CN112481391A - 黄牛、水牛和牦牛的实时荧光pcr检测试剂和检测方法 - Google Patents

黄牛、水牛和牦牛的实时荧光pcr检测试剂和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及黄牛、水牛和牦牛的实时荧光PCR检测试剂和检测方法。包括检测黄牛、水牛和牦牛的引物和探针序列。本发明优化了检测条件，建立了最佳的单重、双重和三重检测方法，实现以real‑time PCR为手段的黄牛、水牛和牦牛的快速同步鉴定方案，具有较高的检测灵敏度高和覆盖度，有效提高牛肉制品掺假问题的检测准确性和检测效率。

Description

黄牛、水牛和牦牛的实时荧光PCR检测试剂和检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学检测领域，特别涉及黄牛、水牛和牦牛的实时荧光PCR检测试剂和检测方法。
背景技术
在经济利益驱动下的肉制品制假贩假事件屡禁不绝，已成为中国食品质量控制面临的重要挑战之一。牛肉一直是制假掺假的重灾区，除了用价格相对廉的猪肉、鸡肉、鸭肉冒充牛肉外，更有甚者将狐狸、水貂等肉掺入牛肉中进行销售。此外，由于牛肉本身可分为黄牛(Bos taurus)肉、水牛(Bubalus bubalis)肉和牦牛(Bos grunniens)肉，且这3类肉之间也存在价格差异，一般来说牦牛肉价格高于黄牛肉，黄牛肉又高于水牛肉，因此往往会出现水牛肉、黄牛肉被用来冒充牦牛肉，而水牛肉还被用来冒充黄牛肉。
为此，近年来，国家针对肉制品掺假问题加强检测监管力度，大力支持肉品检测方法的研究。目前对肉类真伪鉴别的检测技术中分子生物学的鉴定方法，仍是目前比较常用和可靠的鉴定方法。
目前用来鉴别牛肉真伪的qPCR方法已经较多，且建立一系列检测标准，如《SN/T2051-2008食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法实时PCR法》，《GB/T 25165-2010明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法》、《SN/T 2557-2010畜肉食品中牛成分定性检测方法实时荧光PCR法》、《SB/T 10923-2012肉及肉制品中动物源性成分的测定实时荧光PCR法》等，但上述标准并不能区分是哪种牛。虽然目前也有有关黄牛、水牛和牦牛的检测方法，如《SZDB/Z 268-2017动物产品及饲料中黄牛、水牛和牦牛源性成分实时荧光PCR检测方法》，《SN/T 3730.7-2013食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第7部分:水牛成分检测实时荧光PCR法》，但上述方法存在灵敏度不高，或者覆盖度不高，即存在不能检测到种内某些品种的情况。《SN/T 4397-2015出口食品中牦牛源性成分的检测方法实时荧光PCR法》该方法的检测灵敏度和准确度都较高，但该方法的引物探针最佳退火温度是57℃，
发明内容
本发明提供了一种对可对混合含有黄牛、水牛和牦牛肉进行同步鉴定的方法，可用于肉制品的真伪鉴别。
为了实现上述目的，本发明提供了一种对黄牛、水牛及牦牛混合样品的同步物种成分检测的引物和探针，其中，
检测黄牛的引物和探针序列包括：
F:CCCGTCACCCTCCTCAAATA
R:CACACTTTCCAGTATGCTTACCT
P:CGCACTAGCTACATGAGAGGA；
检测水牛的引物和探针序列包括：
F:CAACGGCCAGCATAATCGAA
R:GCTTTGGGTGTTGGTAGTGG
P:AACAACCAACCTCCCCAAGA；
检测牦牛的引物和探针序列包括：
F:CCCGTCACCCTCCTCAAATA
R:CACACTTTCCAGTATGCTTACCT
P:CGCACTAGCTATATGAGAGGA。
进一步的，所述探针选自TaqMan探针。
进一步的，所述检测黄牛的探针包括：
P:FAM-CGCACTAGCTACATGAGAGGA-Eclipse；
进一步的，所述检测水牛探针包括：
P:HEX-AACAACCAACCTCCCCAAGA-Eclipse；
进一步的，所述检测牦牛的探针包括：
P:ROX-CGCACTAGCTATATGAGAGGA-Eclipse。
本发明还提供了一种对黄牛、水牛及牦牛混合样品的同步物种成分检测的实时荧光PCR检测方法，包括：
步骤1：抽提样本中的DNA；
步骤2：将步骤1中的DNA样品加入至PCR反应体系中，按预先设定的反应程序进行反应；
步骤3：结果判定；
进一步的，本发明采用以下技术方案：
取动物肌肉、骨骼、内脏或血液100mg或100μL，使用Promega FF3750(美国)抽提试剂盒进行DNA提取，最后抽提得到DNA溶解在20μL-100μL水中，使抽提得到的DNA浓度大于等于10ng/μL。
单重实时荧光PCR反应体系及结果判定。总体积为20μL的反应体系中，成分如下：10μL Premix Ex Taq，上游引物(10pmol/μL)0.4μL，下游引物(10pmol/μL)0.4μL，探针(10pmol/μL)0.4μL，DNA用量2μL，不足的体积用水补足。应用实时荧光PCR仪lightcycle480(Roche)进行反应，反应程序为(1)95℃，10sec；(2)95℃，5sec；60℃，23sec；40个循环。结果判定：Ct值小于35时，结果为阳性，Ct值大于等于35时为阴性。
双重实时荧光PCR反应体系及结果判定。双重荧光qPCR的20μL的反应体系中，在引物探针的总浓度不变的情况下，将任意两种物种的引物和探针的含量比例调整为1:1，其他条件不变。反应程序为：(1)95℃，10sec；(2)95℃，5sec；60℃，23sec；40个循环。结果判定：Ct值小于35时，结果为阳性，Ct值大于等于35时为阴性。
三重实时荧光PCR反应体系及结果判定。三重荧光qPCR的20μL的反应体系中，在引物探针的终浓度不变的情况下，将当黄牛、水牛、牦牛三组引物探针的含量比例调节为3:3:2，其他条件不变。反应程序为：(1)95℃，10sec；(2)95℃，5sec；60℃，23sec；40个循环。结果判定：Ct值小于35时，结果为阳性，Ct值大于等于35时为阴性。
进一步的，本发明所述方法中的引物和探针选自表1所列引物和探针。
本发明还提供了一种对可对混合含有黄牛、水牛和牦牛肉进行同步鉴定的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括表1所述的引物和探针。
进一步的，所述试剂盒还包括作为内参照引物探针。
本发明与现有技术以及背景技术中提及的方法相比，具有以下优点：基于黄牛、牦牛线粒体12S rRNA基因(12S ribosomal RNA，基因序列号分别为：KF926377.1和KJ463418.1)，和水牛的线粒体Cyt b基因(Cytochrome b，基因序列号分别为：AY488491.1)设计了黄牛、水牛和牦牛特异性的引物探针各1组。建立了单重、双重和三重检测方法，实现以real-time PCR为手段的黄牛、水牛和牦牛的快速同步鉴定方案。可同步检测上述3种牛的成分，实现对黄牛、水牛及牦牛混合样品的同步物种成分检测。实验证明检测灵敏度高，且有很高的覆盖度。单重检测时，3种牛的检测灵敏度均为0.025ng/μL；双重检测时，两两组合的引物探针含量比例为1:1时，黄牛的检测灵敏度降低至0.1ng/μL，而水牛和牦牛仍为0.025ng/μL；对三重qPCR检测体系进行了优化，当黄牛、水牛和牦牛三组引物探针的含量比例为3:3:2时，检测灵敏度最佳，黄牛和水牛的检测灵敏度可达到0.1ng/μL，而牦牛的灵敏度仍可达到0.025ng/μL。
本发明不仅适用于单重实时荧光PCR反应体系、还适用于双重实时荧光PCR反应体系和单三重实时荧光PCR反应体系。有效提高了肉制品掺假问题的检测准确定和检测效率。
附图说明
图1为DNA浓度和Ct值相关性曲线。其中图1A为黄牛(DNA浓度≥0.024ng/μL)的相关性曲线；图1B为黄牛(DNA浓度≥0.006ng/μL)的相关性曲线；图1C为水牛(DNA浓度≥0.024ng/μL)的相关性曲线；图1D为牦牛(DNA浓度≥0.024ng/μL)的相关性曲线；图1E为牦牛(DNA浓度≥0.006ng/μL)的相关性曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但并不因此将本发明限制在所述的具体实施例中。实施例中未说明的条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照商品说明书建议的步骤和条件。
实施实例1：样本DNA提取，以及实时荧光PCR反应体系和结果判定
取动物肌肉、骨骼、内脏、血液或者植物可食用部分(样品见表2)100mg或100μL，使用Promega FF3750(美国)抽提试剂盒进行DNA提取，最后抽提得到DNA溶解在20μL-100μL水中，可根据实际对DNA浓度的需求进行调节。
单重实时荧光PCR反应体系及结果判定。总体积为20μL的反应体系中，成分如下：10μL Premix Ex Taq，上游引物(10pmol/μL)0.4μL，下游引物(10pmol/μL)0.4μL，探针(10pmol/μL)0.4μL，DNA用量2μL，不足的体积用水补足。应用实时荧光PCR仪lightcycle480(Roche)进行反应，反应程序为(1)95℃，10sec；(2)95℃，5sec；60℃，23sec；40个循环。结果判定：Ct值小于35时，结果为阳性，Ct值大于等于35时为阴性。
双重实时荧光PCR反应体系及结果判定。双重荧光qPCR的20μL的反应体系中，在引物探针的总浓度不变的情况下，将任意两种物种的引物和探针的含量比例调整为1:1，其他条件不变。反应程序为：(1)95℃，10sec；(2)95℃，5sec；60℃，23sec；40个循环。结果判定：Ct值小于35时，结果为阳性，Ct值大于等于35时为阴性。
三重实时荧光PCR反应体系及结果判定。三重荧光qPCR的20μL的反应体系中，在引物探针的终浓度不变的情况下，将当黄牛、水牛、牦牛三组引物探针的含量比例调节为3:3:2，其他条件不变。反应程序为：(1)95℃，10sec；(2)95℃，5sec；60℃，23sec；40个循环。结果判定：Ct值小于35时，结果为阳性，Ct值大于等于35时为阴性。
实施实例2：引物和探针的设计和特异性验证
基于黄牛、牦牛线粒体12S rRNA基因(12S ribosomal RNA，基因序列号分别为：KF926377.1和KJ463418.1)，和水牛的线粒体Cyt b基因(Cytochrome b，基因序列号为：AY488491.1)，设计得到如表1所示的黄牛、水牛和牦牛特异性的引物和探针，并在探针上标记了荧光信号，以实现实时荧光检测。
表1检测黄牛、牦牛和水牛的引物和探针序列
Figure BDA0002823223170000051
Figure BDA0002823223170000061
a F:正向引物；R:反向引物；P:探针。
b引用自国标GB/T 25165-2010；该引物探针可作为内参照引物探针,检验所抽提DNA的质量。
将表1所示的用于检测3种牛的引物探针用于检测包括黄牛、水牛和牦牛在内的19种家畜、家禽及其他动植物。并按实施例1的实时荧光PCR反应体系进行反应和结果判定。
结果显示上述引物探针只对目标物种呈阳性反应，其他非目标物种均未检测到Ct值(表2)；而同时用检测真核生物的引物探针检测时，反应都呈阳性，说明抽提得到的DNA质量符合qPCR检测要求。在单重qPCR检测体系中，以单一的目标DNA为检测样本，设计得到的引物探针序列有较好的特异性。
表2黄牛水牛牦牛引物探针的特异性
Figure BDA0002823223170000062
Figure BDA0002823223170000071
“—”表示3次检测结果中2次或2次以上无Ct值显示.
实施实例3：单重qPCR的检测灵敏度
将3种牛的DNA浓度都调节到25ng/μL左右，再进行4倍稀释，共形成8个浓度梯度。各个DNA浓度单重qPCR的结果如表3所示，当3种DNA的浓度稀释到0.025ng/μL时，3种牛的检测都能得到Ct值小于35且阳性明显的S型扩增曲线，此时得到3组标准曲线的R2值均大于0.99(图1A，C，D)；但进一步稀释后(0.006ng/μL)，黄牛和牦牛得到的Ct值分别为38.4和38.8，而水牛则无Ct值显示，此时黄牛和牦牛的标准曲线的R2值分别降至0.9826(图1B)和0.9597(图1E)；DNA浓度降至0.002ng/μL左右时，则3种牛的检测结果都呈阴性。
R2值大于0.99时，说明该标准曲线所取范围内的DNA浓度与检测得到的Ct值有较好的对应关系，Ct值能比较准确的反应对应DNA的浓度；R2值下降，说明两者间的对应关系下降，Ct值反应对应DNA的浓度的可信度下降。因此，3种牛在单重，以及在双重及三重荧光PCR检测中，以35为Ct值的临界值，3次检测结果中2次或2次以上Ct值小于35，结果为阳性(+)；2次或2次以上Ct值大于等于35或无Ct值显示，结果为阴性(—)。
表3单重实时荧光PCR检测黄牛水牛牦牛的灵敏度
Figure BDA0002823223170000072
Figure BDA0002823223170000081
*检测黄牛时，不同稀释度的DNA只含黄牛DNA，以此类推；
**用NanoDrop ND-1000实际测得的浓度；
***4倍梯度稀释推算得到的浓度；
—:3次检测结果中2次或2次以上无Ct值显示.
实施实例4：双重和三重qPCR的检测灵敏度
在双重qPCR的检测中，将任意两种引物探针组合按照1:1比例混合，得到结果显示：只有黄牛的检测因为试剂间及两种DNA间的叠加而导致其灵敏度降低至0.1ng/μL，而水牛和牦牛的检测灵敏度仍保持在单重qPCR的水平(0.025ng/μL)，并未下降(表4)。
但双重变成三重qPCR后，结果则大不相同，即便是在最高的起始浓度下(25ng/μL)，黄牛和水牛的检测都未得到阳性结果，但牦牛的检测灵敏度仍然保持在0.025ng/μL的浓度水平，未受到三重的影响。
为了提高三重qPCR检测中黄牛和水牛的检测灵敏度，调整了3种引物探针组合的浓度比例。比较了8种混合比例，提高黄牛和水牛的引物探针比例有助于提高检测灵敏度，表5显示，当黄牛、水牛、牦牛三组引物探针的比例调节为3:3:2时，黄牛和水牛的检测灵敏度可达到0.1ng/μL，而牦牛的灵敏度仍可达到0.025ng/μL，因此认为该比例较佳。
表4双重和三重实时荧光PCR同步检测黄牛、水牛及牦牛
Figure BDA0002823223170000082
a DNA浓度，在双重和三重qPCR反应中，对应目标物种目标浓度的DNA都加入1μL，即在检测黄牛和水牛的双重qPCR反应体系中只加入1μL黄牛和1μL水牛的DNA，三重qPCR中则黄牛、水牛和牦牛各加入1μL；在双重qPCR和三重qPCR中，各物种引物探针组合的比例为1:1和1:1:1；
b黄牛；c水牛；d牦牛；
+:3次检测结果中2次或2次以上Ct值小于35；
－:3次检测结果中2次或2次以上Ct值大于等于35或无Ct值显示。
表5黄牛、水牛和牦牛三重荧光qPCR检测体系优化
Figure BDA0002823223170000091
a DNA浓度, 即在三重qPCR中对应浓度的黄牛、水牛和牦牛的DNA各加入1 μL；b 在三重qPCR中，各物种引物探针组合的比例；
+:3次检测结果中2次或2次以上Ct值小于35；
－:3次检测结果中2次或2次以上Ct值大于等于35或无Ct值显示。
实施例5：不同检测方法对3种牛肉混合样品检测结果的比较
深加工混合样的制备及混合物的DNA抽提：以黄牛、水牛和牦牛肉的肉干为材料，制备深加工混合样，按照表6的比例混合，每个混合样总重30g，共制成7个样。按照比例混合后的样品经过震荡研磨仪(Precellys Evolution，Bertin)充分混合研磨成肉泥，加入DNA提取裂解液(DNeasy nericon Food Kit，QIAGEN)，使混合物降解成液状，取降解后混合物2ml，继续进行DNA抽提(DNeasy nericon Food Kit，QIAGEN)。抽提后的DNA用以下方法进行检测。
检测方法：
方法1：即本发明的方法,但针对表6的混合样，只采用了双重和三重Real-timePCR方法进行检测。每个混合样，用每种方法重复检测3次，3次结果中两次显示为阳性，即3次结果中两次的Ct值小于35即为阳性，以“+”表示，说明能检测到该混合肉样中黄牛、水牛或牦牛成分，否则以“—”表示，说明不能检测到相应成分。
方法2：参照专利CN107858442A，即应用高分辨率熔解曲线(HRM)法。检测结束后，通过软件分析扩增产物与阳性对照是否一致，即分析样品的熔解曲线是否与阳性对照一致。若与黄牛的熔解曲线一致则含有黄牛成分，以此类推。每一个样品重复检测3次，若两次和对应阳性对照一致，则表示检测到该成分，用“+”表示，否则为阴性，用“—”。
方法3：参照专利CN109457015A，即环介导等温扩增技术(LAMP法)。该方法与三重qPCR及HRM法比较，一个检测孔只能检测一种牛成分，一个样品若要检测三种牛成分的话，即需要3个检测孔，这和本发明方法中的单重qPCR类似。
为避免由于使用不同DNA造成不同检测方法的不同结果，一次重复中所有方法的使用相同的DNA。
检测结果:
方法1：如表6所示，样品1-7所有检测得到的Ct值均小于35，因此检测结果皆为阳性。因此本发明的方法，不论是双重qPCR还是三重qPCR都能从不同比例的混合肉样中同步检测到目标物种，即以三重qPCR检测为例，由于3个目标物种标记了3种不同的荧光，因此对一个混合肉样来说，只需要一个检测孔，就可以完成是否含有这3种牛成分的检测。
表6双重qPCR和三重qPCR检测深加工混合肉干样品中的黄牛、水牛和牦牛
Figure BDA0002823223170000101
a 在三重qPCR中，各物种引物探针组合的比例；
b 黄牛；c 水牛；d 牦牛；
+:3次检测结果中2次或2次以上Ct值小于35；
－:3次检测结果中2次或2次以上Ct值大于等于35或无Ct值显示。
方法2：高分辨率熔解曲线(HRM)法和方法1中的三重qPCR方法类似，可以在一个检测孔中对一个样品同时检测黄牛、水牛和牦牛三种物种。检测结果显示(表7)，对6个单纯肉样检测，结果与预设结果一致，但对7个混合样检测得到的熔解曲线，都与牦牛阳性对照一致，黄牛和水牛对应的熔解曲线均未出现。说明该方法对混合样的检测存在偏差。因此该方法比较适合对整块肉样进行鉴定，而不适合对肉丸、肉松等深加工样品的鉴定。
表7高分辨率熔解曲线(HRM)法检测单一肉样及深加工混合肉样中的黄牛、水牛和牦牛
Figure BDA0002823223170000111
a 混合肉样的质量比例(黄牛：水牛：牦牛)；
b 黄牛；c 水牛；d 牦牛；
+:3次检测结果中2次或2次以上的熔解曲线与对应的阳性对照的熔解曲线一致，否则为“－”。
方法3：环介导等温扩增技术(LAMP)与三重qPCR及HRM法比较，并不能在一个检测孔中同时完成3种牛的检测，而只能一个检测孔检测一种牛成分，一个样品若要检测三种牛成分的话，即需要3个检测孔，这和本发明方法中的单重qPCR类似。结果显示(表8)，该方法的特异性不高，黄牛、水牛和牦牛的引物皆不能区分这3种牛，因此用该方法检测混合样品，也不具意义，无法达到区分的目的。
表8环介导等温扩增(LAMP)法检测单一肉样及深加工混合肉样中的黄牛、水牛和牦牛
Figure BDA0002823223170000112
Figure BDA0002823223170000121
a 混合肉样的质量比例(黄牛：水牛：牦牛)；
b 黄牛；c 水牛；d 牦牛；
+:3次检测结果中2次或2次以上的熔解曲线与对应的阳性对照的熔解曲线一致，否则为“－”。
序列表
<110> 浙江省检验检疫科学技术研究院
<120> 黄牛、水牛和牦牛的实时荧光PCR检测试剂和检测方法
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Bos taurus
<400> 1
cccgtcaccc tcctcaaata 20
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Bos taurus
<400> 2
cacactttcc agtatgctta cct 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Bos taurus
<400> 3
cgcactagct acatgagagg a 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Bubalus bubalis
<400> 4
caacggccag cataatcgaa 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Bubalus bubalis
<400> 5
gctttgggtg ttggtagtgg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Bubalus bubalis
<400> 6
aacaaccaac ctccccaaga 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Bos grunniens
<400> 7
cccgtcaccc tcctcaaata 20
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
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<400> 8
cacactttcc agtatgctta cct 23
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Bos grunniens
<400> 9
cgcactagct atatgagagg a 21
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Eukaryotes
<400> 10
cctgagaaac ggctaccat 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> Eukaryotes
<400> 11
cgtgtcagga ttgggtaat 19

Claims (10)

1.对黄牛、水牛及牦牛混合样品的同步物种成分检测的检测试剂，包括引物和探针，其特征在于，
检测黄牛的引物和探针序列包括：
F:CCCGTCACCCTCCTCAAATA
R:CACACTTTCCAGTATGCTTACCT
P:CGCACTAGCTACATGAGAGGA；
检测水牛的引物和探针序列包括：
F:CAACGGCCAGCATAATCGAA
R:GCTTTGGGTGTTGGTAGTGG
P:AACAACCAACCTCCCCAAGA；
检测牦牛的引物和探针序列包括：
F:CCCGTCACCCTCCTCAAATA
R:CACACTTTCCAGTATGCTTACCT
P:CGCACTAGCTATATGAGAGGA。
2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，探针选自TaqMan探针。
3.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，
检测黄牛的探针包括：
P:FAM-CGCACTAGCTACATGAGAGGA-Eclipse；
检测水牛探针包括：
P:HEX-AACAACCAACCTCCCCAAGA-Eclipse；
检测牦牛的探针包括：
P:ROX-CGCACTAGCTATATGAGAGGA-Eclipse。
4.一种对黄牛、水牛及牦牛混合样品的同步物种成分检测的实时荧光PCR检测方法，包括：
步骤1：抽提样本中的DNA；
步骤2：将步骤1中的DNA样品加入至PCR反应体系中，按预先设定的反应程序进行反应；
步骤3：结果判定；
所述PCR反应体系包括检测黄牛、水牛和牦牛的引物和探针，分别是，
检测黄牛的引物和探针序列包括：
F:CCCGTCACCCTCCTCAAATA
R:CACACTTTCCAGTATGCTTACCT
P:CGCACTAGCTACATGAGAGGA；
检测水牛的引物和探针序列包括：
F:CAACGGCCAGCATAATCGAA
R:GCTTTGGGTGTTGGTAGTGG
P:AACAACCAACCTCCCCAAGA；
检测牦牛的引物和探针序列包括：
F:CCCGTCACCCTCCTCAAATA
R:CACACTTTCCAGTATGCTTACCT
P:CGCACTAGCTATATGAGAGGA。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，探针选自TaqMan探针。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，
检测黄牛的探针包括：
P:FAM-CGCACTAGCTACATGAGAGGA-Eclipse；
检测水牛探针包括：
P:HEX-AACAACCAACCTCCCCAAGA-Eclipse；
检测牦牛的探针包括：
P:ROX-CGCACTAGCTATATGAGAGGA-Eclipse。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，反应程序为：(1)95℃，10sec；(2)95℃，5sec；60℃，23sec；40个循环。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，结果判定：Ct值小于35时，结果为阳性，Ct值大于等于35时为阴性。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，进行双重实时荧光PCR反应时，黄牛、水牛及牦牛中任意两种物种的引物探针的含量为1:1。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，进行三重实时荧光PCR反应时，黄牛、水牛、牦牛三组引物探针的含量比例为3:3:2。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN114350822A (zh) * 2022-01-21 2022-04-15 锡林郭勒职业学院 乳肉中牛、水牛、牦牛以及质控同步检测的引物和探针

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