa uma mistura de sequências de oligonucleotídeos em que algumas posições contêm um número de bases possíveis, dando uma população de iniciadores com sequências semelhantes que abrangem todas as combinações de nucleotídeos possíveis para uma determinada sequência de proteína. Um nucleotídeo degenerado é designado por um R. Um exemplo não limitativo de um iniciador degenerado é SEQ ID NO: 1.
[104] Em algumas modalidades, um controle positivo compreendendo ácido nucleico derivado de um organismo estoque de L. pneumophila é usado para o ensaio de triagem. Por exemplo, o DNA de controle adequado está disponível a partir de Microbiologics (Cat. # 0211P). Em algumas modalidades, o controle positivo é diluído em um tampão, tal como tampão de TE ou água. Em algumas modalidades, a diluição é de cerca de 1:1.000, 1:10.000, 1:100.000, 1:1.000.000 ou 1:10.000.000 no tampão.
[105] Em algumas modalidades, um controle de amplificação ou extração compreendendo ácido nucleico exógeno é usado para o ensaio de rastreio. Em algumas modalidades, a amostra de controle de amplificação ou extração não compreende ácidos nucleicos derivados de Legionella sp. Por exemplo, DNA de controle adequado está disponível de Diasorin (Cat. # 151599). Em algumas modalidades, o controle de amplificação ou extração é diluído em um tampão, tal como tampão TE ou água. Em algumas modalidades, a diluição é de cerca de 1:1.000, 1:10.000, 1:100.000, 1:1.000.000 ou 1:10.000.000 no tampão. Em algumas modalidades, a amostra de controle de amplificação ou extração é misturada com a amostra biológica antes da amplificação dos ácidos nucleicos alvo.
[106] Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico controle compreende 5’
TAACCCCGCGATAAAGACAGAAGATTATGCATACGAGATCAAAGGAGCCGGCCTTTT CTCTAGAGATCTCTTATTTTCCTTGAAGTCACCTGTTTATGTTAAAGCAGGTGAGCAG GTATACATTCAGTACGATCTGAACAAAAGCAATGCAGAACTTGCTCTCGACTATGGTT TTGTGGAATCAAACCCTAAACGGAACTCATATACTTTAACAATAGAGATACCAGAATC AGACCCATTCTTTGGGGATAAGTTGGATATTGCTGAGAGTAACAAGATGGGTGAGAC CGGATACTTTGACATAGTAGACGGCCAGACTCTTCCCGCTGGTATGCTTCAGTACCTT CGGCTTGTGGCTCTTGGCGGTCCAGATGCTTTCTTATTAGAATCTATCTTCAATAACAC CATATGGGGTCATCTTGAATTGCCTGTAAGTCGTACAAACGAGGAACTCATATGCCGT GTTGTCAGAGATGCCTGCAAATCTGCTCTGTCTGGTTTTGATACGACCATTGAAGAGG
ATGAGAAGCTTCTGGACAAAGGAAAGCTTGAGCCTAGGTTGGAAATGGCTCTCAAG 3’ (SEQ ID NO: 13), e um iniciador senso compreendendo 5’ GCTTCAGTACCTTCGGCTTG 3’ (SEQ ID NO: 17), um iniciador antissenso compreendendo 5’ TTGCAGGCATCTCTGACAAC 3’ (SEQ ID NO: 18) e uma sonda de ácido nucleico marcada de forma detectável compreendendo 5’ TGGCTCTTGGCGGTCCAGATG 3’ (SEQ ID NO: 19) são usados para amplificar a sequência de ácido nucleico controle.
[107] Em algumas modalidades, o ácido nucléico alvo de controle compreende 5’
GCTTCAGTACCTTCGGCTTGTGGCTCTTGGCGGTCCAGATGCTTTCTTATTAGAATCTA
TCTTCAATAACACCATATGGGGTCATCTTGAATTGCCTGTAAGTCGTACAAACGAGGA ACTCATATGCCGTGTTGTCAGAGATGCCTGCAA 3’ (SEQ ID NO: 20).
[108] Em algumas modalidades, um controle negativo que não compreende ácidos nucleicos derivados de Legionella sp. é usado para o ensaio de rastreio. Exemplos não limitativos de um controle negativo adequado incluem água livre de nuclease, água estéril livre de nuclease e tampão de TE.
[109] Por conseguinte, em alguns aspectos, são fornecidos na presente invenção métodos para detectar a presença de pelo menos uma espécie de Legionella em uma amostra biológica, os métodos compreendendo, consistindo em, ou consistindo essencialmente em: (a) fornecer um primeiro par de iniciadores adequado para amplificar um ácido nucleico alvo ssrA; fornecer um segundo par de iniciadores adequado para amplificar um ácido nucleico alvo rRNA 16S; amplificar o ácido nucleico alvo ssrA e o ácido nucleico alvo rRNA 16S, se presente; e detectar um ou mais produtos de amplificação produzidos na etapa (c); em que a presença do ácido nucleico alvo ssrA identifica a presença de pelo menos uma espécie de Legionella, e a presença do ácido nucleico alvo rRNA 16S identifica a presença de Legionella pneumophila. Tratamento para Infecção por Legionella
[110] São revelados na presente invenção métodos para determinar se um paciente exibindo sintomas semelhantes aos de pneumonia se beneficiará do tratamento com agentes terapêuticos que inibem Legionella sp. e/ou L. pneumophila.
[111] Por conseguinte, são fornecidos na presente invenção métodos para selecionar um indivíduo que exibe sintomas semelhantes aos de pneumonia para tratamento com um agente terapêutico que inibe Legionella pneumophila, os métodos compreendendo, consistindo em ou consistindo essencialmente em: (a) contactar uma amostra isolada do indivíduo com um primeiro par de iniciadores adequado para amplificar um ácido nucleico alvo ssrA; (b) contactar a amostra com o segundo par de iniciadores adequado para amplificar um ácido nucleico alvo rRNA 16S; (c) amplificar o ácido nucleico alvo ssrA e o ácido nucleico alvo rRNA 16S, se presente; e (d) detectar um ou mais produtos de amplificação produzidos na etapa (c); e (e) selecionar o indivíduo para tratamento com um agente terapêutico que inibe Legionella pneumophila se for detectado um produto de amplificação para o ácido nucleico alvo rRNA 16S.
[112] Também são fornecidos na presente invenção métodos para tratar um indivíduo com uma infecção por Legionella pneumophila, o método compreendendo, consistindo em, ou consistindo essencialmente em administrar um agente terapêutico que inibe Legionella pneumophila a um indivíduo selecionado, um método compreendendo, consistindo em, ou consistindo essencialmente em: (a) contactar uma amostra isolada do indivíduo com um primeiro par de iniciadores adequado para amplificar um ácido nucleico alvo ssrA; (b) contactar a amostra com o segundo par de iniciadores adequado para amplificar um ácido nucleico alvo rRNA 16S; (c) amplificar o ácido nucleico alvo ssrA e o ácido nucleico alvo rRNA 16S, se presente; e (d) detectar um ou mais produtos de amplificação produzidos na etapa (c); e (e) selecionar o indivíduo para tratamento com um agente terapêutico que inibe Legionella pneumophila se for detectado um produto de amplificação para o ácido nucleico alvo rRNA 16S.
[113] Em algumas modalidades dos métodos fornecidos na presente invenção, o primeiro par de iniciadores compreende pelo menos um iniciador degenerado. Em algumas modalidades, o primeiro par de iniciadores compreende um primeiro iniciador senso compreendendo 5’ TCGACGTGGGTTGCRAAACG 3’ (SEQ ID NO: 1) ou um complemento do mesmo. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o primeiro par de iniciadores compreende um primeiro iniciador antissenso compreendendo 5’ TATGACCGTTGATTCGATACC 3’ (SEQ ID NO: 2) ou um complemento do mesmo. Em algumas modalidades, o segundo par de iniciadores compreende pelo menos um iniciador degenerado. Em algumas modalidades, o segundo par de iniciadores compreende um segundo iniciador senso compreendendo 5’ TACCTACCCTTGACATACAGTG 3’ (SEQ ID NO: 4) ou um complemento do mesmo. Em algumas modalidades, o segundo par de iniciadores compreende um segundo iniciador antissenso compreendendo 5’ CTTCCTCCGGTTTGTCAC 3’ (SEQ ID NO: 5) ou um complemento do mesmo.
[114] Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente contactar a amostra biológica com uma ou mais sondas de oligonucleotídeo capazes de hibridizar especificamente a um produto de amplificação ou um complemento do mesmo. Em algumas modalidades, a sonda de oligonucleotídeo é marcada de forma detectável. Em algumas modalidades, o marcador detectável é um marcador fluorescente. Em algumas modalidades, o marcador fluorescente é selecionado a partir do grupo que consiste em fluoresceína, Cy3, Cy5, Cy5.5 tetracloro-6-car-boxifluoresceína, 2,7-dimetoxi- 4,5-dicloro-6-carboxi-fluoresceína, Yakima Yellow, Texas Red, TYE 563, ROX, TEX 615, TYE 665, TYE 705 e hexacoloro-6-carboxifluoresceína. Em algumas modalidades, a sonda de oligonucleotídeo compreende adicionalmente pelo menos um quencher. Em algumas modalidades, o quencher é selecionado a partir do grupo que consiste em TAMRA, Black Hole Quencher, Deep Dark Quencher, ZEN, Iowa Black FQ, Iowa Black RQ e DABCYL. Em algumas modalidades, a sonda de oligonucleotídeo hibridiza especificamente a um produto de amplificação de ssrA e em que a sonda de oligonucleotídeo compreende 5’ TAAATATAAATGCAAACGATGAAAACTTTGC 3’ (SEQ ID NO: 3) ou um complemento do mesmo. Em algumas modalidades, a sonda de oligonucleotídeo hibridiza especificamente a um produto de amplificação de rRNA 16S e em que a sonda de oligonucleotídeo compreende 5’ CCAGCATGTGATGGTGGGGACTCTA 3’ (SEQ ID NO: 6) ou um complemento do mesmo.
[115] Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente a mistura de DNA de controle exógeno com a amostra biológica. Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente contactar a amostra biológica com um terceiro par de iniciadores adequado para amplificação de um ácido nucleico alvo controle exógeno e a amplificação do ácido nucleico alvo controle exógeno. Em algumas modalidades, o ácido nucleico alvo controle exógeno compreende SEQ ID NO: 20. Em algumas modalidades, o terceiro par de iniciadores consiste em um terceiro iniciador senso compreendendo 5’
GCTTCAGTACCTTCGGCTTG 3’ (SEQ ID NO: 17) e um terceiro iniciador antissenso compreendendo 5 'TTGCAGGCATCTCTGACAAC 3' (SEQ ID NO: 18). Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente contactar a amostra biológica com uma terceira sonda de oligonucleotídeo, em que a terceira sonda de oligonucleotídeo é marcada de forma detectável e compreende 5’ TGGCTCTTGGCGGTCCAGATG 3’ (SEQ ID NO: 19).
[116] Em algumas modalidades dos métodos fornecidos na presente invenção, a amplificação de PCR em tempo real é desempenhada em um disco de amplificação direta em conjunto com um termociclador integrado.
[117] Em algumas modalidades dos métodos fornecidos na presente invenção, a amostra biológica é uma amostra de lavado broncoalveolar, uma amostra de lavagem brônquica, uma amostra de escarro, uma amostra de aspirado ou lavagem nasofaríngea (NP), um swab nasal, ou um isolado bacteriano.
[118] Exemplos de agentes terapêuticos que inibem Legionella sp. e/ou L. pneumophila incluem fluoroquinolonas, carbapenens, sulfametoxazol- trimetoprima (por exemplo, Bactrim, Septra) e anticorpos específicos de L. pneumophila. Em algumas modalidades, as fluoroquinolonas são selecionadas a partir do grupo que consiste em ciprofloxacino, gemifloxacino, levofloxacino, norfloxacino, ofloxacino, rovafloxacino, gatifloxacino, grepafloxacino, temafloxacino, lomefloxacino, esparfloxacino, enoxifloxacino e moxifloxacino. Em certas modalidades, os carbapenens são selecionados a partir do grupo que consiste em imipenem, meropenem, ertapenem, doripenem, panipenem, biapenem, razupenem (PZ-601), tebipenem, lenapenem, tomopenem e tienpenem (Tienamicina).
[119] Exemplos de agentes terapêuticos que inibem Legionella sp. e/ou L. pneumophila incluem Legionella sp. de célula inteira (wP) e/ou vacina de L.
pneumophila, Legionella sp. acelular e/ou vacina de L. pneumophila, sulfametoxazol-trimetoprima (por exemplo, Bactrim, Septra), telitromicina e antibióticos macrólidos. Em algumas modalidades, os antibióticos macrolídeos são selecionados a partir do grupo consistindo em azitromicina (Zithromax), claritromicina (Biaxin), eritromicina (E-Mycin, Eryc, Ery-Tab, PCE, Pediazol, Ilosone) e roxitromicina.
[120] Exemplos de agentes terapêuticos adicionais que inibem Legionella sp. e/ou L. pneumophila incluem sulfametoxazol-trimetoprima (por exemplo., Bactrim, Septra), ciprofloxacino, gemifloxacino, levofloxacino, norfloxacino, ofloxacino, rovafloxacino, gatifloxacino, grepafloxacino, temafloxacino, lomefloxacino, esparfloxacino, enoxacino e moxifloxacino.
[121] Sintomas semelhantes aos da pneumonia incluem, mas não estão limitados a dor no peito, confusão, mudanças na consciência mental, tosse, catarro, fadiga, febre, sudorese, tremores, calafrios, temperatura corporal inferior ao normal, náuseas, vômitos, diarreia, falta de ar, inflamação dos pulmões e fluido nos pulmões.
[122] Em algumas modalidades, o indivíduo é um mamífero. Em algumas modalidades, o mamífero é um bovino, equino, porcino, felino, canino, murino, símio, rato ou humano. Em algumas modalidades, o indivíduo é um humano. Em modalidades particulares, o indivíduo é um paciente humano com um ou mais sintomas semelhantes aos de pneumonia. Interpretação de Resultados
[123] Ao submeter as misturas de reação de amostra a PCR em tempo real e detectar e medir os sinais de fluorescência associados com as sequências alvo de controle, rRNA 16S e ssrA amplificado, os métodos da presente tecnologia fornecem ainda um algoritmo para determinar a presença de uma ou mais Legionella sp. patogênicas relacionadas, que fornece os resultados finais ao combinar o limite de ciclo (Ct) a partir das sequências de ácido nucleico alvo amplificadas.
[124] Em algumas modalidades, um Ct positivo é um Ct menor ou igual a cerca de 35, cerca de 36, cerca de 37, cerca de 38, cerca de 39 ou cerca de 40 para uma reação compreendendo 40 ciclos. Em algumas modalidades, um Ct negativo é um Ct maior que cerca de 35, cerca de 36, cerca de 37 ou cerca de 38, cerca de 39 ou um Ct de cerca de 40 para uma reação compreendendo 40 ciclos. Em algumas modalidades, um Ct positivo é um Ct menor ou igual a cerca de 40, cerca de 41, cerca de 42, cerca de 43, cerca de 44 ou cerca de 45 para uma reação compreendendo 45 ciclos. Em algumas modalidades, um Ct negativo é um Ct maior que cerca de 40, cerca de 41, cerca de 42, cerca de 43 ou cerca de 44 ou um Ct de cerca de 45 para uma reação compreendendo 45 ciclos. Em algumas modalidades, um Ct positivo é um Ct menor ou igual a cerca de 45, cerca de 46, cerca de 47, cerca de 48, cerca de 49 ou cerca de 50 para uma reação compreendendo 50 ciclos. Em algumas modalidades, um Ct negativo é um Ct maior que cerca de 45, cerca de 46, cerca de 47, cerca de 48 ou cerca de 49 ou um Ct de cerca de 50 para uma reação compreendendo 50 ciclos.
[125] O algoritmo de Legionella sp. dita: Controle negativo Se o resultado for... Então… Positivo (por exemplo, um valor de Ct O controle é inválido. Isso indica <40) e com uma curva de possível contaminação das amostras amplificação válida preparadas. Negativo (por exemplo, um valor Ct O controle é válido. indeterminado e IPC Ct está no intervalo) Controle Positivo
Se o resultado for... Então… Negativo ou fora do intervalo Possível inibição ou formulação inadequada da mastermix. O controle é inválido. Positivo e dentro do intervalo O controle é válido.
[126] Consequentemente, a presença ou ausência de Legionella sp. patogênica em uma amostra biológica pode ser determinada com base nos seguintes cenários: Se o resultado for... Então… Positivo para ssrA (por exemplo, Ct < A amostra compreende uma espécie 37) e negativo para rRNA 16S (por de Legionella diferente de L. exemplo, Ct > 37) pneumophila Positivo para ssrA (por exemplo, Ct < A amostra compreende L. 37) e rRNA 16S positivo (por pneumophila exemplo, Ct < 37) Negativo para ssrA (por exemplo, Ct > A amostra não compreende uma 37) e negativo para rRNA 16S (por espécie de Legionella exemplo, Ct > 37) Kits e Composições
[127] A presente invenção também fornece kits para detectar sequências de ácido nucleico alvo correspondentes a espécies de Legionella patogênicas.
[128] Por conseguinte, são fornecidos na presente invenção kits para detectar a presença de pelo menos uma espécie de Legionella em uma amostra biológica, os kits compreendendo, consistindo em, ou consistindo essencialmente em: (a) um primeiro par de iniciadores que amplifica um ácido nucleico alvo ssrA; (b) um segundo par de iniciadores que amplifica um ácido nucleico alvo rRNA 16S; (c) uma primeira sonda de oligonucleotídeo capaz de hibridizar especificamente a um segmento do ácido nucleico alvo ssrA; e (d) uma segunda sonda de oligonucleotídeo capaz de hibridizar especificamente a um segmento do ácido nucleico alvo rRNA 16S; em que a primeira sonda de oligonucleotídeo e a segunda sonda de oligonucleotídeo são marcadas de forma detectável.
[129] Em algumas modalidades dos kits fornecidos na presente invenção, os kits compreendem adicionalmente um terceiro par de iniciadores que amplifica um ácido nucleico alvo controle. Em algumas modalidades, o primeiro par de iniciadores é capaz de hibridizar especificamente a um ácido nucleico alvo ssrA compreendendo nucleotídeos que são pelo menos 85-95% idênticos à SEQ ID NO: 7, ou um complemento do mesmo. Em algumas modalidades, o segundo par de iniciadores é capaz de hibridizar especificamente a um ácido nucleico alvo rRNA 16S compreendendo nucleotídeos que são pelo menos 85-95% idênticos à SEQ ID NO: 8, ou um complemento do mesmo.
[130] Em algumas modalidades dos kits fornecidos na presente invenção, o primeiro par de iniciadores compreende pelo menos um iniciador degenerado. Em algumas modalidades, o primeiro par de iniciadores compreende um primeiro iniciador senso compreendendo 5’ TCGACGTGGGTTGCRAAACG 3’ (SEQ ID NO: 1) ou um complemento do mesmo. Em algumas modalidades, o primeiro par de iniciadores compreende um primeiro iniciador antissenso compreendendo 5’ TATGACCGTTGATTCGATACC 3’ (SEQ ID NO: 2) ou um complemento do mesmo. Em algumas modalidades, o segundo par de iniciadores compreende pelo menos um iniciador degenerado. Em algumas modalidades, o segundo par de iniciadores compreende um segundo iniciador senso compreendendo 5’ TACCTACCCTTGACATACAGTG 3’ (SEQ ID NO: 4) ou um complemento do mesmo. Em algumas modalidades, o segundo par de iniciadores compreende um segundo iniciador antissenso compreendendo 5’
CTTCCTCCGGTTTGTCAC 3’ (SEQ ID NO: 5) ou um complemento do mesmo. Em algumas modalidades, a primeira sonda de ácido nucleico compreende 5’ TAAATATAAATGCAAACGATGAAAACTTTGC 3’ (SEQ ID NO: 3), ou um complemento do mesmo. Em algumas modalidades, a segunda sonda de ácido nucleico compreende 5’ CAACCAGCCGCTGCTGACGGTC 3’ (SEQ ID NO: 9), ou um complemento do mesmo.
[131] Em algumas modalidades dos kits fornecidos na presente invenção, o marcador detectável é um marcador fluorescente. Em algumas modalidades, o marcador fluorescente é selecionado a partir do grupo que consiste em fluoresceína, Cy3, Cy5, Cy5.5 tetracloro-6-car-boxifluoresceína, 2,7-dimetoxi- 4,5-dicloro-6-carboxi-fluoresceína, Yakima Yellow, Texas Red, TYE 563, ROX, TEX 615, TYE 665, TYE 705 e hexacoloro-6-carboxifluoresceína. Em algumas modalidades, pelo menos uma sonda de oligonucleotídeo compreende adicionalmente pelo menos um quencher. Em algumas modalidades, a sonda de oligonucleotídeo compreende dois quenchers. Em algumas modalidades, o quencher é selecionado a partir do grupo que consiste em TAMRA, Black Hole Quencher, Deep Dark Quencher, ZEN, Iowa Black FQ, Iowa Black RQ e DABCYL.
[132] Os kits da presente tecnologia compreendem pelo menos dois oligonucleotídeos que podem servir como iniciadores ou sondas-iniciador para amplificar sequências de ácido nucleico alvo ssrA e rRNA 16S para determinar a presença de Legionella sp. patogênica em uma amostra biológica.
[133] Em algumas modalidades, o kit compreende meio líquido contendo pelo menos uma sonda de ácido nucleico específico de alvo em uma concentração de 250 nM ou menos. Com tal kit, as sondas são fornecidas na quantidade necessária para desempenhar reações de detecção multiplex confiáveis de acordo com a presente tecnologia. Em algumas modalidades, as sondas de ácido nucleico específicas de alvo são marcadas de forma detectável.
[134] Em algumas modalidades, os kits compreendem adicionalmente tampões, enzimas tendo atividade de polimerase, enzimas tendo atividade de polimerase e sem atividade de exonuclease de 5'→3’ ou ambos 5'→3’ e atividade de exonuclease de 3'→5’, cofatores de enzima, tal como magnésio ou manganês, sais, nucleotídeos de extensão de cadeia, tal como desoxinucleosídeos trifosfato (dNTPs), dNTPs modificados, dNTPs resistentes a nuclease ou dNTPs marcados, necessários para realizar um ensaio ou reação, tal como amplificação e/ou detecção de sequências de ácido nucleico alvo correspondentes a espécies de Legionella patogênicas.
[135] Em uma modalidade, os kits da presente tecnologia compreendem adicionalmente uma sequência de ácido nucleico de controle positivo e uma sequência de ácido nucleico de controle negativo para garantir a integridade do ensaio durante as execuções experimentais. Um kit pode conter adicionalmente um meio para comparar o número de cópias de um ou mais de ssrA e rRNA 16S em uma amostra biológica com uma amostra de ácido nucleico de referência (por exemplo, uma amostra tendo um número de cópia conhecido para um ou mais de ssrA e rRNA 16S). O kit também pode compreender instruções para uso, software para análise automatizada, recipientes, embalagens, tal como embalagens destinadas à venda comercial e semelhantes.
[136] O kit pode compreender adicionalmente um ou mais de: tampões de lavagem e/ou reagentes, tampões de hibridização e/ou reagentes, tampões de marcação e/ou reagentes e meios de detecção. Os tampões e/ou reagentes são geralmente otimizados para a técnica de amplificação/detecção específica para a qual o kit se destina. Protocolos para usar esses tampões e reagentes para desempenhar diferentes etapas do procedimento também podem ser incluídos no kit.
[137] O kit, adicionalmente, pode compreender um cartão de varredura de definição de ensaio e/ou instruções, tais como instruções impressas ou eletrônicas para usar os oligonucleotídeos em um ensaio. Em algumas modalidades, um kit compreende uma mistura de reação de amplificação ou uma mistura principal de amplificação. Os reagentes incluídos no kit podem estar contidos em um ou mais recipientes, tais como um vial.
[138] Iniciadores, sondas e/ou iniciador-sondas específicos para amplificação e detecção de controle interno de DNA podem ser incluídos na mistura principal de amplificação tal como os pares de iniciadores alvo para monitorar a inibição de PCR em potencial. Os reagentes necessários para a amplificação e a detecção de alvos e controle interno podem ser formulados como uma mistura principal de amplificação tudo-em-um, que pode ser fornecida como alíquotas de reação única em um kit.
[139] Em um aspecto, é fornecida na presente invenção uma composição compreendendo, consistindo em, ou consistindo essencialmente em uma sonda de oligonucleotídeo marcada de forma detectável compreendendo 5’ TAAATATAAATGCAAACGATGAAAACTTTGC 3’ (SEQ ID NO: 3). Em algumas modalidades, o marcador detectável é um marcador fluorescente. Em algumas modalidades, o marcador fluorescente é selecionado a partir do grupo que consiste em fluoresceína, Cy3, Cy5, Cy5.5 tetracloro-6-car-boxifluoresceína, 2,7- dimetoxi-4,5-dicloro-6-carboxi-fluoresceína, Yakima Yellow, Texas Red, TYE 563, ROX, TEX 615, TYE 665, TYE 705 e hexacoloro-6-carboxifluoresceína. Em algumas modalidades, a sonda de oligonucleotídeo compreende adicionalmente pelo menos um quencher. Em algumas modalidades, o quencher é selecionado a partir do grupo que consiste em TAMRA, Black Hole Quencher, Deep Dark Quencher, ZEN, Iowa Black FQ, Iowa Black RQ e DABCYL.
[140] Em outro aspecto, é fornecida na presente invenção uma composição compreendendo uma sonda de oligonucleotídeo marcada de forma detectável compreendendo 5’ TAAATATAAATGCAAACGATGAAAACTTTGC 3’ (SEQ ID NO: 3). Em algumas modalidades, o marcador detectável é um marcador fluorescente. Em algumas modalidades, o marcador fluorescente é selecionado a partir do grupo que consiste em fluoresceína, Cy3, Cy5, Cy5.5 tetracloro-6-car- boxifluoresceína, 2,7-dimetoxi-4,5-dicloro-6-carboxi-fluoresceína, Yakima Yellow, Texas Red, TYE 563, ROX, TEX 615, TYE 665, TYE 705 e hexacoloro-6- carboxifluoresceína. Em algumas modalidades, a sonda de oligonucleotídeo compreende adicionalmente pelo menos um quencher. Em algumas modalidades, o quencher é selecionado a partir do grupo que consiste em TAMRA, Black Hole Quencher, Deep Dark Quencher, ZEN, Iowa Black FQ, Iowa Black RQ e DABCYL.
EXEMPLOS Exemplo 1: Detecção de espécies de Legionella patogênicas usando PCR em tempo real
[141] Amostras de lavado broncoalveolar são coletadas de pacientes. Um alvo de DNA de controle positivo interno é adicionado ao tampão de lise externo antes da extração. O DNA é extraído usando o instrumento MagNA Pure 96, usando o kit “DNA/Viral NA SV 2.0”. O volume de eluição está definido para 50.
[142] Um mastermix de PCR de Legionella é criado compreendendo os seguintes reagentes e armazenado a -10˚C a -90˚C: Unidade de medida Concentração final μL por reação (1000 rxns) por reação Água esterilizada 1,45 1,45 mL sem nuclease Iniciador senso de 0,125 125 μL 500 nM ssrA (100 μM) Iniciador antissenso 0,125 125 μL 500 nM de ssrA (100 μM)
Unidade de medida Concentração final μL por reação (1000 rxns) por reação Sonda de ssrA (100 0,05 25 μL 100 nM μM) Iniciador senso de 0,125 125 μL 500 nM 16S (100 μM) Iniciador antissenso 0,125 125 μL 500 nM de 16S (100 μM) Sonda 16S (100 μM) 0,05 25 μL 100 nM Par de Iniciadores de Controle de DNA 0,5 500 μL 1X Focus (SC #151600) TaqPath qPCR 12,5 12,5 mL 1X Mixes, CG Total 15μL 15 mL
[143] O PCR em tempo real é realizado usando as seguintes condições: i) pré-aquecimento de amostra a 50° C, 120 segundos, 1 ciclo ii) ativação da polimerase a 95° C, 10 minutos, 1 ciclo e iii) Desnaturação a 95° C, 15 segundos e anelamento a 60° C, 35 segundos por 40 ciclos.
[144] O DNA genômico alvo é especificamente amplificado e simultaneamente detectado por sondas marcadas com fluorescência na mesma reação. O Ct é detectado e os resultados são analisados de acordo com o seguinte algoritmo: Se o resultado for... Então… Positivo para ssrA (Ct < 37) e negativo para A amostra compreende uma espécie de rRNA 16S (Ct > 37) Legionella diferente de L. pneumophila Positivo para ssrA (Ct < 37) e positivo para A amostra compreende L. pneumophila rRNA 16S (Ct < 37) Negativo para ssrA (Ct > 37) e negativo para A amostra não compreende uma espécie de rRNA 16S (Ct > 37) Legionella
Exemplo 2: Reatividade cruzada do Ensaio Legionella Multiplex.
[145] Para ensaios de reatividade cruzada, os espécimes de swab nasais de controle serão enriquecidos com um dos organismos de teste listados abaixo (n=5 para cada organismo). Bacillus cereus Chlamydophila pneumoniae Haemophilus influenzae Klebsiella pneumonia RSV B Mycoplasma pneumonia Streptococcus pneumoniae Staphylococcus aureus Moraxella catarrhalis Influenza A Influenza B Pseudomonas sp. Enterobacter sp.
[146] O ensaio multiplex de Legionella será desempenhado em cada amostra. Em cada caso, um valor de Ct ≤ 40 é interpretado tal como um resultado positivo para reatividade cruzada de Legionella, um valor de Ct ≤ 40 é interpretado como um resultado positivo para reatividade cruzada de Legionella, e um valor de Ct ≤ 40 é interpretado como um resultado positivo para reatividade cruzada de Legionella.
[147] Prevê-se que nenhuma reatividade cruzada será observada para qualquer uma das espécies microbianas acima.
EQUIVALENTES
[148] A presente tecnologia não deve ser limitada em termos das modalidades particulares descritas neste pedido, que se destinam a ser ilustrações únicas de aspectos individuais da presente tecnologia. Muitas modificações e variações desta presente tecnologia podem ser feitas sem se afastar de seu espírito e escopo, como será evidente para os técnicos no assunto. Métodos e aparelhos funcionalmente equivalentes dentro do escopo da presente tecnologia, além daqueles enumerados na presente invenção, serão evidentes para os técnicos no assunto a partir das descrições anteriores. Tais modificações e variações destinam-se a cair dentro do escopo da presente tecnologia. Deve ser entendido que esta presente tecnologia não está limitada a métodos, reagentes, composições de compostos ou sistemas biológicos particulares, que podem, é claro, variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada na presente invenção tem a finalidade de descrever apenas modalidades particulares e não se destina a ser limitante.
[149] Os termos “compreendendo”, “incluindo”, “contendo”, etc. devem ser lidos de maneira expansiva e sem limitação. Além disso, os termos e expressões empregados na presente invenção foram usados como termos de descrição e não de limitação, e não há intenção no uso de tais termos e expressões de excluir quaisquer equivalentes dos recursos mostrados e descritos ou partes deles, mas é reconhecido que várias modificações são possíveis dentro do escopo da invenção reivindicada.
[150] Além disso, onde as características ou aspectos da invenção são descritos em termos de grupos Markush, os técnicos no assunto reconhecerão que a invenção também é assim descrita em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo Markush.
[151] Como será entendido por um técnico no assunto, para todos e quaisquer fins, particularmente em termos de fornecer uma descrição escrita, todos os intervalos revelados na presente invenção também abrangem todos e quaisquer subintervalos possíveis e combinações de subfaixas dos mesmos. Qualquer faixa listada pode ser facilmente reconhecida como descrevendo suficientemente e permitindo que a mesma faixa seja dividida em pelo menos metades iguais, terços, quartos, quintos, décimos, etc. Como um exemplo não limitativo, cada faixa discutida na presente invenção pode ser facilmente dividida em um terço inferior, terço médio e terço superior etc. Como também será entendido por um técnico no assunto, todas as linguagens, como “até”, “pelo menos”, “maior que”, “menor que” e semelhantes, incluem o número recitado e se referem a faixas que podem ser subsequentemente divididas em subfaixas, conforme discutido acima. Finalmente, como será entendido por um técnico no assunto, uma faixa inclui cada membro individual. Assim, por exemplo, um grupo com 1 a 3 células refere-se a grupos com 1, 2 ou 3 células. Da mesma forma, um grupo com 1 a 5 células refere-se a grupos com 1, 2, 3, 4 ou 5 células e assim por diante.
[152] Todas as patentes, pedidos de patentes, pedidos provisórios e publicações referidas ou citadas na presente invenção são incorporados por referência em sua totalidade, incluindo todas as figuras e tabelas, na medida em que não sejam inconsistentes com os ensinamentos explícitos deste relatório descritivo.

Claims (71)

REIVINDICAÇÕES
1. Um método para detectar a presença de pelo menos uma espécie de Legionella em uma amostra biológica, o método compreendendo: (a) fornecer um primeiro par de iniciadores adequado para amplificar um ácido nucleico alvo de ssrA; (b) fornecer um segundo par de iniciadores adequado para amplificar um ácido nucleico alvo de rRNA 16S; (c) amplificar o ácido nucleico alvo de ssrA e o ácido nucleico alvo de rRNA 16S, se presente; e (d) detectar um ou mais produtos de amplificação produzidos na etapa (c); em que a presença do ácido nucleico alvo de ssrA identifica a presença de pelo menos uma espécie de Legionella, e a presença do ácido nucleico alvo de rRNA 16S identifica a presença de Legionella pneumophila.
2. O método da reivindicação 1, em que o primeiro par de iniciadores compreende pelo menos um iniciador degenerado.
3. O método da reivindicação 1 ou 2, em que o primeiro par de iniciadores compreende um primeiro iniciador senso compreendendo 5’ TCGACGTGGGTTGCRAAACG 3’ (SEQ ID NO: 1) ou um complemento do mesmo.
4. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o primeiro par de iniciadores compreende um primeiro iniciador antissenso compreendendo 5’ TATGACCGTTGATTCGATACC 3’ (SEQ ID NO: 2) ou um complemento do mesmo.
5. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o segundo par de iniciadores compreende pelo menos um iniciador degenerado.
6. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o segundo par de iniciadores compreende um segundo iniciador senso compreendendo 5’ TACCTACCCTTGACATACAGTG 3’ (SEQ ID NO: 4) ou um complemento do mesmo.
7. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o segundo par de iniciadores compreende um segundo iniciador antissenso compreendendo 5’ CTTCCTCCGGTTTGTCAC 3’ (SEQ ID NO: 5) ou um complemento do mesmo.
8. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo adicionalmente contactar a amostra biológica com uma ou mais sondas de oligonucleotídeo capazes de hibridizar especificamente a um produto de amplificação ou um complemento do mesmo.
9. O método da reivindicação 8, em que a sonda de oligonucleotídeo é marcada de forma detectável.
10. O método da reivindicação 9, em que o marcador detectável é um marcador fluorescente.
11. O método da reivindicação 10, em que o marcador fluorescente é selecionado a partir do grupo que consiste em fluoresceína, Cy3, Cy5, Cy5.5 tetracloro-6-car-boxifluoresceína, 2,7-dimetóxi-4,5-dicloro-6-carboxi- fluoresceína, Yakima Yellow, Texas Red, TYE 563, ROX, TEX 615, TYE 665, TYE 705 e hexacloro-6-carboxifluoresceína.
12. O método da reivindicação 10, em que a sonda de oligonucleotídeo compreende adicionalmente pelo menos um quencher.
13. O método da reivindicação 12, em que o quencher é selecionado a partir do grupo que consiste em TAMRA, Black Hole Quencher, Deep Dark Quencher, ZEN, Iowa Black FQ, Iowa Black RQ e DABCYL.
14. O método de qualquer uma das reivindicações 8-13, em que a sonda de oligonucleotídeo hibridiza especificamente a um produto de amplificação de ssrA e em que a sonda de oligonucleotídeo compreende 5’ TAAATATAAATGCAAACGATGAAAACTTTGC 3’ (SEQ ID NO: 3) ou um complemento do mesmo.
15. O método de qualquer uma das reivindicações 8-14, em que a sonda de oligonucleotídeo hibridiza especificamente a um produto de amplificação de rRNA 16S e em que a sonda de oligonucleotídeo compreende 5’ CCAGCATGTGATGGTGGGGACTCTA 3’ (SEQ ID NO: 6) ou um complemento do mesmo.
16. O método de qualquer uma das reivindicações 1-15, compreendendo adicionalmente misturar o DNA de controle exógeno com a amostra biológica.
17. O método da reivindicação 16, compreendendo adicionalmente contactar a amostra biológica com um terceiro par de iniciadores adequado para amplificação de um ácido nucleico alvo de controle exógeno e amplificar o ácido nucleico alvo de controle exógeno.
18. O método da reivindicação 17, em que o ácido nucleico alvo de controle exógeno compreende SEQ ID NO: 20.
19. O método da reivindicação 18, em que o terceiro par de iniciadores consiste em um terceiro iniciador senso compreendendo 5’ GCTTCAGTACCTTCGGCTTG 3’ (SEQ ID NO: 17) e um terceiro iniciador antissenso compreendendo 5’ TTGCAGGCATCTCTGACAAC 3’ (SEQ ID NO: 18).
20. O método da reivindicação 17 ou 18, compreendendo adicionalmente contactar a amostra biológica com uma terceira sonda de oligonucleotídeo, em que a terceira sonda de oligonucleotídeo é marcada de forma detectável e compreende 5’ TGGCTCTTGGCGGTCCAGATG 3’ (SEQ ID NO: 19).
21. O método de qualquer uma das reivindicações 1-20, em que a amplificação por PCR em tempo real é realizada em um disco de amplificação direta em conjunto com um termociclador integrado.
22. O método de qualquer uma das reivindicações 1-21, em que a amostra biológica é uma amostra de lavado broncoalveolar, uma amostra de lavagem brônquica, uma amostra de escarro, uma amostra de aspirado ou lavagem nasofaríngea (NP), um swab nasal ou um isolado bacteriano.
23. Um kit para detectar a presença de pelo menos uma espécie de Legionella em uma amostra biológica compreendendo: (a) um primeiro par de iniciadores que amplifica um ácido nucleico alvo de ssrA; (b) um segundo par de iniciadores que amplifica um ácido nucleico alvo de rRNA 16S; (c) uma primeira sonda de oligonucleotídeo capaz de hibridizar especificamente a um segmento do ácido nucleico alvo de ssrA; e (d) uma segunda sonda de oligonucleotídeo capaz de hibridizar especificamente a um segmento do ácido nucleico alvo de rRNA 16S; em que a primeira sonda de oligonucleotídeo e a segunda sonda de oligonucleotídeo são marcadas de forma detectável.
24. O kit da reivindicação 23, compreendendo adicionalmente um terceiro par de iniciadores que amplifica um ácido nucleico alvo de controle.
25. O kit da reivindicação 23 ou 24, em que o primeiro par de iniciadores é capaz de hibridizar especificamente a um ácido nucleico alvo de ssrA compreendendo nucleotídeos que são pelo menos 85-95% idênticos à SEQ ID NO: 1, ou um complemento do mesmo.
26. O kit de qualquer uma das reivindicações 23-25, em que o segundo par de iniciadores é capaz de hibridizar especificamente a um ácido nucleico alvo de rRNA 16S compreendendo nucleotídeos que são pelo menos 85-95% idênticos à SEQ ID NO: 2, ou um complemento do mesmo.
27. O kit de qualquer uma das reivindicações 23-26, em que o primeiro par de iniciadores compreende pelo menos um iniciador degenerado.
28. O kit de qualquer uma das reivindicações 23-27, em que o primeiro par de iniciadores compreende um primeiro iniciador senso compreendendo 5’ TCGACGTGGGTTGCRAAACG 3’ (SEQ ID NO: 1) ou um complemento do mesmo.
29. O kit de qualquer uma das reivindicações 23-28, em que o primeiro par de iniciadores compreende um primeiro iniciador antissenso compreendendo 5’ TATGACCGTTGATTCGATACC 3’ (SEQ ID NO: 2) ou um complemento do mesmo.
30. O kit de qualquer uma das reivindicações 23-29, em que o segundo par de iniciadores compreende pelo menos um iniciador degenerado.
31. O kit de qualquer uma das reivindicações 23-30, em que o segundo par de iniciadores compreende um segundo iniciador senso compreendendo 5’ TACCTACCCTTGACATACAGTG 3’ (SEQ ID NO: 4) ou um complemento do mesmo.
32. O kit de qualquer uma das reivindicações 23-31, em que o segundo par de iniciadores compreende um segundo iniciador antissenso compreendendo 5’ CTTCCTCCGGTTTGTCAC 3’ (SEQ ID NO: 5) ou um complemento do mesmo.
33. O kit de qualquer uma das reivindicações 23-32, em que a primeira sonda de ácido nucleico compreende 5’ TAAATATAAATGCAAACGATGAAAACTTTGC 3’ (SEQ ID NO: 3), ou um complemento do mesmo.
34. O kit de qualquer uma das reivindicações 23-33, em que a segunda sonda de ácido nucleico compreende 5’ CAACCAGCCGCTGCTGACGGTC 3’ (SEQ ID NO: 9), ou um complemento do mesmo.
35. O kit de qualquer uma das reivindicações 23-34, em que o marcador detectável é um marcador fluorescente.
36. O kit da reivindicação 35, em que o marcador fluorescente é selecionado a partir do grupo que consiste em fluoresceína, Cy3, Cy5, Cy5.5 tetracloro-6-car-boxifluoresceína, 2,7-dimetoxi-4,5-dicloro-6-carboxi- fluoresceína, Yakima Yellow, Texas Red, TYE 563, ROX, TEX 615, TYE 665, TYE 705 e hexacloro-6-carboxifluoresceína.
37. O kit de qualquer uma das reivindicações 23-36, em que pelo menos uma sonda de oligonucleotídeo compreende adicionalmente pelo menos um quencher.
38. O kit da reivindicação 37, em que o quencher é selecionado a partir do grupo que consiste em TAMRA, Black Hole Quencher, Deep Dark Quencher, ZEN, Iowa Black FQ, Iowa Black RQ e DABCYL.
39. Uma composição compreendendo uma sonda de oligonucleotídeo marcada de forma detectável compreendendo 5’ TAAATATAAATGCAAACGATGAAAACTTTGC 3’ (SEQ ID NO: 3).
40. A composição da reivindicação 39, em que o marcador detectável é um marcador fluorescente.
41. A composição da reivindicação 40, em que o marcador fluorescente é selecionado a partir do grupo que consiste em fluoresceína, Cy3, Cy5, Cy5.5 tetracloro-6-car-boxifluoresceína, 2,7-dimetoxi-4,5-dicloro-6-carboxi- fluoresceína, Yakima Yellow, Texas Red, TYE 563, ROX, TEX 615, TYE 665, TYE 705 e hexacloro-6-carboxifluoresceína.
42. A composição de qualquer uma das reivindicações 39-41, em que a sonda de oligonucleotídeo compreende adicionalmente pelo menos um quencher.
43. O kit da reivindicação 42, em que o quencher é selecionado a partir do grupo que consiste em TAMRA, Black Hole Quencher, Deep Dark Quencher, ZEN, Iowa Black FQ, Iowa Black RQ e DABCYL.
44. Um método para selecionar um indivíduo que exibe sintomas semelhantes aos de pneumonia para tratamento com um agente terapêutico que inibe Legionella pneumophila, o método compreendendo: (a) contactar uma amostra isolada do indivíduo com um primeiro par de iniciadores adequado para amplificar um ácido nucleico alvo de ssrA;
(b) contactar a amostra com um segundo par de iniciadores adequado para amplificar um ácido nucleico alvo de rRNA 16S; (c) amplificar o ácido nucleico alvo de ssrA e o ácido nucleico alvo de rRNA 16S, se presente; e (d) detectar um ou mais produtos de amplificação produzidos na etapa (c); e (e) selecionar o indivíduo para tratamento com um agente terapêutico que inibe Legionella pneumophila se um produto de amplificação para o ácido nucleico alvo de rRNA 16S for detectado.
45. Um método para tratar um indivíduo com uma infecção por Legionella pneumophila, o método compreendendo administrar um agente terapêutico que inibe Legionella pneumophila a um indivíduo selecionado pelo método da reivindicação 44.
46. O método da reivindicação 44 ou 45, em que o primeiro par de iniciadores compreende pelo menos um iniciador degenerado.
47. O método de qualquer uma das reivindicações 44-46, em que o primeiro par de iniciadores compreende um primeiro iniciador senso compreendendo 5’ TCGACGTGGGTTGCRAAACG 3’ (SEQ ID NO: 10) ou um complemento do mesmo.
48. O método de qualquer uma das reivindicações 44-47, em que o primeiro par de iniciadores compreende um primeiro iniciador antissenso compreendendo 5’ TATGACCGTTGATTCGATACC 3’ (SEQ ID NO: 2) ou um complemento do mesmo.
49. O método de qualquer uma das reivindicações 44-48, em que o segundo par de iniciadores compreende pelo menos um iniciador degenerado.
50. O método de qualquer uma das reivindicações 44-49, em que o segundo par de iniciadores compreende um segundo iniciador senso compreendendo 5’
TACCTACCCTTGACATACAGTG 3’ (SEQ ID NO: 4) ou um complemento do mesmo.
51. O método de qualquer uma das reivindicações 44-50, em que o segundo par de iniciadores compreende um segundo iniciador antissenso compreendendo 5’ CTTCCTCCGGTTTGTCAC 3’ (SEQ ID NO: 5) ou um complemento do mesmo.
52. O método de qualquer uma das reivindicações 44-51, compreendendo adicionalmente contactar a amostra biológica com uma ou mais sondas de oligonucleotídeo capazes de hibridizar especificamente a um produto de amplificação ou um complemento do mesmo.
53. O método da reivindicação 52, em que a sonda de oligonucleotídeo é marcada de forma detectável.
54. O método da reivindicação 53, em que o marcador detectável é um marcador fluorescente.
55. O método da reivindicação 54, em que o marcador fluorescente é selecionado a partir do grupo que consiste em fluoresceína, Cy3, Cy5, Cy5.5 tetracloro-6-car-boxifluoresceína, 2,7-dimetoxi-4,5-dicloro-6-carboxi- fluoresceína, Yakima Yellow, Texas Red, TYE 563, ROX, TEX 615, TYE 665, TYE 705 e hexacloro-6-carboxifluoresceína.
56. O método de qualquer uma das reivindicações 52-55, em que a sonda de oligonucleotídeo compreende adicionalmente pelo menos um quencher.
57. O método da reivindicação 56, em que o quencher é selecionado a partir do grupo que consiste em TAMRA, Black Hole Quencher, Deep Dark Quencher, ZEN, Iowa Black FQ, Iowa Black RQ e DABCYL.
58. O método de qualquer uma das reivindicações 52-57, em que a sonda de oligonucleotídeo hibridiza especificamente a um produto de amplificação de ssrA e em que a sonda de oligonucleotídeo compreende 5’ TAAATATAAATGCAAACGATGAAAACTTTGC 3’ (SEQ ID NO: 3) ou um complemento do mesmo.
59. O método de qualquer uma das reivindicações 52-58, em que a sonda de oligonucleotídeo hibridiza especificamente a um produto de amplificação de rRNA 16S e em que a sonda de oligonucleotídeo compreende 5’ CCAGCATGTGATGGTGGGGACTCTA 3’ (SEQ ID NO: 6) ou um complemento do mesmo.
60. O método de qualquer uma das reivindicações 44-59, compreendendo adicionalmente misturar o DNA de controle exógeno com a amostra biológica.
61. O método da reivindicação 60, compreendendo adicionalmente contactar a amostra biológica com um terceiro par de iniciadores adequado para amplificação de um ácido nucleico alvo de controle exógeno e amplificar o ácido nucleico alvo de controle exógeno.
62. O método da reivindicação 61, em que o ácido nucleico alvo de controle exógeno compreende SEQ ID NO: 20.
63. O método da reivindicação 62, em que o terceiro par de iniciadores consiste em um terceiro iniciador senso compreendendo 5’ GCTTCAGTACCTTCGGCTTG 3’ (SEQ ID NO: 17) e um terceiro iniciador antissenso compreendendo 5’ TTGCAGGCATCTCTGACAAC 3’ (SEQ ID NO: 18).
64. O método da reivindicação 61 ou 62, compreendendo adicionalmente contactar a amostra biológica com uma terceira sonda de oligonucleotídeo, em que a terceira sonda de oligonucleotídeo é marcada de forma detectável e compreende 5’ TGGCTCTTGGCGGTCCAGATG 3’ (SEQ ID NO: 19).
65. O método de qualquer uma das reivindicações 44-64, em que a amplificação por PCR em tempo real é realizada em um disco de amplificação direta em conjunto com um termociclador integrado.
66. O método de qualquer uma das reivindicações 44-65, em que a amostra biológica é uma amostra de lavado broncoalveolar, uma amostra de lavagem brônquica, uma amostra de escarro, uma amostra de aspirado ou lavagem nasofaríngea (NP), um swab nasal ou um isolado bacteriano.
67. O método de qualquer uma das reivindicações 44-66, em que o agente terapêutico que inibe Legionella pneumophila é um ou mais agentes selecionados a partir do grupo que consiste em fluoroquinolonas, carbapenens, antibióticos macrolídeos, sulfametoxazol-trimetoprima, anticorpos específicos contra Legionella pneumophila, e vacinas específicas contra Legionella pneumophila.
68. O método da reivindicação 67, em que as fluoroquinolonas são selecionadas a partir do grupo que consiste em ciprofloxacino, gemifloxacino, levofloxacino, norfloxacino, ofloxacino, rovafloxacino, gatifloxacino, grepafloxacino, temafloxacino, lomefloxacino, esparfloxacino, enoxacino e moxifloxacino.
69. O método da reivindicação 67, em que os carbapenens são selecionados a partir do grupo que consiste em imipenem, meropenem, ertapenem, doripenem, panipenem, biapenem, razupenem (PZ-601), tebipenem, lenapenem, tomopenem e tienpenem (Tienamicina).
70. O método da reivindicação 67, em que a vacina específica contra Legionella pneumophila é selecionada a partir do grupo que consiste em vacina contra Legionella pneumophila de células inteiras (wP) e vacina contra Legionella pneumophila acelular.
71. O método da reivindicação 67, em que os antibióticos macrolídeos são selecionados a partir do grupo que consiste em azitromicina (Zithromax), claritromicina (Biaxin), eritromicina (E-Mycin, Eryc, Ery-Tab, PCE, Pediazole, Ilosone) e roxitromicina.
BR112021015031-5A 2019-01-31 2020-01-30 Métodos para detectar legionella BR112021015031A2 (pt)

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