CN107400717B - 水貂源性成分的恒温荧光法检测引物组、试剂盒及检测方法 - Google Patents
水貂源性成分的恒温荧光法检测引物组、试剂盒及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种水貂源性成分的恒温荧光法检测引物组，包括外引物OF和外引物OB、内引物IF和内引物IB、环引物和分子信标。同时公开了一种水貂的检测方法，包括如下步骤：(1)提取待检样品DNA；(2)恒温基因扩增反应：利用恒温检测引物组对待检样品进行恒温扩增，扩增时将检测管放置在可提供恒温及荧光检测的仪器上，每30～60s采集一次荧光信号；(3)结果判断：根据有无“S”型扩增曲线判断阴阳性结果，有“S”型扩增曲线为阳性结果，反之为阴性结果。该检测方法具有检测简便，克服恒温检测技术的不足，提高了检测准确度和灵敏度，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，特别涉及一种水貂源性成分的恒温荧光法检测引物组及其检测方法。
背景技术
近年来，由于水貂养殖业快速发展，养殖数量不断增加，水貂肉的处理成为行业内的问题。在整个产业链中，水貂有价值的只有皮毛，而肉因为味道不好，因此并没有市场，价格十分便宜。市场上的无良商家会从养殖户手中以每斤2-3元的价格大量收取水貂肉，然后通过添加各种化学品，把味道调制成羊肉或牛肉的味道，冒充羊肉或牛肉销售以牟取暴利。为此，建立快速、准确的水貂源成分检测方法势在必行。
目前食品和饲料中动物源性成分检测方法主要有以下几种：1)以显微镜观察为基础的物理方法；2)以高效液相色谱技术为基础的化学方法；3)以检测蛋白为基础的免疫学方法；4)以检测DNA为基础的分子生物学方法。其中显微镜学方法设备便宜、简单易行，但要求操作者具备相当的实际经验，所测结果具有一定的主观性。高效液相色谱技术主要是蛋白质分析方法，在较高温度及压力下，蛋白质的二、三级结构发生变化，氨基酸间共价键断裂，蛋白质降解至多肽，因此此方法不能检测热处理后的蛋白质。免疫学方法简单、方便而且能够对微量的蛋白进行检测，但品种接近的蛋白间能够发生交叉反应，甚至其它品种的微量蛋白常常能够掩盖品种特异性的条带，因此会产生假阳性结果。分子生物学方法主要是利用DNA分析技术，根据基因组中的DNA序列来确定物种，并且对于经过热加工的食品仍能很好地区分动物来源。其中恒温扩增技术具有快速简便、操作准确、容易普及、安全可靠的优点，自建立来已得到广泛的应用，并在原基础上发展出采用SYBR Green染色法、钙黄绿素法、浊度法、荧光染料法等不同结果伴读方法，适合现场及快速检测，已在基层得到推广应用。但所采用的SYBR Green染色法、钙黄绿素法、浊度法、荧光染料法等在检测原理上具有先天的不足，都以核酸扩增产物或副产物为靶标进行直接检测，如检测中所发生的是非特异扩增，检测结果仍为阳性结果，即以上的测试方法存在检测结果为假阳性的问题(特异性差的问题)，开发一种可避免假阳性的水貂检测试剂盒是目前亟待解决的难题。
为避免假阳性扩增，本发明在检测引物组中引入特异性分子探针，该探针可实时与产物扩增产生的靶标片段特异性结合并发出荧光信号，如扩增产物为非靶标基因，该探针不与扩增的产物进行结合，无荧光信号发出，检测结果仍为阴性。该检测方法克服恒温检测技术的不足，将进一步引领恒温检测技术的在检测中的推广应用。
发明内容
本发明的目的在于公开一种水貂源性成分的恒温荧光法检测引物组及其检测方法。
本发明所采取的技术方案是：水貂的恒温检测引物组，包括外引物OF和外引物OB、内引物IF和内引物IB、环引物和分子信标，其核苷酸序列分别如下所示：
外引物OF：5’-GATCTCATCCGACTCTCC-3’(SEQ ID NO.1)；
外引物OB：5’-GGATAGAATAGCTAGTGTT-3’(SEQ ID NO.2)；
内引物IF：5’-AGGGGTGAAAGGGGATTTTGTCATGAAACAGGATCCAATAAC-3’(SEQIDNO.3)；
内引物IB：5’-TATCCTACTACTGGCTATGCACTACACCGCAGTATAATTGTCTG-3’(SEQIDNO.4)；
环引物：5’-AATCAGATGGGATTCCAG-3’(SEQ ID NO.5)；
分子信标：GACCTGC TTGTGTTGGCTACTGAGGAGCGCAGGTC(SEQ ID NO.6)。
一种水貂的恒温检测试剂盒，试剂盒包括权利要求1所述的恒温检测引物组。
优选的，试剂盒中还包括：DNA聚合酶、恒温反应液、阳性对照和阴性对照。
进一步优选的，恒温反应液由10mM dNTP、150mM MgSO4水溶液组成，按体积比计，dNTP：MgSO4水溶液＝(7～9)：(2～4)。
优选的，阳性对照为水貂的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液。
一种水貂的检测方法，其步骤是：
(1)提取待检样品DNA；
(2)恒温基因扩增反应：利用恒温检测引物组对待检样品进行恒温扩增，扩增时将检测管放置在可提供恒温及荧光检测的仪器上，每30～60s采集一次荧光信号；
(3)结果判断：根据有无“S”型扩增曲线判断阴阳性结果，有“S”型扩增曲线为阳性结果，反之为阴性结果。
进一步优选的，恒温基因扩增反应体系是内含分子信标的PM引物1.5μL，Bst大片断DNA聚合酶1μL，DNA模板2μL，恒温反应液12.5μL，不含目的基因的双蒸水补足25μL。
进一步优选的，PM引物配置方法是：内引物IF和IB配置成200μM，外引物OF和OB配置成100μM，环引物和分子信标配置成200μM，将外引物OF/OB：环引物/分子信标：内引物IF/IB：ddH2O为1:2:4:6的比例配置成PM引物。
本发明的有益效果是：检测简便，克服恒温检测技术的不足，提高了检测准确度和灵敏度，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为质粒扩增曲线。
图2为水貂肉样灵敏度实验结果图，基质肉为羊肉。
图3为水貂肉样灵敏度实验结果图，基质肉为牛肉。
具体实施方式
实施例1：水貂基因的恒温检测引物及反应体系
水貂基因的恒温检测引物组，包括外引物OF和外引物OB、内引物IF和内引物IB、环引物和分子信标，引物序列如下所示：
反应液：内引物IF和IB配置成200μM，外引物OF和OB配置成100μM，环引物LF分子信标配置成200μM，将外引物(OF/OB)、环引物/分子信标、内引物(IF/IB)、ddH2O为1:2:4:6的比例配置成PM引物。反应液中各组分：PM引物1.5uL，Bst大片断DNA聚合酶1μLDNA模板2μL，恒温反应液12.5μL，不含目的基因的双蒸水补足25μL。
对照：阳性对照为水貂基因的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的双蒸水。
| 体系组分 | 加入体积uL |
| RM 2x反应液 | 12.5 |
| Bst聚合酶 | 1 |
| 引物(内含分子信标) | 1.5 |
| 样本 | 2 |
| H<sub>2</sub>O | 8 |
实施例2：水貂基因的恒温检测方法
利用实施例1的水貂基因的恒温检测引物对样品进行检测，步骤如下：
(1)提取待检样品DNA。
(2)恒温基因扩增反应：利用实施例一所述的恒温检测引物组对待检样品进行恒温扩增，扩增时将检测管放置在可提供恒温及荧光检测的仪器上，如ABI7500仪器，每60s采集一次荧光信号；
恒温基因扩增反应体系的25μL反应体系含有：PM引物1.5μL，Bst大片断DNA聚合酶1μL，DNA模板2μL，恒温反应液12.5μL，不含目的基因的双蒸水补足25μL。
对照：阳性对照为水貂基因的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的双蒸水。
恒温扩增反应的程序为：
结果判断：根据有无“S”型扩增曲线判断阴阳性结果，有“S”型扩增曲线为阳性结果，反之为阴性结果。
实施例3：质粒灵敏度试验
对不同浓度的已知样品进行检测，具体过程如下：
(1)待检样品DNA：含目的基因的大肠杆菌质粒DNA进行DNA模板浓度梯度稀释，100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、100ag/μL；
(2)恒温扩增反应：在200μLPCR管配制反应体系：引物PM 1.5μL，RM 2x反应液12.5μL，DNA聚合酶1μL，待检DNA 2μL，用不含目的基因的双蒸水补足25μL；用含目的基因的大肠杆菌质粒DNA作为阳性对照，用不含目的基因的双蒸水作为阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，将反应管放置在ABI7500仪器上，设置1min采集1次信号，63℃反应45min；
(3)结果判断：反应结束后，根据“S”型扩增曲线判断结果。结果如下表所述，100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、100ag/μL的质粒均有明显的“S”型扩增曲线，表明试剂盒质粒灵敏度可达到100ag/μL。
| 引物浓度 | 100pg/uL | 10pg/uL | 1pg/uL | 100fg/uL | 10fg/uL | 1fg/uL | 100ag/uL |
| 扩增时间 | 10.1/10.0 | 12.2/11.6 | 13.6/13.4 | 14.2/14.3 | 16.3/16.3 | 15.8/15.7 | 17.0/16.0 |
实施例4：肉样灵敏度试验
对不同浓度的已知样品进行检测，具体过程如下：
(1)待检样品DNA的提取：以牛肉和羊肉为基质，分别混入水貂肉，制成不同浓度的混合肉样，采用动物组织基因组DNA快速提取试剂盒提取已知浓度的样品DNA，水貂的含量如下：10％、5％、1％、0.5％、0.1％；
(2)恒温扩增反应：在200μLPCR管配制反应体系：引物PM 1.5μL，RM 2x反应液12.5μL，DNA聚合酶1μL，待检DNA 2μL，用不含目的基因的双蒸水补足25μL；用含目的基因的大肠杆菌质粒DNA作为阳性对照，用不含目的基因的双蒸水作为阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，将反应管放置在ABI7500仪器上，设置1min采集1次信号，63℃反应45min；
(3)结果判断：反应结束后，根据“S”型扩增曲线判断结果。结果如下表所述：浓度为10％、5％、1％、0.5％、0.1％的样品有明显的“S”型扩增曲线，表明试剂盒灵敏度可达到0.1％。
实施例5：特异性试验
分别对水貂、蓝狐、貉子、番鸭、黄牛、猪肉、肥牛、猪肾、牛肉1、牛肉2、黄牛2、鲜猪肝、水牛1、水牛2、鲜猪粉肠、鸽子、鸡翅根、调味鸡扒、吃谷鸡、湛江鸡、汇先丰鸡腿、客家咸鸡、鹧鸪2、汇先竹丝鸡、鹧鸪3、进口鸡翅、鸽子肉、文昌鸡进行加入分子信标组和未加分子信标组鉴定。
检测结果如下表所示，+为阳性，-为阴性：
鉴定结果显示：加入分子信标组的蓝狐、貉子、番鸭、黄牛、猪肉、肥牛、猪肾、牛肉1、牛肉2、黄牛2、鲜猪肝、水牛1、水牛2、鲜猪粉肠、鸽子、鸡翅根、调味鸡扒、吃谷鸡、湛江鸡、汇先丰鸡腿、客家咸鸡、鹧鸪2、汇先竹丝鸡、鹧鸪3、进口鸡翅、鸽子肉、文昌鸡反应管均无“S”型扩增曲线，水貂的反应管有“S”型扩增曲线，结果表明加入分子信标后该试剂盒具有良好的特异性。
实施例6：实际样品检测
对已知1例水貂样本和14例非水貂源性样本进行加入分子信标组检测。
检测结果如下表所示，+为阳性，-为阴性：
| 样本 | 检测结果 | 样本 | 检测结果 |
| 鸭边腿 | - | 蓝狐 | - |
| 猪肉 | - | 貉子 | - |
| 牛肉 | - | 水牛 | - |
| 山羊 | - | 黄牛 | - |
| 猪肾 | - | 山羊 | - |
| 肥牛 | - | 绵羊 | - |
| 猪肉2 | - | 马肉 | - |
| 水貂 | + | 驴肉 | - |
鉴定结果显示：已知水貂样本有明显的“S”型扩增曲线，已知14例非水貂源性样本无“S”型扩增曲线。
以上实施例表明，本发明的检测方法具有高特异性、高灵敏度、鉴定简便、快速高效、操作简便等有益效果。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州迪澳医疗科技有限公司；广州迪澳生物科技有限公司
<120> 水貂源性成分的恒温荧光法检测引物组、试剂盒及检测方法
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gatctcatcc gactctcc 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggatagaata gctagtgtt 19
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aggggtgaaa ggggattttg tcatgaaaca ggatccaata ac 42
<210> 4
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tatcctacta ctggctatgc actacaccgc agtataattg tctg 44
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aatcagatgg gattccag 18
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gacctgcttg tgttggctac tgaggagcgc aggtc 35
Claims (7)
1.水貂的恒温检测引物组，包括外引物OF和外引物OB、内引物IF和内引物IB 、环引物和分子信标，其核苷酸序列分别如下所示：
外引物OF:5'-GATCTCATCCGACTCTCC-3'(SEQ ID NO. l) ；
外引物OB:5'-GGATAGAATAGCTAGTGTT-3'(SEQ ID NO. 2)；
内引物IF:5'-AGGGGTGAAAGGGGATTTTGTCATGAAACAGGATCCAATAAC-3'(SEQ ID NO. 3) ；
内引物IB:5'-TATCCTACTACTGGCTATGCACTACACCGCAGTATAATTGTCTG-3'(SEQ ID NO. 4) ；
环引物：5'-AATCAGATGGGATTCCAG-3'(SEQ ID NO. 5) ；
分子信标：GACCTGCTTGTGTTGGCTACTGAGGAGCGCAGGTC(SEQ ID NO.6)。
2.一种水貂的恒温检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1 所述的恒温检测引物组。
3.根据权利要求2所述的水貂的恒温检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：
DNA聚合酶、恒温反应液、阳性对照和阴性对照。
4.根据权利要求3 所述的水貂的恒温检测试剂盒，其特征在于，恒温反应液由l0mM
dNTP、150mM MgSO4水溶液组成，按体积比计，dNTP：MgSO4水溶液＝ (7~9) : （2~4) 。
5.根据权利要求3所述的水貂的恒温检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为水貂的DNA或含目的基因的质粒，阴性对照为不含目的基因的反应混合液。
6.一种水貂的检测方法，其步骤是：
(1) 提取待检样品DNA；
(2) 恒温基因扩增反应：利用权利要求1 所述的恒温检测引物组对待检样品进行恒温扩增，扩增时将检测管放置在可提供恒温及荧光检测的仪器上，每30~60s采集一次荧光信号；
(3) 结果判断：根据有无“S”型扩增曲线判断阴阳性结果，有“S”型扩增曲线为阳性结果，反之为阴性结果。
7.根据权利要求6所述的水貂的检测方法，其特征在于，所述恒温基因扩增反应体系是内含分子信标的PM引物1.5μL，Bst大片断DNA聚合酶lμL，DNA模板2μL，恒温反应液12.5μL，不含目的基因的双蒸水补足25μL；
所述PM 引物配置方法是：内引物IF和IB配置成200μM，外引物OF和OB配置成l00μM ，环引物和分子信标配置成200μM，将外引物OF/OB：环引物/分子信标：内引物IF/IB：ddH2O为1:2:4:6的比例配置成PM引物。
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| 鉴定动物肉源性成分的可视化环介导等温扩增技术的建立及应用;冉光耀等;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》;20150915(第9期);摘要和第14页第1段，第17页2.2.2 * |
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Inventor after: Huang Xi Inventor after: Shen Hongjie Inventor after: Gao Fang Inventor after: Wang Haibo Inventor after: Guo Jiyuan Inventor after: Sun Chunhua Inventor before: Gao Fang Inventor before: Shen Hongjie Inventor before: Huang Xi Inventor before: Guo Jiyuan Inventor before: Sun Chunhua |
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| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |