CN106811513B

CN106811513B - 桉树成分实时荧光pcr检测方法及其试剂盒

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Publication number: CN106811513B
Application number: CN201510868887.0A
Authority: CN
Inventors: 李想; 黄新新; 高琴; 刘博�; 李辉; 任怡菲; 门光琦
Original assignee: Shanghai Huirui Biotechnology Co ltd; Shanghai Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of PRC
Current assignee: Shanghai Huirui Biotechnology Co ltd; Shanghai Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of PRC
Priority date: 2015-12-01
Filing date: 2015-12-01
Publication date: 2020-12-01
Anticipated expiration: 2035-12-01
Also published as: CN106811513A

Abstract

本发明涉及桉树成分实时荧光PCR检测方法及其试剂盒。本发明揭示了一种可特异性鉴定桉树成分的引物，所述引物针对含有桉树成分的DNA可发生特异性扩增，而对没有桉树成分的DNA不发生特异性扩增。本发明还提供了一种简化的PCR检测方法，所述的方法可良好地应用于鉴定桉树成分，并且具有良好的再现性、灵敏度。

Description

桉树成分实时荧光PCR检测方法及其试剂盒

技术领域

本发明属于PCR检测领域，更具体地，本发明涉及桉树成分实时荧光PCR检测方法及其试剂盒。

背景技术

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物混合后，经充分酿造而成的天然甜物质。每年全世界的蜂蜜总产量大概有130万吨，产量分布情况如下：欧洲占23％，北美洲占16％，南美洲占10％，亚洲占37％，还有大洋洲占2％。而中国是世界上最大的蜂蜜生产和出口国，每年蜂蜜总产量在30～40万吨之间，总年产值也在80亿人民币左右。2013年中国蜂产品协会统计数据显示，中国近年来蜂蜜年出口保持在10万吨左右，2012年出口达到了11万吨，占世界蜂蜜贸易总量的1/4，出口量世界第一。

由于蜂蜜市场需求旺盛，产量难以满足国内外市场需要，为了获得更高的市场份额，在经济利益的驱动下，部分蜂蜜生产企业利用蜂蜜市场监管不足、检测技术薄弱、消费者难以识别等弱点，大量生产制造假蜂蜜，投入市场，牟取暴利。据统计，掺假占据了蜂蜜市场的20％～30％。蜂蜜掺假的方式主要有两种，一种是以假乱真，即加入其它价格低廉的甜味物质，例如糖和工业糖浆，来提高蜂蜜的产量。有些不法厂家为了改善掺假蜂蜜的外观品质，甚至还掺入焦糖色素、合成色素等。蜂蜜香精的出现更使得假蜂蜜几乎可以乱真。另一种掺假方法就是以次充好，包括用价格低廉的杂花蜜充当价格相对较高的单一花种蜂蜜，用价格相对低廉的单花种蜂蜜掺入高价单花种蜂蜜。从某种意义上虽然没有掺入外源的糖分造成蜂产品伪劣，但在一定程度上也存在假冒问题，消费者权益受到侵害。此外，欧美国家对于蜂蜜进口质量要求比国内严格，检测指标较多，由于我国蜂蜜质量情况良莠不齐，蜂蜜出口贸易受到极大限制。且蜂蜜掺假行为严重损害了消费者利益，损坏了我国天然蜂蜜的产品信誉，阻碍了中国蜂业的健康发展。

随着蜂蜜掺假的水平的不断提高，蜂蜜的真伪评价难度加大。传统的检测方法已经不能满足生产实践和应用中的需求。现代分析技术在蜂蜜掺假识别虽具有很大优势及发展空间，但价格昂贵，且由于不同蜂蜜品种自身的复杂性，千差万别的来源产地，以及受采收季节、储存、加工等因素影响，使得检测带有很大的不确定性，而且不能有效区分混合蜂蜜和单一蜜，及低价蜜掺杂高价蜜。且目前更多的技术处在实验室研究阶段，实用性不高、不能全方面的推广。

因此，亟需建立快速、准确、易推广的蜂蜜身份鉴定方法，用于对蜂蜜的真伪及种类进行准确区分，以完善现有的管理体系。

发明内容

本发明的目的在于提供桉树成分实时荧光PCR检测方法及其试剂盒。

在本发明的第一方面，提供一种鉴定桉树成分的方法，所述方法包括：以待测样品的DNA为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物进行PCR扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含桉树成分。

在一个优选例中，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物以及SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的Taqman探针进行实时荧光PCR检测。

在另一优选例中，以ndhB基因作为检测内参，检测ndhB基因的引物如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

在另一优选例中，以SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的引物以及SEQ ID NO:7所述的Taqman探针进行ndhB基因的实时荧光PCR检测。

在另一优选例中，所述的待测样品是食品、饮料、植物、植物制品(如植物精油等)。

在本发明的另一方面，提供一种用于鉴定桉树成分的引物，所述引物是引物对，其序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

在本发明的另一方面，提供一种用于鉴定桉树成分的Taqman探针，所述的探针序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

在本发明的另一方面，提供所述的引物和所述的Taqman探针的用途，用于从待测样品中鉴定桉树成分。

在本发明的另一方面，提供一种鉴定桉树成分的试剂盒，其中包括前面所述的引物和前面所述的Taqman探针。

在一个优选例中，所述试剂盒中还包括：检测ndhB基因的引物，其序列如SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6所示。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括选自以下的试剂：DNA提取试剂，Taq酶，PCR缓冲液，DNA聚合酶，和/或说明鉴定桉树成分的方法的使用说明书。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、内参照实时荧光PCR通用性检测。其中，48种显花植物样品DNA显示特异性的扩增曲线，阴性对照及空白对照无特异性的扩增曲线。

图2、桉树引物探针实时荧光PCR。其中，7个桉树品种样品DNA显示特异性的扩增曲线，其它DNA样品及空白对照无特异性扩增曲线。

图3、柠檬桉引物探针实时荧光PCR扩增反应及其标准曲线。其中，上述为扩增曲线，下图为标准曲线。

图4、直干桉引物探针实时荧光PCR扩增反应及其标准曲线。其中，上述为扩增曲线，下图为标准曲线。

图5、蓝桉引物探针实时荧光PCR扩增反应及其标准曲线。其中，上述为扩增曲线，下图为标准曲线。

图6、柠檬桉成分最低检测限检测结果。其中，基线上方为1％桉树蜜/油菜蜜DNA的扩增曲线，阴性对照及空白对照无特异性的扩增曲线。

图7、蓝桉成分最低检测限检测结果。其中，基线上方为1％桉树蜜/油菜蜜DNA的扩增曲线，阴性对照及空白对照无特异性的扩增曲线。

图8、市售蜂蜜中桉树成分检测结果。其中，图中标号表示各市售样品的编号，1为荔枝和荆条混合蜜，2为荆条蜜，3为油菜和向日葵混合蜜，4为洋槐和龙眼混合蜜，5为紫云英和向日葵混合蜜，6为洋槐蜜，7为桉树蜜，8为桉树蜜。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究和试验，首次揭示一种可特异性鉴定桉树成分的引物，所述引物针对含有桉树成分的DNA可发生特异性扩增(获得阳性结果)，而对没有桉树成分的DNA不发生特异性扩增(获得阴性结果)。为了简化PCR扩增方法，本发明人还设计了配合所述引物的、用于进行实时荧光PCR的Taqman探针。采用所述的引物配合Taqman探针，可良好地应用于鉴定桉树成分，并且具有良好的再现性、灵敏度。

如本文所用，所述的“桉树成分”是指特异性来自于桉树的成分，可以是桉树本身或其加工产品，包括蜂蜜等。

桉树(Eucalyptus robusta Smith)又称尤加利树，是桃金娘科桉属植物的统称。桉树蜜的蜜源主要是大叶桉、小叶桉、和柠檬桉等。桉树蜜有养胃补虚、清热、补中、解毒、润燥的功效，还有一定的镇定作用，营养价值较高。鉴于目前蜂蜜鱼龙混杂的状况，需要以有效的手段来区分真正来自于桉树作为蜜源的蜂蜜。

引物和探针

本发明人通过桉树及其它物种在基因层面的比较和筛选，获得一种可特异性鉴定桉树成分的引物，其对于桉树的DNA发生特异性扩增，而对没有桉树成分的DNA不发生特异性扩增。

因此，本发明提供一种引物，所述的引物具SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

本发明的这些引物还可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记。

本发明还提供一种探针，所述的探针是具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列和具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的两条探针；较佳地，所述的探针是Taqman探针，从而便于实时荧光检测。

检测内参

本发明人经过反复筛选，还获得了一组适用于作为内参的引物探针，其以显花植物ndhB基因(NADH dehydrogenase subunit B(ndhB)gene)作为检测靶标。

因此，作为本发明的优选方式，提供了以ndhB基因作为检测内参，检测ndhB基因的引物，其序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。更优选地，还提供了特异性鉴定所述引物的扩增产物的Taqman探针，其序列如SEQ ID NO:7所示。

PCR方法

基于本发明所提供的适用于鉴定桉树成分的特异性引物及探针，本发明还提供了一种鉴定桉树成分的方法，所述方法包括：以待测样品的DNA为模板，以SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所示的引物进行PCR扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含桉树成分。

获取待测样品的DNA的方法是本领域技术人员所熟知的技术，例如可采取传统的酚/氯仿/异戊醇法，或者可采用一些商购的DNA提取试剂盒，这类试剂盒是本领域技术人员熟知的。

聚合酶链反应(PCR)技术是本领域技术人员熟知的技术，其基本原理是体外酶促合成特异DNA片段的方法。本发明的方法可采用常规的PCR技术进行。

在本发明的优选实施方式中，采用Taqman实时荧光PCR检测技术：根据桉树的核糖体蛋白L16基因设计特异性引物和探针，特异性识别靶序列上长度187bp的片段。在PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的标记有荧光素的Taqman探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct(cycle threshold,Ct)值。Ct值，即PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数，它与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，模板DNA量越多，荧光达阈值的循环数越少，即Ct值越小，从而实现对起始模板定量及定性的分析。

利用本发明的引物及探针，只需进行PCR反应和/或琼脂糖凝胶电泳，并通过判断相应的PCR产物的有无，就可以准确、快速地判断待测样品是否含有桉树成分，而且所需的样品量很少，对于微量的桉树成分也能检出，绝对灵敏度可达到5pg DNA，相对灵敏度可达到0.01％。

试剂盒

本发明还涉及一种用于鉴定桉树成分的试剂盒，所述试剂盒中含有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物；更佳地，所述的试剂盒中还含有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的探针。

作为本发明的优选方式，所述的试剂盒中还包括：如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的引物，用于扩增内参基因。更佳地，所述的试剂盒中还包括：如SEQ ID NO:7所示的探针。

此外，所述的试剂盒还可含有其它鉴定桉树成分的试剂，如(但不限于)：

(A)各种PCR反应用试剂，例如但不限于：Taq酶，PCR缓冲液，dNTP，DNA聚合酶等；或

(B)各种提取DNA(即制备PCR反应模板)所需的试剂，例如但不限于：酚、氯仿、异戊醇、NaCl等；或

(C)提取DNA的试剂盒。

此外，所述的试剂盒中还可含有鉴定桉树成分的使用说明书和/或标准操作程序。

本发明所述的试剂盒可实现快速检测、批量检测桉树成分的目的。

本发明的主要优点在于：

(1)首次揭示一种可特异性鉴定桉树成分的引物，所述的引物特异性良好，对于各种桉树能够实现特异性扩增，而对于桉树以外的其它物质则不能特异性扩增。并且，所述引物具有良好的再现性、结果稳定可靠。

(2)利用所述的引物或含有所述引物的检测试剂盒，可快速、大批量地检测桉树成分，从待测样品中快速准确地区分真假桉树成分，并且所需样品量少，操作简单。

(3)较佳地，本发明应用Taqman实时荧光PCR技术，可快速实现待测样品如食品中桉树源性成分的准确鉴定。

(4)本发明的方法的推广应用对保障产品的质量，保护消费者知情权和选择权，维护正常的经济秩序等提供了技术支持。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、桉树检测靶序列的确定及引物探针设计

本发明人根据桉树基因组特点并综合分析与桉树亲缘关系较近的其它物种的基因组特点，经过大量的分析比较，确定以桉树的核糖体蛋白L16基因作为特异性基因，并且以该特异性基因上的多个特定位点设计检测引物和探针来分析检测结果的特异性和准确性。

经反复检测验证，本发明人确定蜜源植物桉树成分检测靶序列及特异性引物探针如下：

F：5’-ATTGTAGCAACTGAAATCTTTCCTA-3’(SEQ ID NO:1)；

R：5’-GTATTGATGCTTTATTACACTGCCT-3’(SEQ ID NO:2)；

P1：5’-FAM-ATGCAGATAAAGGGAAGGTTGAGAGAA-BHQ1-3’(SEQ ID NO:3)；

P1：5’-FAM-TGCAGATGGAGGGAAGGTTGAGAGAA-BHQ1-3’(SEQ ID NO:4)。

本发明人发现，一条探针不能将所有的桉树品种均检测出来，因此使用时将两条探针等比例混合后使用。

实施例2、蜜源植物实时荧光PCR内参照引物探针的通用性筛选

采用的实时荧光反应体系为：

将混合物反应管置于实时荧光PCR仪7500中，程序如下：

50℃ 2min；

95℃预变性 10min；

95℃15s，60℃1min，共进行40个循环；

生成图像时阈值设为自动。

进行通用性检测时，以显花植物(48种)：洋槐、油菜、紫云英、枸杞、荆条、荔枝、龙眼、巨桉、枣、椴树、向日葵、玫瑰、棉花、麦卢卡、苹果、薰衣草、桔、红薯、白菜、芝麻、黄瓜、大米、小麦、桑树、蚕豆、冬青、木兰、橄榄、桂花、人参、芋头、国槐、甘薯、山茶、郁金香、猕猴桃、芒果、葡萄、草莓、百合、菊花、杜鹃、板栗、榆树、番茄、杨树、水仙、桃为阳性对照；以松树、金针菇、木耳、香菇、鸡、猪、绿藻、大肠杆菌、酵母9个物种为阴性对照。进行显花植物通用性筛选。

经过大量的分析比较，结果显示，显花植物ndhB基因(NADH dehydrogenasesubunit B(ndhB)gene)引物探针对48种显花植物均能扩增出来，阴性对照及空白对照无特异性的扩增曲线，如图1所示。

ndhB基因引物探针为：

内参照F：

5’-GCTGAAGCAGCTACTTTCGAAGTAACA-3’(SEQ ID NO:5)；

内参照R：

5’-AGGAGCCGTGTGAGATGAAAGTCTCA-3’(SEQ ID NO:6)；

内参照P：

5’-FAM-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGAGG-BHQ1-3’(SEQ ID NO:7)。

鉴于ndhB基因的上述引物探针通用性较好，故依此引物探针作为内参照，用于对蜜源植物及蜂蜜样品DNA提取效果进行质控检测。

实施例3、桉树蜜实时荧光PCR体系的建立

1、桉树蜜实时荧光PCR反应体系

桉树成分实时荧光PCR反应体系，如表1所示。将混合物反应管置于实时荧光PCR仪AB ViiA7中。

PCR程序如下：

50℃ 2min；

95℃预变性 10min；

95℃15s，60℃1min，40个循环。

生成图像时阈值设为自动。

PCR反应体系如表1。

表1、实时荧光PCR反应体系

2、桉树引物特异性实验

以上述实时荧光反应体系及程序进行特异性检测，以7个桉树品种：柠檬桉(Eucalyptus citriodora Hook.f.)、蓝桉(Eucalyptus globulus Labill.)、巨桉(Eucalyptus grandis Hill ex Maiden)、直干桉(Eucalyptus maiden F.V.Muell.)、大叶桉(Eucalyptus robusta Smith)、窿缘桉(Eucalyptus exserta F.V.Muell.)、赤桉(Eucalyptus camaldulensis Dehnh.)DNA；选择近缘植物物种或其它蜜源植物物种样品(22种)：金蒲桃、澳洲蒲桃、年青蒲桃、红梢白千层、油菜、紫云英、荔枝、洋槐、龙眼、椴树、巨桉、枸杞、葵花、枇杷、枣、月季、玫瑰、大豆、黄瓜、木瓜、玉米、水稻；动物类样品(4种)：猪、鸡、牛、羊DNA样品为模板，以无菌水为空白对照，进行体系特异性测试。

结果显示，本发明的引物探针特异性很好，能对桉树(7种)进行有效扩增，同时其它物种DNA均无扩增，如图2所示。

3、桉树引物探针灵敏度检测

(1)标准曲线的制备

首先将提取的桉树(柠檬桉、直干桉、蓝桉)DNA溶液用0.1×TE(Tris-HCl，EDTA·Na)缓冲液连续梯度稀释至5个浓度：10、1、0.1、0.01和0.001ng/μL，然后利用本发明设计的桉树特异性引物/探针进行实时荧光PCR扩增反应。整个实验重复3次，每个浓度设立3个平行反应。去除偏离度较大的点之后，最后以DNA模板量(拷贝数)的对数值为横坐标，相对应的Ct值(荧光信号达到设定的阈值时所经过的循环数)为纵坐标，建立标准曲线。

柠檬桉引物探针实时荧光PCR扩增反应及其标准曲线如图3所示，可见其反应效率为92.58％，R2为0.9995。

直干桉引物探针实时荧光PCR扩增反应及其标准曲线如图4所示，可见其反应效率为96.70％，R2为0.9997。

蓝桉引物探针实时荧光PCR扩增反应及其标准曲线如图5所示，可见其反应效率为91.69％，R2为0.999。

结果表明，建立的标准曲线线性好，反应效率高，可以对桉树成分进行分析检测。

(2)绝对灵敏度实验

将桉树(柠檬桉、蓝桉、赤桉、直干桉、巨桉)DNA浓度梯度分别按10，0.1，0.01，0.001，0.0001和0.00001ng/μL稀释。按桉树优化好的反应体系进行绝对灵敏度检测，整个实验设立4次重复，每个浓度设立5个平行反应，即每个浓度均进行了20次反应，得到20个Ct值。

结果如表2所示。赤桉和巨桉可稳定检出的最低浓度为0.001ng/μL，即检测下限为5pg(模板为5μL)。柠檬桉、蓝桉和直干桉可稳定检出的最低浓度为0.0001ng/μL，即检测下限为0.5pg。

表2、实时荧光PCR检测的绝对灵敏度测试

注：*16/20指20次检测检出16次。

综合五种桉树的检测结果，本发明建立的实时荧光PCR体系的绝对灵敏度可达到5pg DNA。

(3)桉树成分相对灵敏度检测

为了验证本发明的方法对桉树检测的相对灵敏度，本发明人将提取的大豆DNA分别掺入到桉树(柠檬桉、蓝桉、直干桉)DNA中，按比例依次混合成10％、1％、0.1％、0.01％的样品，采用建立的实时荧光PCR方法进行测试，每个百分比含量样品设置5个平行，重复4次，即每个梯度得到对应的20个Ct值，计算阳性扩增次数。

结果如表3所示，柠檬桉、蓝桉、直干桉可稳定检出的最低百分比浓度均为0.01％。

表3、实时荧光PCR检测的相对灵敏度测试

注：*20/20指20次检测检出20次

综合上述结果，本发明建立的实时荧光PCR体系的相对灵敏度可达到0.01％。

实施例4、桉树蜜成分最低检测限检测

本发明人将桉树蜜与油菜蜜进行混合配制成5％、1％和0.5％(体积比)含有桉树蜜成分的混合蜜，每个百分比含量样品设置5个平行，重复4次，即每个梯度得到对应的20个Ct值，计算阳性扩增次数。

结果发现，1％桉树蜜/油菜蜜样品的10次检测均能产生特异性的扩增曲线，如图6和图7，相应的Ct值均在结果判断的检测限内，即低限检测稳定性较好，检出率为100％，如表4所示。

表4、桉树蜜最低检测限稳定性检测Ct值

实施例5、市售蜂蜜样品实际检测

提取8份市售蜂蜜DNA，浓度调至10ng/μL。进行实时荧光PCR检测之前，用内参照引物进行扩增，以确证所有样品的DNA均成功提出，结果显示DNA质量良好。

用前述建立的方法对市售样品进行实际检测，以桉树样品为阳性对照，重复三次。

检测结果发现，有1种市售样品检出桉树成分，但Ct值出现的较为靠后，可能掺有其它蜜源植物；其中1种蜂蜜标识桉树蜜，并未检出桉树成分，说明这份市售蜂蜜并不含有桉树蜜成分，其余6种样品均未检测出桉树蜜成分，与标签相符。结果见图8，详细结果分析详见表5。

表5、8份蜂蜜样品蜜源植物成分的实时荧光PCR检测结果统计

注：“+”表示检出，“-”表示未检出。

综上，本发明所建立的方法的最低检出限(LOD)为0.01％桉树成分(w/w)或1％桉树蜜成分(体积比)，特异性强、灵敏度高、操作简便、快速、自动化程度高，适用于实验室对桉树蜜中桉树成分的快速检测。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种鉴定桉树成分的方法，其特征在于，所述方法包括：

以待测样品的DNA为模板，以SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示的引物进行PCR扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含桉树成分。

2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，以SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示的引物以及SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示的Taqman探针进行实时荧光PCR检测。

3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，以ndhB基因作为检测内参，检测ndhB基因的引物如SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6所示。

4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，以SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6所示的引物以及SEQ ID NO: 7所述的Taqman探针进行ndhB基因的实时荧光PCR检测。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待测样品是食品、植物或植物制品。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的食品是饮料。

7. 引物和Taqman探针在制备用于鉴定桉树成分的试剂盒中的应用，所述引物是引物对，其序列如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示，所述的探针序列如SEQ ID NO: 3和SEQID NO: 4所示。

8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述试剂盒中还包括：检测ndhB基因的引物，其序列如SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6所示。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述试剂盒中还包括选自以下的试剂：DNA提取试剂，Taq酶，PCR缓冲液，DNA聚合酶，和/或说明鉴定桉树成分的方法的使用说明书。