KR102098773B1

KR102098773B1 - 뱀장어 Anguilla japonica(극동산 뱀장어) 종과 A. bicolor, A. rostrata, A. anguilla, A. marmorata 구별을 위한 프라이머 및 이를 이용한 Real-time PCR 검출 방법

Info

Publication number: KR102098773B1
Application number: KR1020190048196A
Authority: KR
Inventors: 강현우; 이민아; 김소영; 김병일; 정진욱
Original assignee: 티엔에스(주)
Priority date: 2019-04-25
Filing date: 2019-04-25
Publication date: 2020-04-08

Abstract

본 개시 내용의 구체예에 따르면, 검체시료의 핵산을 추출하고 Real-Time PCR을 이용해서 증폭하고 이 증폭된 표적핵산이 형광물질에 의해 발생하는 형광신호를 온도별로 분석하여, 뱀장어의 종별로 특이적인 유전자마커와 동일한 염기서열이 나타남을 확인하여 극동산 뱀장어 (A. japonica)와 그 외 뱀장어 4종을 동시에 그리고 신속하게 검출할 수 있게 하는 뱀장어 종판별 프라이머 조성물, 키트 및 검출방법이 기재된다.

Description

뱀장어 Anguilla japonica(극동산 뱀장어) 종과 A. bicolor, A. rostrata, A. anguilla, A. marmorata 구별을 위한 프라이머 및 이를 이용한 Real-time PCR 검출 방법{Primers for distinguishing Anguilla japonica from other species such as A. bicolor, A. rostrata, A. anguilla and A. marmorata and detection method using Real-time PCR}

본 발명은 극동산 뱀장어(Anguilla japonica)와 그 외 4종의 뱀장어(A. bicolor, A. rostrata, A. anguilla, A. marmorata)의 종특이적 유전자 마커를 이용한 뱀장어 종판별 프라이머 조성물, 키트 및 그 판별방법에 관한 것이다.

본 발명은 뱀장어 검체시료로부터 Real-Time PCR을 이용하여 상기 뱀장어 검체시료의 종을 판별하고자 함이다.

보다 자세하게는, 서로 다른 종의 뱀장어를 특이적으로 구별할 수 있는 유전자마커를 확보하고 이를 증폭시킬 수 있는 프라이머 조성물을 제작하고, 이 프라이머 조성물을 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)에 이용하여 유전자마커의 융해온도(Tm)를 확보한다. 검체시료에 대하여도 동일한 PCR 과정을 실행하여 나타난 융해온도값을 비교하여 상기 검체시료의 뱀장어 종판별을 할 수 있다.

추가적으로, 본 발명에서는 뱀장어 종판별에 있어서 신속이 요구되는 바, 기존의 PCR 수행시 판별시간을 단축할 수 있는 Fast PCR 조건을 제시하여 진단을 대기하며 생길 수 있는 불의의 사고를 예방하는데 도움을 줄 수 있다.

뱀장어는 뱀장어목 뱀장어과에 속하는 민물고기로 염분환경에도 적응할 수 있어 바다에서 하천으로 이동하는 회유성 어종이다. 우리나라를 포함하여 일본, 중국 등의 동북아시아 문화권에서 뱀장어는 강장작용이 탁월하다고 하여 보양식으로 애용되고 있다. 실제로 뱀장어에는 비타민 A와 E, 타우린을 많이 함유하고 있고, 도코사헥사에노산(docosahexaenoic acid)와 에코사펜테에노산(eicosapentaenoic acid) 등의 불포화지방산이 풍부하다고 한다. 특히, 국내에서 민물장어 (극동산 뱀장어, Anguilla japonica)는 매우 고가임에도 불구하고 보양식으로 많은 소비가 이루어지고 있다. 실제로 2016년도 기준으로 민물고기 생산액은 2658억원, 생산략은 약 1만톤에 달할 정도로 큰 시장을 이루고 있다. 뱀장어는 바다에서 산란하고 실뱀장어 형태의 치어상태로 강으로 올라와서 성장하는 매우 특이한 생태특성이 있어 인공종묘하기 어렵고, 이로 인하여 실뱀장어 시기에 채집하여 양식하고 있는 실정이다. 우리나라에서는 전남북 지역에서 민물장어를 많이 채포할 수 있다.

뱀장어속 어류는 15종 3아종으로, 총 18종이 분류되어 있다. 그 중, 극동산 뱀장어와 북미산 뱀장어(A. rostrata), 동남아뱀장어(A. bicolor), 무태장어(A. marmorata), 유럽산 뱀장어(A. anguilla) 등이 양식되고 있다. 이들이 성체가 되었을 때는 형태학적으로 종을 구별하는 것이 가능하지만, 실뱀장어시기에는 이들 종을 구별해내기가 쉽지 않다. 뱀장어 종에 따른 양식방법에도 차이가 있지만, 무엇보다 민물장어인 극동산 뱀장어는 그 신선도와 탁월한 피로회복 효과로 말미암아 다른 뱀장어 종보다 비싸게 거래되고 있다. 이런 상황에서 뱀장어의 종을 구별하는 것은 소비자를 보호하기 위한 중요한 사안이다.

뱀장어 종판별에는 주로 분자진단법이 이용되며, 진단이 가능한 전문시설로 이동하고 결과를 확인하는데 일반적으로 2∼3일이 소요된다. 하지만 종묘 식재 시기에는 유전자 감별 의뢰가 몰려, 결과확인에 더 많은 시간이 소요되고 있다. 그 기간 동안에 뱀장어 종묘가 양식장에서 대기하며 폐사하게 되는 문제가 발생하기도 한다.

이러한 기술적 과제를 해결하기 위하여 본 발명자들은 뱀장어의 종판별을 신속·정확하게 이뤄질 수 있도록 하여 유전자 검사의 적체가 이뤄지지 않아 불의의 사고를 미연에 방지할 수 있는 발명을 완성하였다. 보다 자세하게는, 뱀장어 종판별이 가능한 유전자마커를 특이적으로 증폭하는 프라이머 조성물을 제작하여 검사의 정확성을 높이고, 증폭방법에 있어서 시간을 단축시킬 수 있는 조건을 제시하여 신속성을 개선한 발명을 완성하였다.

본 발명은 상기의 목적에 따라서 극동산 뱀장어와 그 외 4종의 뱀장어를 판별하기 위한 방법을 제시하고, 판별함에 있어서 필요한 유전자마커, 증폭용 프라이머 조성물 및 이들을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명은 상기의 프라이머 조성물을 포함하며 real-time PCR 및 fast real-time PCR이 가능한 각각의 키트를 개발하여 현장에서 최적으로 필요한 방법으로 적용시킬 수 있는 방법을 각각 제공하는 데 있다.

따라서, 본 발명의 최종목적은 소비자 오해의 소지가 다분한 극동산 뱀장어와 그 외 4종의 뱀장어를 간단ㆍ신속ㆍ정확하게 판별함으로써, 뱀장어 종판별에 소요되는 시간을 단축하여 판별과정에서 생길 수 있는 폐사와 같은 불의의 사고를 예방하고 원활한 판별과정이 이루어지도록 하여, 종국에는 소비자에게 뱀장어 종에 대한 정확한 정보를 전달할 수 있게 하고자 함이다.

상기 목적을 달성하기 위해,

본 발명의 개시내용에 따르면,

a) 서열번호 1을 포함하는 정방향 프라이머와 서열번호 2, 3, 4 및 5 중 적어도 하나를 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머세트; 및

b) 서열번호 6을 포함하고, 서열번호 7, 8 및 9 중 적어도 하나를 더 포함하는 정방향 프라이머와 서열번호 10, 11 및 12 중 적어도 하나를 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머세트; 중

적어도 하나의 프라이머세트를 포함하고 있는 뱀장어 종판별 프라이머 조성물이 제공된다.

또한, 본 발명의 개시내용에 따르면,

상기 뱀장어 종판별 프라이머 조성물을 포함하는 뱀장어 종판별용 키트가 제공된다.

또한, 본 발명의 개시내용에 따르면,

상기 프라이머 조성물를 사용하여 극동산 뱀장어와 그 외 4종의 뱀장어를 특이적으로 판별할 수 있는 방법이 제공된다.

또한, 본 발명의 개시내용에 따르면,

상기 판별방법으로는 Real-time PCR을 이용하여 실시간으로 분석할 수 있는 방법과 보다 신속한 검출을 위해 Fast PCR 조건이 제공된다.

본 발명은 뱀장어 종별 특이적인 유전자 마커를 선별하고, 선별된 유전자에 특이적인 프라이머세트를 사용하여 극동산 뱀장어와 그 외 4종의 뱀장어를 간단ㆍ신속ㆍ정확하게 판별함으로써, 뱀장어 종판별에 소요되는 시간을 단축하여 판별과정에서 생길 수 있는 폐사와 같은 불의의 사고를 예방할 수 있는 효과가 있다.

도면 1은 실시간-중합효소연쇄반응(Real-time PCR) 진행 과정 및 SYBR 의 결합 과정을 나타내는 개념도이다.
도면 2은 유전자 데이터베이스의 결과를 통해 디자인된 프라이머의 위치를 나타낸 것이다.
도면 3는 실시간 Normal PCR조건에서 A. japonica종 특이 프라이머세트 후보군들의 증폭곡선 및 융해곡선을 나타낸 것이다.
도면 4는 도면 3의 결과를 Agarose Gel electrophoresis법으로 재확인한 것으로 A. japonica종에 특이 프라이머로 적합한 서열번호 1 및 2 세트와 서열번호 1 및 3 세트의 결과와 이와 비교하기 위한 프라이머 서열번호 1 및 4 세트를 대표적으로 나타낸 것이다.
도면 5는 실시간 Normal PCR조건에서 A. japonica종을 제외한 뱀장어 4종 특이 프라이머세트 후보군들의 증폭곡선 및 융해곡선을 나타낸 것이다.
도면 6는 도면 5의 결과를 Agarose Gel electrophoresis법으로 재확인한 것으로 A. japonica종을 제외한 뱀장어 4종 특이 프라이머로 적합한 서열번호 6, 7 및 10 세트와 서열번호 6, 7 및 11 세트와 이를 비교하기 위한 프라이머 서열번호 6, 9 및 12 세트를 대표적으로 나타낸 것이다.
도면 7는 실시간 FAST PCR조건에서 A. japonica종 특이 프라이머세트 후보군들의 증폭곡선 및 융해곡선을 나타낸 것이다.
도면 8는 실시간 FAST PCR조건에서 A. japonica종을 제외한 뱀장어 4종 특이 프라이머세트 후보군들의 증폭곡선 및 융해곡선을 나타낸 것이다.
도면 9는 도면 7과 도면 8의 결과를 Agarose Gel electrophoresis법으로 재확인한 것으로 FAST PCR 조건에서
A. japonica종에 적합한 서열번호 1 및 2 프라이머세트의 결과와 이를 비교하기 위한 서열번호 1 및 3 프라이머세트의 결과; 및
A.japonica종을 제외한 뱀장어 4종 특이 프라이머로 적합한 서열번호 6, 7 및 10 세트의 결과와 이를 비교하기 위한 서열번호 6, 7 및 11 세트의 결과;
를 나타낸 것이다.
도면 10는 유효하다고 판단한 서열번호 1 및 2 프라이머세트와 서열번호 6, 7 및 10 프라이머세트의 재현성을 확인하고자 Normal PCR 조건에서의 여러 핵산 샘플을 이용한 증폭곡선 및 융해곡선을 나타낸 것이다.
도면 11는 유효하다고 판단한 서열번호 1 및 2 프라이머세트와 서열번호 6, 7 및 10 프라이머세트의 재현성을 확인하고자 Fast PCR 조건에서의 여러 핵산 샘플을 이용한 증폭곡선 및 융해곡선을 나타낸 것이다.

본 발명은 첨부된 도면과 하기의 설명에 의하여 모두 달성될 수 있을 것이다. 다만, 하기의 설명은 본 발명의 바람직한 구체예를 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아님을 이해해야 한다.

본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명의 명세서에서 사용되는 용어의 정의는 하기에 기재된 것과 같다.

"프라이머 (primer)″는 DNA 합성시 시발점이 되는 DNA 짧은 가닥으로 DNA 중합효소가 합성을 시작할 수 있도록 3′-OH를 제공하는 것으로 의미할 수 있다. 표적핵산을 증폭하고자 할 때, 표적핵산만을 증폭할 수 있도록 시발점을 지정해주는 역할을 하며 따라서, 표적핵산에 따라 다양한 프라이머가 존재할 것이다. 프라이머세트(종래 프라이머쌍)라고 함은 정방향 프라이머(Forward primer)와 역방향 프라이머(Reverse primer)를 포함하는 것을 의미한다. 중합효소연쇄반응 (PCR)시 이 프라이머를 시발점으로 하기 위하여 합성하여 사용할 수 있다.

"유전자 마커″라는 용어는 본 발명에서 구별하고자 하는 뱀장어의 종별로 특정 유전자에서만 발견되는 염기서열로서 이를 이용하여 A. japonica와 다른 4종의 뱀장어(A. bicolor, A. rostrata, A. anguilla, A. marmorata)를 특이적으로 검출할 수 있게 된다고 이해될 수 있다.

"중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)″이라는 용어는 최초의 주형 DNA를 반복과정(가열 및 냉각이 교대로 이루어짐)에 의하여 다량의 동일 DNA가 증폭되는 일련의 과정을 의미할 수 있다. 여기에는 (ⅰ) 증폭하고자하는 주형 DNA, (ⅱ) 복제의 시발점이 되는 프라이머, (ⅲ) DNA를 합성할 수 있는 효소인 DNA polymerase 그리고 (ⅳ) DNA의 재료가 되는 dNTPs 등이 필요하다.

"Real time PCR″이라는 용어는 증폭되는 유전자의 정량적인 정보를 실시간으로 확인할 수 있는 PCR 기법으로 이해될 수 있다. 염기서열이 증폭되는 경우 형광물질이 방출되어 이를 측정하여 증폭된 염기서열의 정량적인 정보를 획득할 수 있다.

"형광물질″이라는 용어는 상기 Real time PCR에서 증폭된 염기서열의 정량적 정보를 얻기 위해 첨가하는 것으로서, PCR에 의해 생성된 이중가닥의 DNA에 결합하여 형광을 방출하게 되는 것으로 이해할 수 있다. 따라서, PCR에 의해 이중가닥이 증폭될 때 형광의 증폭을 측정하여 증폭곡선을 얻을 수 있고, 온도를 높여 이중가닥이 해리되는 경우에는 형광이 감소하게 되며, 이렇게 온도 변화에 따른 형광의 증폭을 측정하여 융해곡선을 얻을 수 있다. 핵산 착생용 형광물질로는 SYBR green, SYBR gold, SYPRO red, Fluorescein/FITC, Radiant Red, EtBr 및 Texas Red 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

"Fast PCR″은 PCR의 기법 중 하나로, 증폭단계의 반복과정을 간결화하여 짧은 시간에 유전자를 증폭시킬 수 있는 일체의 PCR 기법을 의미할 수 있다.

"증폭″은 주형 DNA의 적어도 하나의 세그먼트의 복수개 복제물을 형성하기 위하여 반복적으로 일어나는 일련의 반응을 의미할 수 있다.

"키트″는 버퍼, DNA 중합효소 및 dNTPs와 같은 표적 핵산 증폭 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 통상적으로 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 또한, 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트에 있어서, 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 장비는 앞서 언급된 구성 성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다. 여기서, DNA 중합효소는 Taq 중합효소일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

-본 발명의 개요

본 발명자들은 뱀장어 종판별을 위한 구성과 그 판별방법을 확립하고자 하였다. 그 결과, 뱀장어의 종별 특이적 유전자마커를 확보하고 상기 유전자에 대응하는 검출용 프라이머세트를 이용하여 실시간으로 정량적인 정보를 획득하며 유전자를 증폭한 후, 융해곡선분석을 통해 얻어진 Tm값으로 뱀장어의 서로 다른 종을 간단ㆍ신속ㆍ정확하게 검출할 수 있게 되었다.

상세히 설명하면,

(1) 각 뱀장어 종에 따라 특이적으로 판단할 수 있는 유전자 마커를 특이적인 프라이머 조성물로 증폭시키고;

(2) 형광물질에 의해 실시간으로 정량적인 데이터를 확보하며 증폭된 유전자 마커의 증폭곡선을 획득하고;

(3) 증폭된 이중가닥 염기서열이 변성 및 재결합되는 과정에서 발생되는 온도별 융해곡선을 획득하고;

(4) 상기 증폭곡선과 융해곡선을 분석하여 뱀장어 종별로 판별할 수 있게 되었다.

따라서, 본 발명을 실시하기 위하여 극동산 뱀장어와 그 외 4종을 구별할 수 있는 유전자 마커가 필요하고, 이 유전자 마커를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 제작해야하며, 증폭된 유전자 마커를 통해 증폭곡선과 융해곡선을 얻고 분석해야 한다.

-유전자 마커의 염기서열 및 종별 증폭용 프라이머세트

극동산 뱀장어(A. japonica)와 그 외 4종의 뱀장어(A. bicolor, A. rostrata, A. anguilla, A. marmorata) 를 특이적으로 검출하기 위하여 뱀장어 종별로 특이적인 유전자마커가 요구된다. 본 발명에 의하면, 이 유전자마커와 동일 염기서열을 가지면 동일한 종으로 판별할 수 있음을 충분히 이해할 수 있을 것이다. 유전자마커의 유무를 밝히기 위해서는 이를 증폭시킬 필요가 있는데, 표적핵산만을 증폭시킬 수 있는 특이적인 프라이머세트가 필요하다. 따라서, 유전자마커와 이를 특이적으로 증폭시킬 수 있는 종별 프라이머세트를 추출하기 위하여 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 뉴클레오티드 데이터베이스에 등록된 997개의 염기서열을 수집하였다. 상세하게는 A. japonica 232개, A. bicolor 145개, A. rostrata 85개, A. anguilla 317개, A. marmorata 218개 의 염기서열을 분석하였고, 각 종별로 공통서열(consensus)을 비교·분석하여, A. japonica을 판별하는 프라이머 5개, 4종 판정용 프라이머 7개를 추출하였다. 도면 2와 표 7에 이를 표시하였으며, 종 판별에 있어 적합한 프라이머를 선별하는 작업을 수행하였다.

서열번호 1로 표시되는 염기서열은 A. japonica의 정방향 프라이머이고, 서열번호 2, 3, 4 또는 5로 표시되는 염기서열은 A. japonica의 역방향 프라이머이다. 서열번호 6, 7, 8 또는 9로 표시되는 염기서열은 A. japonica를 제외한 4종의 뱀장어 (A. bicolor, A. rostrata, A. anguilla, A. marmorata)의 정방향 프라이머이고, 서열번호 10, 11 또는 12로 표시되는 염기서열은 A. japonica를 제외한 4종의 뱀장어 (A. bicolor, A. rostrata, A. anguilla, A. marmorata)의 역방향 프라이머이다. 따라서, 본 발명은 A. japonica 특이적 판별용 프라이머세트 및 그 외 뱀장어 4종 동시판별용 프라이머세트를 포함하는 프라이머 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 제공된 프라이머의 염기서열은 본 발명을 실시함에 있어서, 보다 자세하게는 PCR 수행시 증폭단계가 본 발명의 의도와 부합하게 이루어지는 범위내에서 염기서열의 부가·결실·치환이 가능한 실질적으로 동일한 염기서열까지를 포함할 것이다.

-뱀장어 종별 특이적 검출용 조성물 및 키트

본 발명은 다른 관점에서, 상기 프라이머세트를 포함하는 뱀장어 종별 특이적 검출용 조성물 및 키트에 관한 것이다.

본 발명의 프라이머 조성물은 하기의 프라이머세트를 적어도 하나 함유하고 있다.

a) 서열번호 1을 포함하는 정방향 프라이머와 서열번호 2, 3, 4 및 5 중 적어도 하나를 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머세트

b) 서열번호 6을 포함하고, 서열번호 7, 8 및 9 중 적어도 하나를 더 포함하는 정방향 프라이머와 서열번호 10, 11 및 12 중 적어도 하나를 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머세트

본 발명의 뱀장어 종별 특이적 검출용 키트는 상기의 프라이머 조성물을 포함하고, 유전자 마커인 주형 염기서열(template)과 증폭의 정량정보를 알 수 있는 형광물질, dNTPs, DNA중합효소 및 일련의 PCR반응이 일어날 수 있는 PCR premix만 있으면 충분할 것이나, 당업계의 통상의 지식을 가진 자가 구상할 수 있는 구성의 치환 또는 추가 역시 포함할 것이다.

-뱀장어 종별 특이적 검출방법

본 발명자들은 상기 뱀장어의 종별 특이적으로 검출하는 방법에 있어서,

(a) 뱀장어 검체로부터 추출된 표적 핵산을 실험에 적용하는 단계;

(b) 표적핵산의 염기서열을 상기의 프라이머 조성물을 사용하여 증폭시키고, 형광물질을 이용하여 실시간 증폭곡선을 얻는 단계;

(c) 증폭된 이중가닥 염기서열을 온도에 따라 해리 및 재결합되는 과정에서 발생하는 형광의 증폭을 통해 온도별 융해곡선을 얻는 단계;

(d) 상기 (a-c) 단계에서 얻은 증폭곡선 및 융해곡선의 분석을 통해 뱀장어 종별 특이적 검출하는 단계;

를 포함하는 뱀장어 종별 특이적 검출 방법에 관한 것으로, (a) - (d) 단계를 수행하는 조건 및 시간은 본 발명이 속한 기술분야의 숙련된 전문가들에게 용이한 범위에서 선택할 수 있다.

상기 PCR 조건은 기존의 방법을 사용가능하며 PCR이 끝난 후 융해(melting) 과정이 필요하고 1℃ 씩 증가할 때마다 형광의 세기를 측정하여 Tm값을 얻는다. 특히 일반적인 실시간 PCR(real-time PCR) 장치는 널리 보급되어 있으며 HRM(High resolution melting)과 같이 부가적인 프로그램 구입이나 세밀한 온도변화를 요구하지 않는 장점이 있다.

한편, 본 발명에서 기존 방법의 PCR 조건 이외에도 Fast PCR 검출방법을 이용할 수 있다. Normal PCR조건은 (b) 및 (c)가 수행되는 시간이 140∼150분 및 Fast PCR 조건의 경우 (b) 및 (c)가 수행되는 시간이 70∼80분을 넘지 않는다. 보다 바람직하게는, Fast PCR 조건으로는 70∼80분을 넘지 않는 것을 특징으로 한다. 이 경우, 기존의 conventional PCR 방법을 이용하는 키트보다 검출시간을 60∼80분 단축시킬 수 있어 더욱 빠른 시간 내에 동등하거나 더 우월한 특이성으로 뱀장어의 종별 구별이 가능하다.

본 발명에 있어서, 상기 융해곡선 분석은 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis; 형광융해곡선분석) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.

-Real-Time PCR

본 발명의 리얼타임 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction) 방법은, 실시간으로 증폭 과정을 확인하기 위해, 형광물질이 PCR 과정에서 생성된 이중가닥 DNA 사슬에 결합하면서 형광을 발한다. 따라서, PCR의 cycle이 진행됨에 따른 PCR 산물의 증폭과 함께, 형광의 세기가 점차 증가 하는 방식으로 확인한다. PCR이 끝난 뒤에는 온도를 높여 주어 이중가닥을 풀어줌으로써 존재하는 형광의 세기가 점차 감소하게 되어 융해곡선이 나오게 되며, 융해곡선을 분석하여 Tm을 찾아낸다. 이 때의 Tm값이 검체시료에서도 동일하게 나오는지를 판단하여 특정 염기서열의 유무를 확인하게 되고, 이를 통해 뱀장어의 종별 구별 또는 판별이 가능하다. 전통적인 기존의 PCR 방법은 표적유전자의 size를 확인하며 전기영동으로 증폭정도를 판단할 수 있었기 때문에 실시간으로 정량적인 판단을 할 수가 없고, 표적유전자의 size를 모르는 경우 증폭된 PCR 산물을 sequencing 분석을 진행해야하는 등의 추가적인 검증 단계를 필요로 한다. 뱀장어와 같은 생물은 검사 단계에서 폐사를 하는 등의 불의의 사고를 당할 수 있는바, 신속을 요하는 검출이 필요한 경우, 기존의 방법은 부합하지 못한 면이 있었고, Real-time PCR을 적용할 필요성이 대두되었다.

-융해곡선 분석 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis)

본 발명의 융해곡선 분석은 표적 핵산이 증폭과정에서 형성된 이중가닥 DNA의 융해온도를 해석하는 방법이다. 이러한 방법은 예컨대, Tm 해석, 또는 상기 이중쇄의 융해곡선의 해석에 의해 행해지기 때문에, 융해곡선 분석이라고 불리고 있다. PCR에 의해 증폭된 이중가닥은 가열 처리시, 온도 상승에 따라 이중가닥의 해리(융해)가 발생하는데, 해리에 의해 발생하는 형광세기의 증감의 시그널을 획득한다. 그리고 이 검출 결과에 기초하여 Tm값을 결정함으로써, 특정 염기서열의 유무를 판단하는 방법이다.

Tm값은 특정 염기서열의 염기의 종류 또는 개수에 따라 값이 달라진다. 이 때문에, 검출 대상의 특정 염기서열에 대해서 미리 Tm값(평가 기준값)을 구해 두고, 검출 시료의 이중가닥 DNA의 Tm값(측정값)을 측정하여, 측정값이 평가 기준값과 동일한 정도이면 표적 DNA에 특정 염기서열이 존재한다고 판단할 수 있고, 측정값이 평가 기준값보다 낮으면 미스매치 즉, 표적 DNA에 변이가 존재한다고 판단할 수 있다.

본 발명의 형광융해곡선 분석은 형광물질을 사용하여 융해곡선을 분석하는 방법으로, 보다 구체적으로, PCR을 통해 증폭된 이중가닥 DNA가 온도에 따라 해리되어 감소하는 형광물질의 발광 정도를 측정하여 융해곡선을 분석할 수 있다. 형광물질은 SYBR일 수 있으며, 실시간 중합효소연쇄반응에 당업자가 용이하게 선택할 수 있는 형광물질일 수 있다.

이하, 본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허 청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.

실시예 1: Anguilla japonica과 A. bicolor, A. rostrata, A. anguilla, A. marmorata 종 판별을 위한 유전자마커 및 특이적인 프라이머 제작

뱀장어를 검출하기 위한 특이적 유전자 마커를 도출하기 위하여, 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 뉴클레오티드 DB(nucleotide database)에 등록된 997개의 염기서열 가지고 분석을 진행하였으며, 상세하게는 A. japonica 232개, A. bicolor 145개, A. rostrata 85개, A. anguilla 317개, A. marmorata 218개 이며, 각 종별로 공통서열(consensus)을 제작하여 이를 비교·분석하였다(표 1 내지 표 5).

염기서열 분석을 통해 선별한 유전자 마커를 포함하는 뱀장어 종을 판별하기 위해 이를 특이적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머세트를 확보할 필요가 있었다. 그에 따라, A. japonica을 판별하는 프라이머 5개, A. japonica를 제외한 뱀장어 4종 판정용 프라이머 7개를 제작하였고 표 7과 도면 2에 이를 표시하였다. 유전자마커를 증폭시키기 위한 프라이머에서 사용된 mixed base인 Y, R 및 W는 표 6에 나타난 바와 같이 공식적인 base code를 바탕으로 표기하였다.

Species

NCBI No.

A. japonica

AF479272.1, AF006702.1, AF006703.1, AF485277.1, AF198357.1, JQ312097.1, KT355033.1, M95866.1, M95868.1, M95869.1, M95870.1, M95871.1, M95872.1, M95873.1, M95874.1, M95875.1, M95876.1, M95877.1, M95878.1, M95879.1, M95880.1, M95881.1, M95882.1, M95884.1, M95885.1, M95887.1, AB279442.1, AB279447.1, AB279448.1, AB279449.1, AB279450.1, AB279451.1, AB279443.1, AB279444.1, AB279445.1, AB279446.1, AB279440.1, AB279441.1, AB279431.1, AB279438.1, AB279439.1, AB279433.1, AB279434.1, AB279435.1, AB279436.1, AB279437.1, AB279452.1, AB279453.1, AB279454.1, AB279455.1, AB279456.1, AB021772.1, L13336.1, L13335.1, L13337.1, L13371.1, L13370.1, L13369.1, L13372.1, L13368.1, L13367.1, L13366.1, D84305.1, AB038556.2, AB030667.1, LC063560.1, LC063561.1, LC063562.1, LC063563.1, LC063564.1, LC063565.1, LC063566.1, LC063567.1, LC063568.1, LC063569.1, LC063570.1, LC063571.1, LC063572.1, LC063573.1, LC063574.1, LC063575.1, LC063576.1, LC063577.1, LC063578.1, LC063579.1, LC063580.1, LC063581.1, LC063582.1, LC063583.1, LC063584.1, LC063585.1, LC063586.1, LC063587.1, LC063588.1, LC063589.1, LC063590.1, LC063591.1, LC063592.1, LC063593.1, LC063594.1, LC063595.1, LC063596.1, LC063597.1, LC063598.1, LC063599.1, LC063600.1, LC063601.1, LC063602.1, LC063603.1, LC063604.1, LC063605.1, LC063606.1, LC063607.1, LC063608.1, LC063609.1, LC063610.1, LC063611.1, LC063612.1, LC063613.1, LC063614.1, LC063615.1, LC063616.1, LC063617.1, LC063618.1, LC063619.1, AB042421.1, M95883.1, AM997179.1, AM997189.1, AM997209.1, AM997219.1, AM997229.1, AM997239.1, M997249.1, AM997188.1, AM997198.1, AM997208.1, AM997218.1, AM997228.1, AM997238.1, AM997248.1, AM997258.1, AM997180.1, AM997190.1, AM997200.1, AM997210.1, AM997220.1, AM997230.1, AM997240.1, AM997181.1, AM997191.1, AM997201.1, AM997211.1, AM997221.1, AM997231.1, AM997241.1, AM997251.1, AM997182.1, AM997192.1, AM997202.1, AM997212.1, AM997222.1, AM997232.1, AM997242.1, AM997252.1, AM997183.1, AM997193.1, AM997203.1, AM997213.1, AM997223.1, AM997233.1, AM997253.1, AM997194.1, AM997204.1, AM997214.1, AM997224.1, AM997234.1, AM997244.1, AM997254.1, AM997185.1, AM997195.1, AM997205.1, AM997215.1, AM997225.1, AM997235.1, AM997245.1, AM997255.1, AM997186.1, AM997196.1, AM997206.1, AM997216.1, AM997226.1, AM997236.1, AM997246.1, AM997256.1, AM997187.1, AM997207.1, AM997217.1, AM997227.1, AM997237.1, AM997247.1, AM997257.1, KJ948424.1, AM990946.1, AM990966.1, AM990956.1, AM990955.1, AM990975.1, AM990965.1, AM990947.1, AM990967.1, AM990957.1, AM990948.1, AM990968.1, AM990958.1, AM990949.1, AM990969.1, AM990959.1, AM990950.1, AM990970.1, AM990960.1, AM990951.1, AM990971.1, AM990961.1, AM990952.1, AM990972.1, AM990962.1, AM990953.1, AM990963.1, AM990954.1, AM990974.1, AM990964.1

Species

NCBI No.

A. marorata

AB021778.1, AB030668.1, AB205227.1, AB205228.1, AB205229.1, AB205230.1, AB205231.1, AB205232.1, AB205233.1, AB205234.1, AB205235.1, AB205236.1, AB205237.1, AB205238.1, AB205239.1, AB205240.1, AB205241.1, AB205242.1, AB205243.1, AB205244.1, AB205245.1, AB205246.1, AB205247.1, AB205248.1, AB205249.1, AB205250.1, AB205251.1, AB205252.1, AB205253.1, AB205255.1, AB205256.1, AB205257.1, AB205258.1, AB205259.1, AB205260.1, AB205261.1, AB205262.1, AB205263.1, AB205264.1, AB205265.1, AB205266.1, AB205267.1, AB205268.1, AB205269.1, AB205270.1, AB205271.1, AB205272.1, AB279457.1, AB279458.1, AB279459.1, AB279460.1, AB279461.1, AB279463.1, AB279464.1, AB279465.1, AB279466.1, AB279467.1, AB279468.1, AB279469.1, AB279470.1, AB279471.1, AB279472.1, AB279473.1, AB279474.1, AB279475.1, AB279476.1, AB279477.1, AB279478.1, AB279479.1, AB279480.1, AB279481.1, AB279482.1, AB279483.1, AB279484.1, AB279485.1, AB279486.1, AB279487.1, AB279488.1, AB279489.1, AB279490.1, AB279491.1, AB279492.1, AB279493.1, AB279494.1, AB279495.1, AB279496.1, AB279497.1, AB279498.1, AB279499.1, AB279500.1, AB279501.1, AB279502.1, AB279503.1, AB279504.1, AB279505.1, AB279506.1, AB279507.1, AB279508.1, AB279509.1, AB279510.1, AB279511.1, AB279512.1, AB279513.1, AB279514.1, AB279515.1, AB279516.1, AB279517.1, AB279518.1, AB279519.1, AB279520.1, AB279521.1, AB279522.1, AB279523.1, AB279524.1, AB279525.1, AB279526.1, AB279527.1, AB279528.1, AB279529.1, AB279530.1, AB279531.1, AB279532.1, AB279533.1, AB279534.1, AB279535.1, AB279536.1, AB279537.1, AB279538.1, AB279539.1, AB279540.1, AB279541.1, AB279542.1, AB279543.1, AB279544.1, AB279545.1, AB279546.1, AF006704.1, AF006705.1, AF074863.1, AF485278.1, AP007242.1, AY735147.1, AY738724.1, D28776.1, D84299.1, DQ093416.1, DQ093417.1, EF690363.1, HG965522.1, HG965523.1, HG965524.1, HG965525.1, HG965526.1, HG965527.1, HG965528.1, HG965529.1, HG965530.1, HG965531.1, HG965532.1, HG965533.1, HG965534.1, HG965535.1, HG965536.1, HG965537.1, HG965538.1, HG965539.1, HG965540.1, HG965541.1, HG965542.1, HG965543.1, HG965544.1, HG965545.1, HG965546.1, HG965547.1, HG965548.1, HG965549.1, HG965550.1, HG965551.1, HG965552.1, HG965553.1, HG965554.1, HG965555.1, HG965556.1, HG965557.1, HG965558.1, HG965559.1, HG965560.1, HG965561.1, HG965562.1, HG965563.1, HG965564.1, HM802165.1, HM802166.1, HM802167.1, HM802168.1, HM802169.1, HM802170.1, HM802171.1, HM802172.1, HM802173.1, HM802174.1, HM802175.1, HM802176.1, HM802177.1, HM802178.1, HQ388825.1, HQ388826.1, HQ388827.1, HQ388828.1, HQ388829.1, HQ388830.1, HQ388831.1, HQ388832.1, HQ388833.1, HQ388834.1, JQ312100.1, JQ312101.1, M95888.1,

Species	NCBI No.
A. bicolor	AB021780.1, AB030657.1, AB279379.1, AB279380.1, AB279381.1, AB279382.1, AB279383.1, AB279384.1, AB279385.1, AB279386.1, AB279387.1, AB279388.1, AB279389.1, AB279390.1, AB279391.1, AB279392.1, AB279393.1, AB279394.1, AB279395.1, AB279396.1, AB279397.1, AB279398.1, AB279399.1, AB279400.1, AB279401.1, AB279402.1, AB279403.1, AB279404.1, AB279405.1, AB279406.1, AB279407.1, AB279408.1, AB279409.1, AB279410.1, AB279411.1, AB279412.1, AB279414.1, AB279415.1, AB279416.1, AB279417.1, AB279418.1, AB279419.1, AB279420.1, AB279421.1, AB279422.1, AB279423.1, AB279424.1, AB279425.1, AB279426.1, AB279427.1, AB279428.1, AB279429.1, AB279430.1, AF006710.1, AP007236.1, DQ093413.1, HG965472.1, HG965473.1, HG965474.1, HG965475.1, HG965476.1, HG965477.1, HG965478.1, HG965479.1, HG965480.1, HG965481.1, HG965482.1, HG965483.1, HG965484.1, HG965485.1, HG965486.1, HG965487.1, HG965488.1, HG965489.1, HG965490.1, HG965491.1, HG965492.1, HG965493.1, HG965494.1, HG965495.1, HG965496.1, HG965497.1, HG965498.1, HG965499.1, HG965500.1, HG965501.1, HG965502.1, HG965503.1, HG965504.1, HG965505.1, HG965506.1, HG965507.1, HG965508.1, HG965509.1, HG965510.1, HG965511.1, HG965512.1, HG965513.1, HG965514.1, HG965515.1, HG965516.1, JQ312088.1, JQ312089.1, JQ312090.1, JQ312091.1, AF006708.1, AF006709.1, DQ093414.1, DQ093415.1, AB279356.1, AB279357.1, AB279358.1, AB279359.1, AB279360.1, AB279361.1, AB279362.1, AB279363.1, AB279364.1, AB279365.1, AB279366.1, AB279367.1, AB279368.1, AB279369.1, AB279370.1, AB279371.1, AB279372.1, AB279373.1, AB279374.1, AB279375.1, AB279376.1, AB279377.1, AB279378.1, AB021774.1, AP007237.3, AB030658.1, HG965462.1, HG965463.1, HG965464.1, HG965465.1, HG965466.1, HG965467.1, HG965468.1, HG965469.1, HG965470.1, HG965471.1
A. rostrata	AF006716.1, AF006717.1, MF407466.1, AF485271.1, AF485272.1, AF485273.1, AF485274.1, AF485275.1, AF485276.1, JQ312109.1, JQ312110.1, JQ312111.1, JQ312112.1, KJ564172.1, KJ564173.1, KJ564177.1, KJ564178.1, KJ564179.1, KJ564180.1, KJ564181.1, KJ564182.1, KJ564183.1, KJ564184.1, KJ564186.1, KJ564185.1, KJ564187.1, KJ564188.1, KJ564271.1, KJ564189.1, KJ564199.1, KJ564204.1, KJ564205.1, KJ564198.1, KJ564190.1, KJ564191.1, KJ564192.1, KJ564193.1, KJ564194.1, KJ564195.1, KJ564196.1, KJ564197.1, KJ564207.1, KJ564200.1, KJ564201.1, KJ564202.1, KJ564203.1, KJ564206.1, KJ564208.1, KJ564210.1, KJ564211.1, KJ564212.1, KJ564213.1, KJ564170.1, KJ564214.1, KJ564215.1, KJ564216.1, KJ564217.1, KJ564174.1, KJ564175.1, KJ564176.1, KJ564171.1, EU315240.1, EU315241.1, EU315242.1, EU315243.1, EU315239.1, AB021767.1, AP007249.2 AB030662.1, M85080.1, HG794875.1, HG794877.1, HG794896.1, HG794898.1, HG794865.1, HG794881.1, HG794886.1, HG794887.1, HG794889.1, HG794890.1, HG794868.1, KJ546046.1, KJ546054.1, KJ546041.1, KJ546042.1

Species

NCBI No.

A. anguilla

AF006715.1, AF006714.1, MF407467.1, AF165069.1, AF172394.1, AF368247.1, KT633962.1, KT633963.1, KT633964.1, KT633965.1, KT633966.1, KT633956.1, KT633957.1, KT633958.1, KT633959.1, KT633960.1, KT633961.1, AF368243.1, KT633974.1, KT633975.1, KT633967.1, KT633968.1, KT633969.1, KT633970.1, T633971.1, KT633972.1, KT633973.1, JX162731.1, JX162740.1, JX162741.1, JX162742.1, JX162743.1, JX162744.1, JX162745.1, JX162746.1, JX162747.1, JX162748.1, JX162749.1, JX162732.1, JX162750.1, JX162751.1, JX162752.1, JX162753.1, JX162733.1, JX162734.1, JX162735.1, JX162736.1, JX162737.1, JX162738.1, JX162739.1, JX162682.1, JX162683.1, JX162684.1, JX162685.1, JX162686.1, JX162687.1, JX162688.1, JX162689.1, JX162690.1, JX162691.1, JX162692.1, JX162693.1, JX162694.1, JX162695.1, JX162696.1, JX162697.1, JX162698.1, JX162699.1, JX162700.1, AF368240.1, KT633976.1, KT633977.1, KT633978.1, AF368252.1, KT633979.1, JX162728.1, JX162729.1, JX162730.1, JX162727.1, AF368250.1, KT633980.1, AF368245.1, KT633981.1, KT633982.1, KT633983.1, AF368246.1, KT633984.1, AF368253.1, KT633985.1, KT633986.1, KT633987.1, JQ312081.1, AF368251.1, JQ312082.1, JQ312083.1, AF368248.1, AF368242.1, JX162701.1, JX162702.1, JX162703.1, JX162704.1, JX162705.1, AF368239.1, JX162706.1, JX162707.1, JX162708.1, JX162709.1, JX162710.1, JX162711.1, JX162712.1, JX162713.1, AF368244.1, AF368249.1, AF368241.1, AF368238.1, AF368254.1, JX162715.1, JX162716.1, JX162717.1, JX162718.1, JX162719.1, JX162720.1, JX162721.1, JX162722.1, JX162723.1, JX162724.1, JX162725.1, JX162726.1, JX162714.1, JQ312084.1, JQ312085.1, EU223996.1, EU223997.1, FJ707255.1, FJ707256.1, FJ707257.1, FJ707258.1, FJ707259.1, FJ707260.1, FJ707261.1, FJ707262.1, FJ707263.1, KJ564252.1, KJ564244.1, KJ564245.1, KJ564246.1, FJ707284.1, FJ707285.1, FJ707286.1, FJ707287.1, FJ707288.1, FJ707289.1, FJ707290.1, FJ707291.1, FJ707264.1, FJ707265.1, FJ707266.1, FJ707267.1, FJ707268.1, FJ707269.1, FJ707270.1, FJ707271.1, FJ707272.1, KJ564254.1, KJ564255.1, KJ564256.1, KJ564257.1, KJ564258.1, KJ564259.1, KJ564260.1, KJ564261.1, KJ564262.1, KJ564263.1, KJ564264.1, KJ564265.1, KJ564266.1, KJ564267.1, KJ564250.1, KJ564251.1, KJ564253.1, KJ564268.1, KJ564269.1, KJ564270.1, KJ564225.1, KJ564218.1, KJ564219.1, KJ564220.1, KJ564221.1, KJ564222.1, KJ564223.1, KJ564224.1, KJ564226.1, KJ564227.1, KJ564228.1, KJ564229.1, KJ564230.1, KJ564231.1, KJ564232.1, KJ564247.1, KJ564248.1, KJ564249.1, FJ707273.1, FJ707282.1, FJ707283.1, FJ707274.1, FJ707275.1, FJ707276.1, FJ707277.1, FJ707278.2, FJ707279.1, FJ707281.1, KJ564233.1, KJ564234.1, KJ564235.1, KJ564236.1, KJ564237.1, KJ564238.1, KJ564239.1, KJ564240.1, KJ564241.1, KJ564242.1, KJ564243.1, EU315238.1, EU315235.1, EU315236.1, EU315237.1, AB021776.1, D84302.1, AJ247003.1, AJ247004.1, AJ247006.1, AJ246983.1, AJ246984.1,

Species

NCBI No.

A. anguilla

AJ246986.1, AJ246985.1, AJ246988.1, AJ246987.1, AJ247005.1, AJ246989.1, AJ246993.1, AJ246990.1, AJ246991.1, AJ246992.1, AJ247007.1, AJ247002.1, AJ247000.1, AJ247001.1, AJ246996.1, AJ246997.1, AJ246999.1, AJ246994.1, AJ246995.1, AJ225985.1, AJ225986.1, AJ225987.1, AJ225988.1, AJ225994.1, AJ225995.1, AJ225996.1, AJ225997.1, AJ225967.1, AJ225968.1, AJ225969.1, AJ225970.1, AJ225971.1, AJ225998.1, AJ225999.1, AJ226000.1, AJ226001.1, AJ226002.1, AJ225979.1, AJ225980.1, AJ225983.1, AJ225953.1, AJ225954.1, AJ225955.1, AJ225956.1, AJ225957.1, AJ225989.1, AJ225990.1, AJ225992.1, AJ225993.1, AJ225972.1, AJ225973.1, AJ225974.1, AJ225975.1, AJ225958.1, AJ225959.1, AJ225960.1, AJ225961.1, AJ225962.1, AJ225963.1, AJ225964.1, AJ225965.1, AJ225966.1, AJ225977.1, AJ225978.1, AJ226003.1, AJ226004.1, AJ226005.1, AJ226006.1, AJ226007.1, AP007233.1, AB030666.1, D28775.1, FN263189.1, FN263190.1, HG794914.1, HG794917.1, HG794918.1, HG794919.1, HG794920.1, HG794910.1, EF427617.1, EF427618.1, EU492327.1, EU492326.1

IUPAC nucleotide code	Base
A	Adenine
C	Cytosine
G	Guanine
T (or U)	Thymine *or Uracil)
R	A or G
Y	C or T
S	G or C
W	A or T
K	G or T
M	A or C
B	C or G or T
D	A or G or T
H	A or C or T
V	A or C or G
N	any base

구분	서열번호	서열(5'->3')	변형	목표
프라이머	서열번호 1	CTAGGACTATGCCTTATCTCG		Forward primer of A. japonica
프라이머	서열번호 2	GAGTACATATCCTACGAATCCA		Reverse primer of A. japonica
프라이머	서열번호 3	AGTCCCCTACGTATGGTAAA
프라이머	서열번호 4	GAATCATCCATAATTAACGTCTC
프라이머	서열번호 5	GAGAATAGGGCAAGTATTG
프라이머	서열번호 6	CCTAGGATTGTGTCTATTTCA		Forward primer of A. bicolor, A. rostrata, A. anguilla and A. marmorata
프라이머	서열번호 7	CCTAGGATTATGCCTTATTTCA
프라이머	서열번호 8	CTCCTAGGATTATGCCTTATGTCA
프라이머	서열번호 9	ACCCGGATTTTAACCGAAACC
프라이머	서열번호 10	CAACCTACATGCAAACGGAG		Reverse primer of A. bicolor, A. rostrata, A. anguilla and A. marmorata
프라이머	서열번호 11	CAACCTACATGGAAACGGAGCC
프라이머	서열번호 12	AATGGGAATAGGAAGTGGAATGC

실시예 2: 극동산 뱀장어(A. japonica) 특이적 검출 프라이머 후보군 확인 및 그 외 뱀장어(A. bicolor, A. rostrata, A. anguilla, A. marmorata) 4종 특이적 검출 프라이머 후보군 확인

실시예 1에서 제작된 극동산 뱀장어 (A. japonica)의 특이적 프라이머 후보군을 이용하여 극동산 뱀장어 핵산 샘플에서 증폭곡선 및 융해곡선을 도출하였으며, 이를 분석하여 극동산 뱀장어만을 특이적으로 검출하는 프라이머세트를 선정하고자 하였다. 실시간(Real-time) PCR 반응은 Real-Time 시스템(BIO-RAD 사, 미국)을 이용하여 수행하였으며 PCR 반응을 위해 필요한 마스터 믹스의 경우 2X 농도 qPCR Premix(티엔에스(주))에 프라이머세트별로 10pmol 순방향 프라이머 1uL, 10pmol 역방향 프라이머 1uL를 첨가하고, EvaGreen 1uL, 뱀장어 핵산 샘플 1uL, 증류수로 전체 20uL 부피로 제작하여 진행하였다. 프라이머세트 후보군으로는 서열번호 1 및 2 세트, 서열번호 1 및 3 세트, 서열번호 1 및 4 세트 그리고 서열번호 1 및 5 세트로 선정하여 실험을 진행하였다. 사용된 뱀장어 핵산 샘플은 A. japonica, A. bicolor, A. rostrata, A. anguilla 및 A. marmorata 종을 이용하여 유효성을 입증하고자 하였다.

증폭된 이중가닥 DNA에 대하여 65℃에서 95℃까지 5초간 1.0℃씩 증가된 온도를 가하며 형광 촬영을 하였다.

Normal PCR 조건	온도(℃)	반응시간 및 사이클		반응시간
변성 (Pre-denaturation)	95	10 min		154 min
유전자 증폭 및 실시간 유전자 확인	95	40 sec	35 cycle
	60*	40 sec
	72	60 sec
융해(Melting)**	65 to 95	Increment 1.0℃, 5 sec
단계에서는 형광 촬영을 통해 실시간 유전자 증폭을 확인한다. *단계에서는 Melting curve를 얻기 위해 형광 촬영을 하는 단계이다.

실시간 유전자 증폭을 통해 A. japonica 종의 검출 융해 곡선을 확인 결과, 서열 번호 1 및 2 프라이머세트에서는 A. japonica 시료에서만 특이적으로 Ct(증폭곡선) 값이 26, Melt peak (Tm) 81의 결과를 확인하였고, 그 외 다른 종(4종) 에서는 유의한 결과가 검출되지 않았다. 또한, 서열 번호 1 및 3 프라이머세트에서도 A. japonica 시료에서만 Ct값 27 Tm값 80에서 확인되었다. 서열 번호 1 및 4 프라이머세트에서는 A. japonica 시료에서 Ct 21 Tm 81로 확인되었으나, A. anguilla 시료와 A. marmorata 시료에서 각각 Ct 33/Tm 81, Ct 20/Tm 81로 검출되었고, 서열 번호 1 및 5 프라이머세트에서는 A. japonica 시료를 포함한 모든 종의 시료에서 Ct 및 Tm값이 확인되었다(도면 3).

상기 결과에 대한 유효성을 검토하기 위하여, 증폭산물에 대하여 Agarose Gel electrophoresis를 진행하였다(도면 4). A. japonica종 특이 증폭을 위한 프라이머로 적합한 서열번호 1 및 2 프라이머세트와 서열번호 1 및 3 프라이머세트로 진행한 실험에서는 PCR product 300bp에서 A. japonica만 검출되었으나, 서열번호 1 및 4 프라이머세트는 다른 종에서도 증폭산물이 검출되는 것을 확인하였다. 이를 통해, 서열번호 1 및 2 프라이머세트와 서열번호 1 및 3 프라이머세트가 유효함을 확인하였다.

	1 및 2 세트		1 및 3 세트		1 및 4 세트		1 및 5 세트
	Ct	Tm	Ct	Tm	Ct	Tm	Ct	Tm
A. japonica	26	81	27	80	21	81	23	81
A. bicolor	-	-	-	-	-	-	29	79
A. rostrata	-	-	-	-	-	-	36	80
A. anguilla	-	-	-	-	33	81	34	81
A. marmorata	-	-	-	-	20	81	27	80
적합성	적합		적합		부적합		부적합

실시예 1에서 제작된 극동산 뱀장어 제외한 4종의 뱀장어(A. bicolor, A. rostrata, A. anguilla, A. marmorata)의 특이적 프라이머 후보군을 이용하여 상기 4종의 뱀장어만을 특이적으로 검출하는 프라이머세트를 선정하고자 하였다. 실시간(Real-time) PCR 반응은 Real-Time 시스템(BIO-RAD 사, 미국)을 이용하여 수행하였으며 PCR 반응을 위해 필요한 마스터 믹스의 경우 2X 농도 qPCR Premix(티엔에스(주))에 각 프라이머 세트별로 각 서열번호에 해당하는 프라이머를 10pmol로 1uL씩 첨가하고, EvaGreen 1uL, 뱀장어 핵산 샘플 1uL, 증류수로 전체 20uL 부피로 제작하여 진행하였다. 프라이머세트 후보군으로는 서열번호 6, 7 및 10 세트, 서열번호 6, 7 및 11 세트, 서열번호 6, 7 및 12 세트, 서열번호 6, 8 및 12 세트 그리고 서열번호 6, 9 및 12 세트로 선정하여 실험을 진행하였다. 사용된 뱀장어 핵산 샘플은 A. japonica, A. bicolor, A. rostrata, A. anguilla 및 A. marmorata 종을 이용하여 유효성을 입증하고자 하였다.

실시간 유전자 증폭을 통해 뱀장어의 종별 융해 곡선을 확인 결과, 서열번호 6, 7 및 10 프라이머세트와 서열번호 6, 7 및 11 프라이머세트로 진행한 실험에서는 A. japonica 시료만 Ct값과 Tm값을 얻지 못하였고 그 외의 종에 대해서는 모두 검출이 되었다. 반면, 서열번호 6, 7 및 12 프라이머세트, 서열번호 6, 8 및 12 프라이머세트 그리고 서열번호 6, 9 및 12 프라이머세트로 진행한 실험에서는 A. japonica를 포함한 5종 모두 Ct값과 Tm값을 측정할 수 있어서, A. japonica와 그 외의 종을 구분할 수 없었다(도면 5).

상기 결과에 대한 유효성을 검토하기 위하여, 증폭산물에 대하여 Agarose Gel electrophoresis를 진행하였다(도면 6). A. japonica를 제외한 4종의 특이 증폭을 위한 프라이머로 적합하였던 서열번호 6, 7 및 10 프라이머세트와 서열번호 6, 7 및 11 프라이머세트로 진행한 실험에서는 PCR product 200bp에서 A. japonica 제외한 4종에서만 검출되었다. 반면, 서열번호 6, 9 및 12 프라이머세트는 A. japonica를 포함한 모든 종에서 동일한 증폭산물이 검출되는 것을 확인하였다. 이를 통해, 서열번호 6, 7 및 10 프라이머세트와 서열번호 6, 7 및 11 프라이머세트의 유효성을 확인하였다.

	6, 7 및 10 세트		6, 7 및 11 세트		6, 7 및 12 세트		6, 8 및 12 세트		6, 9 및 12 세트
	Ct	Tm	Ct	Tm	Ct	Tm	Ct	Tm	Ct	Tm
A. japonica	-	-	-	-	29	75	32	80	31	80
A. bicolor	21	81	21	81	30	79	30	80	33	80
A. rostrata	28	81	28	81	32	80	32	79	31	79
A. anguilla	28	81.5	31	80	32	79	34	79	34	80
A. marmorata	30	81	30	80	28	79	33	80	33	79
적합성	적합		적합		부적합		부적합		부적합

실시예 3: Fast real-time PCR을 적용한 뱀장어 종별 특이적 프라이머 후보군 확인

신속한 검출이 요구되는 현장에서 보다 빠르게 뱀장어의 종을 확정하는 것이 요구되는 바, Fast PCR 조건을 확립하였다.

실시간(Real-time) PCR 반응은 Real-Time 시스템(BIO-RAD 사, 미국)을 이용하여 수행하였으며 PCR 반응을 위해 필요한 마스터 믹스의 경우 2X 농도 qPCR Premix(티엔에스(주))에 각 프라이머 세트별로 각 서열번호에 해당하는 프라이머를 10pmol로 1uL씩 첨가하고, EvaGreen 1uL, 뱀장어 핵산 샘플 1uL, 증류수로 전체 20uL 부피로 제작하여 진행하였다. Fast real-time PCR 반응 조건은 표 11와 동일하며, 뱀장어 핵산샘플(A.japonica, A.bicolor, A.rostrata, A.anguilla, A.marmorata) 5종을 이용하였다. 프라이머세트 후보군으로는 Normal PCR의 후보군과 동일하게 진행하였다.

Fast PCR 조건	온도(℃)	반응시간 및 사이클		반응시간
변성 (Pre-denaturation)	95	10 min		74 min
유전자 증폭 및 실시간 유전자 확인	95	10 sec	35 cycle
	60*	10 sec
	72	10 sec
융해(Melting)**	65 to 95	Increment 1.0℃, 5 sec
단계에서는 형광 촬영을 통해 실시간 유전자 증폭을 확인한다. *단계에서는 Melting curve를 얻기 위해 형광 촬영을 하는 단계이다.

고속 실시간 유전자 증폭을 통해 A. japonica 종의 검출 융해 곡선을 확인 결과, 서열 번호 1 및 2 프라이머세트에서는 A. japonica 시료에서만 특이적으로 Ct(증폭곡선) 값이 19, Melt peak (Tm) 80의 결과를 확인하였고, 그 외 다른 종(4종) 에서는 유의한 결과가 검출되지 않았다. 반면, 서열 번호 1 및 3 프라이머세트와 서열번호 1 및 4 프라이머세트에서는 A. japonica 뿐만 아니라 다른 4종의 뱀장어에 대해서도 검출되었다. 서열번호 1 및 5 프라이머세트에서도 모든 종이 검출되었으며 효율이 낮게 나타나는 것을 확인하였다(도면 7).

상기 결과에 대한 유효성을 검토하기 위하여, 증폭산물에 대하여 Agarose Gel electrophoresis를 진행하였다(도면 9). A. japonica종 특이 증폭을 위한 프라이머세트인 서열번호 1 및 2 프라이머세트로 진행한 실험에서는 PCR product 300bp에서 A. japonica만 검출되었으나, 서열번호 1 및 3 프라이머세트로 진행한 실험에서는 5종 모두 증폭산물이 검출되는 것을 확인하였다. 이를 통해, 서열번호 1 및 2 프라이머세트만 Fast real time PCR에서 유효함을 확인하였다.

고속 실시간 유전자 증폭을 통해 뱀장어의 종별 융해 곡선을 확인 결과, 서열번호 6, 7 및 10 프라이머세트로 진행한 실험에서는 A. japonica 시료만 Ct값과 Tm값을 얻지 못하였고 그 외의 종에 대해서는 모두 검출이 되었다. 반면, 서열번호 6, 7 및 11 프라이머세트는 A. japonica 시료의 Ct값과 Tm값을 얻지 못하였으나, A. anguilla 시료 역시 자료를 얻지 못하여 Fast PCR 적용시 적합하지 않은 것으로 확인되었다. 서열번호 6, 7 및 12 프라이머세트, 서열번호 6, 8 및 12 프라이머세트 그리고 서열번호 6, 9 및 12 프라이머세트는 Fast PCR 조건에서 A. japonica를 포함한 모든 종에서 Ct값과 Tm값이 검출되어 프라이머세트로 부적합한 것으로 확인되었다(도면 8).

상기 결과에 대한 유효성을 검토하기 위하여, 증폭산물에 대하여 Agarose Gel electrophoresis를 진행하였다(도면 9). A. japonica를 제외한 4종의 특이 증폭을 위한 프라이머로 적합하였던 서열번호 6, 7 및 10 프라이머세트는 A. japonica를 제외한 모든 종에서 PCR product 200bp가 검출되었다. 반면, 서열번호 6, 7 및 11 프라이머세트는 A. japonica 뿐만 아니라 A. anguilla에서도 PCR product가 검출되지 않아 적합하지 않은 것을 확인하였다. 이를 통해, 서열번호 6, 7 및 10 프라이머세트의 유효성을 확인하였다.

	6, 7 및 10 세트		6, 7 및 11 세트		6, 7 및 12 세트		6, 8 및 12 세트		6, 9 및 12 세트
	Ct	Tm	Ct	Tm	Ct	Tm	Ct	Tm	Ct	Tm
A. japonica	-	-	-	-	31	79	30	80	31	79
A. bicolor	27	81	31	80	31	80	31	79	31	80
A. rostrata	28	81	27	80	33	80	32	79	33	80
A. anguilla	21	81	-	-	31	79	30	79	31	79
A. marmorata	26	81	29	80	26	80	30	80	26	80
적합성	적합		부적합		부적합		부적합		부적합

실시예 4: A. japonica, A. bicolor, A. rostrata, A. anguilla 및 A. marmorata 판별법 재현성 검증

Normal PCR과 Fast PCR에서 적법하다고 판단하였던 서열번호 1 및 2 프라이머세트와 서열번호 6, 7 및 10 프라이머세트의 재현성을 확인하고자 하였다. Normal PCR의 경우 실시예 2와 표 8의 조건으로 수행하였다. Fast PCR의 경우 실시예 3와 표 11의 조건으로 수행하였다. 핵산 샘플은 A. japonica종 5개와 그 외의 뱀장어 4종을 2개씩 8개를 이용하여 총 13개의 시료를 대상으로 하였다.

A. japonica 판별용 프라이머세트인 서열번호 1 및 2로 진행한 재현성 실험에서 나타난 Ct값과 Tm값은 표 13와 같다. 표 13에서 확인할 수 있듯이, 모든 시료가 동일성 있게 확인되는 바, 서열번호 1 및 2 프라이머세트는 Normal PCR 조건과 Fast PCR 조건 모두에서 재현성이 검증되었다.

서열번호 1 및 2	Normal PCR 조건		Fast PCR 조건
서열번호 1 및 2	Ct	Tm	Ct	Tm
1번 시료	29	79	28	81
2번 시료	29	79	27	81
3번 시료	30	79	27	82
4번 시료	29	79	28	81
5번 시료	29	78	26	81

A. japonica를 제외한 뱀장어 4종 판별용 프라이머세트인 서열번호 6, 7 및 10로 진행한 재현성 실험에서 나타난 Ct값과 Tm값은 표 14와 같다. 표 14에서 확인할 수 있듯이, 모든 시료가 동일성 있게 확인되는 바, 서열번호 6, 7 및 10 프라이머세트는 Normal PCR 조건과 Fast PCR 조건 모두에서 재현성이 검증되었다.

서열번호 6, 7 및 10	Normal PCR 조건				Fast PCR 조건
	1번시료		2번시료		1번시료		2번시료
	Ct	Tm	Ct	Tm	Ct	Tm	Ct	Tm
A. japonica	-	-	-	-	-	-	-	-
A. bicolor	21	79	30	78	21	82	28	81
A. rostrata	31	79	32	80	27	82	28	82
A. anguilla	22	79	31	79	21	82	28	82
A. marmorata	21	79	31	78	21	82	26	81

본 발명의 서열번호 1 및 2 프라이머세트와 서열번호 6, 7 및 10 프라이머세트는 Normal PCR 및 Fast PCR 조건에서 본 발명의 목적에 부합함을 검증하였다(도면 10 및 도면 11).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> BongSuk Kim : T&S <120> Primers for distinguishing Anguilla japonica from other species such as A. bicolor, A. rostrata, A. anguilla, A. marmorata and detection method using Real-time PCR <130> P19DS0127 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of Anguilla japonica <400> 1 ctaggactat gccttatctc g 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of Anguilla japonica <400> 2 gagtacatat cctacgaatc ca 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of Anguilla japonica <400> 3 agtcccctac gtatggtaaa 20 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of Anguilla japonica <400> 4 gaatcatcca taattaacgt ctc 23 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of Anguilla japonica <400> 5 gagaataggg caagtattg 19 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of Anguilla bicolor, A. rostrata, A. anguilla and A. marmorata <400> 6 cctaggattg tgtctatttc a 21 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of Anguilla bicolor, A. rostrata, A. anguilla and A. marmorata <400> 7 cctaggatta tgccttattt ca 22 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of Anguilla bicolor, A. rostrata, A. anguilla and A. marmorata <400> 8 ctcctaggat tatgccttat gtca 24 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of Anguilla bicolor, A. rostrata, A. anguilla and A. marmorata <400> 9 acccggattt taaccgaaac c 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of Anguilla bicolor, A. rostrata, A. anguilla and A. marmorata <400> 10 caacctacat gcaaacggag 20 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of Anguilla bicolor, A. rostrata, A. anguilla and A. marmorata <400> 11 caacctacat ggaaacggag cc 22 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of Anguilla bicolor, A. rostrata, A. anguilla and A. marmorata <400> 12 aatgggaata ggaagtggaa tgc 23

Claims

서열번호 1을 포함하는 정방향 프라이머와 서열번호 2를 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 하기 a)군 검출용 프라이머세트; 및
서열번호 6 및 서열번호 7을 포함하는 정방향 프라이머와 서열번호 10을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 하기 b)군 검출용 프라이머세트;
를 포함하는 fast real-time PCR을 위한 뱀장어 종판별용 프라이머 조성물에 있어서,
상기 뱀장어 종판별은 하기 a)군 또는 b)군으로 판별하는 것을 특징으로 하는 프라이머 조성물:
a) 극동산 뱀장어
b) 필리핀뱀장어, 아메리카뱀장어, 유럽뱀장어, 무태장어.
삭제
제 1항의 뱀장어 종판별 프라이머 조성물을 포함하는 뱀장어 종판별용 조성물.
제 3항의 뱀장어 종판별 조성물을 포함하는 뱀장어 종판별용 키트.
제 4항에 있어서,
상기 키트는 DNA 중합효소, dNTPs, 안정제 및 반응완충액을 포함하는 것을 특징으로 하는 뱀장어 종판별 키트.
검체 시료로부터 추출된 표적 핵산을 제 1항의 프라이머 조성물을 이용한 fast real-time PCR을 수행하여 표적서열을 증폭시키는 단계; 및
상기 증폭된 표적서열을 분석하여 뱀장어종을 구별하여 검출하는 단계;
를 포함하는 뱀장어 종판별 방법에 있어서,
상기 뱀장어 종판별은 하기 a)군 또는 b)군으로 판별하는 것을 특징으로 하는 뱀장어 종판별 방법:
a) 극동산 뱀장어
b) 필리핀뱀장어, 아메리카뱀장어, 유럽뱀장어, 무태장어.
삭제
제 6항에 있어서,
형광물질은 TaqMan 프로브인 것을 특징으로 하는 뱀장어 종판별 방법.
제 6항에 있어서,
상기 (b)의 분석단계는 융해곡선분석(Fluorescence Melting Curve Analysis, FMCA)을 수행하는 것을 특징으로 하는 뱀장어 종판별 방법.
삭제
삭제
제 6항에 있어서,
상기 fast real-time PCR 조건은 증폭단계에 소요되는 시간을 감축하여 전체 PCR 반응의 시간을 60분∼80분을 감축한 것을 특징으로 하는 뱀장어 종판별 방법.