JP6408447B2 - Lamp産物の均質リアルタイム検出のための配列特異的方法 - Google Patents
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Description
本出願は、特願2012−537982号の分割出願である。
(a)核酸シグナルプライマーを核酸標的配列の領域にハイブリダイズさせるステップであって、前記標的配列はループ媒介等温増幅反応中に生じた少なくとも1つの自己相補的ヘアピン構造を含み、前記領域はヘアピン構造のループ領域に位置していないステップと、
(b)ハイブリダイズした核酸シグナルプライマーを核酸標的配列上で伸長させて、第一のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第一のシグナル伸長産物は1つのヘアピン構造を含むステップと
を含む方法が本明細書において提示される。
(a)核酸シグナルプライマーを核酸標的配列領域にハイブリダイズさせるステップであって、標的配列はループ媒介等温増幅反応中に生じた少なくとも1つの自己相補的ヘアピン構造を含むステップと、
(b)ハイブリダイズした核酸シグナルプライマーを核酸標的配列上で伸長させて、第一のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第一のシグナル伸長産物はヘアピン構造を含むステップと、
(c)核酸増幅プライマーを第一のシグナル伸長産物のループ領域にハイブリダイズさせ、第一のシグナル伸長産物上でハイブリダイズした核酸増幅プライマーを伸長させて第二のシグナル伸長産物および第三のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第二のシグナル伸長産物はヘアピン構造を欠き、前記第三のシグナル伸長産物はその5’末端にヘアピン構造を有するステップと
を含む方法が本明細書において提示される。
(a)核酸シグナルプライマーを核酸標的配列領域にハイブリダイズさせるステップであって、標的配列はループ媒介等温増幅反応中に生じた少なくとも1つの自己相補的ヘアピン構造を含むステップと、
(b)核酸標的配列上でハイブリダイズした核酸シグナルプライマーを伸長させて、第一のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第一のシグナル伸長産物はヘアピン構造を含むステップと、
(c)核酸増幅プライマーを第一のシグナル伸長産物のループ領域にハイブリダイズさせ、第一のシグナル伸長産物上でハイブリダイズした核酸増幅プライマーを伸長させて、第二のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第二のシグナル伸長産物は二本鎖でありヘアピン構造を欠くステップと、
(d)核酸シグナルプライマーを第二のシグナル伸長産物にハイブリダイズさせ、第二のシグナル伸長産物上でハイブリダイズした核酸シグナルプライマーを伸長させて、第三のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第三のシグナル伸長産物はその5’末端にヘアピン構造を有するステップと
を含む方法が本明細書において提示される。
(a)核酸シグナルプライマーを核酸標的配列領域にハイブリダイズさせるステップであって、標的配列はループ媒介等温増幅反応中に生じた少なくとも1つの自己相補的ヘアピン構造を含むステップと、
(b)ハイブリダイズした核酸シグナルプライマーを核酸標的配列上で伸長させて、第一のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第一のシグナル伸長産物はヘアピン構造を含むステップと、
(c)核酸増幅プライマーを第一のシグナル伸長産物のループ領域にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした核酸増幅プライマーを第一のシグナル伸長産物上で伸長させて、第二のシグナル伸長産物および第三のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第二のシグナル伸長産物はヘアピン構造を欠き、前記第三のシグナル伸長産物は一本鎖でありその5’末端にヘアピン構造を有するステップと、
(d)核酸シグナルプライマーを第三のシグナル伸長産物にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした核酸シグナルプライマーを第三のシグナル伸長産物上で伸長させて、第四のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第四のシグナル伸長産物は二本鎖核酸を含むステップと
を含む方法である。
(a)核酸シグナルプライマーを核酸標的配列領域にハイブリダイズさせるステップであって、標的配列はループ媒介等温増幅反応中に生じた少なくとも1つの自己相補的ヘアピン構造を含むステップと、
(b)ハイブリダイズした核酸シグナルプライマーを核酸標的配列上で伸長させて、第一のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第一のシグナル伸長産物はヘアピン構造を含むステップと、
(c)核酸増幅プライマーを第一のシグナル伸長産物のループ領域にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした核酸増幅プライマーを第一のシグナル伸長産物上で伸長させて、第二のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第二のシグナル伸長産物は二本鎖でありヘアピン構造を欠くステップと、
(d)核酸シグナルプライマーを第二のシグナル伸長産物にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした核酸シグナルプライマーを第二のシグナル伸長産物上で伸長させて、第三のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第三のシグナル伸長産物は一本鎖でありその5’末端にヘアピン構造を有するステップと、
(e)核酸シグナルプライマーを第三のシグナル伸長産物にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした核酸シグナルプライマーを第三のシグナル伸長産物上で伸長させて、第四のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第四のシグナル伸長産物は二本鎖核酸を含むステップと
を含む方法が本明細書において提示される。
相補的核酸をハイブリダイズさせ核酸伸長反応を起こさせる条件下で、標的核酸分子とプライマー核酸F3、FLP、FSP、RLP、RSPおよびR3を組み合わせるステップであって、
(i)標的核酸およびプライマー核酸のそれぞれが5’末端(「5’」)および3’末端(「3’」)を含み;
(ii)プライマー核酸F3、FLPおよびFSPのそれぞれが、標的核酸分子3’から5’の順に、以下のF3、FLP、FSPの通りに、標的核酸分子の異なる部分に相補的であり;
(iii)FLPは、3’から5’の順に、標的核酸分子の部分(F2c)に相補的である第一の部分(F2)およびF2cの5’側であるがFSPが相補的である標的核酸の部分(FSc)の3’側である標的核酸分子の部分(F1c)と同一の第二の部分(F1c)を含み;
(iv)FSPは、3’から5’の順に、標的核酸分子の部分(FSc)に相補的である第一の部分(FS)、および随意に、標的核酸に相補的ではない検出可能な核酸配列を含む第二の部分(S1)を含み;
(v)プライマー核酸R3、RLPおよびRSPのそれぞれが、以下の、標的核酸分子5’から3’の順に:R3、RLP、RSPの通りに標的核酸の異なる部分と同一であり;
(vi)RLPは、3’から5’の順に、標的核酸分子の部分(R2)と同一である第一の部分(R2)、およびR2の3’側であるがRSPと同一の標的核酸の部分(RS)の上流の標的核酸分子の部分(R1)に相補的である第二の部分(R1c)を含み;
(vii)RSPは、3’から5’の順に、FScの5’側の標的核酸分子の部分(RS)と同一の第一の部分、および随意に、標的核酸に相補的ではない検出可能な核酸配列を含む第二の部分(S2)を含み、その結果、5’から3’の順に、R1c、R2、R1、RS、FScおよび(随意に)S1cを含み、S1cがS1に相補的である核酸検出産物が生じるステップとを含む方法が本明細書において提示される。ある種の実施形態では、標的核酸分子は、FScの5’側およびRSの3’側である部分Dを含み、その結果、生じる核酸検出産物は、5’から3’の順に、R1c、R2、R1、RS、Dおよび(随意に)S1cを含む。一般に、生じる核酸産物はDの単一コピーのみを含む。別の態様では、方法は、核酸検出産物の存在および/または量を検出するステップをさらに含む。ある種の実施形態では、そのような方法は、核酸検出産物においてDの存在を検出するステップを含む。
相補的核酸をハイブリダイズさせ核酸伸長反応を起こさせ、それによってFSPを標的核酸分子にハイブリダイズさせてFSPを伸長する条件下で、(i)3’および5’末端ヘアピン構造を含む標的核酸分子、ならびに(ii)3’から5’の順に、3’ヘアピン構造の5’側であり5’ヘアピン構造の3’側の直鎖状核酸分子の部分(FSc)に相補的である第一の部分(FS)、および随意に、標的核酸分子に相補的ではない検出可能な核酸配列を含む第二の部分(S1)を含む核酸プライマー(FSP)を組み合わせ、その結果、5’から3’の順に、FSPおよび5’末端ヘアピン構造の実質的にすべてに相補的である核酸配列を含む核酸伸長産物が生じるステップを含む方法が本明細書において提供される。さらに別の実施形態では、生じた核酸伸長産物は、FSPの実質的にすべてに相補的である3’末端をさらに含む。
相補的核酸をハイブリダイズさせ核酸伸長反応を起こさせる条件下で、(i)3’末端ヘアピン構造と5’末端ヘアピン構造を含む標的核酸分子、(ii)3’から5’の順に、3’ヘアピン構造の5’側であり5’ヘアピン構造の3’側の直鎖状核酸分子の部分(FSc)に相補的である第一の部分(FS)、および随意に、標的核酸分子に相補的ではない検出可能な核酸配列を含む第二の部分(S1)を含む核酸プライマー(FSP)、ならびに(iii)3’から5’の順に、5’末端ヘアピン構造のループ部分と同一の第一の部分(R2)および5’末端ヘアピン構造のヘアピン区分内のR2の3’側の標的核酸分子の部分(R1)に相補的である第二の部分(R1c)を含む核酸プライマー(RLP)を組み合わせ、その結果、5’から3’の順に、RLP(R1cとR2)、R1およびFSPの実質的にすべてに相補的である核酸配列を含む核酸検出産物が生じるステップを含む方法が本明細書において提供される。別の実施形態では、方法は、5’から3’の順に、FSP(S1(随意)およびFS)、FS、RSc、R2cならびにR1の実質的にすべてを含む核酸検出産物であって、RScはRSに相補的であり、R2cはR2に相補的である核酸検出産物を生じさせるステップをさらに含む。別の態様では、そのような方法は、核酸検出産物の存在および/または量を検出するステップをさらに含むことが可能である。
本明細書において使用されるように、以下の用語および語句は以下の通りに使用される。
本明細書に提示される方法は、一般にLAMP等温核酸増幅と併せて実施されるが、従来のLAMPを使用して生成される核酸中に存在する問題のある連鎖状の二次構造(例えば、標的核酸分子のいくつかの逆方向反復を有するステムループDNAおよび同一鎖中に標的分子の交互逆方向反復間のアニーリングにより形成される複数のループを有するカリフラワー状構造であり、それぞれが高融解温度および折り畳まれる強い傾向を有する)のない核酸検出産物の作製を可能にする。例えば、一態様では、LAMP反応と併せてシグナルプライマーまたはプライマー対を利用して、対象の標的核酸分子部分またはその相補体を含む核酸検出産物であって、ヘアピン核酸配列または構造を含まず、それによって、特に検出を受け入れやすくなる核酸検出産物を生じさせることにより、1つまたは複数の標的核酸分子内の1つまたは複数の核酸配列のリアルタイム配列特異的作製および検出を可能にする方法および組成物が本明細書において提示される。例えば、核酸検出産物(単数または複数)は、レポータープローブの従来のハイブリダイゼーションによりまたは核酸検出産物(複数可)を生じさせるために使用される1つまたは複数のシグナルプライマーにレポーター基を組み込むことにより検出することが可能である。さらに、核酸検出産物は、例えば、LAMP工程と併せて、例えば、その工程中に、リアルタイムで生成され、例えば、リアルタイム蛍光フォーマットを使用して、単一反応容器、例えば、管内で複数の核酸検出産物を検出するという選択肢を提供することが可能である。
相補的核酸をハイブリダイズさせ核酸伸長反応を起こさせる条件下で、標的核酸分子ならびに置換プライマー核酸F3とR3、増幅プライマーFLPとRLP、およびシグナルプライマーFSPとRSPを組み合わせるステップであって、
(i)標的核酸およびプライマー核酸のそれぞれが5’末端(「5’」)および3’末端(「3’」)を含み;
(ii)プライマー核酸F3、FLPおよびFSPのそれぞれが、標的核酸分子3’から5’の順に、以下のF3、FLP、FSPの通りに、標的核酸分子の異なる部分に相補的であり;
(iii)FLPは、3’から5’の順に、標的核酸分子の部分(F2c)に相補的である第一の部分(F2)およびF2cの5’側であるがFSPが相補的である標的核酸の部分(FSc)の3’側の標的核酸分子の部分(F1)と同一である第二の部分(F1c)を含み;
(iv)FSPは、3’から5’の順に、標的核酸分子の部分(FSc)に相補的である第一の部分(FS)および随意に、標的核酸に相補的ではない検出可能な核酸配列を含む第二の部分(S1)を含み;
(v)プライマー核酸R3、RLPおよびRSPのそれぞれが、標的核酸分子5’から3’の順に、以下のR3、RLP、RSPの通りに、標的核酸の異なる部分と同一であり;
(vi)RLPは、3’から5’の順に、標的核酸分子の部分(R2)と同一である第一の部分(R2)およびR2の3’側であるが、RSPと同一の標的核酸の部分(RS)の5’側の標的核酸分子の部分(R1)に相補的である第二の部分(R1c)を含み;
(vii)RSPは、3’から5’の順に、FScの5’側の標的核酸分子の部分(RS)と同一である第一の部分および随意に、標的核酸に相補的ではない検出可能な核酸配列を含む第二の部分(S2)を含み、その結果、5’から3’の順に、R1c、R2、R1、RS、FScおよび(随意に)S1cを含む核酸検出産物が生じるステップ、
を含む。ある種の実施形態では、標的核酸分子はFScの5’側およびRSの3’側である部分Dを含み、その結果、生じる核酸検出産物が5’から3’の順に、R1c、R2、R1、RS、Dおよび(随意に)S1cを含む。別の態様では、方法は、核酸検出産物の存在および/または量を検出するステップをさらに含む。ある種の実施形態では、そのような方法は、核酸検出産物においてDの存在を検出するステップを含む。
(a)第一の核酸シグナルプライマー、第一の核酸増幅プライマーおよび第一の核酸置換プライマーを核酸標的配列の領域にハイブリダイズさせるステップであって、
第一の核酸シグナルプライマーの少なくとも一部が、第一の核酸増幅プライマーの3’末端部分がハイブリダイズする標的配列領域の下流の標的配列領域にハイブリダイズし;
第一の核酸増幅プライマーが、i)第一のシグナルプライマーがハイブリダイズする標的配列領域の上流の標的配列領域にハイブリダイズする3’末端部分、およびii)第一の核酸増幅プライマーの3’末端部分がハイブリダイズする標的配列領域の下流の標的配列の領域と実質的に同じヌクレオチド配列を含む5’末端部分を含み;
第一の核酸置換プライマーが、第一の核酸増幅プライマーの3’末端部分がハイブリダイズする標的配列領域の上流の標的配列領域にハイブリダイズするステップと、
(b)ハイブリダイズした第一の核酸シグナルプライマーを核酸標的配列上で伸長させて第一のシグナル伸長産物を生成し;ハイブリダイズした第一の核酸増幅プライマーを核酸標的配列上で伸長させ、その結果、第一の増幅プライマーの伸長が核酸標的配列由来の第一のシグナル伸長産物を置換除去し;第一の核酸置換プライマーを伸長させ、その結果、第一の核酸置換プライマーの伸長が核酸標的配列由来の第一の増幅伸長産物を置換除去するステップと
を含む。
(a)第二の核酸シグナルプライマー、第二の核酸増幅プライマーおよび第二の核酸置換プライマーを第一のシグナル伸長産物の領域にハイブリダイズさせるステップであって、
第二の核酸シグナルプライマーの少なくとも一部が、第二の核酸増幅プライマーの3’末端部分がハイブリダイズする第一のシグナル伸長産物領域の下流の第一のシグナル伸長産物領域にハイブリダイズし;
第二の核酸増幅プライマーが、i)第二のシグナルプライマーがハイブリダイズする第一のシグナル伸長産物領域の上流の第一のシグナル伸長産物領域にハイブリダイズする3’末端部分、およびii)第二の核酸増幅プライマーの3’末端部分がハイブリダイズする第一のシグナル伸長産物領域の下流の第一のシグナル伸長産物の領域と実質的に同じヌクレオチド配列を含む5’末端部分を含み;
第二の核酸置換プライマーが、第二の核酸増幅プライマーの3’末端部分がハイブリダイズする第一のシグナル伸長産物領域の上流の第一のシグナル伸長産物領域にハイブリダイズするステップと、
(b)ハイブリダイズした第二の核酸シグナルプライマーを第一のシグナル伸長産物上で伸長させて第二のシグナル伸長産物を生成し;ハイブリダイズした第二の核酸増幅プライマーを第一のシグナル伸長産物上で伸長させ、その結果、第二の増幅プライマーの伸長が第一のシグナル伸長産物由来の第二のシグナル伸長産物を置換除去し;第二の核酸置換プライマーを伸長させ、その結果、第二の核酸置換プライマーの伸長が第一のシグナル伸長産物由来の第二の増幅伸長産物を置換除去するステップと
をさらに含む。
(a)第二の核酸シグナルプライマー、第二の核酸増幅プライマーおよび第二の核酸置換プライマーを第一のシグナル伸長産物の領域にハイブリダイズさせるステップであって、
第二の核酸シグナルプライマーの少なくとも一部が、第二の核酸増幅プライマーの3’末端部分がハイブリダイズする第一のシグナル伸長産物領域の下流の第一のシグナル伸長産物領域にハイブリダイズし;
第二の核酸増幅プライマーが、i)第二のシグナルプライマーがハイブリダイズする第一のシグナル伸長産物領域の上流の第一のシグナル伸長産物領域にハイブリダイズする3’末端部分、およびii)第二の核酸増幅プライマーの3’末端部分がハイブリダイズする第一のシグナル伸長産物領域の下流の第一のシグナル伸長産物の領域と実質的に同じヌクレオチド配列を含む5’末端部分を含み;
第二の核酸置換プライマーが、第二の核酸増幅プライマーの3’末端部分がハイブリダイズする第一のシグナル伸長産物領域の上流の第一のシグナル伸長産物領域にハイブリダイズし;
第一のシグナル伸長産物が、ループ媒介等温増幅反応において増幅と同時に生じるステップと、
(b)ハイブリダイズした第二の核酸シグナルプライマーを第一のシグナル伸長産物上で伸長させて第二のシグナル伸長産物を生成し;ハイブリダイズした第二の核酸増幅プライマーを第一のシグナル伸長産物上で伸長させ、その結果、第二の増幅プライマーの伸長が第一のシグナル伸長産物由来の第二のシグナル伸長産物を置換除去し;第二の核酸置換プライマーを伸長させて、その結果、第二の核酸置換プライマーの伸長が第一のシグナル伸長産物由来の第二の増幅伸長産物を置換除去するステップと
を含む。
(a)核酸シグナルプライマーを核酸標的配列の領域にハイブリダイズさせるステップであって、前記標的配列はループ媒介等温増幅反応中に生じた少なくとも1つの自己相補的ヘアピン構造を含み、前記領域はヘアピン構造のループ領域に位置していないステップと、
(b)ハイブリダイズした核酸シグナルプライマーを核酸標的配列上で伸長させて、第一のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第一のシグナル伸長産物は1つのヘアピン構造を含むステップと
を含む。
(a)核酸シグナルプライマーを核酸標的配列領域にハイブリダイズするステップであって、標的配列はループ媒介等温増幅反応中に生じた少なくとも1つの自己相補的ヘアピン構造を含むステップと、
(b)ハイブリダイズした核酸シグナルプライマーを核酸標的配列上で伸長させて、第一のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第一のシグナル伸長産物がヘアピン構造を含むステップと、
(c)核酸増幅プライマーを第一のシグナル伸長産物のループ領域にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした核酸増幅プライマーを第一のシグナル伸長産物上で伸長させて、第二のシグナル伸長産物および第三のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第二のシグナル伸長産物がヘアピン構造を欠き、前記第三のシグナルがその5’末端にヘアピン構造を有するステップと
を含む。
(a)核酸シグナルプライマーを核酸標的配列領域にハイブリダイズするステップであって、標的配列はループ媒介等温増幅反応中に生じた少なくとも1つの自己相補的ヘアピン構造を含むステップと、
(b)ハイブリダイズした核酸シグナルプライマーを核酸標的配列上で伸長させて、第一のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第一のシグナル伸長産物がヘアピン構造を含むステップと、
(c)核酸増幅プライマーを第一のシグナル伸長産物のループ領域にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした核酸増幅プライマーを第一のシグナル伸長産物上で伸長させて、第二のシグナル伸長産物および第三のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第二のシグナル伸長産物がヘアピン構造を欠き、前記第三のシグナル伸長産物が一本鎖であり、その5’末端にヘアピン構造を有するステップと、
(d)核酸シグナルプライマーを第三のシグナル伸長産物にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした核酸シグナルプライマーを第三のシグナル伸長産物上で伸長させて、第四のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第四のシグナル伸長産物が二本鎖核酸を含むステップと
を含む。
(a)第一のシグナルプライマーを標的配列の第一の鎖にハイブリダイズさせるステップと、
(b)標的配列の第一の鎖にハイブリダイズする3’末端部分と標的配列の第一の鎖の任意の領域と実質的に同じヌクレオチド配列を含む5’末端部分を含む第一の増幅プライマーを、第一のシグナルプライマーの上流の標的配列の第一の鎖にハイブリダイズさせるステップと、
(c)ハイブリダイズした第一のシグナルプライマーを標的配列の第一の鎖上で伸長させて第一のシグナル伸長産物を生成し、ハイブリダイズした第一の増幅プライマーを標的配列の第一の鎖上で伸長させ、その結果、第一の増幅プライマーの伸長が標的配列由来の第一のシグナル伸長産物を置換除去するステップと、
(d)第一の増幅プライマーの上流の標的配列の第一の鎖に第一の置換プライマーをハイブリダイズさせ、第一の置換プライマーをその3’末端から伸長させて、標的配列由来の第一の増幅伸長産物を置換除去するステップと、
(e)第二のシグナルプライマーを置換された第一のシグナル伸長産物にハイブリダイズさせるステップと、
(f)第一のシグナル伸長産物にハイブリダイズする3’末端部分と第一のシグナル伸長産物の任意の領域と実質的に同じヌクレオチド配列を含む5’末端部分を含む第二の増幅プライマーを第二のシグナルプライマーの上流の第一のシグナル伸長産物にハイブリダイズさせるステップと、
(g)ハイブリダイズした第二のシグナルプライマーを第一のシグナル伸長産物上で伸長させて第二のシグナル伸長産物を生成し、ハイブリダイズした第二の増幅プライマーを第一のシグナル伸長産物上で伸長させ、その結果、第二の増幅プライマーの伸長が第一のシグナル伸長産物由来の第二のシグナル伸長産物を置換除去するステップと、
(h)第二の置換プライマーを第二の増幅プライマーの上流の第一のシグナル伸長産物にハイブリダイズさせ、第二の置換プライマーをその3’末端から伸長させて、第一のシグナル伸長産物由来の第二の増幅伸長産物を置換除去するステップと、
を含む方法も含むことが可能である。
(a)第二のシグナルプライマーを標的配列の第二の鎖にハイブリダイズさせるステップと、
(b)標的配列の第二の鎖にハイブリダイズする3’末端部分および標的配列の第二の鎖の任意の領域と実質的に同じヌクレオチド配列を含む5’末端部分を含む第二の増幅プライマーを、第二のシグナルプライマーの上流の標的配列の第二の鎖にハイブリダイズさせるステップと、
(c)ハイブリダイズした第二のシグナルプライマーを標的配列の第二の鎖上で伸長させて第三のシグナル伸長産物を生成し、ハイブリダイズした第二の増幅プライマーを標的配列の第二の鎖上で伸長させ、その結果、第二の増幅プライマーの伸長が標的配列由来の第三のシグナル伸長産物を置換除去するステップと、
(d)第二の増幅プライマーの上流の標的配列の第二の鎖に第二の置換プライマーをハイブリダイズさせ、第二の置換プライマーをその3’末端から伸長させて、標的配列由来の第三の増幅伸長産物を置換除去するステップと、
(e)第一のシグナルプライマーを置換された第三のシグナル伸長産物にハイブリダイズさせるステップと、
(f)第三のシグナル伸長産物にハイブリダイズする3’末端部分および第三のシグナル伸長産物の任意の領域と実質的に同じヌクレオチド配列を含む5’末端部分を含む、第一の増幅プライマーを第一のシグナルプライマーの上流の第三のシグナル伸長産物にハイブリダイズさせるステップと、
(g)ハイブリダイズした第一のシグナルプライマーを第三のシグナル伸長産物上で伸長させて第四のシグナル伸長産物を生成し、ハイブリダイズした第一の増幅プライマーを第三のシグナル伸長産物上で伸長させ、その結果、第一の増幅プライマーの伸長が第三のシグナル伸長産物由来の第四のシグナル伸長産物を置換除去するステップと、
(h)第一の置換プライマーを第一の増幅プライマーの上流の第三のシグナル伸長産物にハイブリダイズさせ、第一の置換プライマーをその3’末端から伸長させて、第三のシグナル伸長産物由来の第四の増幅伸長産物を置換除去するステップと
をさらに含む。
本明細書に記載される核酸検出産物および二次LAMP産物のキーとなる特徴は、分子ビーコンなどの従来の技法による通例のLAMP産物の検出を妨げると考えられるヘアピン構造を形成することができるヘアピン、潜在的ヘアピン構造またはヘアピン配列が存在しないことである。したがって、例えば、プローブもしくは他の配列ハイブリダイゼーションによって核酸配列を検出するための当業者には公知のいかなる技法も、本明細書に記載される核酸検出産物および二次LAMP産物を検出するのに日常的に使用することが可能である。そのような検出のために日常的に使用することが可能な技法の例となる非限定的例は下に提示されている。
核酸検出産物および二次LAMP産物の作製および検出のためのキットが本明細書において提供される。このキットは、(i)核酸シグナルプライマーであって、少なくとも核酸シグナルプライマーの一部が第一の標的配列領域にハイブリダイズするもの、(ii)核酸増幅プライマーであって、シグナルプライマーがハイブリダイズする第一の標的配列領域の上流の第二の標的配列領域にハイブリダイズする3’末端部分および3’末端部分がハイブリダイズする第二の標的配列領域の下流の標的配列の第三の領域と実質的に同じヌクレオチド配列を含む5’末端部分を含むもの、ならびに(iii)置換プライマーであって、核酸増幅プライマーの3’末端部分がハイブリダイズする第二の標的配列領域の上流の第四の標的配列領域にハイブリダイズするものを含む。
本明細書に記載される方法およびキットは、例えば、2つまたはそれよりも多い(潜在的)標的または配列バリアントの多重検出を可能にすることができる。具体的には、本方法およびキットは、リアルタイムおよび単一閉管フォーマットでの(潜在的)標的のそのような検出を可能にすることができる。
この実施例は、抗生物質リファンピンに対する結核菌の耐性に関連するrpoB遺伝子中の変異の検出を促進する核酸検出産物を生じさせるためのLAMP反応における本明細書に提示されるシグナルプライマーの使用および方法を例示する。
5’ACCACCGGCCGGATGTTGGATGACCACCCAGGACGTGGAGGCGAT
5’CCGGCGGTCTGTCACGTGAaGGCCGTAGTGtGACGGGTGCACGT
5’CGGGTCGGCATGTCGCGGATGGAGC
5’CCCTCAGGGGTTTCGATCGGGCACAT
5’CGCCGCGATCAAGGAGTTCTTC
5’ATCAACGTCTGCGGTGT
5’CCGGGCTGGAGGTCCGC
プローブA(配列番号31):5’−テキサスレッド−TTTTTT−フルオレセイン−CGAGCTCAGCTGGCTGGTGCCTCG−ダブシル−3’
プローブB(配列番号32):5’−テトラクロロフルオレセイン−GCTACGAGCCAATTCATGGACCAGACGTAGC−ダブシル−3’
プローブC(配列番号33):5’−テトラメチルローダミン−TTTTTT−
フルオレセイン−CCGACGCCGACAGCGGGTTGTTCGTCGG−ダブシル−3’
プローブD(配列番号34):5’−ローダミン−TTTTTT−フルオレセイン−CCACGCTTGTGGGTCAACCCCCGTGG−ダブシル−3’
プローブE(配列番号35):5’−フルオレセイン−CCTGCCGCCGACTGTCGGCGCTGGCAGG−ダブシル−3’
この実施例は、結核菌中のイソニアジド耐性に関連する変異の同時検出を促進するためのLAMP反応におけるシグナルプライマーの使用を例示している。katG遺伝子のコドン315またはinhA転写物のリボソーム結合部位のどちらかにおける変異は、耐性株の最大75%を占めることが知られている(非特許文献19)。2つの標的特異的LAMP反応および関連するシグナルプライマーおよび分子ビーコンを用いることにより、この実施例に記載されるアッセイは、単一反応管においてkatGおよびinhA変異を同時に検出するように設計されている。反応管は、結核菌由来のDNAの存在を立証する手段として結核菌gyrB遺伝子の一領域を増幅するように設計されている第三のLAMP反応のためのプライマーおよびプローブも含有している。gyrB標的のLAMPベースの検出は、蛍光的に標識されたフォワードlampプライマーの5’末端にハイブリダイズしたクエンチャータグ付きオリゴヌクレオチドの置換(LAMP工程中)により達成される。
Claims (29)
- ループ媒介等温増幅反応中に核酸シグナル伸長産物を生じさせるための方法であって、
a. 第一の核酸シグナルプライマーの部分、第一の核酸増幅プライマーの部分、及び第一の核酸置換プライマーの部分を核酸標的配列の相補的部分にハイブリダイズさせるステップであって、
前記第一の核酸シグナルプライマーは、第一の核酸増幅プライマーの下流で前記標的配列にハイブリダイズし、
前記第一の核酸増幅プライマーは、i)前記核酸標的配列の部分に相補的な3’末端部分と、ii)前記標的配列の部分にハイブリダイズしないが、前記標的配列の部分と同一なヌクレオチド配列を含む5’末端部分を含み、前記5’末端部分は、前記第一の核酸増幅プライマーの3’末端部分がハイブリダイズする標的領域の上流にあり、且つ、
前記第一の核酸シグナルプライマー、前記第一の核酸増幅プライマー及び前記第一の核酸置換プライマーが前記核酸標的の異なる部分にハイブリダイズし、前記第一の核酸置換プライマーは、前記第一の核酸増幅プライマーの上流で前記標的配列にハイブリダイズするステップと、
b. 前記ハイブリダイズした第一の核酸シグナルプライマーを前記核酸標的配列上で伸長させて、第一のシグナル伸長産物を生成するステップと、
c. ハイブリダイズした第一の核酸増幅プライマーを前記核酸標的配列上で伸長させるステップであって、そのような伸長が、前記核酸標的配列から前記第一のシグナル伸長産物を置換し、第一の増幅伸長産物を生成するステップと、
d. 前記ハイブリダイズした第一の核酸置換プライマーを伸長するステップであって、そのような伸長が、前記核酸標的配列から前記第一の増幅伸長産物を置換し、第一の置換伸長産物を生成するステップと、
e. 前記第一のシグナル伸長産物を検出するステップであって、前記第一のシグナル伸長産物は、自己相補的ヘアピン構造を形成せず、且つ、ループ媒介等温増幅反応中に前記第一の増幅伸長産物と同時に生成されるステップとを含み、
前記方法は、更に、
f. 前記第一のシグナル伸長産物の相補的部分に、第二の核酸シグナルプライマーの部分をハイブリダイズし、第二の核酸増幅プライマーをハイブリダイズし、及び第二の核酸置換プライマーをハイブリダイズするステップであって、前記第一のシグナル伸長産物は自己相補的ヘアピン構造を欠き、前記第二の増幅プライマーは、i)前記第一のシグナル伸長産物の部分に相補的な3’末端部分と、ii)前記第一のシグナル伸長産物の部分にハイブリダイズしないが、第二の核酸増幅プライマーの3’末端部分がハイブリダイズする前記第一のシグナル伸長産物の部分の下流の、前記第一のシグナル伸長産物の部分と同一な5’末端部分を含むステップと、
g. 前記ハイブリダイズした第二の核酸シグナルプライマーを前記第一のシグナル伸長産物上で伸長させて、第二のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第二のシグナル伸長産物が自己相補的ヘアピン構造を欠くステップと、
h. 前記ハイブリダイズした第二の核酸増幅プライマーを前記第一のシグナル伸長産物上で伸長させるステップであって、そのような伸長が前記第一のシグナル伸長産物から前記第二のシグナル伸長産物を置換し、第二の増幅伸長産物を生成するステップと、
i. 前記第二の核酸置換プライマーを伸長させるステップであって、そのような伸長が前記第一のシグナル伸長産物から前記第二の増幅伸長産物を置換し、第二の置換伸長産物を生成するステップと、
j. 前記第二のシグナル伸長産物を検出するステップであって、前記第二の核酸シグナルプライマー、前記第二の核酸増幅プライマー及び前記第二の核酸置換プライマーが、第一のシグナル伸長産物の異なる部分にハイブリダイズし、前記第二の核酸置換プライマーが、前記第二の核酸増幅プライマーの上流で前記第一のシグナル伸長産物の配列にハイブリダイズし、前記第二の核酸シグナルプライマーが前記第二の核酸増幅プライマーの下流で前記第一のシグナル伸長産物にハイブリダイズするステップ
とを含むことを特徴とする方法。 - ループ媒介等温増幅反応中に核酸シグナル伸長産物を同時に生じさせるための方法であって、
a.第一の核酸シグナルプライマーを核酸標的配列領域にハイブリダイズさせるステップであって、前記標的配列はループ媒介等温増幅反応中に生じた少なくとも1つの自己相補的ヘアピン構造を含むステップと、
b.前記ハイブリダイズした第一の核酸シグナルプライマーを前記核酸標的配列上で伸長させて、第一のシグナル伸長産物を生成するステップであって、前記第一のシグナル伸長産物はヘアピン構造を含むステップと、
c.前記標的配列上の前記少なくとも1つの自己相補的ヘアピン構造を伸長することにより、前記第一のシグナルプライマー伸長産物を前記核酸標的領域から置換するステップと、 d.核酸増幅プライマーの部分を前記第一のシグナル伸長産物の相補的部分にハイブリダイズさせ、前記ハイブリダイズした核酸増幅プライマーを前記第一のシグナル伸長産物上で伸長させて、増幅プライマー伸長産物を生成するステップと、
e.第二の核酸シグナルプライマーを前記第一のシグナル伸長産物にハイブリダイズさせ、前記ハイブリダイズした第二の核酸シグナルプライマーを前記第一のシグナル伸長産物上で伸長させて、第二のシグナル伸長産物を生成するステップと、
f.e.のステップによって、前記増幅プライマー伸長産物を前記第一のシグナルプライマー伸長産物から置換するステップと、
g.第三のシグナルプライマーを前記増幅プライマー伸長産物にハイブリダイズさせ、前記増幅プライマー伸長産物上で前記第三のシグナルプライマーを伸長するステップであって、前記第三のシグナル伸長産物が、その5’末端にヘアピン構造を有するステップと、
h.前記第二のシグナル伸長産物または前記第三のシグナル伸長産物を検出するステップと
を含むことを特徴とする方法。 - ループ媒介等温増幅反応中に核酸シグナル伸長産物を同時に生じさせるための方法であって、
a.第一のシグナルプライマーの部分を第一の一本鎖標的配列にハイブリダイズさせるステップと、
b.第一の核酸増幅プライマーの部分を、前記第一のシグナルプライマーのハイブリダイズした部分の上流で前記第一の一本鎖標的配列にハイブリダイズするステップであって、
前記第一の増幅プライマーは、i)前記第一の一本鎖標的核酸配列の部分に相補的な3’末端部分と、ii)前記第一の一本鎖標的配列の部分にハイブリダイズしないが、前記第一の増幅プライマーがハイブリダイズする標的領域の上流の配列と同一なヌクレオチド配列を含む5’末端部分を含むステップと、
c.第一の置換プライマーを、前記第一の増幅プライマーの上流で前記第一の一本鎖標的配列にハイブリダイズするステップと、
d.前記ハイブリダイズした第一のシグナルプライマーを前記第一の一本鎖標的配列上で伸長させて、第一のシグナル伸長産物を生成するステップと、
e.前記ハイブリダイズした第一の増幅プライマーを伸長させて、これにより前記標的配列から前記第一のシグナル伸長産物を置換するステップと、
f.前記ハイブリダイズした第一の置換プライマーを伸長させて、これにより前記標的配列から第一の増幅伸長産物を置換するステップと、
g.第二のシグナルプライマーの部分を前記置換された第一のシグナル伸長産物にハイブリダイズするステップと、
h.第二の増幅プライマーの部分を、前記ハイブリダイズした第二のシグナルプライマーの上流で前記第一のシグナル伸長産物にハイブリダイズするステップであって、前記第二の増幅プライマーは、i)前記第一のシグナル伸長産物の部分に相補的な3’末端部分と、ii)前記第一のシグナル伸長産物の部分にハイブリダイズしないが、前記第二の増幅プライマーがハイブリダイズする第一のシグナル伸長産物の上流の配列と同一なヌクレオチド配列を含む5’末端部分を含むステップと、
i.第二の置換プライマーを、前記第二の増幅プライマーの上流で前記第一のシグナル伸長産物にハイブリダイズするステップと、
j.前記ハイブリダイズした第二のシグナルプライマーを前記第一のシグナル伸長産物上で伸長させて、第二のシグナル伸長産物を生成するステップと、
k.前記ハイブリダイズした第二の増幅プライマーを前記第一のシグナル伸長産物上で伸長させて、これにより前記第一のシグナル伸長産物から前記第二のシグナル伸長産物を置換するステップと、
l.前記ハイブリダイズした第二の置換プライマーを伸長させて、これにより前記第一のシグナル伸長産物から前記第二の増幅伸長産物を置換するステップと、
m.前記第一及び第二のシグナル伸長産物を検出するステップと
を含むことを特徴とする方法。 - 2つまたはそれよりも多い標的配列または配列バリアントが同時に使用され、前記2つまたはそれよりも多い標的配列にハイブリダイズする2つまたはそれよりも多い核酸シグナルプライマーが使用されることを特徴とする請求項1、2または3に記載の方法。
- 前記2つまたはそれよりも多い標的配列は、同じ連続するヌクレオチド配列中または2つの異なるヌクレオチド配列上に存在する配列であることを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 前記2つまたはそれよりも多い標的配列または配列バリアントは1つの生物または2つもしくはそれよりも多い異なる生物に由来することを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 前記第一のシグナル伸長産物、第二のシグナル伸長産物または第三のシグナル伸長産物はリアルタイムで検出されることを特徴とする請求項1、2、3または4に記載の方法。
- 前記第一のシグナル伸長産物、第二のシグナル伸長産物または第三のシグナル伸長産物は閉管フォーマットで検出されることを特徴とする請求項1、2、3または4に記載の方法。
- 前記第一のシグナル伸長産物、第二のシグナル伸長産物または第三のシグナル伸長産物はハイブリダイゼーションプローブにより検出されることを特徴とする請求項1、2、3、4、7または8に記載の方法。
- 前記ハイブリダイゼーションプローブは単一ヌクレオチド差異感受性プローブであることを特徴とする請求項9に記載の方法。
- 前記ハイブリダイゼーションプローブは蛍光発生性であることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 前記ハイブリダイゼーションプローブは分子ビーコンであることを特徴とする請求項11に記載の方法。
- 前記シグナルプライマーは、ハイブリダイゼーション領域およびレポーター領域を含み、前記ハイブリダイゼーション領域が前記核酸標的配列の前記領域にハイブリダイズし、前記第一のシグナル伸長産物、第二のシグナル伸長産物または第三のシグナル伸長産物が前記レポーター領域によって検出されることを特徴とする請求項1、2、3または4に記載の方法。
- 前記レポーター基は蛍光シグナルを発生することを特徴とする請求項13に記載の方法。
- 前記レポーター基は蛍光発生ヘアピンであることを特徴とする請求項14に記載の方法。
- 前記第一のシグナル伸長産物、前記第二のシグナル伸長産物または前記第三のシグナル伸長産物は、前記シグナルプライマーのうちの1つに組み込まれた前記シグナル産物の捕獲を促進する改変物によって検出されることを特徴とする請求項1、2、3または4に記載の方法。
- 薬物耐性結核を検出するための、請求項1、2、3、4または12に記載の方法の使用。
- 前記第一のシグナル伸長産物、第二のシグナル伸長産物または第三のシグナル伸長産物は増幅後に検出されることを特徴とする請求項1、2、3または4に記載の方法。
- 前記第一のシグナル伸長産物、第二のシグナル伸長産物または第三のシグナル伸長産物は、蛍光発生プローブまたはSERS標識プローブを使用して検出されることを特徴とする請求項18に記載の方法。
- (i)少なくともその一部が第一の標的配列領域にハイブリダイズし、その上で伸長する核酸シグナルプライマー、
(ii)前記シグナルプライマーがハイブリダイズし、その上で伸長する前記第一の標的配列領域の上流の第二の標的配列領域にハイブリダイズする3’末端部分を含み、前記3’末端部分がハイブリダイズする前記第二の標的配列領域の下流の前記標的配列の第三の領域と実質的に同じヌクレオチド配列を含む5’末端部分を更に含む、核酸増幅プライマーであって、前記増幅プライマーの伸長が前記シグナル伸長産物を置換する核酸増幅プライマー、ならびに
(iii)前記核酸増幅プライマーの3’末端部分がハイブリダイズし、その上で伸長する前記第二の標的配列領域の上流の第四の標的配列領域にハイブリダイズする、置換プライマーであって、前記置換プライマーの伸長が前記増幅伸長産物を置換する置換プライマー
を含むことを特徴とするキット。 - ハイブリダイゼーションプローブをさらに含むことを特徴とする請求項20に記載のキット。
- 前記ハイブリダイゼーションプローブは分子ビーコンであることを特徴とする請求項21に記載のキット。
- 前記シグナルプライマーはレポーター領域を含むことを特徴とする請求項20に記載のキット。
- 前記レポーター基は蛍光シグナルを発生することを特徴とする請求項23に記載のキット。
- 前記レポーター基は蛍光発生ヘアピンであることを特徴とする請求項24に記載のキット。
- 前記核酸標的配列は結核菌(Mycobacterium tuberculosis)の配列であることを特徴とする請求項20に記載のキット。
- 前記キットは、(i)第二の標的配列にハイブリダイズする第二の核酸シグナルプライマー、(ii)前記第二の標的配列にハイブリダイズする第二の核酸増幅プライマー、および(iii)前記第二の標的配列にハイブリダイズする第二の置換プライマーをさらに含むことを特徴とする請求項20に記載のキット。
- 前記キットは、(i)第三の標的配列にハイブリダイズする第三の核酸シグナルプライマー、(ii)前記第三の標的配列にハイブリダイズする第三の核酸増幅プライマー、および(iii)前記第三の標的配列にハイブリダイズする第三の置換プライマーをさらに含むことを特徴とする請求項27に記載のキット。
- 前記キットは、(i)第四の標的配列にハイブリダイズする第四の核酸シグナルプライマー、(ii)前記第四の標的配列にハイブリダイズする第四の核酸増幅プライマー、および(iii)前記第四の標的配列にハイブリダイズする第四の置換プライマーをさらに含むことを特徴とする請求項28に記載のキット。
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