KR101538343B1 - 이중 표지된 ｌｎａ 프로브와 형광 융해 곡선 분석을 이용한 녹용 원산지 판별방법 및 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 프라이머 쌍에 의한 각 원산지별 녹용 샘플의 DNA 증폭, 이중 표지된 LNA 프로브와 증폭된 DNA와의 상보적 결합 그리고 FMCA를 이용한 Tm 측정을 토대로 한 새로운 녹용 원산지 판별 방법 및 키트를 제공한다. 본 발명에 따르면, 원산지 속이기에 주로 이용되는 중국산 녹용, 뉴질랜드산 녹용, 엘크 녹용과 상급 녹용인 러시아산 녹용을 간편하고 저렴하면서도 신속, 정확하게 그리고 특이적으로 판별할 수 있다. 특히, 본 발명은 이중 표지된 LNA 프로브를 이용하여 각각의 녹용 원산지에 대응하는 Tm값의 차이를 증가시켰기 때문에 결과 분석이 용이하면서도 정밀하다는 장점이 있고, 1개의 반응 튜브 내에서 1가지 프로브만을 이용하여 4가지 원산지 판별을 달성할 수 있어 검사가 간결하면서도 경제성이 높다는 장점이 있다.

Description

이중 표지된 ＬＮＡ 프로브와 형광 융해 곡선 분석을 이용한 녹용 원산지 판별방법 및 키트 {Method and kit for identifying place of origin of deer antlers using dual labeled LNA probe and fluorescence melting curve analysis}

본 발명은 리얼타임 PCR 적용 분야인 형광 융해 곡선 분석(Fluorescence Melting Curve Analysis; FMCA)과 이중 표지된 LNA(dual labeled Locked Nucleic Acid) 프로브를 이용한 녹용 원산지 판별방법 및 키트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 육안으로는 판별이 어려운 녹용의 원산지를 간편하고 저렴하면서도 신속, 정확하게 그리고 특이적으로 판별할 수 있는 녹용 원산지 판별방법 및 키트에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명은 원산지별 녹용의 샘플로부터 증폭된 표적 유전자의 증폭 산물과 이러한 표적 유전자의 증폭산물에 상보적으로 결합하는 이중 표지된 LNA 프로브를 이용하여 형광 융해 곡선 분석(Fluorescence Melting Curve Analysis)을 수행할 때, 원산지별 녹용의 샘플로부터 증폭된 표적 유전자의 증폭 산물과 LNA 프로브 간의 염기 미스매칭 개수가 녹용 원산지별로 상이한 점과, 이러한 원산지별로 서로 다른 염기 미스매칭 개수에 따라 녹용 원산지별 Tm(melting temperature)이 유의적으로 상이한 점을 이용하여 녹용의 원산지를 간편하고 저렴하면서도 신속, 정확하게 그리고 특이적으로 판별할 수 있는 녹용 원산지 판별방법 및 키트에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 비대칭 PCR, 이중 표지된 프로브, LNA 및 FMCA 등의 기술들을 융합하여 원산지 속이기에 주로 이용되는 중국산 녹용, 뉴질랜드산 녹용, 엘크 녹용과 상급 녹용인 러시아산 녹용을 판별하되, 1가지의 이중 표지된 LNA 프로브 만을 이용함으로써 프로브 디자인의 효율을 도모하고, 기존의 리얼타임 PCR에서 사용되는 프로브의 양 보다 훨씬 적은 양의 프로브를 사용함으로써 1회 시험 비용을 대폭 감소시킨 녹용 원산지 판별방법 및 키트에 관한 것이다.

나아가, 본 발명은 절편된 상태에서 원산지의 판별이 어려운 녹용의 원산지를 간단하고 신속하면서도 정확하게 그리고 특이적으로 판별하여 중국산 녹용, 뉴질랜드산 녹용이나 엘크의 뿔, 심지어는 다른 동물의 뿔이 국내산 녹용이나 상대적으로 고가인 러시아산 녹용으로 둔갑되는 것을 수입, 검역 및 유통과정에서 신속하게 차단하고 불법 유통을 방지하는 대책을 마련하게 함으로써 녹용 유통과정의 투명성을 제고하고 국내 소비자의 이익과 건강을 보호할 수 있는 기술에 관한 것이다.

녹용은 숫사슴의 굳어지지 않은 어린 뿔을 채취하여 가공한 약재를 말하며, 한방에서는 늦봄에 숫사슴의 뿔이 떨어진 자리에 새롭게 자라기 시작한 뿔로서 털이 밀생되고 아직 골질화되지 않았거나 일부 골질화된 어린 뿔을 자른 다음 말린 것을 녹용이라 하고 가을이 되어 각질화된 뿔은 녹각이라고 한다.

녹용에는 다양한 활성 성분들이 함유되어 있는데, 특히 강장보신의 효능이 있어 여러 가지 허약증을 치료하는 대표적인 보약으로 알려져 왔다. 녹용은 간질, 궤양, 빈혈, 류머티즘, 중풍 등의 질환 치료 및 예방, 불면, 피로, 두통, 경련 등의 증상의 개선, 위장운동 촉진, 식욕증진, 신경쇠약 치료 및 개선, 병후회복, 노화방지, 기억력 증진, 성기능 회복 촉진, 그리고 상처 치유 촉진효능 등이 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 이유로 녹용은 우리나라에서 가장 많이 소모되는 동물성 생약이다.

통상, 약용으로 가장 뛰어난 효능을 갖는 것으로 알려진 녹용은 국내산 사슴인 꽃사슴(Cervus nippon)의 녹용이나, 고가이고 수량이 적어 최근에는 수입산 녹용이 주로 사용되고 있다. 국내에서 유통되고 있는 녹용은 산지에 따라 크게 러시아 사슴(Cervus elaphus sibiricus)의 녹용(이하, '러시아산 녹용'이라 함), 중국 사슴(Cervus elaphus bartrianus)의 녹용(이하, '중국산 녹용'이라 함), 및 뉴질랜드 사슴(Cervus elaphus)의 녹용(이하, '뉴질랜드산 녹용'이라 함)과, 대록(大鹿)이라고 불리는 엘크(Cervus canadensis, ELK)의 녹용(이하, '캐나다산 녹용 또는 엘크 녹용'이라 함)이 있다. 엘크의 녹용은 광록병을 발생시키는 것으로 알려져 현재 수입이 금지되어 있다.

수입산 녹용의 경우 약효가 동일하지 않은 것으로 알려져 있는데, 녹용은 추운 지방에서 난 녹용을 상급으로 분류한다. 따라서, 러시아산 녹용이 수입산 녹용 중에서는 상급으로 분류되고, 중국산 녹용(유통명: 깔깔이), 뉴질랜드산 녹용(유통명: 뉴자) 및 엘크 녹용은 중급 또는 하급으로 분류된다. 러시아산 녹용은 보통 원용이라 불리며, 그 효능이 뛰어나 가격적인 면에서 중국산 녹용, 뉴질랜드산 녹용 및 엘크 녹용과는 차별화되고 있다.

그러나, 현재 유통되고 있는 녹용은 전문가가 아니면 원산지를 판별하기가 어렵고, 특히 녹용은 숫사슴의 뿔을 자른 후 건조시킨 것이기 때문에 육안으로는 그 원산지 판별이 거의 불가능하다. 따라서, 녹용은 유통과정에서 원산지를 속이기가 쉽고, 이로 인해 값싼 엘크 녹용, 중국산 녹용, 뉴질랜드산 녹용 등이 러시아산 녹용이나 심지어는 국내산 녹용으로 둔갑되어 팔리는 경우들이 자주 발생하고 있다. 또한, 엘크 녹용은 2000년 이후에는 유통이 금지되었지만, 중국을 통한 밀무역을 통하여 일부 유통되고 있으며 원용과 혼합·판매되어 소비자 건강에 심각한 위협이 된 사례도 있다.

즉, 녹용의 분류 및 유통에 있어서 가장 큰 문제가 되고 있는 것이 바로 원산지 속이기이라고 할 수 있다. 녹용의 원산지 속이기에 주로 사용되고 있는 녹용은 중국산 녹용, 뉴질랜드산 녹용, 엘크 녹용이다. 이들 녹용들은 절편 상태에서는 원산지 판별이 어렵지만, 그 원산지에 따라 DNA 염기서열이 다른 특성이 있다. 이에 따라 본 발명이 속한 기술분야에서는 이러한 DNA 염기서열의 차이를 이용하여 러시아산 녹용, 엘크 녹용, 중국산 녹용 및 뉴질랜드산 녹용을 판별할 수 있는 기술에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

녹용 원산지 속이기에서 빈번하게 사용되는 중국산 녹용, 뉴질랜드산 녹용, 엘크 녹용의 원산지 판별을 위해서는 유전자의 시퀀싱이 필요하지만 전체 유전자에 대해 시퀀싱을 하는 것은 비용이 비싸고 시간이 오래 걸리는 단점이 있다. 따라서, 이를 대신하여 표적 유전자에서의 수개의 염기쌍, 예를 들어 1 내지 2bp의 DNA 염기서열 차이를 저렴하고 빠르게 분석할 수 있는 기술이 주목을 받고 있다.

즉, 현재의 분자 생물학적 원산지 판별법은 시퀀싱을 통해 각 원산지별로 레퍼런스 염기서열을 확보한 후, 이를 토대로 원산지 특이적인 특정 표적 유전자를 결정하고, 해당 표적 유전자에서의 원산지별 염기서열 차이를 분석하는 방식을 채택하고 있다. 또한, 특정 표적 유전자에서의 원산지별 염기서열 차이를 분석하기 위해, 일반 PCR과 전기영동법, 파이로시퀀싱, 마이크로어레이법 및 리얼타임(real-time) PCR이 이용되고 있다.

현재까지의 분자유전학적 원산지 판별은 대부분 PCR 기술을 통해서 이루어지고 있다. PCR 기술은 프라이머 쌍과 증폭 대상이 되는 DNA 사이의 어닐링(annealing)을 기초로 수행된다. 따라서, 원산지 판별은 판별하고자 하는 샘플의 DNA와 100% 상보적인 프라이머 쌍을 이용한 PCR 증폭을 통해 이루어진다. 그러나, 프라이머 쌍과 증폭 대상 DNA는 염기서열이 서로에 대해 완전히 상보적이지 않더라도 어닐링이 이루어질 수 있는데, 프라이머 쌍과 증폭 대상 DNA 간에 염기서열이 1~3bp 정도 상보적이지 않은 경우 어닐링이 일어나고, 이는 잘못된 원산지 판별 결과로 이어지게 된다. 특히, 본 발명에서 다루고 있는 러시아산 녹용, 엘크 녹용, 중국산 녹용 및 뉴질랜드산 녹용은 상호 간의 DNA 서열의 차이가 크지 않다. 따라서, 기존의 PCR 방법만으로는 원산지 판별이 어렵다.

이와 관련하여, 대한민국 등록특허공보 제10-0768829호에서는 순록 미토콘드리아 유전자의 D-loop 부분에만 특이적으로 결합하는 프라이머를 이용한 PCR 증폭을 수행하고 이를 통해 순록을 다른 종들과 구분하는 기술을 개시하고 있다. 그러나, 상기 종래 기술은 다양한 원산지의 녹용을 판별할 수 없는 한계와, 전술한 바와 같은 프라이머 쌍의 비특이적 어닐링의 문제점을 여전히 해결할 수 없는 한계가 있었다.

이러한 문제점 등을 감안하여 리얼타임 PCR이 대안으로 제시되고 있으나, 리얼타임 PCR 기법 중 SYBR 그린(SYBR green) 기법은 특이성이 떨어지며 한 개의 튜브에서 한 가지의 원산지만 분석할 수 있기 때문에 다양한 원산지 판별에는 적합하지 않은 문제점이 있다. 예를 들어, SYBR 그린 리얼타임 PCR을 사용하여 미지의 녹용 시료가 어떠한 원산지 사슴에서 나왔는지를 판별하는 경우, 리얼타임 PCR 증폭 과정에서 증폭된 DNA에 SYBR 그린 염색약이 끼어들어가 형광신호를 발생하게 되고 이러한 형광신호를 통해 사슴의 종 판별이 이루어지지만, 프로브 없이 증폭용 프라이머쌍 만을 사용하기 때문에 검출 특이성이 떨어지는 한계와, 원산지 개수 만큼 실험에 사용되는 반응 튜브의 개수가 많아져야 하기 때문에 분석과정이 불편한 단점을 가지고 있다.

상기 SYBR 그린 리얼타임 PCR 기법의 대안으로서 원산지 판별을 위해 이중 표지된 프로브(dual labeled probe)를 이용한 리얼타임 PCR 기법이 사용되고 있는데, 이는 5'말단에 형광물질이 표지되어 있고 3'말단에 소광물질(Quencher)이 표지된 이중 표지된 프로브를 이용하여 리얼타임 PCR을 수행함으로써 표적 유전자에서의 원산지별 염기서열 차이, 예를 들어 1-2bp의 염기서열 차이를 저렴하고 빠른 속도로 분석할 수 있으며, 각 원산지 특이적인 프로브에 파장이 다른 형광물질을 표지할 경우 한 개의 반응 튜브 내에서 2~3가지의 원산지 판별이 가능하다.

이와 관련하여, 대한민국 등록특허공보 제10-0829987호에서는 전술한 이중 표지된 프로브를 이용한 리얼타임 PCR 기법을 사용하여 순록 뿔과 녹용을 구별하는 방법을 개시하고 있다. 상기 종래 기술은 순록 뿔의 DNA와 녹용의 DNA에 각각 특이적인 2개의 프로브로서 다른 파장 대의 형광물질로 표지된 2개의 프로브를 이용함으로써 한 개의 튜브에서 두 가지 종 판별이 가능하지만, 사전에 두 가지의 프로브를 다지인해야 하는 불편과 프로브 증가에 따른 비용 증가라는 단점을 가지고 있다. 즉, 상기 종래기술은 1가지 원산지 판별을 위해 1가지의 프로브를 제작해야 하기 때문에, 예를 들어 4가지 원산지 판별을 해야 하는 경우에는 4가지의 프로브를 제작해야 하므로 검사 과정이 복잡해 지고 1회 검사 비용이 판별하고자 하는 원산지 개수에 비례하여 증가하게 된다.

따라서, 본 발명이 속하는 기술분야에서는 간편하면서도 저렴하게 그리고 정확하게 원산지를 판별할 수 있는 기술의 제공이 절실히 요구되고 있다. 이중 표지된 프로브를 이용한 리얼타임 PCR 기법의 단점들을 보완하기 위한 방법으로 형광 융해 곡선 분석(Fluorescence Melting Curve Analysis; FMCA) 방법이 주목을 받고 있다.

상기 기술은 표적 유전자를 증폭하는 프라이머 쌍과 종 내지는 원산지 특이적인 프로브를 이용하고, 증폭된 표적 유전자와 상기 프로브 사이에 염기 미스매칭이 있을 때 발생하는 Tm(melting temperature)의 변화를 이용하여 다양한 종 또는 원산지를 판별하는 방법이다. 이 방법은 프로브 개수를 줄일 수 있어 검사 과정의 간소화와 경제성을 도모할 수 있으나, 표적 유전자와 프로브 간의 미스매칭에 따른 Tm값의 차이가 크지 않아 판별하는데 어려움이 있는 단점이 있고, 이러한 단점은 판별 대상이 되는 종과 원산지가 증가할 수록 더욱 심화된다.

즉, 종래 기술에서는 DNA-DNA 결합의 미스매칭에 따른 Tm의 변화가 크지 않아 그 분석에 어려움을 겪고 있었고(DNA-DNA 결합에서 1개 염기의 미스매칭이 있을 경우 Tm이 단지 0.2℃~0.3℃정도 차이가 나는 것으로 알려져 있음), 이를 극복하기 위해 FMCA 과정에서 온도 조절을 미세하게 하는 HRM(High Resolution Method)이 개발되었으나, 이 역시 분석 과정이 불편하고 정밀한 분석에는 한계가 있었다.

따라서, 본 발명이 속하는 기술분야에서는 기존의 이중 표지된 프로브를 이용한 리얼타임 PCR 방법 대신에 1가지 프로브 만을 이용하되 하나의 반응 튜브 내에서 동시에 여러 가지의 녹용 원산지를 판별하여 검사의 간결성과 경제성을 향상시킨 새로운 녹용 원산지 판별방법의 제공이 요구되고 있다고 할 수 있다.

대한민국 등록특허공보 제10-0768829호 (2007. 10. 19) 대한민국 등록특허공보 제10-0829987호 (2008. 5. 20) 대한민국 공개특허공보 제10-2009-0015587호 (2009. 2. 12)

본 발명은 리얼타임 PCR 적용 분야인 형광 융해 곡선 분석과 이중 표지된 LNA 프로브를 이용한 Tm의 패턴을 보고 육안으로는 판별이 어려운 녹용의 원산지를 간편하고 저렴하면서도 신속, 정확하게 그리고 특이적으로 판별할 수 있는 녹용 원산지 판별방법 및 키트를 제공하는데 그 목적이 있다.

구체적으로, 본 발명은 원산지별 녹용의 샘플로부터 증폭된 표적 유전자의 증폭 산물과 이러한 표적 유전자의 증폭산물에 상보적으로 결합하는 이중 표지된 LNA 프로브를 이용하여 형광 융해 곡선 분석을 수행할 때, 원산지별 녹용의 샘플로부터 증폭된 표적 유전자의 증폭 산물과 LNA 프로브 간의 염기 미스매칭 개수가 녹용 원산지별로 상이한 점과, 이러한 원산지별로 서로 다른 염기 미스매칭 개수에 따라 녹용 원산지별 Tm이 유의적으로 상이한 점을 이용하여 녹용의 원산지를 간편하고 저렴하면서도 신속, 정확하게 그리고 특이적으로 판별할 수 있는 녹용 원산지 판별방법 및 키트를 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 비대칭 PCR, 이중 표지된 프로브, LNA 및 FMCA 등의 기술들을 융합하여 원산지 속이기에 주로 이용되는 중국산 녹용, 뉴질랜드산 녹용, 엘크 녹용과 상급 녹용인 러시아산 녹용을 판별하되, 1가지의 이중 표지된 LNA 프로브 만을 이용함으로써 프로브 디자인의 효율을 도모하고, 기존의 리얼타임 PCR에서 사용되는 프로브의 양 보다 훨씬 적은 양의 프로브를 사용함으로써 1회 검사 비용을 대폭 감소시킨 녹용 원산지 판별방법 및 키트를 제공하는데 그 목적이 있다.

나아가, 본 발명은 절편된 상태에서 원산지의 판별이 어려운 녹용의 원산지를 간단하고 신속하면서도 정확하게 그리고 특이적으로 판별하여 중국산 녹용, 뉴질랜드산 녹용이나 엘크의 뿔, 심지어는 다른 동물의 뿔이 국내산 녹용이나 상대적으로 고가인 러시아산 녹용으로 둔갑되는 것을 수입, 검역 및 유통과정에서 신속하게 차단하고 불법 유통을 방지하는 대책을 마련하게 함으로써 녹용 유통과정의 투명성을 제고하고 국내 소비자의 이익과 건강을 보호할 수 있는 기술을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기한 발명의 기술적 과제를 해결하고 상기한 발명의 목적에 부합되도록 예의 연구를 거듭한 결과, 본 발명자들은 프라이머 쌍에 의한 각 원산지별 녹용 샘플의 DNA 증폭, 이중 표지된 LNA 프로브와 증폭된 DNA와의 상보적 결합 그리고 FMCA를 이용한 Tm 측정을 토대로 한 새로운 녹용 원산지 판별 방법을 사용함으로써, 1개의 반응 튜브 내에서 1가지의 프로브 만을 사용한 경우에도 동시에 4가지의 녹용 원산지 판별이 가능하도록 하였다.

이하, 본 명세서에서 사용되는 "녹용"이란 용어는 숫사슴의 굳어지지 않은 어린 뿔을 채취하여 가공한 약재를 말하는 협의의 녹용 뿐만 아니라 가을이 되어 각질화된 뿔인 녹각까지 포함하는 것으로서, 숫사슴의 뿔 자체, 녹용, 녹용각, 녹각, 이들의 절편 내지는 일부 등을 포함하는 광의의 개념이다. 또한, 검사 대상 시료에서 DNA를 추출하는 것은 시료의 각 조직으로부터 다양한 방법에 의해 수행될 수 있고, 이는 추출된 DNA를 분석하여 사슴 종 또는 녹용 원산지를 판별하기 위한 것이기 때문에 시료의 어느 부위에서 DNA를 추출하는지 또는 어떠한 방법으로 추출하는지 역시 특별히 제한되지 않는다.

그리고, 상기와 같이 추출한 DNA를 PCR로 증폭하는 것 또한 검사 표본을 늘이기 위한 것으로, 증폭산물을 얻는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 알려진 다른 DNA 추출방법이나 증폭방법 또한 본 발명의 범주에 속한다는 것은 명백하다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 "LNA(Locked Nucleic Acid)"라는 용어는 리보 핵산의 2'의 산소 원자와 4'의 탄소 원자 사이에 메틸렌을 개입시켜 2개의 환상 구조를 가지게 한 인공 핵산을 지칭한다. LNA의 기본 구조는 하기 구조식 1과 같다.

구조식 1

다음으로, 본 명세서에서 사용되는 "융해 곡선 분석(melting curve analysis)"이란 PCR이 끝난 후에 온도를 서서히 올려 형광 세기를 모니터링하여 분석하는 것으로서, 온도가 올라가면서 이중 가닥의 DNA가 단일 가닥으로 될 때 형광 세기가 급격하게 감소하는 것을 모니터링하여 분석하는 것이다. 융해 곡선 분석에서 형광 세기가 급격하게 감소할 때의 온도를 Tm (melting temperature)이라고 한다.

한편, Tm (melting temperature)은 이중 가닥의 DNA가 포함된 반응액의 온도를 서서히 상승시키면 어떤 온도에 도달할 때 갑자기 이중 가닥 구조가 무너지기 시작하여 결국에는 무작위 구조를 갖는 단일 가닥으로 분리될 때의 온도로서 부분 변성도가 평균 50%에 도달하였다고 간주되는 온도를 의미한다.

구체적으로, 본 발명의 일실시예의 녹용 원산지 판별 방법은,

(a) 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머를 사용하여 러시아산 녹용, 엘크 녹용, 뉴질랜드산 녹용 및 중국산 녹용으로 구성된 군으로부터 선택된 녹용 샘플의 DNA를 PCR을 수행하여 증폭하는 단계와,

(b) 서열번호 3의 염기서열을 갖고 5'말단이 형광물질로 표지되며 3'말단이 소광물질로 표지되는 이중 표지된 LNA(Locked Nucleic Acid) 프로브로서, 5'말단으로부터 9번째 염기, 10번째 염기 및 13번째 염기가 LNA로 변형된 이중 표지된 LNA 프로브를 준비하는 단계와,

(c) 상기 (a) 단계에서의 PCR 증폭 후, 상기 (b) 단계에서 준비된 이중 표지된 LNA 프로브를 PCR 증폭 산물에 첨가하는 단계와,

(d) 형광 융해 곡선 분석을 위한 시작 온도에서 상기 PCR 증폭산물과 이중 표지된 LNA 프로브의 혼합물을 인큐베이션시켜 상기 이중 표지된 LNA 프로브를 상기 PCR 증폭 산물에 어닐링시키는 단계와,

(e) 상기 시작 온도에서 온도를 단계적으로 상승시키면서 각각의 상승된 온도에서 형광의 세기를 측정하는 단계와.

(f) 형광 융해 곡선 분석에 있어서 온도에 대한 형광의 세기를 분석하고, 형광의 세기가 급격히 변화하는 온도를 Tm으로 결정하는 단계와,

(g) 상기 결정된 Tm에 대응되는 녹용 원산지 또는 사슴 종을 판별하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일실시예의 녹용 원산지 판별 방법에 있어서, 상기 러시아산 녹용 샘플로부터의 PCR 증폭 산물은 상기 이중 표지된 LNA 프로브와 미스매칭 없이 100% 상보적인 결합을 하고, 상기 엘크 녹용 샘플로부터의 PCR 증폭 산물은 상기 이중 표지된 LNA 프로브와 1개의 염기의 미스매칭을 갖는 상보적인 결합을 하며, 상기 뉴질랜드산 녹용 샘플로부터의 PCR 증폭 산물은 상기 이중 표지된 LNA 프로브와 2개의 염기의 미스매칭을 갖는 상보적인 결합을 하고, 상기 중국산 녹용 샘플로부터의 PCR 증폭 산물은 상기 이중 표지된 LNA 프로브와 3개의 염기의 미스매칭을 갖는 상보적인 결합을 하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예의 녹용 원산지 판별 방법에 있어서, 상기 이중 표지된 LNA 프로브는 추가적으로 5'말단으로부터 12번째 염기 및 14번째 염기가 LNA로 변형될 수 있다. 상기 이중 표지된 LNA 프로브는 상기 미스매칭되는 염기와 그 주변 염기가 LNA로 변형됨으로써 Tm값의 차이를 유의적으로 증가시킬 수 있게 된다.

본 발명의 일실시예의 녹용 원산지 판별 방법에 있어서, Tm이 73℃이면 러시아산 녹용, Tm이 64℃이면 엘크 녹용, Tm이 51℃이면 중국산 녹용, 그리고 Tm이 47℃이면 뉴질랜드산 녹용으로 판별하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예의 녹용 원산지 판별 방법에 있어서, 상기 (f) 단계에서는 상기 형광 세기를 온도에 대해 미분한 후 미분값을 음수처리하는 과정을 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예의 녹용 원산지 판별 방법에 있어서, 상기 (e) 단계에서는 약 35℃부터 약 85℃까지 온도를 단계적으로 상승시키고 약 1℃ 상승을 약 10초 동안 유지한 후 형광 세기를 측정하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예의 녹용 원산지 판별 방법에 있어서, 상기 (a) 단계에서는 비대칭 PCR을 수행하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 이러한 비대칭 PCR을 수행하기 위해 서열번호 2의 역방향 프라이머의 농도는 서열번호 1의 정방향 프라이머의 농도의 10배로 하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 일실시예의 녹용 원산지 판별용 키트는, 러시아산 녹용, 엘크 녹용, 뉴질랜드산 녹용 및 중국산 녹용으로 구성된 군으로부터 선택된 녹용 샘플의 DNA를 증폭하기 위한 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍, DNA 중합효소, dNTPs, 및 PCR 완충용액과, 서열번호 3의 염기서열을 갖고 5'말단이 형광물질로 표지되며 3'말단이 소광물질로 표지되는 이중 표지된 LNA(Locked Nucleic Acid) 프로브로서 5'말단으로부터 9번째 염기, 10번째 염기 및 13번째 염기가 LNA로 변형된 이중 표지된 LNA 프로브를 포함한다.

본 발명의 일실시예의 녹용 원산지 판별용 키트에 있어서, 상기 이중 표지된 LNA 프로브는 추가적으로 5'말단으로부터 12번째 염기 및 14번째 염기가 LNA로 변형될 수 있다.

추가로, 본 발명은 서열번호 3의 염기서열을 갖고, 5'말단이 형광물질로 표지되며 3'말단이 소광물질로 표지되어 있으며, 5'말단으로부터 9번째 염기, 10번째 염기 및 13번째 염기가 LNA로 변형된 이중 표지된 LNA(Locked Nucleic Acid) 프로브로를 제공한다. 상기 이중 표지된 LNA 프로브는 추가적으로 5'말단으로부터 12번째 염기 및 14번째 염기가 LNA로 변형될 수 있다.

한편, 본 발명에 있어서 형광물질은 Cy5, Cy3, x-로다민, 텍사스 레드, SYBR 그린 (SYBR green), FAM, VIC, JOE, NED, HEX 및 TET 등일 수 있고, 소광물질은 IABkFQ, DABCYL, BHQ (BHQ-1, BHQ-2)등일 수 있다. 그러나, 전술한 바와 같이 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고 당업계에 알려진 다양한 형광물질 및 소광물질이 사용될 수 있다.

본 발명에 따르면, 리얼타임 PCR 적용 분야인 형광 융해 곡선 분석과 이중 표지된 LNA 프로브를 이용한 Tm의 패턴을 보고 녹용 원산지 판별을 진행하여 원산지 속이기에 주로 이용되는 중국산 녹용, 뉴질랜드산 녹용, 엘크 녹용과 상급 녹용인 러시아산 녹용을 간편하고 저렴하면서도 신속, 정확하게 그리고 특이적으로 판별할 수 있다.

특히, 본 발명은 러시아산 녹용의 PCR 증폭 산물에는 특이적으로 결합하고 엘크 녹용의 PCR 증폭 산물, 뉴질랜드산 녹용의 PCR 증폭 산물, 중국산 녹용의 PCR 증폭 산물에 대해서는 각각 1개의 염기, 2개 염기 및 3개 염기의 미스매칭을 허용하면서 상보적으로 결합하는 이중 표지된 LNA 프로브를 이용하여 각각의 녹용 원산지에 대응하는 Tm값의 차이를 증가시켰기 때문에 결과 분석이 용이하면서도 정밀하다는 장점이 있고, 1개의 반응 튜브 내에서 1가지 프로브만을 이용하여 4가지 원산지 판별을 달성할 수 있어 검사가 간결하면서도 경제성이 높다는 장점이 있다.

추가로, 본 발명은 1가지의 이중 표지된 LNA 프로브 만을 이용함으로써 프로브 디자인의 효율을 도모하고, 기존의 리얼타임 PCR에서 사용되는 프로브의 양 보다 훨씬 적은 양의 프로브를 사용함으로써 1회 검사 비용을 대폭 감소시킬 수 있다.

나아가, 본 발명은 절편된 상태에서 원산지의 판별이 어려운 녹용의 원산지를 간단하고 신속하면서도 정확하게 그리고 특이적으로 판별하여 중국산 녹용, 뉴질랜드산 녹용이나 엘크의 뿔, 심지어는 다른 동물의 뿔이 국내산 녹용이나 상대적으로 고가인 러시아산 녹용으로 둔갑되는 것을 수입, 검역 및 유통과정에서 신속하게 차단하고 불법 유통을 방지하는 대책을 마련하게 함으로써 녹용 유통과정의 투명성을 제고하고 국내 소비자의 이익과 건강을 보호할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 증폭용 프라이머 쌍을 이용하여 각 원산지별 녹용 샘플을 PCR 증폭한 후 전기영동한 결과를 나타낸다.
도 2는 각각의 원산지별 녹용 샘플 DNA가 공통적으로 가지고 있는 미토콘드리아 ATPase 8 유전자의 표적 서열과, 서열번호 3의 프로브의 서열을 정렬하여 비교한 도면이다.
도 3은 본 발명의 이중 표지된 LNA 프로브와 형광 융해 곡선 분석을 이용하여 4가지 녹용 원산지를 판별하는 원리를 설명한 도면이다.
도 4는 본 발명의 이중 표지된 LNA 프로브와 형광 융해 곡선 분석을 이용하여 실제 얻어진 Tm 값 및 녹용 원산지 판별 결과를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명의 실시예에 기초하여 보다 상세하게 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.

실시예

실시예 1: 프라이머의 제작

NCBI의 GenBank와 선행연구에서 확보된 미토콘드리아 ATPase 8(ATP synthase subunit) 유전자 정보를 이용하여 러시아 사슴의 녹용(이하, '러시아산 녹용'이라 함), 중국 사슴의 녹용(이하, '중국산 녹용'이라 함), 뉴질랜드 사슴의 녹용(이하, '뉴질랜드산 녹용'이라 함) 및 엘크의 녹용(또는 캐나다산 녹용이라고 함) 샘플에서 추출한 DNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 합성하였다.

합성된 PCR 프라이머는 상기 4가지 원산지 녹용이 공통적으로 가지고 있는 미토콘드리아 ATPase 8 유전자를 표적으로 하였다. 이때, 본 발명에서는 PCR 효율을 높이기 위해 여러 쌍의 프라이머를 넣지 않고 1쌍의 유니버설 프라이머를 제작하여 사용하였는데, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 안의 DNA 염기서열 부분이 각각의 녹용 원산지 특이적인 부분을 포함하도록 프라이머 쌍을 디자인하였다. 이러한 녹용 원산지 특이적인 염기서열 부분은 후술하는 본 발명의 이중 표지된 LNA 프로브와 상보적으로 결합한다(도 2 참조). 또한, 본 실시예의 PCR 증폭용 프라이머 쌍에 의해 증폭되는 PCR 증폭 산물은 PCR 증폭시간 단축과 형광 융해 곡선 분석에서의 효율을 위해 100~200bp 가량이 되도록 하였다.

후술하는 본 실시예에서는 하기의 표 1의 프라이머들을 사용한다. 이들 프라이머는 한국의 (주)코스모진텍(본사 서울시 소재)에 의뢰하여 합성하였다.

녹용 원산지 판별의 표적이 되는 DNA 서열을 증폭시키기 위한 PCR 증폭용 프라이머

프라이머	염기서열 (5' → 3')	서열번호	증폭산물 (bp)
정방향 프라이머	GAA AAA TGA TCT GCA TCA ATA CTA	서열번호 1	106
역방향 프라이머	TAA GTC ATG TGG ACG TGT CTA GT	서열번호 2

또한, 전술한 바와 같이 준비한 PCR 증폭용 프라이머 쌍이 각 원산지별 녹용 샘플의 표적 DNA 서열을 효율적으로 증폭하는지 검증하기 위해 각 원산지별 녹용 샘플로부터 독일 퀴아젠사 (QIAGEN)의 DNeasy blood & tissue kit를 사용하여 DNA를 추출하였고, 하기 표 2의 PCR 시약 조성과 표 3의 PCR 증폭 조건 하에서 PCR 증폭반응을 수행하였다. PCR 프리믹스로는 일본 타카라사 (Takara)의 TAKARA RR390(PCR 버퍼, dNTP, DNA 폴리머라아제 등 포함)을 사용하였고, PCR 증폭 기기로는 Bio-radCFX96(Hercules, California, USA)을 사용하였다.

본 실시예의 프라이머 쌍의 증폭 효율 검증용 PCR 시약 조성

PCR 프리믹스 (TAKARA RR390)	10ul
정방향 프라이머 (서열번호 1)	10pmol
역방향 프라이머 (서열번호 2)	10pmol
각 원산지별 녹용 샘플로부터 추출된 DNA	1ul
전체	20ul

본 실시예의 프라이머 쌍의 증폭 효율 검증용 PCR 조건

과정	온도	시간	사이클
사전-변성	95℃	20초	1사이클
변성	95℃	3초	35사이클
어닐링/연장	60℃	30초

상기와 같은 조건 하에서 PCR 증폭반응이 끝난 후, PCR 증폭산물 3㎕에 젤 로딩 버퍼(TBE 2%)를 넣고 2% 아가로스젤에서 50V 하에서 60분간 전기영동을 수행하였다. PCR 증폭산물의 확인결과 비특이적인 밴드의 형성을 확인할 수 없었고, 각 원산지별 녹용 샘플로부터 정상적인 증폭산물의 크기를 확인하였다(도 1 참조).

실시예 2: 녹용 원산지 판별을 위한 이중 표지된 LNA 프로브의 제작

본 발명의 녹용 원산지 판별용 이중 표지된 LNA 프로브는 러시아산 녹용이 가지고 있는 미토콘드리아 ATPase 8 유전자의 표적 서열과 100% 상보적인 서열을 갖도록 디자인하였다. 본 발명의 일실시예의 녹용 원산지 판별을 위한 프로브 염기서열은 다음과 같다.

5'-TG AGA GTA CTA ACG CTC TCC T-3' (서열번호 3)

한편, 도 2에 도시된 바와 같이, 러시아산 녹용의 미토콘드리아 ATPase 8 유전자의 표적 서열은 엘크 녹용의 미토콘드리아 ATPase 8 유전자의 표적 서열과는 1bp, 뉴질랜드산 녹용의 미토콘드리아 ATPase 8 유전자의 표적 서열과는 2bp, 그리고 중국산 녹용의 미토콘드리아 ATPase 8 유전자의 표적 서열과는 3bp가 다르다.

즉, 도 2는 상기 4가지 원산지 녹용이 공통적으로 가지고 있는 미토콘드리아 ATPase 8 유전자의 표적 서열 부분을 도시하고 있는데, 서열번호 3과 같이 프로브를 디자인할 경우 서열번호 3의 프로브는 러시아산 녹용의 표적 서열에 대해서는 100% 서열이 일치되나, 엘크 녹용의 표적 서열에 대해서는 1개 염기의 미스매칭(5'말단으로부터 13번째 염기), 뉴질랜드산의 표적 서열에 대해서는 2개 염기의 미스매칭(5'말단으로부터 9번째 염기 및 13번째 염기), 그리고 중국산 녹용의 표적 서열에 대해서는 3개 염기의 미스매칭(5'말단으로부터 9번째 염기, 10번째 염기 및 13번째 염기)을 나타내게 된다.

또한, 본 발명의 일실시예의 녹용 원산지 판별을 위한 프로브에서는 상기 미스매칭되는 염기(즉, 5'말단으로부터 9번째 염기, 10번째 염기 및 13번째 염기)를 LNA(Locked Nucleic Acid)로 변형시켰고, 선택적으로 그 주변 염기(예를 들어, 5'말단으로부터 12번째 염기 및 14번째 염기)도 LNA(Locked Nucleic Acid)로 변형시켰다.

그리고, 이러한 본 발명의 LNA 프로브는 PCR 증폭 산물에 대해 어닐링되는 것을 FRET (Fluorescent Resonance Energy Transfer) 원리에 의해 가시화하기 위해 이중 표지되었다. 이중 표지된 LNA 프로브는 LNA 프로브의 양 말단에 형광물질(fluorophore)과 소광물질(quencher)이 표지된 것으로서, 예를 들어 5'말단에는 FAM, JOE, TET, HEX, VIC 등과 같은 형광물질을 표지하고 3'말단에는 IABkFQ, DABCYL, BHQ (BHQ-1, BHQ-2) 등과 같은 소광물질을 표지함으로써 얻어진다. 한편, LNA 프로브를 표지하는 형광물질 및 소광물질로는 전술한 예시에 한정되는 것이 아니고, 당업계에 알려진 다양한 형광물질 및 소광물질이 사용될 수 있음은 물론이다. 본 실시예의 이중 표지된 LNA 프로브는 다음의 구조식 2와 같다.

구조식 2

상기 구조식 2의 이중 표지된 LNA 프로브는 미국 아이오와주 소재의 인티그레이티드 디엔에이 테크놀로지사(Integrated DNA Technologies, Inc.)에 의뢰하여 합성하였으며, 상기 구조식 2에서 56-FAM은 형광물질, 3IABkFQ는 소광물질 그리고 "+"는 LNA로 변형된 염기를 나타낸다.

상기와 같은 이중 표지된 LNA 프로브는 상보적인 DNA 염기서열이 없는 경우, 내적인 염기서열 간의 인력으로 인해 꼬임 구조를 갖게 되고 형광물질과 소광물질 간의 거리가 가까워져 형광신호가 나타나지 않는다. 반면에, 상보적인 DNA 염기서열이 존재하는 경우, 이중 표지된 LNA 프로브는 상보적 결합에 의해 일자 구조를 취하게 되고, 형광물질과 소광물질 간의 거리가 멀어져 형광신호가 발생하게 된다. 이러한 이중 표지된 LNA 프로브에 의한 형광신호를 통해 이중 표지된 프로브가 PCR 증폭 산물과 어닐링되었는지 여부를 확인할 수 있고 후술하는 형광 융해 곡선 분석에 있어서는 Tm 값을 측정할 수 있게 된다.

실시예 3: 이중 표지된 LNA 프로브와 형광 융해 곡선 분석을 이용한 녹용 원산지별 Tm 분석

실시예 2와 같은 방식으로 설계된 녹용 원산지 판별을 위한 이중 표지된 LNA 프로브는 엘크 녹용의 표적 서열, 뉴질랜드산 녹용의 표적 서열 또는 중국산 녹용의 표적 서열과 1개 내지 3개의 염기의 미스매칭을 가지면서 상보적인 결합이 이루어진다. 따라서, 미스매칭 없이 완전히 상보적으로 결합 때의 Tm 값과는 상이한 Tm 값을 가지게 된다.

Tm 값의 차이는 상보적이지 않은 염기의 종류, 위치 및 개수에 따라 다르게 된다. 서열번호 3의 프로브와 1개 염기의 미스매칭을 가지면서 상보적으로 결합하는 엘크 녹용 DNA 증폭 산물의 Tm과, 서열번호 3의 프로브와 2개 염기의 미스매칭을 가지면서 상보적으로 결합하는 뉴질랜드산 녹용 DNA 증폭 산물의 Tm과, 서열번호 3의 프로브와 3개 염기의 미스매칭을 가지면서 상보적으로 결합하는 중국산 녹용 DNA 증폭 산물의 Tm은 서로 상이할 뿐만아니라 서열번호 3의 프로브와 미스매칭 없이 완전히 상보적으로 결합하는 러시아산 녹용 DNA 증폭 산물의 Tm과도 상이하게 된다. 본 발명에서는 이와 같은 미스매칭 개수의 차이에 따른 Tm 값의 차이를 이용하여 1가지 프로브를 통한 4가지 녹용 원산지 판별을 진행하였다. 후술하는 실시예에서는 리얼타임 PCR 기술의 응용분야인 형광 융해 곡선 분석(Fluorescence Melting Curve Analysis)을 변형하여 적용하였다.

통상의 DNA-DNA 결합에서 1개 염기의 미스매칭이 있을 경우 Tm이 단지 0.2℃~0.3℃정도 차이가 나기 때문에 이중 표지된 서열번호 3의 프로브를 사용하는 것만으로는 1개의 반응 튜브에서 1개의 프로브 사용으로 4가지 녹용 원산지 판별이 어렵다.

이러한 종래의 문제점을 해결하기 위해 본 발명에서는 이중 표지된 서열번호 3의 프로브를 LNA(Locked Nucleic Acid) 프로브로 변형시켜 4가지 녹용 원산지 판별을 진행하였다. 프로브와 증폭된 표적 DNA 염기서열 부분의 LNA-DNA 결합에서는 DNA-DNA의 결합과는 달리 1bp만 상보적이지 않아도 Tm 값이 현저하게 차이가 나는 경향을 갖는다. 따라서, 본 발명에서는 서열번호 3의 프로브 중 미스매칭되는 염기와 그 주변 염기를 LNA로 변형시킴으로써 각각의 녹용 원산지에 대응하는 Tm값의 차이를 현격하게 증가시켰다.

도 3에는 본 발명의 이중 표지된 LNA 프로브와 형광 융해 곡선 분석(FMCA)을 이용하여 4가지 녹용 원산지를 판별하는 원리가 도식화되어 설명되어 있다.

도 3을 참조하면, FMCA 프로토콜의 시작 온도인 35℃ 부근에서는 낮은 온도로 인하여 이중 표지된 LNA 프로브가 녹용 DNA 샘플의 표적 DNA 염기서열 부분에 부착되어 있는 것을 알 수 있다. 따라서, 모든 원산지의 녹용 DNA 샘플에 대해 이중 표지된 LNA 프로브가 일자 형태를 취하게 되고 이로 인해 형광물질과 소광물질 간의 거리가 떨어지면서 형광이 발생한다.

만약 검사대상 녹용 샘플이 뉴질랜드산 녹용인 경우, 35℃로부터 서서히 온도를 올려 47℃ 부근에 도달하게 되면 이중 표지된 LNA 프로브는 Tm 부근에 도달하게 되어 뉴질랜드산 녹용 DNA 샘플의 표적 DNA로부터 분리된다. 일단 분리가 되면 이중 표지된 LNA 프로브는 꼬임 구조를 갖게 되고, 형광물질과 소광물질은 매우 가깝게 위치하게 된다. 이로 인해 이중 표지된 LNA 프로브에 의해 발생되는 형광신호는 급격하게 감소하게 된다.

이때, Bio-rad CFX96와 같은 리얼타임 PCR 기기에서는 내장된 분석 소프트웨어를 이용하여 가로축에 온도를 그리고 세로축에 형광신호의 크기를 표시한 그래프를 그리게 된다. 이후, 분석 소프트웨어는 시각적으로 판단이 용이하도록 세로축에 표시된 형광신호 크기를 온도에 대해 미분한 후 음수 값을 취한 그래프, 즉 가로축은 온도, 세로축은 -d(RFU)/dT 값을 갖는 그래프를 형성하게 된다. 따라서, 47℃인 경우 피크를 갖는 그래프로부터 Tm이 47℃이라는 분석결과를 용이하게 얻을 수 있게 되고, 이로부터 검사한 샘플이 뉴질랜드산 녹용이라는 것을 용이하게 판정할 수 있게 된다.

본 발명에서는 이러한 형광신호의 급격한 감소 원리를 적용하여 녹용의 원산지 판별을 진행할 수 있고, 중국산 녹용, 엘크 녹용, 러시아산 녹용의 경우에도 같은 원리를 이용한다.

도 3에서 확인되는 바와 같이, 러시아산 녹용 DNA 샘플은 이중 표지된 LNA 프로브와 미스매칭 없이 100% 상보적인 결합을 이루기 때문에 가장 높은 Tm(73℃)을 가진다. 엘크 녹용 DNA 샘플은 이중 표지된 LNA 프로브와 1개의 미스매칭을 갖는 상보적인 결합을 이루고 64℃의 Tm을 갖는다. 그리고 중국산 녹용 DNA 샘플은 이중 표지된 LNA 프로브와 3개의 미스매칭을 갖는 상보적인 결합을 이루고 51℃의 Tm을 갖는다. 마지막으로, 뉴질랜드산 녹용 DNA 샘플은 이중 표지된 LNA 프로브와 2개의 미스매칭을 갖는 상보적인 결합을 이루고 47℃의 Tm을 갖는다.

실시예 4: 각 원산지별 녹용 샘플로부터 추출한 DNA에 대한 PCR 증폭반응의 수행

상기 실시예 1과 유사한 방식으로 하기 표 4의 PCR 시약 조성과 표 5의 PCR 증폭 조건 하에서 PCR 증폭반응을 수행하였다. PCR 프리믹스로는 일본 타카라사 (Takara)의 TAKARA RR390(PCR 버퍼, dNTP, DNA 폴리머라아제 등 포함)을 사용하였고, PCR 증폭 기기로는 Bio-radCFX96(Hercules, California, USA)을 사용하였다. 참고로, PCR 증폭 기기인 Bio-radCFX96은 리얼타임 PCR의 수행이 가능할 뿐만아니라 후술하는 형광 융해 곡선 분석을 위해 형광 신호를 검출하고 형광 신호에 관한 수치를 정량화할 수 있는 기능도 탑재하고 있다.

4가지 녹용 원산지 판별을 위한 비대칭 PCR의 시약 조성

PCR 프리믹스 (TAKARA RR390)	10ul
정방향 프라이머 (서열번호 1)	1pmol
역방향 프라이머 (서열번호 2)	10pmol
각 원산지별 녹용 샘플로부터 추출된 DNA	1ul
전체	20ul

4가지 녹용 원산지 판별을 위한 비대칭 PCR의 조건

과정	온도	시간	사이클
사전-변성	95℃	20초	1사이클
변성	95℃	3초	50사이클
어닐링/연장	60℃	30초

본 실시예에서는 이중 표지된 LNA 프로브 발광원리에 FMCA를 적용하기 위해 비대칭 PCR 기술을 사용하였다. 비대칭 PCR은 단일 사슬의 DNA를 양산하는 기술로서, 이중 표지된 LNA 프로브는 양산된 단일 사슬 DNA에 상보적인 염기서열이 존재할 경우, 이러한 단일 사슬 DNA에 결합하여 형광신호를 나타내게 된다.

즉, 본 실시예에서는 이중 표지된 LNA 프로브가 어닐링하게 되는 단일 사슬 DNA를 양산하기 위해서 PCR 과정에서 역방향 프라이머(서열번호 2)를 정방향 프라이머(서열번호 1)에 비해 10배 더 넣어 주었다. 그리고, 이러한 비대칭 PCR은 증폭효율이 일반 PCR 보다 떨어질 수 있기 때문에 50 사이클을 반복하여 수행하였다. 그 결과, 역방향 프라이머로부터 증폭된 단일 사슬 DNA가 풍부해 졌고, 이중 표지된 LNA 프로브가 어닐링될 수 있는 상보적인 염기서열 부분이 충분히 확보되었다.

실시예 5: 형광 융해 곡선 분석을 이용한 각 원산지별 Tm 측정 및 원산지 판별

실시예 4에서의 PCR 과정이 종료되면, 1개의 반응 튜브에 실시예 2에서 제작한 이중 표지된 LNA 프로브를 100fmol 첨가하였다. 그런 다음, 리얼타임 PCR 장비인 Bio-rad CFX96(Hercules, California, USA)을 사용하여 하기 표 6과 같은 조건 하에서 형광 융해 곡선 분석을 실시하였다.

우선, 35℃에서 3분간 PCR 증폭산물과 이중 표지된 LNA 프로브의 혼합물을 인큐베이션시켰다. 이는 증폭된 단일 사슬 DNA와 이중 표지된 LNA 프로브를 완전히 부착시키기 위해서 수행되는 것이다.

그런 다음, 35℃부터 85℃까지 온도를 서서히 올려가면서 형광의 세기를 측정하였다. 1℃ 상승을 10초 동안 유지한 후 형광 세기의 측정을 진행하였다. 이는 이중 표지된 LNA 프로브가 증폭된 단일 사슬 DNA로부터 분리될 시간적 여유를 제공하기 위해 수행되는 것이다.

형광 융해 곡선 분석 프로토콜에서의 온도와 시간

온도	시간
35℃	180초 (인큐베이션 시간)
35℃~85℃	500초 (형광측정 시간)

전술한 바와 같은 조건 하에서 형광 융해 곡선 분석 과정이 종료된 후, 온도 대비 형광 세기를 실시예 3에서 설명한 바와 같이 측정 및 분석하였다. 이때, Tm 값의 용이한 분석을 위해, 측정된 형광 세기는 온도에 대해 미분한 후 미분값을 음수처리하였다. 이와 같이 미분 및 음수처리한 값인 -d(RFU)/dT를 세로축에 표시하고 온도를 가로축에 표시한 그래프를 새로 그렸다(도 4 참조).

도 4에 도시된 그래프의 곡선들 중 피크를 나타내는 부분이 각 원산지별 녹용 DNA 샘플에 대한 이중 표지된 LNA 프로브의 Tm이다. 본 실시예에서는 이러한 Tm 값을 분석하여 검사대상 시료 내에 포함된 녹용 원산지를 확인하였다. 이와 관련하여 본 발명에서는 러시아산 녹용 DNA 샘플에는 특이적이고 엘크 녹용 DNA 샘플, 뉴질랜드산 녹용 DNA 샘플, 중국산 녹용 DNA 샘플에 대해서는 각각 1개의 염기, 2개 염기 및 3개 염기의 미스매칭을 허용하면서 표적 유전자에 상보적으로 결합하는 이중 표지된 LNA 프로브를 이용하여 각각의 녹용 원산지에 대응하는 Tm값의 차이를 증가시켰기 때문에 결과 분석 및 녹용 원산지 확인이 용이하다.

도 4에 확인되는 바와 같이, 본 실시예에서는 Tm의 패턴을 보고 녹용의 원산지 판별을 진행하기 때문에 1개의 반응 튜브 내에서 1가지의 이중 표지된 LNA 프로브를 사용한 경우에도 동시에 4가지의 녹용 원산지 판별이 가능한 것을 알 수 있다. 또한, 본 실시예에서는 기존의 리얼타임 PCR에서 사용하는 프로브의 양(5pmol의)보다 훨씬 적은 양(100fmol)의 프로브를 이용함으로써 경제적인 원산지 판별이 가능한 장점이 있다.

종래에는 4가지 녹용 원산지 판별을 위해 각 원산지 판별을 위한 4개의 반응 튜브가 필요하거나 4가지의 특이적 프로브가 필요하였으나, 본 발명의 방법은 1개의 반응 튜브에서 1가지의 이중 표지된 LNA 프로만을 사용하더라도 중국산 녹용, 뉴질랜드산 녹용, 엘크 녹용 및 러시아산 녹용의 판별이 가능한 장점이 있다.

이상 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

<110> GENOCHECK CO.,LTD. <120> Method and kit for identifying place of origin of deer antlers using dual labeled LNA probe and fluorescence melting curve analysis <130> P13-0081KR <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal forward primer <400> 1 gaaaaatgat ctgcatcaat acta 24 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal reverse primer <400> 2 taagtcatgt ggacgtgtct agt 23 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sq. <400> 3 tgagagtact aacgctctcc t 21

Claims (10)

1. (a) 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머를 사용하여 러시아산 녹용, 엘크 녹용, 뉴질랜드산 녹용 및 중국산 녹용으로 구성된 군으로부터 선택된 녹용 샘플의 DNA를 PCR을 수행하여 증폭하는 단계와,
   (b) 서열번호 3의 염기서열을 갖고 5'말단이 형광물질로 표지되며 3'말단이 소광물질로 표지되는 이중 표지된 LNA(Locked Nucleic Acid) 프로브로서, 5'말단으로부터 9번째 염기, 10번째 염기 및 13번째 염기가 LNA로 변형된 이중 표지된 LNA 프로브를 준비하는 단계와,
   (c) 상기 (a) 단계에서의 PCR 증폭 후, 상기 (b) 단계에서 준비된 이중 표지된 LNA 프로브를 PCR 증폭 산물에 첨가하는 단계와,
   (d) 형광 융해 곡선 분석(fluorescence melting curve analysis)을 위한 시작 온도에서 상기 PCR 증폭산물과 이중 표지된 LNA 프로브의 혼합물을 인큐베이션시켜 상기 이중 표지된 LNA 프로브를 상기 PCR 증폭 산물에 어닐링시키는 단계와,
   (e) 상기 시작 온도에서 온도를 단계적으로 상승시키면서 각각의 상승된 온도에서 형광의 세기를 측정하는 단계와.
   (f) 형광 융해 곡선 분석에 있어서 온도에 대한 형광의 세기를 분석하고, 형광의 세기가 급격히 변화하는 온도를 Tm (melting temperature)으로 결정하는 단계와,
   (g) 상기 결정된 Tm에 대응되는 녹용 원산지 또는 사슴 종을 판별하는 단계를 포함하는 녹용 원산지 판별 방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 이중 표지된 LNA 프로브는 추가적으로 5'말단으로부터 12번째 염기 및 14번째 염기가 LNA로 변형되는 녹용 원산지 판별 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   Tm이 73℃이면 러시아산 녹용, Tm이 64℃이면 엘크 녹용, Tm이 51℃이면 중국산 녹용, 그리고 Tm이 47℃이면 뉴질랜드산 녹용으로 판별하는 것을 특징으로 하는 녹용 원산지 판별 방법.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 (f) 단계에서는 상기 형광 세기를 온도에 대해 미분한 후 미분값을 음수처리하는 과정을 포함하는 녹용 원산지 판별 방법.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 (e) 단계에서는 35℃부터 85℃까지 온도를 단계적으로 상승시키고 1℃ 상승을 10초 동안 유지한 후 형광 세기를 측정하는 것을 특징으로 하는 녹용 원산지 판별 방법.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 (a) 단계에서는 비대칭 PCR을 수행하는 것을 특징으로 하는 녹용 원산지 판별 방법.
7. 러시아산 녹용, 엘크 녹용, 뉴질랜드산 녹용 및 중국산 녹용으로 구성된 군으로부터 선택된 녹용 샘플의 DNA를 증폭하기 위한 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍, DNA 중합효소, dNTPs, 및 PCR 완충용액과,
   서열번호 3의 염기서열을 갖고 5'말단이 형광물질로 표지되며 3'말단이 소광물질로 표지되는 이중 표지된 LNA(Locked Nucleic Acid) 프로브로서 5'말단으로부터 9번째 염기, 10번째 염기 및 13번째 염기가 LNA로 변형된 이중 표지된 LNA 프로브를 포함하는 녹용 원산지 판별용 키트.
8. 제7항에 있어서,
   상기 이중 표지된 LNA 프로브는 추가적으로 5'말단으로부터 12번째 염기 및 14번째 염기가 LNA로 변형되는 녹용 원산지 판별용 키트.
9. 서열번호 3의 염기서열을 갖고, 5'말단이 형광물질로 표지되며 3'말단이 소광물질로 표지되어 있으며, 5'말단으로부터 9번째 염기, 10번째 염기 및 13번째 염기가 LNA로 변형된 이중 표지된 LNA 프로브.
10. 제9항에 있어서,
    추가적으로 5'말단으로부터 12번째 염기 및 14번째 염기가 LNA로 변형되는 이중 표지된 LNA 프로브.

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