BR112015022470B1 - Sonda ou iniciador de oligonucleotídeo, método para determinar presença da sequência do gene de proteína externa principal (opca) de neisseria gonorrhoeae e composições para detecção de neisseria gonorrhoeae - Google Patents

Abstract

detecção de neisseria gonorrhoeaes. métodos e composições para a detecção de neisseria gonorrhoeae são aqui descritos. em algumas formas de realização, a presença ou ausência de n. gonorrhoeae numa amostra é determinada usando métodos de ensaio nucleicos à base de ácido, utilizando os iniciadores e / ou sondas que se ligam à região do gene opca de n. gonorrhoeae.

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO REFERÊNCIA REMISSIVA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade do Pedido de Patente Provisório U.S. N° 61/798.757, intitulado “DETECTION OF NEISSERIA GONORRHOEAES”, depositado em 15 de Março de 2013, o conteúdo todo do qual é aqui incorporado por referência.

REFERÊNCIA A LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002] O presente pedido está sendo depositado com uma Listagem de Sequências no formato eletrônico. A listagem de sequências é fornecida como um arquivo intitulado SEQLISTING.TXT, criado em 15 de Março de 2013, que tem 4 Kb de tamanho. A informação no formato eletrônico da Listagem de Sequências está incorporada aqui por referência em sua totalidade.

FUNDAMENTOS Campo

[003] A presente divulgação diz respeito a métodos, composições, iniciadores e sondas para detecção de Neisseria gonorrhoeae. Mais especificamente, a presente divulgação diz respeito à detecção de N. gonorrhoeae por métodos de teste a base de ácido nucleico usando iniciadores e/ou sondas que ligam à região do gene opcA de proteína externa principal de N. gonorrhoeae. Por exemplo, estes iniciadores e sondas podem ser usados para amplificar ácidos nucleicos de N. gonorrhoeae nas amostras biológicas para determinar a presença de N. gonorrhoeae ou para determinar a presença de ácidos nucleicos de N. gonorrhoeae.

Descrição da Técnica Relacionada

[004] Neisseria gonorrhoeae é uma espécie de bactéria de não formação de foco, não motil, gram-negativa diplococi responsável por gonorreia, uma infeção bacteriana do trato genital inferior que é transmitida principalmente por contato sexual. Sintomas da infeção com N. gonorrhoeae diferem dependendo do local de infeção e geralmente tempo, as infeções são assintomáticas. Infeção de gonorreia podem causar conjuntivite, faringite, proctite ou ureíte, prostatite e orquite. Infeção ascendendo em mulher pode também levar ao desenvolvimento de doença inflamatória pélvica aguda, uma das causas principais da infertilidade feminina. Infeção por gonorreia pode passar de uma mãe infectada ao seu bebê durante parto vaginal e pode resultar em conjuntivite gonococal no olho do recém-nascido.

[005] N. gonorrhoeae é proximamente relacionada geneticamente à N. meningitidis (meningocócita), o agente causador de um tipo de meningite bacteriana e ligeiramente menos relacionado à N. lactamica, um patógeno humano ocasional. Ambas N. gonorrhoeae e N. meningitidis infetam apenas humanos. Existem várias outras espécies adicionais de Neisseria que podem ser consideradas flora normal em humanos incluindo N. cinerea, N. elongata, N. flavescens, N. mucosa, N. sica e N. subflava.

[006] Um número de testes de amplificação de ácido nucleico (AATs) tem sido desenvolvidos para avaliação clínica de infeções de N. gonorrhoeae, incluindo Amplicor®CT/NG teste alvejando o gene metiltransferase de DNA de citosina (Roche Diagnostic Corporation, Basel, Switzerland); Ensaio de Amplificação alvejando genes pilin de multi-cópias ProbeTec™ Qx (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, New Jersey); ensaio LCx®alvejando genes de opacidade alvo (opa) (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois); e GenProbe APTIMA™ Combo 2 versão TMA alvejando gene RNA ribossomal 16S (Gen-Probe, Incorporated, San Diego, California). Os NAATs têm a vantagem de detectar N. gonorrhoeae sem exame pélvico ou espécie de swab intrauretal (para homens) (p.ex. por teste de urina). Entretanto, os iniciadores empregados por certos NAATs para N. gonorrhoeae podem reagir cruzado com espécies de Neisseria não gonocócitas. Então, existe uma necessidade de um teste que pode detectar N. gonorrhoeae com alta sensibilidade e resultados falso positivos reduzidos devido à reatividade cruzada com outras espécies de bactéria, tal como espécies de Neisseria.

SUMÁRIO

[007] Um aspecto da presente divulgação é relacionado a sondas e iniciadores capazes de hibridizar o gene de proteína externo principal (opcA). Algumas modalidades divulgadas aqui fornecem uma sonda de oligonucleotídeo ou iniciador até cerca de 100 nucleotídeos no comprimento que é capaz de hibridizar o gene de proteína externo principal (opcA) de Neisseria gonorrhoeae. Em algumas modalidades, a sonda ou iniciador compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID Nos. 1-6 ou sequência que exibe pelo menos cerca de 85% de identidade a uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID Nos. 1-6.

[008] Em algumas modalidades, a sonda ou iniciador consiste de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID Nos. 1-6 ou sequência que exibe pelo menos cerca de 85% de identidade a uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID Nos. 1-6. Em algumas modalidades, a sonda ou iniciador consiste de uma sequência que exibe pelo menos cerca de 95% de identidade a uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID Nos. 1-6. Em algumas modalidades, a sonda ou iniciador está consistindo de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID Nos. 1-6.

[009] Outro aspecto da presente divulgação é relacionado a métodos para detectar a presença de sequência opcA de Neisseria gonorrhoeae em uma amostra biológica. Algumas modalidades divulgadas aqui fornecem um método para determinar a presença de uma sequência de gene de proteína externa principal (opcA) de Neisseria gonorrhoeae em uma amostra biológica, onde o método compreende, contactar a amostra biológica com pelo menos um par de iniciadores capazes de hibridizar o gene de proteína externa principal (opcA) de Neisseria gonorrhoeae, em que cada iniciador em pelo menos um par dos iniciadores compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID Nos. 1-6 ou sequência que exibe pelo menos cerca de 85% de identidade a uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID Nos. 1-6 e em que o pelo menos um par de iniciadores é configurado para gerar um amplicon de uma sequência opcA sob condições de amplificação de ácido nucleico padrão, gerando um amplicon da sequência opcA da amostra biológica, se a amostra compreende Neisseria gonorrhoeae; e determinar a presença ou quantidade de um ou mais produtos amplificados como uma indicação da presença de sequência de opcA na amostra biológica.

[010] Em algumas modalidades, a amostra biológica é uma amostra clínica. Em algumas modalidades, a amostra biológica é coletada da uretra, pênis, ânus, garganta, cérvix ou vagina. Em algumas modalidades, a amostra biológica é uma amostra vaginal.

[011] Em algumas modalidades, a amostra biológica é contactada com um par de iniciadores. Em algumas modalidades, um par de iniciadores é: a) SEQ ID NOs: 1 e 2; ou b) SEQ ID NOs: 4 e 5.

[012] Em algumas modalidades, a amplificação é realizada usando um método selecionado do grupo consistindo de reação da cadeia de polimerase (PCR), reação de cadeia de ligase (LCR), amplificação isotérmica mediada por volta (LAMP), amplificação de deslocamento de filamento (DAS), amplificação mediada por replicase, Imuno- amplificação, amplificação com base em sequência de ácido nucleico (NASBA), replicação de sequência auto-sustentada (3SR), amplificação de circulo de rolamento e amplificação mediada por transcrição (TMA).

[013] Em algumas modalidades, o PCR é selecionado do grupo consistindo de PCR em tempo real, PCR de ponto final, AFLP, Alu-PCR, PCR assimétrico Colony PCR, DD-PCR, PCR degenerado, Hot-start PCR, PCR in situ, PCR inverso, Long-PCR, Multiplex PCR, PCR aninhado, PCR- ELISA, PCR-RFLP, PCR de polimorfismo de conformação de filamento único (PCR-SSCP), PCR quantitativo competitivo (QC-PCR), amplificação rápida das extremidades de cDNA-PCR (RACE-PCR), Amplificação aleatória de DNA polimórfico-PCR (RAPD-PCR), PCR palindrômico extragênico repetitivo (Rep -PCR), PCR de transcriptase reversa (RT-PCR), TAIL-PCR, Touchdown PCR e Vectorette PCR. Em algumas modalidades, é o PCR quantitativo em tempo real de PCR (QRT-PCR).

[014] Em algumas modalidades, cada iniciador compreende a sequência de nucleotídeos exógena que permite a manipulação pós- amplificação de produtos de amplificação, sem um efeito significativo sobre a própria amplificação.

[015] Em algumas modalidades, cada iniciador do par de iniciadores é flanqueado por sequências complementares compreendendo um fluoroforo na extremidade 5’ e uma inibição de fluorescência na extremidade 3’.

[016] Ainda outro aspecto da presente descrição diz respeito a composições para a detecção de sequências de Neisseria gonorrhoeae. Algumas modalidades aqui descritas proporcionam uma composição para a detecção de Neisseria gonorrhoeae, onde a composição compreende: um primeiro e um segundo iniciadores de amplificação que hibridizam especificamente a sequência do gene da proteína externa principal (opcA) de Neisseria gonorrhoeae ou o complemento da mesma, em que o primeiro e o segundo iniciadores de amplificação tem cerca de 10 a cerca de 50 nucleotídeos de comprimento e em que o opcA tem a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 7.

[017] Em algumas modalidades, a composição compreende ainda uma sonda, em que a sonda hibridiza especificamente com uma amplificação opcA.

[018] Em algumas modalidades, a sonda compreende uma sequência de SEQ ID NO: 3 ou 6 ou uma sequência que exibe pelo menos cerca de 85% de identidade com uma sequência de SEQ ID NO: 3 ou 6. Em algumas modalidades, a sonda tem uma sequência de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 6.

[019] Em algumas modalidades, a sonda compreende uma porção de emissor de fluorescência e uma porção de inibição de fluorescência.

[020] O sumário anterior é apenas ilustrativo e não se destina a ser de qualquer forma limitante. Além das modalidades ilustrativas, aspectos, características acima descritas e, mais aspectos, modalidades e as características serão evidentes por referência aos desenhos e à seguinte descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[021] A Figura 1 mostra a sequência de uma região do gene opcA na cepa de N. gonorrhoeae FA 1090. Também são mostrados os locais de vários iniciadores e sondas descritos nas modalidades aqui descritas.

[022] A Figura 2 mostra os resultados de detecção de 72 isolados clínicos de N. gonorrhoeae, utilizando o sistema de opcA-6 qPCR.

[023] As Figuras 3A-B mostram a especificidade testando resultados da opcA-6 sistema de qPCR para Neisseria não gonorrhoeae.

[024] A Figura 4 mostra a especificidade dos resultados de teste de sistemas opcA-6 qPCR para organismos geralmente encontrados em amostras clínicas vaginais

[025] A Figura 5 mostra histogramas que ilustram os limites de detecção do sistema opcA-6 PCR para a detecção de N. gonorrhoeae em amostras clínicas de urina e de matriz vaginal utilizando BD MAX e métodos de extração de Viper XT.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[026] Os títulos das seções aqui utilizadas são apenas para fins organizacionais e não são para ser interpretados como limitativos do assunto descrito em qualquer maneira. Toda a literatura e materiais semelhantes citados neste pedido de patente, incluindo, mas, sem limitação, patentes, pedidos de patente, artigos, livros, tratados e páginas da Internet, independentemente do formato de tal literatura e materiais semelhantes, são aqui expressamente incorporados por referência na sua totalidade para qualquer finalidade. No caso em que um ou mais da literatura incorporada e materiais semelhantes define ou utiliza um termo de tal maneira que ele contraria a definição do termo no presente pedido, esta aplicação controla. Enquanto os presentes ensinamentos são descritos em conjunto com várias modalidades, não se pretende que os presentes ensinamentos sejam limitados a essas modalidades. Pelo contrário, os presentes ensinamentos abrangem várias alternativas, modificações e equivalentes, tal como será tido em consideração pelos peritos na arte.

[027] Sempre que uma faixa de valores é aqui proporcionada, a faixa é suposta a incluir o valor de partida e o valor final e qualquer valor ou faixa de valor existe a menos que de outro modo estabelecido. Por exemplo, “ de 0,2 a 0,5” significa 0,2, 0,3, 0,4, 0,5; varia entre 0,2-0,3 tal como, 0,3-0,4, 0,2-0,4; incrementos entre eles tais como 0,25, 0,35, 0,225, 0,335, 0,49; incrementos variam entre como 0,26-0,39; e similar.

[028] São aqui proporcionados métodos e composições para a detecção de N. gonorrhoeae, utilizando iniciadores e / ou sondas que se ligam ao gene da proteína externa principal opcA de N. gonorrhoeae. Esses iniciadores e sondas podem ser utilizados para amplificar ácidos nucleicos de N. gonorrhoeae em amostras biológicas para determinar a presença ou ausência de N. gonorrhoeae em uma amostra, tal como uma amostra biológica. Além disso, estes iniciadores e sondas podem ser utilizados para quantificar a quantidade de ácidos nucleicos de N. gonorrhoeae na amostra.

Definições

[029] Tal como aqui utilizado, um “ácido nucleico” refere-se a um composto polimérico compreendendo nucleosídeos ou análogos de nucleosídeos que têm bases heterocíclicas nitrogenadas ou análogos de base, ligados entre si por ligações da cadeia principal de ácido nucleico (por exemplo, ligações de fosfodiéster) para formar um polinucleotídeo. Exemplos não limitativos de ácido nucleico incluem RNA, DNA e seus análogos. A cadeia principal de ácido nucleico pode incluir uma variedade de ligações, por exemplo, uma ou mais ligações de açúcar-fosfodiéster, ligações peptídicas de ácido nucleico, ligações de fosforotioato ou metilfosfonato ou misturas de tais ligações em um único oligonucleotídeo. Porções de açúcar no ácido nucleico podem ser tanto ribose ou desoxirribose ou compostos semelhantes com substituições conhecidas. Bases nitrogenadas convencionais (por exemplo, A, G, C, T, U), análogos de base conhecidas (por exemplo, inosina), derivados de bases de purina ou de pirimidina e resíduos “abásicos” (ou seja, nenhuma base nitrogenada para uma ou mais posições da cadeia principal) estão incluídos no termo ácido nucleico. Isto é, um ácido nucleico pode incluir apenas açúcares convencionais, bases e ligações encontradas em RNA e DNA ou incluir ambos os componentes convencionais e substituições (por exemplo, bases convencionais e análogos ligados através de uma cadeia principal metoxi ou bases convencionais e um ou mais análogos de bases ligados através de uma cadeia principal de RNA ou DNA).

[030] Tal como aqui utilizado, o termo “isolar ácidos nucleicos” refere- se à purificação de ácidos nucleicos a partir de um ou mais componentes celulares. O perito na arte irá ter em consideração que as amostras processadas para “isolar ácidos nucleicos” daí podem incluir outros componentes e impurezas de ácidos nucleicos. As amostras que compreendem os ácidos nucleicos isolados podem ser preparadas a partir de amostras usando qualquer método aceitável conhecido na arte. Por exemplo, as células podem ser lisadas por meio de agentes de lise conhecidos e os ácidos nucleicos podem ser purificados ou parcialmente purificados a partir de outros componentes celulares. Reagentes e protocolos para extrações de DNA e RNA adequados podem ser encontrados, por exemplo, na Publicação do Pedido de Patente US Nos. US 2010-0009351 e US 2009-0131650, respectivamente (cada um dos quais é aqui incorporado por referência na sua totalidade). No teste de ácido nucleico (por exemplo, métodos de amplificação e hibridização são discutidos em maior detalhe abaixo), a solução de ácido nucleico extraída pode ser adicionada diretamente a um reagente (por exemplo, seja no estado líquido, ligado a um substrato, na forma liofilizada ou semelhante, como discutido em maior detalhe abaixo), necessário para a realização de um teste de acordo com as modalidades aqui reveladas.

[031] Tal como aqui utilizado, “modelo” refere-se à totalidade ou a parte de um polinucleotídeo contendo pelo menos uma sequência de nucleotídeos alvo.

[032] Tal como aqui utilizado, um “iniciador” refere-se a um polinucleotídeo que pode servir para iniciar uma reação de extensão da cadeia de ácido nucleico. O comprimento de um iniciador pode variar, por exemplo, desde cerca de 5 até cerca de 100 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 15 a cerca de 40 nucleotídeos ou desde cerca de 20 a cerca de 30 nucleotídeos. O comprimento de um iniciador pode ser de cerca de 10 nucleotídeos, cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 25 nucleotídeos, cerca de 30 nucleotídeos, cerca de 35 nucleotídeos, cerca de 40 nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 75 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos ou um intervalo entre quaisquer dois dos estes valores. Em algumas modalidades, o iniciador tem um comprimento de 10 a cerca de 50 nucleotídeos ou seja, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 ou mais nucleotídeos.

[033] Tal como aqui utilizado, uma “sonda” refere-se a um oligômero de ácido nucleico que hibridiza especificamente uma sequência alvo de ácido nucleico, em condições que permitam a hibridização, permitindo assim a detecção da sequência alvo ou de ácido nucleico amplificado. “Alvo” de uma sonda refere-se geralmente a uma sequência dentro ou um subconjunto de uma sequência de ácido nucleico amplificado que hibridize especificamente pelo menos uma parte de um oligômero sonda por ligação de hidrogênio normal (ou seja, o emparelhamento de bases). A sonda pode compreender sequências específicas de alvo e outras sequências que contribuem para a conformação tridimensional da sonda. Sequências são “suficientemente complementares” se permitirem a hibridização estável em condições adequadas de hibridização de um oligômero de sonda com uma sequência alvo que não é completamente complementar à sequência específica alvo da sonda. O comprimento de uma sonda pode variar, por exemplo, desde cerca de 5 até cerca de 100 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 15 a cerca de 40 nucleotídeos ou desde cerca de 20 a cerca de 30 nucleotídeos. O comprimento de uma sonda pode ser de cerca de 10 nucleotídeos, cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 25 nucleotídeos, cerca de 30 nucleotídeos, cerca de 35 nucleotídeos, cerca de 40 nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos ou em um intervalo entre quaisquer dois destes valores. Em algumas modalidades, a sonda tem um comprimento de 10 a cerca de 50 nucleotídeos. 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 ou mais nucleotídeos.

[034] Em algumas modalidades, a sonda pode ser de não-sequência específica. Por exemplo, em algumas modalidades,

[035] De preferência, os oligonucleotídeos iniciadores e / ou sondas aqui divulgados podem ter entre 8 e 45 nucleotídeos de comprimento. Por exemplo, os iniciadores e ou sondas podem ter, pelo menos, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 ou mais nucleotídeos de comprimento.

[036] As sequências de sondas e de iniciadores aqui descritos podem ser modificadas para conter nucleotídeos adicionais nas extremidades 5 ‘ou 3’ ou ambas. O perito na arte irá ter em consideração que as bases adicionais à extremidade 3’ de iniciadores de amplificação (não necessariamente sondas) são em geral complementares à sequência molde. As sequências de sondas e de iniciadores aqui descritos também podem ser modificadas para remover nucleotídeos na extremidade 5 ‘ou extremidade 3’. O perito na arte irá ter em consideração que, a fim de funcionar para a amplificação, os iniciadores ou sondas serão de um mínimo de comprimento e temperatura de recozimento, como aqui revelado.

[037] Os iniciadores de oligonucleotídicos e sondas podem ligar-se aos seus objetos a uma temperatura de recozimento, que é uma temperatura inferior à temperatura de fusão (Tm). Tal como aqui utilizado, “TM” e “temperatura de fusão” são termos intermutáveis que se referem à temperatura na qual 50% de uma população de moléculas de cadeia dupla de polinucleotídeos torna-se dissociada em cadeias simples. Fórmulas para calcular a Tm de polinucleotídeos são bem conhecidas na arte. Por exemplo, a Tm pode ser calculada pela seguinte equação: Tm = 69,3 + 0,41 (G + C)% - 6- 50 / L, em que L é o comprimento da sonda em nucleotídeos. A Tm de um polinucleotídeo híbrido pode também ser calculada utilizando uma fórmula adotada a partir de ensaios de hibridização em 1 M de sal e utilizada para calcular a Tm para os iniciadores de PCR: [(número de A + T) x 2° C + (número de G + C) x 4° C]. Ver, por exemplo, C. R. Newton et al., PCR, 2aed, Springer Verlag (Nova Iorque: 1997), p. 24. Outros cálculos mais sofisticados existem na arte, que levam características estrutural, bem como de sequência em conta para o cálculo da Tm. A temperatura de fusão de um oligonucleotídeo pode depender de complementaridade entre o iniciador ou sonda de oligonucleotídeo e a sequência de ligação e nas condições de sal. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo iniciador ou sonda aqui proporcionados tem um Tm de menos do que cerca de 90° C em 50 mM de KCl, tampão de Tris-HCl a 10, por exemplo cerca de 89° C, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39° C ou menos, incluindo intervalos entre quaisquer dois dos valores listados.

[038] Em algumas modalidades, os iniciadores aqui descritos, por exemplo, os iniciadores de amplificação, podem ser fornecidos comum par de iniciadores de amplificação, por exemplo, compreendendo um iniciador direto e um iniciador inverso (o primeiro iniciador de amplificação e segundo iniciador de amplificação). De preferência, os iniciadores para frente e reverso possuem Tm que não difere mais do que 10° C, por exemplo, que difere pelo menos de 10° C, inferior a 9° C, inferior a 8° C, inferior a 7° C, a menos a 6° C, inferior a 5° C, inferior a 4° C, inferior a 3° C, inferior a 2° C ou menos do que 1° C.

[039] As sequências de iniciador e sonda podem ser modificadas por substituições de nucleotídeos que tem (em relação à sequência alvo) dentro da sequência de oligonucleotídeo, desde que o oligonucleotídeo contenha complementaridade suficiente para hibridizar especificamente a sequência de ácido nucleico alvo. Deste modo, pelo menos, 1, 2, 3, 4 ou até cerca de 5 nucleotídeos podem ser substituídos. Tal como aqui utilizado, o termo “complementar” refere-se a sequenciar regiões de complementaridade entre duas cadeias de polinucleotídeos ou entre duas regiões da mesma cadeia polinucleotídica. Uma primeira região de um polinucleotídeo é complementar a uma segunda região do mesmo ou de um polinucleotídeo diferente se, quando as duas regiões estão dispostas de uma forma anti-paralela, pelo menos um nucleotídeo da primeira região seja capaz de emparelhamento de bases com uma base da segunda região. Portanto, não é necessário que dois polinucleotídeos complementares tenham par de bases em cada posição de nucleotídeo. “Totalmente complementar” refere-se a um primeiro polinucleotídeo que é 100% ou “inteiramente” complementar a um segundo polinucleotídeo e, portanto, forma um par de bases em cada posição de nucleotídeo. “Parcialmente complementar” também se refere a um primeiro polinucleotídeo que não é 100% complementar (por exemplo, 90% ou 80% ou 70% complementares) e contém nucleotídeos desemparelhados em uma ou mais posições de nucleotídeos. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo inclui uma base universal.

[040] Tal como aqui utilizado, uma “sequência nucleotídica exógena” refere-se a uma sequência introduzida por iniciadores ou sondas usadas para a amplificação, de modo que os produtos de amplificação irão conter sequência de nucleotídeos exógena e a sequência de nucleotídeos alvo em um arranjo não encontrado no molde original a partir do qual a sequência de nucleotídeos alvo foi copiada.

[041] Tal como aqui utilizado, “identidade de sequência” ou “por cento idêntico”, quando aplicado a moléculas de ácidos nucleicos é a percentagem de resíduos de ácido nucleico em uma molécula candidata de ácido nucleico de sequência que é idêntica com uma sequência da molécula de ácido nucleico sujeita, depois de alinhar as sequências para alcançar a percentagem máxima de identidade e não considerando quaisquer substituições de resíduos de ácidos nucleicos como parte da identidade de sequência. A identidade de sequência de ácido nucleico pode ser determinada utilizando qualquer método conhecido na arte, por exemplo CLUSTALW, t-CAFÉ, BLASTN.

[042] Tal como aqui utilizado, o termo “suficientemente complementar” refere-se a uma sequência de base de ácido nucleico contígua que é capaz de hibridizar uma outra sequência de bases por pontes de hidrogênio entre uma série de bases complementares. Sequências de bases complementares podem ser complementares em cada posição na sequência do oligômero utilizando emparelhamento de bases padrão (por exemplo, G: C, A: T ou A: L) ou pode conter um ou mais resíduos que não são complementares (incluindo posições abásicas), mas em que toda a sequência de bases complementar é capaz de hibridizar especificamente uma outra sequência de base em condições de hibridização adequadas. Bases contíguas podem ser de pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% ou 100% complementar a uma sequência a que um oligômero é destinado a hibridizar. De modo substancial, as sequências complementares podem referir-se a sequências que variam em percentagem de identidade a partir de 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 75, 70 ou menos ou qualquer número entre, em comparação com a sequência de referência. Um perito na arte pode prontamente escolher as condições de hibridização adequadas, que podem ser previstas com base na composição da sequência de base ou ser determinada usando testes de rotina (ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Ed 2N. (Laboratório de Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).

Oligonucleotideos

[043] OpcA é um gene de proteína externa principal presente em N. gonorrhoeae. Em N. gonorrhoeae, as sequências de nucleotídeos do gene opcA foram determinadas primeiro a partir de duas cepas de referência FA1090 e MS ll (Zhu et al, FEMS Immunol. Med. Microbiol. 193-200 (2002)). Três sítios polimórficos, duas mutações sinônimas e uma mutação não-sinônimo, diferiram entre o opcA das duas cepas gonocócicas e um códon de uma deleção foi encontrado no MS LL opcA. Vinte e seis cepas de N. gonorrhoeae foram examinadas por PCR utilizando pares de iniciadores de opcA gonocócicos e opcA foi encontrado estando presente em todas estas vinte e seis cepas gonocócicas (Zhu et al., J. Clin. Microbiol., 458-62 (1995);. Zhu et ai, 2002). Cinqüenta e um cepas de N. gonorrhoeaetambém foram examinadas por opcA, por PCR e hibridização de DNA e todas as cepas mostraram presença de opcA em seus genomas. Zhu et al., FEMS Microbiol. Lett. 173-77 (2001). Os produtos de PCR a partir do gene opcA foram digeridos usando quatro endonucleases de restrição de corte frequente (PCR-RFLP). Os mesmos padrões de PCR-RFLP como o da referência da cepa FA1090 foram observados em todas as cepas gonocócicas testadas, mostrando sequência conservada do gene opcA em N. gonorrhoeae.

[044] Algumas modalidades descritas aqui proporcionam oligonucleotídeos (por exemplo, os iniciadores de amplificação e as sondas) que são capazes de especificamente hibridizar (por exemplo, sob condições de amplificação de ácido nucleico padrão, por exemplo, as condições de PCR convencionais, e/ou em condições de hibridização rigorosas) para a região do gene opcA em N. gonorrhoeae ou complemento do mesmo. Uma sequência exemplar da região do gene opcA relacionada com as modalidades aqui descritas são fornecidas no número de acesso GenBank AJ242839. Uma sequência exemplar da região do gene opcA é fornecida na SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, iniciadores e sondas que se ligam especificamente à região do gene opcA de N. gonorrhoeae (por exemplo, SEQ ID NO: 7), são usados na detecção da presença ou quantidade de ácido nucleico de N. gonorrhoeae em uma amostra biológica. Em algumas modalidades, é proporcionado um iniciador que hibridiza a SEQ ID NO: 7 sob condições padrão para a amplificação de ácido nucleico. Exemplos de oligonucleotídeo capaz de hibridizar especificamente a região do gene da opcA em N. gonorrhoeae incluem, mas não estão limitados a, SEQ ID NOs: 1-6, tal como previsto na Tabela 1. Na Tabela 1, “oligo localização” refere-se à localização de cada oligonucleotídeo na SEQ ID NO: 7.Tabela 1

[045] Também são aqui proporcionados oligonucleotídeos que contêm 1, 2, 3, 4 ou mais erros de emparelhamento ou nucleotídeos universais relativamente à SEQ ID Nos: 1-6 ou o complemento do mesmo, incluindo oligonucleotídeos que são pelo menos 80% idênticos (por exemplo, pelo menos 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica) a SEQ ID Nos: 1-6 ou o complemento do mesmo. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO: 1 -6. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo compreende uma sequência que é pelo menos cerca de 85% idêntica a uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO: 1-6. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo consiste de uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO: 1-6. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo consiste de uma sequência que é pelo menos cerca de 85% idêntica ou pelo menos cerca de 95% idêntica com uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO: 1 -6.

[046] Também são aqui divulgadas composições que compreendem oligonucleotídeos (por exemplo, os iniciadores de amplificação e / ou sondas) que são capazes de hibridizar especificamente a sequência da região do gene opcA de N. gonorrhoeae. Por exemplo, a composição pode compreender um ou mais iniciadores de amplificação e / ou uma ou mais sondas capazes de hibridizar especificamente a sequência da região do gene opcA de N. gonorrhoeae. Em algumas modalidades, a composição compreende um primeiro e um segundo iniciadores de amplificação capazes de hibridizar especificamente a sequência da região do gene opcA de N. gonorrhoeae. Em algumas modalidades, o iniciador compreende uma sequência de SEQ ID NO: 1, 2, 4 ou 5. Em algumas modalidades, o iniciador compreende uma sequência que é pelo menos cerca de 85% de identidade ou pelo menos cerca de 95% de identidade com uma sequência de SEQ ID NO: 1, 2, 4 ou 5. Em algumas modalidades, o iniciador consiste de uma sequência de SEQ ID NO: 1, 2, 4 ou 5. Em algumas modalidades, o iniciador consiste de uma sequência que é pelo menos cerca de 85% de identidade ou pelo menos cerca de 95% de identidade com uma sequência de SEQ ID NO: 1, 2, 4 ou 5.

[047] Em algumas modalidades, a composição compreende ainda uma sonda capaz de hibridizar especificamente um amplicon opcA. Em algumas modalidades, a sonda compreende uma sequência de SEQ ID NO: 3 ou 6. Em algumas modalidades, a sonda compreende uma sequência que é pelo menos cerca de 85% de identidade ou pelo menos cerca de 95% de identidade com uma sequência de SEQ ID NO: 3 ou 6. Em algumas modalidades, a sonda é constituída de uma sequência de SEQ ID NO: 3 ou 6. Em algumas modalidades, a sonda é constituída uma sequência que é pelo menos cerca de 85% de identidade ou pelo menos cerca de 95% de identidade com uma sequência de SEQ ID NO: 3 ou 6.

[048] Em algumas modalidades, sondas de oligonucleotídeos podem incluir uma porção detectável. Por exemplo, em algumas modalidades, as sondas de oligonucleotídeos aqui descritas podem compreender um marcador radioativo. Exemplos não limitativos de marcadores radioativos incluem 3H, 14C, 32P e 35S. Em algumas modalidades, as sondas de oligonucleotídeos podem incluir um ou mais marcadores não radioativos ou porções detectáveis, incluindo mas, sem limitação, ligantes, fluoróforos, agentes quimioluminescentes, enzimas e anticorpos. Outros marcadores detectáveis para utilização com sondas, que podem permitir um aumento na sensibilidade do processo da presente invenção, incluem a biotina e radio-nucleotídeos. Ficará evidente para o especialista na matéria que a escolha de um marcador particular dita a maneira como está ligado à sonda. Por exemplo, as sondas oligonucleotídicas marcadas com um ou mais corantes, de tal modo que após hibridização com um ácido nucleico matriz, uma alteração detectável na fluorescência é gerada. Enquanto corantes não específicos podem ser desejáveis para algumas aplicações, as sondas específicas para a sequência podem fornecer medições mais precisas de amplificação. Uma configuração da sonda específica da sequência pode incluir uma extremidade da sonda amarrada a um fluoróforo e a outra extremidade da sonda amarrada a um inibidor. Quando a sonda não é hibridizada, ela pode manter uma configuração de haste-laçada, em que o fluoróforo é neutralizado pelo inibidor, evitando assim que o fluoróforo de fluorescer. Quando a sonda é hibridizada a uma sequência de nucleico molde, ela é linearizada, distanciando o fluoróforo do inibidor e permitindo assim a fluorescência do fluoróforo. Outra configuração da sonda específica da sequência pode incluir uma primeira sonda amarrada a um primeiro fluoróforo de um par de FRET e uma segunda sonda amarrada a um segundo fluoróforo de um par de FRET. A primeira e segunda sonda de detecção pode ser configurada para hibridizar sequências de um amplicon que estão dentro de proximidade suficiente para permitir a transferência de energia por FRET, quando a primeira e segunda sonda são hibridizadas com a mesma amplicon.

[049] Em algumas modalidades, a sonda específica da sequência compreende um oligonucleotídeo tal como aqui descrito conjugado com um fluoróforo. Em algumas modalidades, a sonda é conjugada com dois ou mais fluoróforos. Os exemplos de fluoroforos incluem: corantes de xanteno, por exemplo, fluoresceína e rodamina, corantes, tais como isotiocianato de fluoresceína (FITC), monocloridrato de éster etílico do ácido 2- [etilamino) -3- (etilimino) -2-7-dimetil-3H-xanten-9-il] benzoico (R6G) (emite uma radiação de comprimento de onda de resposta que varia de cerca de 500 a 560 nm), iodeto de 1,1,3,3,3’,3’-hexameti-lindodi- carbocianina (HIDC) (emite uma radiação em resposta ao comprimento de onda que variara de cerca de 600 a 660 nm), 6-carboxifluoresceína (vulgarmente conhecido pelas abreviaturas FAM e F), 6-carboxi-2 ‘, 4’, 7 ‘, 4,7-hexacloro fluoresceína (HEX), 6 -carboxi-4 ‘, 5’-dicloro-2’, 7’- dimetoxifluoresceína (JOE ou J), N,N,N’,N’-tetrametil-6-carboxir- rodamina (TAMRA ou T), 6-carboxi-X -rodamina (ROX ou R), 5- carboxirrodamina-6G (R6G5 ou G5), 6-carboxirrodamina-6G (R6G6 ou G6), rodamina e 110; corantes de cianina, por exemplo Cy3, Cy5 e Cy7 corantes; cumarinas, por exemplo, umbeliferona; corantes, por exemplo benzimida Hoechst 33258; corantes, por exemplo, fenantridina Vermelho do Texas; corantes etídio; corantes de acridina; corantes carbazol; corantes fenoxazina; corantes p.ex.porfirina; corantes de polimetina, p.ex. corantes de cianina, tais como Cy3 (emite uma radiação de resposta no comprimento de onda que varia de cerca de 540 para 580 nm), Cy5 (emite uma radiação de resposta no comprimento de onda que varia de cerca de 640 para 680 nm), etc; corantes BODIPY e corantes de quinolina. Fluoróforos específicos de interesse incluem: pireno, cumarina, Dietilaminocoumarin, FAM, Clorotriazinil Fluoresceína, Fluoresceína, R1 10, Eosina, JOE, R6G, HIDC, tetrametilrodamina, TAMRA, Lissamine, ROX, Naftofluoresceína, Texas Red, Naftofluoresceína, Cy3 e Cy5, laranja fluor CAL e semelhantes.

[050] Em algumas modalidades, a sonda é conjugada com um inibidor. Um inibidor pode absorver radiação eletromagnética e dissipá- la como calor, permanecendo assim escuro. Exemplo de inibidores incluem Dabcyl, QNQ, como BHQ-1 ou BHQ-2 (Biosearch), IOWA PRETO FQ (IDT) e IOWA PRETO RQ (IDT). Em algumas modalidades, o inibidor é selecionado para emparelhar com um fluoróforo de modo a absorver a radiação eletromagnética emitida pelo fluoróforo. Pares de Flouróforo / inibidor úteis nas composições e métodos aqui descritos são bem conhecidos na arte e podem ser encontrados, por exemplo, descrito em S. Marras, “Selection of Fluorophore and Quencher Pairs for Fluorescent Nucleic Acid Hybridization Probes”, disponível no site da World Wide Web molecular beacons. org / download / Marras, mmb06% 28,335% 293.pdf.

[051] Em algumas modalidades, um fluoróforo está ligado a uma primeira extremidade da sonda e um inibidor é ligado a uma segunda extremidade da sonda. A união pode incluir a ligação covalente e pode incluir, opcionalmente, pelo menos uma molécula de ligação posicionada entre a sonda e o fluoróforo ou inibidores. Em algumas modalidades, um fluoróforo está ligado a uma extremidade 5 ‘ de uma sonda e um inibidor está ligado a uma extremidade 3’ da sonda. Em algumas modalidades, um fluoróforo está ligado a uma extremidade 3 ‘ de uma sonda e um inibidor está ligado a uma extremidade 5’ de uma sonda. Exemplos de sondas que podem ser utilizadas na amplificação quantitativa de ácido nucleico incluem, faróis moleculares, sondas Scorpion™ (Sigma), sondas TaqMan ™ (Life Technologies) e afins. Outras tecnologias de detecção de ácidos nucleicos que são úteis nas modalidades aqui reveladas incluem, mas não estão limitados a tecnologia de sonda de nanopartículas (Ver, Elghanian, et al (1997) Science 277: 1078-1081) e tecnologia de sondas Amplifluor (Ver, Pat US No: 6.090.592; 5.866.366 6, 1 17635; e 6,1 17,986).

[052] Os ácidos nucleicos aqui proporcionados podem ser de várias formas. Por exemplo, em algumas modalidades, os ácidos nucleicos estão dissolvidos (por si só ou em combinação com outros ácidos nucleicos) em solução tampão, por exemplo. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos são fornecidos, seja isoladamente ou em combinação com outros ácidos nucleicos isolados, como um sal do mesmo. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos são fornecidos sob uma forma liofilizada que pode ser reconstituída. Por exemplo, em algumas modalidades, os ácidos nucleicos isolados aqui descritos podem ser fornecidos em uma pelota liofilizada sozinha ou em um sedimento liofilizado com outros ácidos nucleicos isolados. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos são fornecidos afixados a uma substância sólida, tal como um grânulo, uma membrana ou semelhante. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos são fornecidos em uma célula hospedeira, por exemplo, uma linha de células transportando um plasmídeo ou uma linha celular que leva uma sequência estavelmente integrada.

Métodos

[053] São aqui proporcionados métodos para a detecção e / ou quantificação de N. gonorrhoeae em uma amostra. Em algumas modalidades, o método inclui um passo de fazer contactar a amostra a ser analisada com um ou mais oligonucleotídeos que hibridizam especificamente a sequência da região do gene opcA de N. gonorrhoeae, sob condições padrão de amplificação de ácidos nucleicos e / ou as condições de hibridização rigorosas. Em algumas modalidades, o método inclui a geração de um amplicon da sequência opcA a partir da amostra, se a amostra compreende N. gonorrhoeae. O método também pode incluir um passo de determinar a presença ou quantidade de um ou mais produtos amplificados como uma indicação da presença da sequência opcA e / ou N. gonorrhoeae na amostra.

Teste de ácido nucléico

[054] Os métodos aqui descritos podem incluir, por exemplo, teste de ácido nucleico. Por exemplo, o teste pode incluir testes para detecção de sequências alvo de ácidos nucleicos na amostra. Várias formas de teste de ácido nucleico podem ser utilizadas nas modalidades aqui descritas, incluindo, mas sem limitação, ensaios que envolvem a amplificação de ácido nucleico.

[055] Tal como aqui utilizado, amplificação de ácidos nucleicos refere-se a qualquer processo conhecido para a obtenção de múltiplas cópias de uma sequência de ácido nucleico alvo ou seu complemento ou seus fragmentos, usando métodos específicos de sequência. Exemplos de métodos de amplificação conhecidos incluem, mas não estão limitados a, reação em cadeia da polimerase (PCR), a reação em cadeia de ligase (LCR), amplificação isotérmica mediada por ciclo (LAMP), amplificação por deslocamento de cadeia (SDA) (por exemplo, amplificação por deslocamento de múltipla (MDA )), amplificação mediada por replicase, a amplificação de imuno-amplificação, com base sequência de ácido nucleico (NASBA), replicação de sequência auto-sustentada (3SR), amplificação por círculo de rolamento e a transcrição mediada (TMA). Ver, por exemplo, Mullis, “Process for amplifying, detecting and/or Cloning Nucleic Acid”, Pat. No. 4.683.195; Walker, “Strand Displacement Amplification”, US Pat. No. 5.455.166; Dean et al, “Multiple Displacement amplification”, Pat. No. 6.977.148; Notomi et al, “Process for Synthesizin Nucleic Acid”, Pat. No. 6.410.278; Landegren et al. Pat EUA. No. 4.988.617 “Method of detecting a nucleotic change in nucleic acids”; Birkenmeyer, “Amplification of Target Nucleic Acids Using Gap Filling Ligase Chain Reaction”, US Pat. No. 5.427.930; Cashman, “Blocked- Polymerase Polynucleotide Immunoassay Method and Kit,” US Pat. No. 5.849.478; Kacian et al., “Nucleic Acid Sequence Amplification Methods”, Pat. No. 5.399.491; Malek et al, “Enhanced Nucleic Acid Amplification Process”, Pat. No. 5.130.238;. Lizardi et al, Biotecnologia, 6: 1 197 (1988); Lizardi et al, Pat EUA. No. 5854033 “Rolling circle replication reporter systems”. Em algumas modalidades, dois ou mais dos métodos de amplificação de ácidos nucleicos acima mencionados podem ser realizados, por exemplo, sequencialmente.

[056] Por exemplo, a amplificação de LCR utiliza, pelo menos, quatro oligonucleotídeos separados para amplificar um alvo e a sua cadeia complementar, utilizando vários ciclos de hibridização, ligadura e desnaturação (Patente EP N° 0 320 308). SDA amplifica usando um iniciador que contém um local de reconhecimento para uma endonuclease de restrição que entalha em uma cadeia de um duplex de DNA hemimodificado que inclui a sequência-alvo, seguida pela amplificação de uma série de extensão do iniciador e passos deslocamento de cadeia (Pat. No. 5.422.252 Walker et al.).

[057] O PCR é um método bem conhecido na técnica para a amplificação de ácidos nucleicos. PCR envolve a amplificação de uma sequência alvo utilizando dois ou mais iniciadores de oligonucleotídicos específicos extensíveis das sequências que flanqueiam a sequência alvo. O ácido nucleico contendo a sequência alvo de interesse é submetido a um programa de múltiplas rondas de ciclos térmicos (desnaturação, emparelhamento e extensão), na presença de iniciadores, uma polimerase de DNA termoestável (por exemplo, a polimerase Taq) e vários dNTP, resultando na amplificação da sequência alvo. PCR utiliza múltiplos ciclos das reações de extensão do iniciador na qual as cadeias complementares de uma região definida de uma molécula de DNA são simultaneamente sintetizadas por uma polimerase de DNA termoestável. No final de cada ciclo, cada molécula de DNA sintetizada de novo atua como um molde para o ciclo seguinte. Durante ciclos repetidos destas reações, o número de cadeias de DNA recém-sintetizados aumenta exponencialmente tal que após 20 a 30 ciclos de reação, o DNA molde inicial foi replicados mil vezes ou várias vezes - milhão. Os métodos para a realização de diferentes tipos e modos de PCR estão completamente descritos na literatura, por exemplo, em “PCR Primer: A Laboratory Manual” Dieffenbach e Dveksler, eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995 e por Mullis et al. em patentes (por exemplo, Patente dos EUA N° s 4,683, 195, 4,683,202 e 4,800,159) e publicações científicas (por exemplo, Mullis et al 1987, Methods in Enzymology, 155:335-350), onde o conteúdo de cada referência é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

[058] PCR pode gerar produtos de amplificação de cadeia dupla adequados para o processamento pós-amplificação. Se desejado, os produtos de amplificação podem ser detectados por visualização com eletroforese em gel de agarose, por um formato de imunoensaio de enzima usando detecção colorimétrica à base de sonda, por tecnologia de emissão de fluorescência ou por outro meio de detecção conhecido para um perito na arte.

[059] Uma ampla variedade de métodos de PCR foi descrita em muitas fontes, por exemplo, Ausubel et al. (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Seção 15, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque (1994). Exemplos de método de PCR incluem, mas não se limitam a, PCR em tempo real, PCR de ponto final, polimorfismo do comprimento do fragmento de PCR amplificado (AFLP-PCR), Alu-PCR, PCR assimétrico, PCR Colony, DD-PCR, PCR degenerado, Hot -start PCR, PCR in situ, PCR inverso longo-PCR, PCR multiplex, PCR aninhado, PCR-ELISA, PCR- RFLP, polimorfismo de conformação em cadeia única de PCR (PCR-SSCP), PCR competitivo quantitativo (QC-PCR), amplificação rápida de extremidades de cDNA-PCR (RACE-PCR), Amplificação de DNA polimórfico-PCR aleatório (RAPD-PCR), PCR em tempo real, PCR palindrômica extragênica repetitiva (rep-PCR), PCR inverso de transcriptase (RT-PCR), TAIL-PCR, Touchdown PCR e Vectorette PCR.

[060] PCR em tempo real, também chamado reação de cadeia de polimerase em tempo real quantitativa (qRT-PCR), pode ser utilizada para quantificar e simultaneamente amplificar uma parte específica de uma dada molécula de ácido nucleico. Ela pode ser usada para determinar se uma sequência especifica está presente na amostra; e se ele estiver presente, o número de cópias da sequência que estão presentes. O termo “em tempo real” refere-se a monitorização periódica durante a PCR. Alguns sistemas, como o ABI 7700 e 7900HT Sequence Detection Systems (Applied Biosystems, Foster City, Calif.) realizam monitoramento durante cada ciclo térmico em um ponto pré-determinado ou definido pelo usuário. Análise em tempo real de PCR com a transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) investiga mudanças do sinal corante nas medidas fluorescentes de ciclo-a-ciclo, de preferência menos quaisquer sinais de controle interno. O processo em tempo real segue o padrão geral de PCR, mas o ácido nucleico é quantificado depois de cada ciclo de amplificação. Dois exemplos de método de quantificação são a utilização de corantes fluorescentes (por exemplo, SYBRGreen) que intercalam no DNA de cadeia dupla e sondas de oligonucleotídeos de DNA modificadas que fluorescem quando hibridizam com um DNA complementar. Agentes intercalantes têm uma fluorescência relativamente baixa, quando não ligados e uma fluorescência relativamente elevada, após ligação a ácidos nucleicos de cadeia dupla. Como tal, os agentes de intercalação podem ser utilizados para monitorizar a acumulação de ácidos nucleicos tensos duplos durante uma reação de amplificação de ácido nucleico. Exemplos de tais corantes não-específicos úteis nas modalidades aqui reveladas incluem agentes de intercalação, tal como SYBR Green I (Molecular Probes), iodeto de propídio, o brometo de etídio e semelhantes.

[061] Devido às sequências alvo específicas, iniciadores e sondas, os métodos aqui divulgados podem ser utilizados para detectar a presença / ausência ou quantidade de N. gonorrhoeae em amostras com uma elevada sensibilidade e precisão. Por exemplo, os métodos podem detectar com precisão N. gonorrhoeae para a exclusão de espécies de Neisseria não-gonorrhoeae estreitamente relacionados. Os métodos têm melhorado especificidade ou seja, reduzida ou nenhuma reatividade cruzada com espécies relacionadas de perto para Neisseria não- gonorrhoeae (por exemplo, N. lactamica, N. cineria e N. sica), em comparação com o sistema de detecção a base de gene Pilin (por exemplo, Ensaio de Amplificação ProbeTec ™ Qx).

[062] Os iniciadores aqui descritos podem ser emparelhados com os sistemas de PCR adicionais usando uma química uniforme e o perfil de PCR térmico para fornecer um painel de ensaios para a detecção de organismos vaginais, para melhorar a sensibilidade do ensaio geral e robustez.

[063] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo compreende uma porção detectável, tal como aqui descrito e a hibridização do oligonucleotídeo específico para a região do gene opcA pode ser detectada, por exemplo, por meios diretos ou indiretos. Consequentemente, algumas modalidades para a detecção e / ou identificação de N. gonorrhoeae em uma amostra incluem os passos de proporcionar uma amostra de teste; e o contato da amostra com uma sonda de oligonucleotídeo que hibridiza especificamente a região do gene opcA de N. gonorrhoeae, sob condições padrão de amplificação de ácidos nucleicos e / ou as condições de hibridização rigorosas, em que a sonda de oligonucleotídeo situa-se entre cerca de 10 e cerca de 45 nucleotídeos de comprimento e compreende uma porção detectável, em que o contato é efetuado sob condições que permitam a hibridização do iniciador específico para a região do gene opcA de N. gonorrhoeae se está presente na amostra. A presença e / ou quantidade de sonda que está especificamente ligada à região do gene opcA (se estiver presente na amostra a ser testada) pode ser determinada, em que a sonda ligada é indicativa da presença de N. gonorrhoeae na amostra. Em algumas modalidades, a quantidade de sonda ligada é usada para determinar a quantidade de N. gonorrhoeae na amostra.

[064] O passo de determinação pode ser realizado utilizando quaisquer métodos conhecidos para aqueles peritos na arte, incluindo, mas sem limitação, hibridização in situ, após o passo de contato. A detecção de hélices duplas híbridas (isto é, de uma sonda ligada especificamente a região do gene opcA) pode ser realizada por uma série de métodos. Tipicamente, duplexadores de hibridização são separados de ácidos nucleicos não hibridizados e as etiquetas ligadas às cadeias duplas são então detectadas. Esses rótulos referem-se a etiquetas ou rótulos de uso padrão na arte de radioativos, fluorescentes, biológicos ou enzimáticos. Um marcador pode ser conjugado a qualquer das sondas oligonucleotídicas ou os ácidos nucleicos derivados da amostra biológica. Os peritos na arte terão em consideração que os passos de lavagem podem ser empregues para lavar o excesso de amostra / ácidos nucleicos alvo ou sonda oligonucleotídica (bem como conjugado não ligado, se for caso disso). Além disso, formatos de ensaios heterogêneos convencionais são adequados para detectar os híbridos utilizando as etiquetas presentes nos iniciadores de oligonucleotídeos e sondas.

[065] Em algumas modalidades, uma amostra a ser testada para a presença de N. gonorrhoeaeé processada antes de se realizar os métodos aqui revelados. Por exemplo, em algumas modalidades, a amostra pode ser isolada, concentrada ou submetida a outros passos de processamento antes de realizar os métodos aqui revelados. Por exemplo, em algumas modalidades, a amostra pode ser processada para isolar os ácidos nucleicos a partir da amostra antes do contato da amostra com os oligonucleotídeos, tal como aqui divulgado. Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos são realizados em amostras, sem a cultura da amostra in vitro. Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos são realizados em amostras sem o isolamento de ácidos nucleicos a partir da amostra antes de fazer contactar a amostra com oligonucleotídeos tal como aqui divulgado.

[066] Os métodos aqui descritos são alteráveis à automação, proporcionando assim uma opção de alto rendimento para a detecção de N. gonorrhoeae. Várias plataformas de PCR multiplex, por exemplo, BD, víbora MAX ™ ™ ou plataformas de LT Viper ™, pode ser usado para executar um ou mais passos dos métodos descritos. Os métodos podem ser efetuados de uma forma simultânea. Por exemplo, a amplificação de ácido nucleico, em algumas modalidades, compreende a realização de PCR multiplex.

Amostras

[067] Os métodos e composições aqui descritos podem ser utilizados para detectar a presença / ausência e quantidade de N. gonorrhoeae em uma ampla variedade de amostras. Tal como aqui utilizado, uma “amostra” refere-se a uma amostra obtida a partir de um ou mais indivíduos ou número de fontes que são suspeitas de conterem ou potencialmente contém ácido nucleico de N. gonorrhoeae.

[068] A fonte da qual a amostra é recolhida não é limitada. Por exemplo, a amostra pode ser feita a partir de uma fonte biológica, tal como, tecidos, sangue, saliva, esputo, muco, suor, urina, a uretra, os esfregaços uretrais, colo do útero, os esfregaços cervicais, pênis, ânus, garganta, vagina, urogenitais ou anal, swabs da conjuntiva, fluido de lente ocular, líquido cefalorraquidiano, leite, fluido ascite, líquido sinovial, fluido peritoneal, fluido amniótico, caldos de fermentação, culturas de células, misturas de reação química e afins. A amostra biológica pode ser utilizada (i) diretamente tal como obtida a partir do objeto ou fonte ou (ii) após um pré-tratamento para modificar o caráter da amostra. Assim, a amostra de teste pode ser pré-tratada antes da utilização, por exemplo, através da preparação de plasma ou soro do sangue, rompendo as células ou partículas virais, a preparação de líquidos a partir de materiais sólidos, diluindo fluidos viscosos, filtrando líquidos, concentrando líquidos, inativando componentes interferentes, adicionando os reagentes, purificando ácidos nucleicos e semelhantes. A preparação da amostra pode também incluir o uso de uma solução que contém tampões, sais, detergentes e / ou similares que são utilizados para preparar a amostra para análise. Em algumas modalidades, a amostra é processada antes do teste molecular. Em algumas modalidades, a amostra é analisada diretamente e não é pré-processada antes do teste.

[069] A amostra pode ser uma amostra biológica, por exemplo uma amostra clínica. Em algumas modalidades, a amostra pode ser recolhida a partir da uretra, pénis, ânus, garganta, colo do útero ou na vagina de um sujeito. Em algumas modalidades, a amostra biológica é uma amostra vaginal.

[070] Amostras vaginal ou de urina são frequentemente infectadas com vários organismos. Os iniciadores e as sondas descritos são tolerantes a infeções mistas da matriz vaginal ou urina.

EXEMPLOS

[071] Os exemplos que se seguem são fornecidos para demonstrar situações particulares e as configurações em que esta tecnologia pode ser aplicada e não se destinam a restringir o escopo da invenção e as Reivindicações incluídas nesta divulgação.

Exemplo 1 Detecção de isolados clínicos de setenta e duas N. gonorrhoeae

[072] Tampões de exemplo foram incrementados com 72 N. gonorrhoeae isolados clínicos / cepas e lisadas por calor, respectivamente. Sistema BD MAX™ foi usado para extrair DNA de cada solução de amostra e o DNA extraído foi amplificado utilizando sistema opcA-6 PCR apresentado na Tabela 1 para detectar a presença da sequência da região do gene opcA em N. gonorrhoeae. Como mostrado na Figura 2, o sistema de opcA-6 identificou com sucesso todos os 72 isolados clínicos diferentes de N. gonorrhoeae testados.

[073] Este exemplo mostra que o sistema opcA-6 PCR pode ser usado para detectar uma grande variedade de isolados clínicos de N. gonorrhoeae.

Exemplo 2 Especificidade do ensaio do sistema opcA-6 PCR

[074] Tampões de exemplo foram incrementados com organismos Neisseria e lisados com calor, respectivamente. Sistema BD MAX ™ foi usado para extrair DNA de cada solução de amostra e o DNA extraído foi amplificado utilizando sistema opcA-6 PCR mostrado na Tabela 1 ou sistema Pilin qPCR para detectar a presença de organismos de Neisseria em soluções de amostra. Como mostrado na Figura 3A, o sistema opcA- 6 resultou em nenhum produto de amplificação em quaisquer amostras contendo apenas o Neisseria não-gonorrhoeae, e, assim, conduzido sem falsos positivos para todas as espécies de Neisseria gonorrhoeaenão testados. Tal como mostrado na Figura 3B, o sistema qPCR baseado em Pilin reagiu de forma cruzada com várias espécies de Neisseria não- gonorrhoeae (por exemplo, N. cineria, N. sica, N. lactamica) produtos de amplificação, enquanto o sistema opcA-6 apenas gerado na amostra enriquecida com N. gonorrhoeae.

[075] Este exemplo mostra que o sistema opcA-6 PCR é altamente específico para a N. gonorrhoeae e não reage de forma cruzada com todas as sequências Neisseria não-gonorrhoeae.

Exemplo 3 Especificidade do ensaio do sistema opcA-6 PCR

[076] Uma amostra de tampão foi enriquecida com organismos comumente encontrados em uma amostra clínica vaginal e lisados com calor, respectivamente. Sistema BD MAX ™ foi usado para extrair o DNA a partir da solução da amostra e o DNA extraído foi amplificado utilizando o sistema de opcA-6 PCR mostrado na Tabela 1. Como mostrado na Figura 4, o sistema opcA-6 não fez reação cruzada com qualquer um dos 115 organismos colocados na amostra e não resultou em nenhum produto de amplificação.

[077] Este exemplo mostra que o sistema opcA-6 PCR é altamente específico para N. gonorrhoeae e não reage de forma cruzada com sequências de organismos comumente encontrados em amostras clínicas vaginais.

Exemplo 4 Limites de detecção do sistema opcA-6 PCR

[078] Amostras clínicas de urina e de matriz vaginal foram incrementadas com N. gonorrhoeae e lisadas com catalisador. Sistema Viper™ XTR e BD MAX™ foram utilizados para extrair DNA das amostras, respectivamente e o DNA extraído foi amplificado utilizando sistema opcA-6 PCR apresentado na Tabela 1 para determinar os limites de detecção do sistema. Os resultados são mostrados na Figura 5. Como mostrado na Figura 5, o sistema de opcA-6 teve uma maior proporção positiva de qPCR sobre o sistema MAX do que o sistema de amplificação de N. gonorrhoeae atualmente utilizado no sistema ViperTMXTR (rotulado como GC Qx na Figura 5).

[079] Embora várias modalidades e aspectos tenham sido aqui divulgados, outros aspectos e modalidades serão evidentes para os peritos na arte. Os vários aspectos e modalidades aqui descritos são apenas para fins de ilustração e não se destinam a ser limitativos, sendo o verdadeiro escopo e espírito sendo indicado pelas Reivindicações seguintes.

[080] Um perito na arte irá ter em consideração que, para este e para outros processos e métodos aqui descritos, as funções desempenhadas nos processos e métodos podem ser implementadas em ordem diferente. Além disso, os passos e operações descritos são fornecidos apenas como exemplos e alguns dos passos e operações podem ser facultativos e combinados em menos passos e operações ou expandidos em passos e operações adicionais sem prejudicar a essência de modalidades divulgadas.

[081] No que diz respeito ao uso de substancialmente quaisquer termos no plural e/ou singular desta invenção, aqueles com conhecimentos na técnica podem traduzir do plural para o singular e / ou a partir do singular para o plural, conforme seja apropriado para o contexto e / ou aplicação. As várias permutações de singular / plural podem ser expressamente previstas neste documento para efeitos de clareza.

[082] Será entendido por aqueles dentro da arte que, em geral, os termos aqui utilizados e em especial nas Reivindicações apensas (por exemplo, corpos das Reivindicações anexas) destinam-se geralmente como termos “abertos” (por exemplo, o termo “ incluindo “deve ser interpretado como” incluindo, mas sem limitação, o termo” ter “deve ser interpretado como” tendo, pelo menos, o termo “inclui” deve ser interpretado como “inclui, mas não está limitado a” etc.). Será ainda entendido por aqueles dentro da técnica que, se for pretendido um número específico de uma citação introduzida na Reivindicação, essa intenção será expressamente citada na Reivindicação e, na ausência dessa citação, nenhuma pretensão está presente. Por exemplo, como ajuda para a compreensão, as seguintes Reivindicações anexas podem conter o uso das frases introdutórias “pelo menos um” e “um ou mais” para introduzir citações de Reivindicação. No entanto, o uso dessas frases não deve ser interpretado como implicando que a introdução de uma citação na Reivindicação pelos artigos indefinidos “um” ou “uma” limita qualquer Reivindicação particular, contendo essa citação da Reivindicação introduzida a modalidades que contêm apenas essa citação, mesmo quando a mesma Reivindicação inclui as frases introdutórias “um ou mais” ou “pelo menos um” e artigos indefinidos, tais como “um” ou “uma” (por exemplo, “um” e / ou “uma” devem ser interpretados como significando “pelo menos um” ou “um ou mais”); o mesmo vale para o uso de artigos definidos utilizados para introduzir citações de Reivindicação. Além disso, mesmo se um número específico de uma citação de Reivindicação introduzida for expressamente citado, os peritos na arte reconhecerão que essa citação deve ser interpretada como significando, pelo menos, o número citado (por exemplo, a mera citação de “duas citações”, sem outros modificadores, significa pelo menos duas citações ou duas ou mais citações). Além disso, nos casos em que uma convenção análoga a “pelo menos um de A, B e C etc.” for utilizada, em geral, essa construção pretende-se que seja no sentido de que um especialista na matéria compreenderá a convenção (por exemplo, “um sistema que tem pelo menos um de A, B e C” incluirá, mas sem limitação, sistemas que têm A isoladamente, B isoladamente, C isoladamente, A e B, em conjunto, A e C em conjunto, B e C em conjunto e / ou A, B e C em conjunto etc.). Naqueles casos em que uma convenção análoga a “pelo menos um de A, B ou C etc.” é utilizada, em geral, essa construção é pretendida no sentido de que um especialista na matéria compreenderá a convenção (por exemplo, “um sistema que tem pelo menos um de A, B, ou C” incluirá, mas sem limitação, sistemas que têm A isoladamente, B isoladamente, C isoladamente, A e B em conjunto, A e C em conjunto, B e C em conjunto e / ou A, B e C em conjunto etc.). Será ainda entendido por aqueles dentro da técnica que, virtualmente, qualquer palavra e / ou frase disjuntiva apresentando dois ou mais termos alternativos, quer no Relatório Descritivo, quer nas Reivindicações quer nos Desenhos, deve ser entendido contemplar as possibilidades de incluir um dos termos, qualquer um dos termos ou ambos os termos. Por exemplo, a frase “A ou B” será entendida como incluindo as possibilidades de “A” ou “B” ou “A e B.”

[083] Além disso, onde as características ou aspectos da invenção são descritos em termos de grupos de Markush, aqueles especialistas na técnica irão reconhecer que a revelação também é assim descrita em termos de quaisquer membros ou subgrupos de membros individuais do grupo Markush.

[084] Tal como será entendido por um especialista na técnica, para qualquer e todos os fins, tais como em termos para proporcionar uma descrição escrita, todos os intervalos aqui revelados também englobam todas e quaisquer subfaixas e combinações de subfaixas possíveis destas. Qualquer faixa listada pode ser facilmente reconhecida como descrevendo de modo suficiente e permitindo que a mesma faixa seja dividida em pelo menos metades, terços, quartos, quintos, décimos iguais etc. Como exemplo não limitativo, cada faixa aqui discutida pode ser prontamente dividida em um terço inferior, terço médio, terço superior etc. Tal como também será entendido por um perito na arte, toda a linguagem tal como “até”, “pelo menos” e similares inclui o número citado e refere-se a faixas que podem ser, subsequentemente, divididas em subfaixas, como discutido acima. Finalmente, tal como será entendido por um perito na arte, uma faixa inclui cada membro individual. Assim, por exemplo, um grupo que possui 1-3 células refere-se a grupos tendo 1, 2 ou 3 células. Da mesma forma, um grupo com 1 -5 células refere-se a grupos tendo 1, 2, 3, 4 ou 5 células e assim por diante.

[085] A partir do exposto, será tido em consideração que várias formas de realização da presente descrição foram aqui descritas para fins de ilustração e que várias modificações podem ser feitas sem afastamento do âmbito e espírito da presente revelação. Por conseguinte, as várias formas de realização aqui descritas não se destinam a ser limitativas, com o verdadeiro âmbito e espírito sendo indicado pelas Reivindicações seguintes.

Claims (29)

1. Sonda ou Iniciador de Oligonucleotídeo, até 100 nucleotídeos de comprimento, que é capaz de hibridizar com o gene de proteína externo principal (opcA) de Neisseria gonorrhoeae, caracterizada por que a referida sonda ou iniciador compreende uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1-6, ou sequência que exibe pelo menos 85% de identidade com uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1-6.

2. Sonda ou Iniciador de Oligonucleotídeo, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por que a referida sonda ou iniciador consiste em uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1-6, ou uma sequência que exibe pelo menos 85% de identidade com uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1-6.

3. Sonda ou Iniciador de Oligonucleotídeo, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por que a referida sonda ou iniciador consiste em uma sequência que exibe pelo menos 95% de identidade com uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1-6.

4. Sonda ou Iniciador de Oligonucleotídeo, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por que a referida sonda ou iniciador consiste em uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1-6.

5. Método Para Determinar Presença da Sequência do Gene de Proteína Externa Principal (opcA) de Neisseria gonorrhoeae, em amostra biológica, compreendendo: contatar a referida amostra biológica com pelo menos um par de iniciadores capazes de hibridizar com o gene de proteína externa principal (opcA) de Neisseria gonorrhoeae, caracterizado por que cada iniciador no dito pelo menos um par de iniciadores compreende uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 2, 4 and 5, ou sequência que exibe pelo menos 85% de identidade com uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 2, 4 e 5, e em que dito pelo menos um par de iniciadores é configurado para gerar um amplicon de uma sequência de opcA sob condições padrão de amplificação de ácido nucleico; gerar um amplicon da sequência de opcA a partir da referida amostra biológica, se a referida amostra compreender Neisseria gonorrhoeae; e determinar a presença ou quantidade de um ou mais produtos amplificados como uma indicação da presença da sequência de opcA na referida amostra biológica.

6. Método Para Determinar Presença da Sequência do Gene de Proteína Externa Principal (opcA) de Neisseria gonorrhoeae, de acordo com a Reivindicação 5, caracterizado por que a referida amostra biológica está em contato com um par de iniciadores selecionados do grupo consistindo de: a) SEQ ID NOs: 1 e 2; ou b) SEQ ID NOs: 4 e 5.

7. Método Para Determinar Presença da Sequência do Gene de Proteína Externa Principal (opcA) de Neisseria gonorrhoeae, de acordo com a Reivindicação 6, caracterizado por que um par de iniciadores é: SEQ ID NOs: 1 e 2.

8. Método Para Determinar Presença da Sequência do Gene de Proteína Externa Principal (opcA) de Neisseria gonorrhoeae, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 5 a 7, caracterizado por que a referida amplificação é realizada usando um método selecionado a partir do grupo que consiste em reação de cadeia da polimerase (PCR), reação de cadeia da ligase (LCR), amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP), amplificação de deslocamento de filamento (SDA), amplificação mediada por replicase, Imunoamplificação, amplificação à base de sequência de ácido nucleico (NASBA), replicação de sequência autossustentada (3SR), amplificação por círculo de rolamento e amplificação mediada por transcrição (TMA).

9. Método Para Determinar Presença da Sequência do Gene de Proteína Externa Principal (opcA) de Neisseria gonorrhoeae, de acordo com a Reivindicação 8, caracterizado por que a referida PCR é PCR em tempo real quantitativa (QRT-PCR).

10. Método Para Determinar Presença da Sequência do Gene de Proteína Externa Principal (opcA) de Neisseria gonorrhoeae, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 5 a 9, caracterizado por que cada iniciador compreende sequência de nucleotídeo exógena que permite manipulação pós-amplificação de produtos de amplificação sem um efeito significativo na própria amplificação.

11. Método Para Determinar Presença da Sequência do Gene de Proteína Externa Principal (opcA) de Neisseria gonorrhoeae, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 5 a 10, caracterizado por que compreende ainda contactar o dito amplicon com uma sonda oligonucleotídica.

12. Método Para Determinar Presença da Sequência do Gene de Proteína Externa Principal (opcA) de Neisseria gonorrhoeae, de acordo com a Reivindicação 11, caracterizado por que a dita sonda oligonucleotídica tem uma sequência de ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO: 3 ou 6, ou uma sequência que exibe pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 3 ou 6.

13. Método Para Determinar Presença da Sequência do Gene de Proteína Externa Principal (opcA) de Neisseria gonorrhoeae, de acordo com a Reivindicação 11, caracterizado por que a dita sonda oligonucleotídica tem uma sequência de ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO: 3 ou 6.

14. Método Para Determinar Presença da Sequência do Gene de Proteína Externa Principal (opcA) de Neisseria gonorrhoeae, de acordo com a Reivindicação 11, caracterizado por que a dita sonda oligonucleotídica tem uma sequência de ácido nucleico consistindo de SEQ ID NO: 3 ou 6.

15. Método Para Determinar Presença da Sequência do Gene de Proteína Externa Principal (opcA) de Neisseria gonorrhoeae, de acordo com a Reivindicação 14, caracterizado por que a dita sonda oligonucleotídica tem uma sequência de ácido nucleico consistindo de SEQ ID NO: 3 e em que os ditos primeiro e segundo iniciadores de amplificação têm uma sequência de ácido nucleico que consiste em SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente.

16. Método Para Determinar Presença da Sequência do Gene de Proteína Externa Principal (opcA) de Neisseria gonorrhoeae, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 5 a 15, caracterizado por que a referida amostra biológica é uma amostra clínica.

17. Método Para Determinar Presença da Sequência do Gene de Proteína Externa Principal (opcA) de Neisseria gonorrhoeae, de acordo com a Reivindicação 16, caracterizado por que a referida amostra biológica é coletada a partir da uretra, pênis, ânus, garganta, colo do útero ou vagina.

18. Método Para Determinar Presença da Sequência do Gene de Proteína Externa Principal (opcA) de Neisseria gonorrhoeae, de acordo com a Reivindicação 16, caracterizado por que a referida amostra biológica é uma amostra vaginal.

19. Composição Para Detecção de Neisseria gonorrhoeae, caracterizada por que a referida composição compreende: um primeiro e um segundo iniciadores de amplificação hibridizando especificamente com a sequência do gene de proteína externa principal (opcA) de Neisseria gonorrhoeae ou ao seu complemento, em que o primeiro e o segundo iniciadores de amplificação são de 10 a 50 nucleotídeos de comprimento, em que os referidos primeiro e segundo iniciadores de amplificação compreendem uma sequência que possui pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 1, 2, 4 ou 5 e em que o opcA tem a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 7 e em que os referidos primeiro e segundo iniciadores de amplificação são configurados para gerar um amplicon de uma sequência opcA.

20. Composição Para Detecção de Neisseria gonorrhoeae, de acordo com a Reivindicação 19, caracterizada por que compreende ainda uma sonda, em que a referida sonda hibrida especificamente com o amplicon opcA.

21. Composição Para Detecção de Neisseria gonorrhoeae, de acordo com a Reivindicação 20, caracterizada por que a sonda compreende uma sequência da SEQ ID NO: 3 ou 6, ou sequência que exibe pelo menos 85% de identidade com uma sequência da SEQ ID NO: 3 ou 6.

22. Composição Para Detecção de Neisseria gonorrhoeae, de acordo com a Reivindicação 20, caracterizada por que a sonda tem uma sequência de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 6.

23. Composição Para Detecção de Neisseria gonorrhoeae, de acordo com a Reivindicação 20, caracterizada por que a referida sonda compreende uma fração emissora de fluorescência e uma fração extintora de fluorescência.

24. Composição Para Detecção de Neisseria gonorrhoeae, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 19 a 23, caracterizada por que os referidos primeiro e segundo iniciadores de amplificação compreendem uma sequência que possui pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 1, 2, 4 ou 5.

25. Composição Para Detecção de Neisseria gonorrhoeae, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 19 a 23, caracterizada por que os referidos primeiro e segundo iniciadores de amplificação compreendem uma sequência da SEQ ID NO: 1, 2, 4 ou 5.

26. Composição Para Detecção de Neisseria gonorrhoeae, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 19 a 23, caracterizada por que os referidos primeiro e segundo iniciadores de amplificação consistem em uma sequência de SEQ ID NO: 1, 2, 4 ou 5.

27. Composição Para Detecção de Neisseria gonorrhoeae, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 19 a 23, caracterizada por que os referidos primeiro e segundo iniciadores de amplificação são um par de iniciadores selecionados do grupo de: a) SEQ ID NOs: 1 e 2; ou b) SEQ ID NOs: 4 e 5

28. Composição Para Detecção de Neisseria gonorrhoeae, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 19 a 23, caracterizada por que os referidos primeiro e segundo iniciadores de amplificação são um par de iniciadores de SEQ ID NOs: 1 e 2.

29. Composição Para Detecção de Neisseria gonorrhoeae, de acordo com a Reivindicação 28, caracterizada por que compreende ainda uma sonda consistindo em SEQ ID NO: 3.

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