CN117660674A - 用于鉴别堆型艾美耳球虫的野毒株和疫苗株的特异性引物及试剂盒和用途 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及分子生物学检测技术领域，涉及用于鉴别堆型艾美耳球虫的野毒株和疫苗株的特异性引物及试剂盒和用途。其中，特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。将该引物及包含该引物的试剂盒用于检测堆型艾美耳球虫的野毒株和疫苗株，其操作简单，重复性高，特异性强。
Description
技术领域
本申请涉及分子生物学检测技术领域，具体涉及一种用于鉴别堆型艾美耳球虫的野毒株和疫苗株的特异性引物及试剂盒和用途。
背景技术
鸡球虫病是由艾美耳属球虫引起的一种常见的寄生虫病，该病危害极为严重，每年全球因球虫病的感染造成巨大的经济损失。目前全球世界鸡球虫有9种，其中以堆型艾美耳球虫（Eimeria acervulina）、巨型艾美耳球虫（Eimeria maxima）、柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella) 、毒害艾美耳球虫（Eimeria necatrix）造成的危害最大。堆型艾美耳球虫主要通过球虫卵囊传播，并寄生于鸡十二指肠及小肠前段。感染堆型艾美耳球虫的养殖动物，特别是雏鸡，临床多见食欲不振、精神萎靡，并伴有下痢，甚至血便等症状，同时生产性能显著降低，出栏量也严重受到影响。
现阶段，养殖业对堆型艾美耳球虫的防治主要是靠抗球虫药物，如磺胺类(磺胺喹恶啉、磺胺氯吡嗪等)、三嗪类(地克珠利、妥曲珠利)、喹啉类(丁氧喹甲酯、苄氧喹甲酯)、吡啶类(氯羟吡啶)、植物碱类(常山酮)以及聚醚离子载体类(莫能霉素、盐霉素、马杜霉素)等。随着药物的广泛使用，耐药株相继被报道，与此同时，药物使用不可避免地导致禽肉中药物残留的增加，这也引起了公众健康担忧。免疫防控是具有潜力的替代技术，目前堆型艾美耳球虫的控制，更多地采用活疫苗免疫方法。但堆型艾美耳球虫的活疫苗可定植于肠道组织，会影响临床样品的鸡堆型艾美耳球虫分子检测结果。另外，疫苗的使用过程也存在毒力恢复的安全隐患。因此，基于堆型艾美耳球虫活疫苗的有效性和安全性考虑，建立鉴别堆型艾美耳球虫疫苗株和野毒株的方法刻不容缓。
发明内容
基于此，本申请一实施例有必要提供一种特异性引物及试剂盒，能用于鉴别堆型艾美耳球虫的野毒株和疫苗株。
具体技术方案包括：
第一方面，本申请提供了一种用于鉴别堆型艾美耳球虫的野毒株和疫苗株的特异性引物，所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
第二方面，本申请还提供了一种用于鉴别堆型艾美耳球虫的野毒株和疫苗株的产品，所述产品包括所述的特异性引物。
在其中一个实施例中，所述产品包括试剂、试剂盒和芯片中的一种或多种。
在其中一个实施例中，所述产品包括适用于的PCR技术的产品。
在其中一个实施例中，所述产品还包括核酸扩增试剂、阳性质控标准品和阴性质控标准品中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述核酸扩增试剂包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+和荧光染料中的一种或多种。
在其中一个实施例中，所述阳性质控标准品包括堆型艾美耳球虫的野毒株和疫苗株的全基因组或含有如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示核苷酸片段的重组质粒。
第三方面，本申请还提供了所述的特异性引物或所述的产品在鉴别堆型艾美耳球虫的野毒株和疫苗株中的用途。
在其中一个实施例中，鉴别堆型艾美耳球虫的野毒株和疫苗株的方法包括如下步骤：
提取待测样本的基因组DNA；
以所述基因组DNA为模板，采用所述的特异性引物或所述的产品进行核酸扩增；及
对所得扩增产物进行分析，根据分析结果判定待测样本为堆型艾美耳球虫的野毒株和/或疫苗株。
在其中一个实施例中，对所得扩增产物进行分析的步骤包括采用琼脂糖凝胶电泳法、测序法和HRM法分析扩增产物。
在其中一个实施例中，判定的方法包括如下步骤：
电泳结果出现一条130bp~140bp的电泳条带，和/或测序峰图为单一峰，测序所得序列与SEQ ID NO.3相同，判定所述待测样本为堆型艾美耳球虫野毒株；
电泳结果出现一条150bp~160bp的电泳条带，和/或测序峰图为单一峰，测序所得序列与SEQ ID NO.4相同，判定所述待测样本为堆型艾美耳球虫疫苗株；
电泳结果出现一条130bp~140bp的电泳条带和一条150bp~160bp的电泳条带，和/或测序所得序列分别与SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列相同，判定所述待测样本同时含有堆型艾美耳球虫的疫苗株和野毒株。
相对于传统技术，本申请具备如下有益效果：
本申请提供一种特异性引物可实现对堆型艾美耳球虫的野毒株和疫苗株的鉴别。将该引物及包含该引物的试剂盒用于检测堆型艾美耳球虫的野毒株和疫苗株，其操作简单，重复性高，特异性强。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为堆型艾美耳球虫EAGZ疫苗株和堆型艾美耳球虫GD检验株PCR扩增产物的电泳结果；其中泳道1~2为堆型艾美耳球虫GD检验株PCR扩增产物结果，条带大小约为136 bp；泳道3~4为堆型艾美耳球虫EAGZ疫苗株扩增产物，条带大小约为158 bp，泳道M为DL500Marker；
图2为堆型艾美耳球虫EAGZ疫苗株和堆型艾美耳球虫GD检验株PCR产物差异位点的峰图；差异序列为GATAAACAAAGAAACAAGTGGA；
图3为试剂盒特异性检测结果。泳道1和2分别为毒害艾美耳球虫的疫苗和株检验株扩增产物，泳道3和4分别为巨型艾美耳球虫的疫苗株和检验株扩增产物，泳道5和泳道6分别为柔嫩艾美耳球虫的疫苗株和检验株扩增产物，泳道7和8分别为布氏艾美耳球虫的早熟株和野毒株扩增产物，泳道9~11为引物在反应体系中的终浓度为0.2μM，0.4μM和0.5μM的阴性对照，泳道12~13和14~15分别为堆型艾美耳球虫的疫苗株和检验株扩增产物，泳道16为空白对照，泳道M为DL500 Marker。
具体实施方式
为使本申请的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本申请的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请。但是本申请能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下做类似改进，因此本申请不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。
本文所使用的术语“和/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。比如，“A和/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，B，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合。
本文所使用的术语 “多种”、“多个”、“多组”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。
本文中，在“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”中，使用的术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本文所使用的术语“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。本申请中，“进一步”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本申请保护范围的限制。
本文所使用的术语 “包含”、“包括”等词语描述的开放式技术特征或技术方案中，如无其他说明，不排除所列成员之外的额外成员，可视为既提供了由所列成员构成的封闭式特征或方案，还提供了在所列成员之外还包括额外成员的开放式特征或方案。
本申请所公开的“范围”可以采用下限和上限的形式来限定，给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的，选定的下限和上限限定了特别范围的边界。这种方式进行限定的范围可以是包括端值或不包括端值的，任一个端值可以独立地被包括或不被包括，并且可以进行任意地组合，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。
本文所使用的术语“引物”是指可以用在扩增方法（例如聚合酶链式反应PCR、高分辨率熔解曲线HRM）中，基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素，包括温度、引物来源以及所用方法等。例如，对于鉴别、诊断和预后应用，根据靶序列的复杂度，寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸，但是也可以含有更少的核苷酸。在本申请公开内容中，术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。
本申请对堆型艾美耳球虫的野毒株和疫苗株进行大量的重测序，并比对分析寻找多个差异目标序列，根据不同目标序列设计多组引物，通过PCR及一代测序筛选出特异性强、稳定性好，可用于鉴别堆型艾美耳球虫的野毒株和疫苗株的引物对。
本申请一实施方式提供了一种用于鉴别堆型艾美耳球虫的野毒株和疫苗株的特异性引物，该特异性引物的上游引物的核苷酸序列为GTAACAATGCTCACAAAC，该特异性引物的下游引物的核苷酸序列为AGAAAGCCTAATGATAGT。该引物特异性强，稳定性好。
本申请一实施方式还提供了一种用于鉴别堆型艾美耳球虫的野毒株和疫苗株的产品，该产品包括上述的特异性引物。
在一个具体示例中，该产品包括试剂、试剂盒和芯片中的至少一种。
在一个具体示例中，该产品包括适用于PCR技术的产品。
PCR为“Polymerase Chain Reaction”的缩写，表示聚合酶链式反应，是利用DNA双链复制的原理，在体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。其特点是可以以微量的DNA为模板，快速扩增得到大量拷贝。在本申请中涵盖所述反应的多个衍生形式，包括但不限于普通PCR、实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）、巢式聚合酶连锁反应(nested PCR)、多重PCR(multiplexed PCR)等。
其中，普通PCR即一代PCR，使用普通PCR扩增仪扩增靶基因，并通过琼脂糖凝胶电泳对产物进行定性分析。
实时荧光定量PCR是一种在DNA扩增反应中加入荧光基团，以荧光信号积累实时监测每次PCR循环后产物总量，进而对待测样品中的目的序列进行定量分析的方法。
其中，实时荧光定量PCR包括DNA结合染料法如SYBR Green Ⅰ染料法和基于探针的化学法如TaqMan探针。SYBR Green Ⅰ染料法是采用了SYBR Green I染料，是一种只与双链DNA小沟结合的染料，并不与单链DNA链结合，而且在游离状态不发出荧光，只有掺入DNA双链中才可以发光，因此，在PCR体系中，随着特异性PCR产物的指数扩增，每个循环的延伸阶段，染料掺入双链DNA中，其荧光信号强度与PCR产物的数量呈正相关。TaqMan探针法核心是使用探针分子，TaqMan探针是单链DNA，5’端偶联发光基团，3’端偶联淬灭基团，游离的完整探针是检测不到荧光信号的，发光基团发出的荧光会被淬灭基团吸收淬灭，探针被水解，发光基团和淬灭基团远离就可以检测到荧光信号。反应开始时，模板链经热变性解链形成单链，TaqMan探针优先跟模板链退火，引物随后退火到模板上，之后进行链的延伸，延伸过程中Taq酶发挥5’-3’外切酶活性，遇到探针会从5’端逐个碱基切除探针，发光基团会跟淬灭基团分开，因此荧光检测系统可以接收到荧光信号，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，荧光信号的累积和PCR产物形成是同步的。
在一个具体示例中，核酸扩增试剂包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+和荧光染料中的一种或多种。
在一个具体示例中，上述产品还包括核酸扩增试剂、阳性质控标准品和阴性质控标准品中的至少一种。
在一个具体示例中，上述阳性质控标准品包括堆型艾美耳球虫的野毒株和疫苗株的全基因组或含有如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示核苷酸片段的重组质粒。
本申请一实施方式还提供了上述的特异性引物或上述的产品在鉴别堆型艾美耳球虫的野毒株和疫苗株中的用途。使用本申请提供的引物及试剂盒鉴别堆型艾美耳球虫的野毒株和疫苗株的方法操作简单，稳定性好，特异性强，且结果准确。在一个具体示例中，鉴别堆型艾美耳球虫野毒和疫苗株的方法包括如下步骤a~步骤c：
步骤a，提取待测样本的基因组DNA。
在一个具体示例中，可以使用常规DNA提取方法或者使用商品化的DNA提取试剂盒提取待测样本DNA。
步骤b，以上述基因组DNA为模板，采用上述的引物或上述的产品进行核酸扩增。
在一个具体示例中，该特异性引物的工作浓度为0.2μM~0.6μM。可选地，0.3μM~0.4μM，进一步可选地，该特异性引物的工作浓度为0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM或者0.6μM。
在一个具体示例中，每50μL的扩增体系包括2×Premix Taq DNA mix 25µL、10µM的上游引物1.5μL~2.5μL、10µM的下游引物1.5μL~2.5μL，待测样本DNA 100ng~500ng，双蒸水补足到50 μL。
在一个具体示例中，每50μL的扩增体系包括2×Premix Taq DNA mix 25µL、10µM的上游引物2μL、10µM的下游引物2μL，待测样本DNA 100ng，双蒸水补足到50 μL。
在一个具体示例中，扩增程序为90℃~95℃预变性5min；90℃~94℃ 20s~30s，50℃~55℃ 20s~30s，72℃~73℃ 20s~30s，循环20~30次；70℃~72℃ 延伸8min~10min。
在一个具体示例中，扩增程序为95℃预变性5min；94℃ 30s，50℃30s，72℃ 30s，循环30次；72℃延伸10min。
步骤c，对所得扩增产物进行分析，根据分析结果判定待测样本为堆型艾美耳球虫的野毒株和/或疫苗株。
具体地，对所得扩增产物进行分析的步骤包括采用琼脂糖凝胶电泳法、测序法和HRM法中的至少一种方法分析扩增产物。
HRM为High-resolution melting的缩写，表示高分辨率熔解曲线，是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术，灵敏度高，可以检测出单个碱基的差异，并且无需设计特异性探针，只需设计一对引物和PCR扩增阶段使用含饱和荧光染料的PCR试剂即可，成本低，实验周期短，操作简单，真正实现闭管操作。本申请提供的引物可适用于HRM分析。
其中，饱和荧光染料，如Eva Green、LC Green和SYTO9，不仅有与DNA结合力较强，而且还具有低抑制作用，这些特点都能保证该染料能够饱和的嵌入DNA双链中，同时能够在溶解过程中所释放的荧光染料不会继续与DNA双链结合。
上述引物及试剂盒可以使用普通PCR和核酸电泳，快速检测区分堆型艾美耳球虫的野毒株和疫苗株。
具体地，判定方法包括如下：
电泳结果出现一条约136 bp的电泳条带，和/或测序峰图为单一峰，测序所得序列与SEQ ID NO.3相同，判定待测样本为堆型艾美耳球虫野毒株；
电泳结果出现一条约158bp的电泳条带，和/或测序峰图为单一峰，测序所得序列与SEQ ID NO.4相同，判定待测样本为堆型艾美耳球虫疫苗株；
电泳结果出现一条约136 bp的电泳条带和一条158bp的电泳条带，和/或测序所得序列分别与SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4相同，判定待测样本同时含有堆型艾美耳球虫的疫苗株和野毒株。
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本申请中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例1 鉴别堆型艾美耳球虫野毒株和疫苗株PCR检测试剂盒组装
本实施例提供的鉴别堆型艾美耳球虫野毒株和疫苗株的PCR检测试剂盒包括堆型艾美耳球虫野毒和疫苗株的特异性引物对、Premix Taq DNA mix（TAKARA Co. Ltd.）、阳性质控标准品、阴性质控标准品和超纯水。其中，鉴别堆型艾美耳球虫野毒株和疫苗株的特异性引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列：GTAACAATGCTCACAAAC，SEQ IDNO.1；下游引物的核苷酸序列：AGAAAGCCTAATGATAGT，SEQ ID NO.2。
试剂盒中，Premix Taq DNA mix（Cat No.RP901A）购自TaKaRa公司；上下游引物母液浓度均为10 μM。另外，阴性质控标准品为纯度不低于18.25 MΩ·CM的反渗透用水；阳性质控标准品为堆型艾美耳球虫GD检验株和堆型艾美耳球虫EAGZ疫苗株的基因组DNA或SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所示核苷酸片段与pMD18T等克隆载体构成的重组质粒。
具体每个反应体系组成如下表1所示。
表1
其中，SEQ ID NO.3的核苷酸序列如下：
GTAACAATGCTCACAAACAAATGAGCAAATAAACACAAGTAAACAAGTAAAAAAATAAACAAATAAACGCGTTAGTAGGTTAATAACTAAACAAAACAACAAACAGGAGACAGAAACAACTATCATTAGGCTTTCT。
SEQ ID NO.4的核苷酸序列如下：
GTAACAATGCTCACAAACAAATGAACAAATAAACAGATAAACAAAGAAACAAGTGGACAGGTAAACAAGTAAAAATATAAACAAATAAACGCGTTAGTAGGTTAATAACTAAACAAAACAACAAACAGGAGACAGAAACAACTATCATTAGGCTTTCT。
实施例2鉴别堆型艾美耳球虫的野毒株和疫苗株
使用实施例1中组装的试剂盒鉴别堆型艾美耳球虫的野毒株和疫苗株，包括如下步骤：
（a）使用快速DNA提取试剂盒对纯化的堆型艾美耳球虫EAGZ疫苗株和堆型艾美耳球虫GD检验株，进行基因组DNA的提取。
（b）以提取的样本基因组DNA为模板，堆型艾美耳球虫野毒和疫苗株的特异性引物对进行PCR扩增。其中，PCR反应体系组分为25 µL Premix Taq DNA mix，2 μL 10 µM的上游引物，2 μL 10 µM的反向引物，1μL待测样本DNA，最后加双蒸水(ddH2O）补足到50 μL。PCR反应程序为：95℃ 5min；94℃ 30sec，50℃ 30sec，72℃ 30sec，30个循环；72℃ 10min。
（c）反应结束后，取5 μLPCR产物，用3%琼脂糖凝胶进行电泳检测，观察堆型艾美耳球虫GD检验株是否出现136 bp大小的电泳条带，堆型艾美耳球虫EAGZ疫苗株对应的PCR产物是否出现158 bp大小的电泳条带。
结果如图1所示，泳道1~2为堆型艾美耳球虫GD检验株PCR扩增产物结果，条带大小约为136 bp，泳道3~4为堆型艾美耳球虫EAGZ疫苗株扩增产物，条带大小约为158 bp。
（d）将PCR产物用pMD18T构建克隆载体，并送测序公司进行测序。
结果如图2所示，堆型艾美耳球虫GD检验株的136 bp扩增条带的测序结果为单一峰，并且测得的序列与SEQ ID NO. 3比对后完全匹配；堆型艾美耳球虫EAGZ疫苗株的158bp扩增条带的测序结果峰图为单一峰，并且测得的序列与SEQ ID NO.4比对后完全匹配。其中，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4比对，会出现“GATAAACAAAGAAACAAGTGGA”序列插入。
实施例3 特异性试验
采用本申请实施例1组装的PCR试剂盒分别对堆型艾美耳球虫（Eimeriaacervulina，Ea）、柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella，Et）、毒害艾美耳球虫（Eimerianecatrix，En）、巨型艾美耳球虫（Eimeria maxima，Em）和布氏艾美耳球虫（Eimeriabrunette，Eb）的疫苗株和检验株基因组DNA进行PCR扩增。
PCR反应体系（50μL）：25 µL Premix Taq DNA mix、2 μL 10 µM的上游引物、2 μL10 µM的反向引物、1μL待测样本DNA、余量为双蒸水(ddH2O）。
PCR反应程序为：95℃ 5min；94℃ 30sec，50℃ 30sec，72℃ 30sec，30个循环；72℃ 10min。结果如图3所示，堆型艾美耳球虫的疫苗株和检验株均有相应的扩增条带，疫苗株的扩增条带的大小约为158 bp，检验株的扩增条带的大小约为136 bp，而其他虫株未扩到特异条带。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.一种用于鉴别堆型艾美耳球虫的野毒株和疫苗株的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
2.一种用于鉴别堆型艾美耳球虫的野毒株和疫苗株的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1所述的特异性引物。
3.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述产品包括试剂、试剂盒和芯片中的至少一种。
4.根据权利要求2或3所述的产品，其特征在于，所述产品包括适用于PCR技术的产品。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述产品还包括核酸扩增试剂、阳性质控标准品和阴性质控标准品中的至少一种；
可选地，所述核酸扩增试剂包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+和荧光染料中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述阳性质控标准品包括堆型艾美耳球虫的野毒株和疫苗株的全基因组，或含有如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示核苷酸片段的重组质粒。
7.权利要求1所述的特异性引物或权利要求2~6任一项所述的产品在鉴别堆型艾美耳球虫的野毒株和疫苗株中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，鉴别堆型艾美耳球虫的野毒株和疫苗株的方法包括如下步骤：
提取待测样本的基因组DNA；
以所述基因组DNA为模板，采用所述的特异性引物或所述的产品进行核酸扩增；及
对所得扩增产物进行分析，根据分析结果判定待测样本为堆型艾美耳球虫的野毒株和/或疫苗株。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所得扩增产物进行分析的步骤包括采用琼脂糖凝胶电泳法、测序法和HRM法中的至少一种方法分析扩增产物。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，判定的方法包括如下：
电泳结果出现一条130bp~140bp的电泳条带，测序峰图为单一峰，测序所得序列与SEQID NO.3相同，判定所述待测样本为堆型艾美耳球虫野毒株；
电泳结果出现一条150bp~160bp的电泳条带，测序峰图为单一峰，测序所得序列与SEQID NO.4相同，判定所述待测样本为堆型艾美耳球虫疫苗株；
电泳结果出现一条130bp~140bp的电泳条带和一条150bp~160bp的电泳条带，测序所得序列分别与SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4相同，判定所述待测样本同时包含堆型艾美耳球虫的疫苗株和野毒株。
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