KR102276717B1

KR102276717B1 - 유전자 검출을 위한 올리고뉴클레오타이드 및 이를 이용한 유전자 검출 방법

Info

Publication number: KR102276717B1
Application number: KR1020200113010A
Authority: KR
Inventors: 박경운; 장호은; 조성률; 신일섭
Original assignee: 주식회사 픽스인스티튜트
Priority date: 2020-09-04
Filing date: 2020-09-04
Publication date: 2021-07-13

Abstract

본 발명은 유전자 검출을 위한 올리고뉴클레오타이드 및 이를 이용한 유전자 검출 방법에 관한 것으로, 다중분석이 용이하도록 제작된 올리고뉴클레오타이드와 형광 물질을 통해 목표 유전자와 기준 유전자를 동시에 검출하여 다중 분석이 가능한 유전자 검출 방법을 제시한다 본 발명에 따른 유전자 검출 방법은, 인터칼레이터 타입 형광 물질, 시료 및 올리고뉴클레오타이드를 혼합하여 PCR 준비용액을 제조하는 PCR 준비단계; DNA 변성(Denaturation), 어닐링(Annealing) 및 DNA 합성(Extension) 과정이 순차적으로 반복되는 PCR 공정단계; 상기 PCR 공정단계에서 실시간으로 측정된 결과를 그래프로 도출하는 그래프 도출 단계; 및 도출된 그래프를 토대로 상기 시료를 분석하는 결과 분석 단계를 포함하며, 단일파장으로 다중분석이 가능하고, 시료 내 목표 유전자 양에 상관없이 유전자의 존재 여부를 판단할 수 있어 정확도가 높은 장점이 있다.

Description

유전자 검출을 위한 올리고뉴클레오타이드 및 이를 이용한 유전자 검출 방법{Primer for gene detection and gene detecting method by using such primer}

본 발명은 유전자 검출을 위한 올리고뉴클레오타이드 및 이를 이용한 유전자 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 다중분석이 용이하도록 제작된 올리고뉴클레오타이드와 형광 물질을 이용하여 목표 유전자와 기준 유전자를 동시에 검출하고 이에 따라 다중분석이 가능한 유전자 검출 방법에 관한 것이다.

PCR(Polymerase Chain Reaction: 중합효소 연쇄반응)은 핵산을 포함하는 유전물질을 반복적으로 가열 및 냉각하여 핵산의 특정 염기서열을 갖는 부위를 연쇄적으로 복제하여 그 측정 염기서열 부위를 갖는 핵산을 기하급수적으로 증폭하는 기술로, 유전물질을 검출하는 거의 모든 실험 과정에 사용된다.

PCR 공정은 DNA 변성(Denaturation), 어닐링(Annealing) 및 DNA 합성(Extension) 단계를 포함하며, 종래의 PCR 공정에서는 증폭 산물을 검출하기 위해 전기영동법을 주로 사용하였다. 그러나 전기영동법은 PCR 후의 증폭 산물(PCR product)을 분석하여 증폭된 부분의 크기에 관한 정보만을 얻을 수 있고, 증폭 부위의 염기 서열에 대한 추측만이 가능하다는 문제가 있다.

또한, 증폭된 부위 길이에 유전정보 이외에 밴드의 특이성도 확인하기 위해서는 약 2~3일 정도가 소요되며, 특이성에 관한 정확도를 높이기 위해 프로브 결합에 필요한 상동성 정도(stringency)를 여러 조건으로 조절해야 하는 단점이 존재한다.

실시간 중합효소 연쇄 반응(Real-time PCR, quantitative PCR(qPCR))은 이러한 전기영동법의 단점을 보완하기 위해서 PCR의 각 사이클에서 나오는 시그널(형광)을 분석하여 시료 내에 존재하는 증폭 산물의 농도를 계산하고, 신속하고 정확하게 PCR 결과를 얻기 위한 기술이다. Real-time PCR을 이용하면 반응 초기부터 반응이 끝날 때까지 증폭되는 형광신호를 실시간으로 확인할 수 있을 뿐만 아니라, 이를 분석하여 시료 내 목표 유전자의 존재 여부, 농도 등을 알 수 있다.

이러한 형광 신호를 통해 PCR 결과를 그래프로 분석할 수 있다. 그러나 종래의 단일파장을 이용한 다중분석의 경우, 융해온도(Tm) 값의 편차, 민감도 등에 따라 융해곡선의 그래프의 peak가 명확하게 구별되지 않을 수 있다는 문제점이 있었다.

등록특허 제10-1939601호

본 발명은 유전자 검출을 위한 올리고뉴클레오타이드 및 이를 이용한 유전자 검출 방법에 관한 것으로, 다중분석이 용이하도록 제작된 올리고뉴클레오타이드와 형광 물질을 통해 목표 유전자와 기준 유전자를 동시에 검출하여 다중 분석이 가능한 유전자 검출 방법을 제공하고자 한다.

상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시 형태는 서열목록 1 및 서열목록 2의 유전자 검출용 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머 세트이다.

본 발명의 다른 실시 형태는 상기 프라이머 세트가 포함된 유전자 검출용 조성물 또는 유전자 검출용 PCR 키트이다.

본 발명의 또 다른 실시 형태는, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 이용한 유전자 검출 방법에 관한 것으로, 인터칼레이터 타입 형광 물질, 시료 및 올리고뉴클레오타이드를 혼합하여 PCR 준비용액을 제조하는 PCR 준비 단계; DNA 변성(Denaturation), 어닐링(Annealing) 및 DNA 합성(Extension) 과정이 순차적으로 반복되는 PCR 공정 단계; 상기 PCR 공정 단계에서 실시간으로 측정된 결과를 그래프로 도출하는 그래프 도출 단계; 및 도출된 그래프를 토대로 상기 시료를 분석하는 결과 분석 단계를 포함한다.

상기 올리고뉴클레오타이드는 다수 개로, 목표 유전자 올리고뉴클레오타이드 및 기준 유전자 올리고뉴클레오타이드가 포함될 수 있다. 이때, 상기 목표 유전자 올리고뉴클레오타이드의 Tm값과 기준 유전자 올리고뉴클레오타이드의 Tm값의 차이는 3~10인 것이 바람직하다.

또한, 상기 기준 유전자 올리고뉴클레오타이드로는, 서열목록 1 및 서열목록 2의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오타이드 한 쌍이 프라이머 세트로 사용될 수 있다.

한편, 상기 인터칼레이터 타입 형광 물질로 SYBR Green가 사용되는 것이 바람직하다.

상기 결과 분석 단계에서, 다중 분석이 수행될 수 있고, 상기 다중 분석은, 동시에 검출된 목표 유전자와 기준 유전자의 Tm값을 비교하여 동시에 분석하는 것이 바람직하다.

본 발명의 유전자 검출을 위한 올리고뉴클레오타이드 및 이를 이용한 유전자 검출 방법에 따르면, 인터칼레이터 타입 형광 물질을 이용하여 단일파장으로 다중분석이 가능하고, 시료 내 목표 유전자 양에 상관없이 유전자의 존재 여부를 판단할 수 있어 정확도가 높을 뿐만 아니라, 경제적이라는 장점이 있다.

도 1은 서열목록 1의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오타이드이다.
도 2는, 서열목록 1 또는 서열목록 2의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오타이드에 상응하는 인간 ACTB(Homo sapiens actin beta) 유전자의 염기서열이다.
도 3은 본 발명의 유전자 검출 과정을 보여주는 순서도이다.
도 4는 본 발명의 유전자 검출 방법 중 결과 분석 단계의 알고리즘이다.
도 5는 Reaction A(A 반응)에 관한 결과 분석 기준이다.
도 6은 Reaction B(B 반응)에 관한 결과 분석 기준이다.
도 7은 제조예 1에 따른 올리고뉴클레오타이드 한 쌍을 이용한 PCR 과정을 실시간으로 관찰한 융해 곡선이다.
도 8의 (a), (b), (c) 및 (d)는 각각 순차로 실험예 1, 실험예 2, 실험예 3 및 실험예 4에 따른 올리고뉴클레오타이드를 이용한 PCR 과정을 실시간으로 관찰한 융해 곡선이다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 통해 상세히 설명하기에 앞서, 본 명세서의 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정하여 해석되어서는 아니 되며, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 함을 밝혀둔다.

본 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 명세서 전체에서 사용되는 "PCR"은, rt-PCR, qPCR, qrt-PCR 등 DNA 중합효소를 이용하여 특정 핵산 염기서열을 증폭하는 모든 반응을 의미한다.

본 명세서 전체에서 사용되는 "Tm (melting temperature)값"은, 올리고뉴클레오타이드와 상보적인 시료 내 유전자와의 결합물인 PCR product의 Tm값을 의미한다.

본 발명의 일 실시 형태는, 유전자 검출을 위한 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide, oligo)는 연구나 유전자 검사를 위해 합성한 짧은 가닥의 DNA 또는 RNA 분자로서, PCR 공정단계의 DNA 합성과정에서 프라이머의 역할을 한다. 상기 프라이머란, DNA 합성과정에서 주형에 상보적인 또 하나의 중합체 가닥이 만들어지는 개시점이 되는 짧은 유전자 서열이다. 즉, 중합체 합성의 초기에 필요한 짧은 절편을 프라이머(Primer)라 하며, 일반적으로 약 18~24개의 염기서열을 갖는 RNA 또는 DNA이다.

DNA(deoxyribonucleic acid)는 RNA(ribonucleic acid)와 함께 세포의 핵 속에서 발견되는 핵산(nucleic acid)으로, 핵산을 구성하는 기본 구조인 리보오스(ribose)의 2번 탄소에서 산소원자 하나가 제거된(deoxy-) 형태의 핵산을 의미한다. 생명체의 종류에 따라 예외가 있으나, 보통 DNA는 거의 모든 생물체의 유전물질로 사용되고, 유전정보를 보관 및 보존하는 데 이용된다. 한편, 일부 바이러스는 유전물질로 RNA를 사용하며, 상기 RNA는 유전정보를 발현하여 단백질을 만드는 과정 등에서 이용된다.

DNA와 RNA는 모두 뉴클레오타이드(nucleotide)를 기본 골격으로 하는 선형 중합체(polynucleotide)로 구성되어 있으며, 모두 네 종류의 염기를 가지고 있는데, DNA는 아데닌(A), 구아닌(G), 사이토신(C), 타이민(T)을 가지고 있는 반면, RNA는 타이민(T) 대신에 유라실(Uracil, U)을 가지고 있다.

상기 DNA는 두 가닥의 뉴클레오타이드 선형 중합체가 서로 반대 방향(antiparallel)으로 마주 놓인 채 염기 간 안정한 수소결합(hydrogen bond)을 형성함으로써 이중가닥의 나선 구조를 형성하게 되며, 상기 뉴클레오타이드는 당, 인산 및 염기가 결합된 DNA의 구조적 단위이다. 이때, 아데닌(A)과 타이민(T)이, 구아닌(G)과 사이토신(C)이 서로 상보적으로 결합하며, 아데닌(A)과 타이민(T)은 이중결합을, 구아닌(G)과 사이토신(C)은 삼중결합을 형성한다. 뉴클레오타이드에서 3인산이 포함된 것을 NTP라고 하고, NTP에서 당을 구성하는 하나의 OH가 H로 치환된 것을 dNTP(deoxy-)라고 한다.

DNA의 한쪽 끝은 5', 다른 끝은 3'으로 지칭되고, 한 가닥의 5'과 다른 가닥의 3'이 서로 상보적인 이중나선구조를 이룬다. 이러한 방향성은 DNA 합성과정에서도 유지되며 DNA 합성을 위해 이중 가닥(dsDNA)이 단일 가닥(ssDNA)으로 해리되면, 각 단일가닥에 상보적인 프라이머가 상기 방향성에 따라 주형가닥(단일가닥)에 결합하고, DNA 중합효소가 프라이머의 3' 말단에서부터 DNA 합성을 시작한다.

PCR은 시료 내의 DNA 또는 RNA를 주형으로 하여 특정 염기 서열을 증폭시키는 반응이므로, DNA 합성이 시작되려면 개시점인 올리고뉴클레오타이드를 첨가해야 한다. 본 발명에서 실시되는 PCR 공정과정에서 프라이머와 올리고뉴클레오타이드가 같은 의미로 사용되는 것은 통상의 기술자에게 자명할 것이다.

본 발명에서 Forward 프라이머로 쓰이는 올리고뉴클레오타이드의 GC%는 60~80(%)인 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 서열목록 1과 같은 염기서열(5'-GCGGGCAGGGCGGCCCGCCAGCTCACCATGGAT-3')을 갖도록 합성될 수 있다. 도 1의 (a)로 표시된 서열 CCGCCAGCTCACCATGGAT는 프라이머 구역으로, 도 2와 같이 이미 알려진 ACTB(Homo sapiens actin beta) 염기서열과 상보적으로 결합되기 위해 합성된 서열이다. ACTB 염기서열은 NCBI 데이터베이스에서 NM_001101(Genbank ACC)로 검색하여 참조하였다.

또한, 도 2의 (b)로 표시된 서열 GCGGGCAGGGCGGC는 Tm 특이성 구역으로, 상기 올리고뉴클레오타이드의 Tm값을 조절하기 위해 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단에 붙이는 GC tail로서 설계한 것이다. 상기 GC tail이 추가됨으로써 염기 중에서 구아닌(G)과 사이토신(C)이 차지하는 비율인 GC%가 높아지면 삼중결합이 늘어나 안정성이 높아지는 반면, 반응성이 약해질 수 있다. 상기와 같은 GCGGGCAGGGCGGC 염기서열은 반응성에 영향을 주지 않으면서 다중 분석에 용이한 Tm값을 갖도록 설계된 것이다. 상기와 같은 서열을 갖는 GC tail이 추가됨으로써, 검출하고자 하는 목표 유전자 PCR product의 Tm(melting temperature)값과 상기 올리고뉴클레오타이드에 상응하는 ACTB PCR product의 Tm값이 융해곡선(melting curve)상에서 명확하게 구분될 뿐만 아니라 적절한 민감도가 유지되어 이를 통한 다중 분석이 효과적으로 수행될 수 있다.

한편, 본 발명의 Reverse 프라이머로 쓰이는 다른 올리고뉴클레오타이드의 GC%는 60~75(%)인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 서열목록 2와 같은 염기서열(5'-CACCATCACGCCCTGGTGC-3')을 갖도록 합성될 수 있다.

Forward, Reverse 프라이머 서열은 도 2와 같은 ACTB 유전자 서열 중 exon 1 및 2(ACTB_gcF)와 exon 2와 3(ACTB_R)의 일부분을 각각 포함하는 영역으로, 역전사반응의 효율이 가장 뛰어나고, 프라이머 간의 DNA 반응성을 최대한 배제할 수 있도록 선별된 영역이다.

본 발명의 다른 실시 형태에는, 서열목록 1 및 서열목록 2의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머 세트가 포함된 유전자 검출용 조성물 또는 유전자 검출용 PCR 키트가 포함된다.

본 발명의 또 다른 실시 형태는, 올리고뉴클레오타이드를 이용한 유전자 검출 방법에 관한 것으로, 도 3은 이에 관한 순서도이다. 도 3을 참조하면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 이용한 유전자 검출 방법은, 인터칼레이터 타입 형광 물질, 시료 및 올리고뉴클레오타이드(프라이머 세트)를 혼합하여 PCR 준비용액을 제조하는 PCR 준비 단계; DNA 변성(Denaturation), 어닐링(Annealing) 및 DNA 합성(Extension) 과정이 순차적으로 반복되는 PCR 공정 단계; 상기 PCR 공정단계에서 실시간으로 측정된 결과를 그래프로 도출하는 그래프 도출 단계; 및 도출된 그래프를 토대로 상기 시료를 분석하는 결과 분석 단계를 포함한다.

상기 PCR 준비 단계는, 인터칼레이터 타입 형광 물질, 시료 및 올리고뉴클레오타이드(프라이머 세트)를 혼합하여 PCR 준비용액을 제조하는 단계이다. 형광 물질은 버퍼 용액에 포함된 채로 혼합될 수 있으며, dNTP, DNA 중합효소 등과 같이 일반적으로 알려진 PCR 공정 과정에서 필요한 물질을 통상의 기술자가 적절히 추가할 수 있다. 상기 인터칼레이터(intercalator) 타입 형광 물질은 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 SYBR Green이 사용될 수 있다.

이때, 시료 내 목표 유전자가 존재하는지 여부를 판단하는 기준으로 활용될 수 있는 Positive Control(target template 포함)과 Negative Control(no template) PCR 준비용액도 별도로 제조되어 사용될 수 있다.

종래에는 PCR 공정에 따른 증폭 산물을 분석하기 위해 전기영동법을 사용하였으나, 형광 물질을 사용하면 실시간으로 증폭 정도를 확인할 수 있고, 이러한 형광물질은 크게 프로브 타입과 인터칼레이터 타입으로 구분될 수 있다.

프로브 타입 형광 물질은 DNA와 상보적인 서열을 갖는 탐침(probe)의 한쪽 끝에 결합되는 것으로, 탐침의 다른 한쪽에는 형광 물질이 발광하지 못하도록 하는 형광 억제 물질(Qhuencher)이 부착되어 있다. DNA 합성단계에서 DNA 중합효소에 의해 시료 내 DNA에 결합한 탐침이 분해되면서 프로브 타입 형광 물질과 형광 억제 물질이 서로 분리되면 형광 물질이 비로소 발광하게 된다.

이러한 프로브 타입 형광 물질로는 Cy5, Cy3, x-로다민, 텍사스 레드, FAM, FAM-NOVA, VIC, JOE, NED, HEX, TET 및 TAMRA 등이 있으며, 상기 형광 억제 물질로는 IABkFQ, DABCYL, BHQ(BHQ1, BHQ1-PLUS, BHQ2 등, EBQ, ZEN-IBFQ 등이 사용될 수 있다.

상기와 같은 프로브 타입 형광 물질을 사용하여 다중분석(다중검출)을 하기 위해서는 상이한 파장 대를 갖는 형광 염료에 의해 표지된 여러 개의 프로브를 사용해야 하지만, 프로브 간 간섭을 피할 수 있는 프로브 디자인이 까다로우며 제작비용이 비싸다는 문제가 있다.

반면, 인터칼레이터 타입 형광 물질은, 단일 가닥 DNA에는 결합하지 않고 이중 가닥 DNA(dsDNA)에 결합할 때 형광을 발광하게 된다. 이러한 인터칼레이터 타입은 이중 가닥 DNA라면 모두 인식하여 결합하기 때문에 비특이적 증폭에 의한 잡신호가 발생할 수 있고, 융해곡선(melting curve)을 분석함으로써 이를 보완할 수 있다.

이중 가닥 DNA를 천천히 가열하면 특정 온도에서 단일 가닥 DNA로 해리되면서 형광물질의 신호가 급격히 감소되는데, 이 시점의 온도를 Tm(meling temperature)이라 하고, 이를 그래프로 나타내면 융해곡선(melting curve)이 된다.

한편, 상기 올리고뉴클레오타이드는 다수 개로, 목표 유전자 올리고뉴클레오타이드 및 기준 유전자 올리고뉴클레오타이드가 포함될 수 있다. 목표 유전자와 기준 유전자는 검출을 목표로 시료 내에서 증폭하고자 하는 유전자로서, 특히 진단키트 등으로 활용되어 결과 분석을 수행할 경우, 상기 목표 유전자는 병원균 등이 갖는 유전자인 것이 바람직하다. 이러한 목표 유전자 수에 따라 상기 PCR 준비단계에서 혼합되는 목표 유전자 올리고뉴클레오타이드(프라이머 세트)의 개수도 달라질 수 있다. 상기 기준 유전자로는 사람 유전자가 사용되는 것이 바람직하며, PCR 반응이 유효한지 여부를 판단하는 기준이 될 뿐만 아니라, 목표 유전자와 동시에 검출됨으로써 다중분석의 정확도가 증가할 수 있다.

상기 기준 유전자로 ACTB가 사용되는 것이 바람직하고, 목표 유전자는 코로나바이러스(SARS-CoV-2)가 갖는 RdRP 유전자와 N유전자가 사용되는 것이 바람직하나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 기준 유전자 올리고뉴클레오타이드로는 상기 일 실시 형태에 따른 서열목록 1 및 서열목록 2의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오타이드 한 쌍이 프라이머 세트로 사용될 수 있다.

상기 시료는 피검체자로부터 추출되는 것으로, 비인두도말, 구인도도말물, 객담, 기관지폐포세척액(Bronchoalveolar lavage fluid, BALF) 등 어떠한 방법으로도 채취될 수 있으며, 본 발명에서는 비인두도말물(nasopharyngeal swab), 구인두도말물(oropharyngeal swab)이 사용되는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.

한편, 상기 PCR 공정단계는, DNA 변성(Denaturation), 어닐링(Annealing) 및 DNA 합성(Extension) 과정이 순차적으로 반복되는 단계이다. 본 발명에서 PCR 공정단계는 45회(cycle) 반복되는 것이 바람직하나, 반복횟수는 필요에 따라 적절히 조절될 수 있다.

이때, 필요에 따라 역전사반응 과정, Melt curve analysis 등을 위해 반응 온도 또는 반응 시간 등을 조절하는 과정이 PCR 공정단계의 전후로 더 수행될 수 있으며, 통상의 기술자가 반응 온도 또는 시간 등의 반응 조건을 적절하게 조절하여 수행할 수 있다.

상기 DNA 변성(Denaturation)은, 특정 염기서열을 증폭하기 위해 시료 내 DNA의 이중 가닥을 단일 가닥으로 해리하기 위한 과정으로, 일반적으로 약 90~96℃에서 이루어질 수 있다. 이중 가닥을 가열하면 서로 상보적인 두 가닥의 DNA 염기쌍이 형성하는 수소결합들이 끊어지면서 이중 가닥 DNA가 단일 가닥 DNA로 분리된다. 본 발명에서 DNA 변성은 95℃에서 이루어지는 것이 바람직하나, 온도는 실험 조건에 따라 적절하게 바뀔 수 있다.

상기 어닐링(Annealing)은, 올리고뉴클레오타이드(프라이머)가 상기 분리된 단일 가닥 DNA에 결합되어 부분적인 DNA-올리고뉴클레오타이드(프라이머) 복합체를 형성하는 단계이며, 복합체 형성 효율에 따라 PCR 공정의 성공 여부가 크게 좌우될 수 있다. 즉, Tm보다 높은 온도에서는 단일 가닥 DNA가 존재할 수 있고, Tm보다 낮은 온도에서는 이중 가닥으로 존재할 수 있으므로, 특히 Tm값을 이용하여 PCR 결과를 다중 분석하는 경우에는 어닐링 과정에서 PCR이 성공할 수 있을 정도로 이중 가닥이 형성되면서, 동시에 다른 유전자 PCR product의 Tm값과 구별되도록 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 것이 중요하다.

상기 복합체는 이중 가닥 형태이므로, 어닐링 과정에서는 올리고뉴클레오타이드(프라이머)의 Tm값에 따라 복합체를 형성하는 반응성이 달라질 수 있다. PCR 공정에서 사용되는 올리고뉴클레오타이드(프라이머)의 Tm값은 아데닌(A)과 타이민(T), 구아닌(G)과 사이토신(C)의 결합쌍의 개수에 따라 계산될 수 있으며, 염기의 수(N)가 14 이하일 때는, 다음의 수식 (1)과 같이 Tm값을 계산할 수 있다.

Tm(N≤14) = 4 x (프라이머 내 G,C 개수)+2 x (프라이머 내 A,T 개수)

(수식 1)

반면, 염기의 수(N)가 14를 초과하는 경우에는 다음의 수식 (2)로 Tm값을 구할 수 있다.

Tm(N>14) = 64.9 + 41 x (프라이머 내 G,C 개수 - 16.4)/N (수식 2)

이러한 Tm값은, 주변 물질의 농도 등에 의해 영향을 받을 수 있으므로 다음과 같은 변수를 보정한 식인 수식 (3)을 사용할 수 있다.

Tm = 81.5 + 16.6 x log([Na+] + [K+]) + 0.41 x (GC%) - 675/N

(수식 3)

본 발명의 일 실시에 따르면, RdRP 유전자 PCR product의 Tm값은 77±1, N 유전자 PCR product의 Tm값은 81±1 및 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(프라이머)에 따라 생성된 PCR product의 Tm값은 87±1인 것이 바람직하다.

이러한 어닐링은 일반적으로 약 40~65℃의 온도에서 수행될 수 있고, 약 56℃에서 수행되는 것이 바람직하나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

DNA 합성(Extension)은 상기 DNA-올리고뉴클레오타이드(프라이머) 복합체 중 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에서부터 DNA 중합효소가 DNA 합성을 개시하여 상기 단일 가닥 DNA와 상보적인 DNA 중합체를 합성하는 과정이다. DNA 중합효소로는 Taq 중합효소(Polymerase)가 사용되는 것이 바람직하고, 상기 Taq 중합효소는 약 72℃에서 가장 활성화되므로, DNA 합성과정은 약 72℃에서 진행되는 것이 바람직하나, PCR 공정 조건에 따라 적절히 조절될 수 있다.

한편, 이러한 PCR 공정 단계에서는 상기 PCR 준비단계에서 첨가된 형광 물질이 이중 가닥 DNA에 결합할 수 있고, 파장에 따른 형광 물질의 형광 신호(발광 정도)를 실시간으로 관찰할 수 있다. 상기 그래프 도출 단계에서는 상기 형광 신호에 따른 결과가 그래프로 나타나며, 증폭 곡선(Amplification curve)과 융해 곡선(Melting curve)이 도출되는 것이 바람직하다. 이때 SYBR Green의 경우, 약 483nm~583nm의 파장에서 형광 신호를 나타내므로, 융해곡선을 도출하기 위해 약 483nm~583nm의 파장이 사용되는 것이 바람직하다.

상기 증폭 곡선이란, PCR 공정 과정의 주기(cycle)가 반복됨에 따른 RFU(Relative Fluorescence Units)를 측정한 것으로서, 이를 분석하면 형광 물질을 매개로 시료 내 유전자 염기서열의 증폭 정도를 알 수 있다. 증폭 곡선에서, PCR 공정 과정의 초기인 약 1~15 cycle에서는 RFU가 거의 증가하지 않는데, 이를 Background 구간이라고 한다. 이후 PCR 공정 과정에서 이중 가닥 DNA가 생성됨에 따라 약 15~25 cycle에서는 RFU가 급속도로 증가하고, 이 구간을 Exponential phase(증폭기)라고 한다. PCR 준비단계에서 첨가된 dNTP 등 재료들이 모두 소진되면 RFU가 다시 일정해지는데 이를 정체기(Plateau)라고 한다.

증폭 곡선을 해석함에 있어, 일정한 형광 신호 값으로 설정된 역치선(Threshold)과 그래프가 만나는 점의 cycle 값을 Ct(Cycle Threshold)라고 하며, Cq(cycle quantification), Cp(crossing point) 또는 TOP(take-off point)로 불리기도 한다. 시료 내 유전자 양이 많을수록 적은 cycle로도 형광 신호가 증폭될 수 있으므로 Ct값이 낮아질 수 있다.

상기 융해 곡선은 이중 가닥 DNA를 가열함에 따라 단일 가닥 DNA로 해리되면서, 형광 물질의 형광 신호 변화를 측정한 것이다. 융해 곡선 중 peak로 나타나는 지점의 온도가 Tm이며, PCR 공정 과정에서 올리고뉴클레오타이드(프라이머)와 단일 가닥 DNA의 결합력에 따라 Tm값이 달라질 수 있고, 서로 다른 Tm값을 통해 시료 내 목표 유전자 또는 기준 유전자의 존재 여부 등에 대한 다중 분석이 가능할 수 있다.

결과 분석 단계는, 상기 그래프 도출 단계를 통해 얻은 그래프들을 다중 분석하여 시료 내 목표 유전자 또는 기준 유전자의 존재 여부를 판단하는 단계이며, 도 4에 분석 과정에 대한 알고리즘을, 도 5 및 도 6에 Reaction A 및 B에 대한 분석 기준을 나타내었다. A 반응(Reaction A)는 RdRP 유전자에 상보적인 프라이머가 포함된 PCR 준비용액을 이용하여 PCR 공정 과정을 거치는 것이고, B 반응(Reaction B)는 N 유전자에 상보적인 프라이머 및 상기 일 실시 형태에 따른 ACTB 올리고뉴클레오타이드(프라이머)가 포함된 PCR 준비용액을 이용하여 PCR 공정 과정을 거치는 반응을 의미한다. 이때, A반응과 B반응은 동시에 진행됨으로써 목표 유전자 및 기준 유전자가 동시에 검출될 수 있다.

상기 결과 분석 단계는 다단계로 수행될 수 있고, 동시에 검출된 목표 유전자와 기준 유전자를 단일파장으로 동시에 분석하는 단계가 포함될 수 있으며, 증폭 곡선을 통해 얻어진 Ct값, 융해곡선 및 Tm값을 분석함으로써 시료 내 유전자를 분석할 수 있다. 상기 Ct값을 통해, PCR 반응성 유무(목표 유전자 유무)를 파악하고, 상기 융해곡선 및 Tm값을 통해 PCR 반응의 특이도(specificity)를 확인할 수 있다.

특정 질병 진단용 PCR 진단키트의 경우, PCR 반응의 민감도(Sensitivity)와 특이도(specificity)에 따라 PCR 검사의 정확도가 증가할 수 있고, 이에 따라 위양성(False positive) 또는 위음성(False negative) 등의 결과가 배제될 수 있다. 민감도란 실제 시료 내 유전자가 존재할 때 PCR 결과가 양성(positive)인 비율을 의미하고, 특이도는 실제 시료 내 유전자가 존재하지 않을 때 PCR 결과가 음성(negative)인 비율을 의미한다.

종래의 PCR 진단키트 결과 분석 방법의 경우, Ct값을 통해 양성 여부를 판단하여 위양성 또는 위음성 등으로 인한 오류를 배제할 수 없었고, 질병의 초기 혹은 호전 등에 따른 약양성(weak positive)의 경우 시료 내 병원균 등의 농도가 낮아 양성 여부를 정확하게 판단할 수 없다는 어려움이 있었다.

이에 반해 상기 결과 분석 단계에서는 Ct값, 융해곡선 및 Tm값을 모두 분석함으로써 시료 내 유전자 농도에 상관없이 높은 민감도와 특이도를 가짐으로써 정확도가 높은 분석 방법으로 활용될 수 있다.

본 발명의 일 실시에 따르면, 1단계(A 반응)는 RdRP 유전자에 관한 분석 단계이고, 2단계(B 반응)는 N 유전자와 ACTB 유전자를 동시에 분석하는 단계이다.

도 4 내지 도 6을 참조하면, A 반응에서 관찰된 증폭 곡선을 도출하여 Ct값이 42 이하인 경우(Ct(A)≤42) 시료 내 RdRP 유전자가 존재할 수 있고, 동시에 융해 곡선의 Tm값이 77±1인 경우(Tm(RdRP)=77±1) 시료 내 코로나바이러스(SARS-CoV-2)의 RdRP 유전자에 대해 특이도가 높은 것으로 판단할 수 있다. 반면, Ct(A)가 42를 초과하거나, 증폭 곡선에 변화가 없어 ND(Not Detected)로 측정되는 경우 또는 Tm(RdRP)이 77±1에서 벗어나는 경우, 2단계(B 반응)를 수행하는 것이 바람직하다.

상기 2단계는 B 반응이 진행되는 단계로, 코로나바이러스(SARS-CoV-2)의 N 유전자와 사람 유전자인 ACTB 유전자에 대하여 PCR 과정을 진행하고, 이에 따른 결과를 다중 분석할 수 있다. B 반응의 증폭 곡선을 도출하여 Ct(B)≤42인 경우, PCR 공정 과정의 결과 시료 내 N 및 ACTB 유전자가 존재할 수 있고, Tm(N)이 81±1이면서 동시에 Tm(ACTB)이 87±1 경우, 시료 내 N 유전자와 ACTB 유전자에 대해 특이도가 높은 것으로 분석될 수 있다. 반면, Ct(B)>42이거나, ND(Not Detected)로 측정되는 경우 또는 Tm(ACTB)가 87±1이 아니거나 NA(Not Applicable)인 경우에는 PCR 결과가 유효하지 않은 것으로 판단될 수 있다.

다중 분석을 위한 목표 유전자와 기준 유전자의 Tm값 사이의 차이는 약 3~10인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 Tm값 간에 약 3~6의 차이가 날 수 있다. 상기 차이가 10을 초과하는 경우에는, 높은 GC 함량(Tm값 증가)에 의해 PCR 반응이 효과적으로 일어나지 않을 수 있다는 문제가 발생할 수 있고, 상기 차이가 3 미만인 경우에는 도출된 융해 곡선상에서 peak가 서로 겹치는 등 peak들이 명확하게 구별되지 않아 정확한 결과 분석이 어려울 수 있다.

이와 같이 복수의 유전자를 동시에 검출하고, 이러한 유전자들의 서로 상이한 Tm값을 동시에 분석하여 PCR 결과 분석의 정확도를 높일 뿐만 아니라, 시료 내 유전자 양에 관계없이 적은 농도로도 유전자의 존재 여부를 파악할 수 있다. 또한, 단일 파장으로 형광 물질의 신호를 측정하여 다중분석이 가능하므로 경제적이라는 장점도 있다.

이하에서는, 본 발명의 구체적인 실시예를 중심으로 설명하고자 한다. 그러나 본 발명의 범위가 이하의 실시예에만 한정되는 것은 아니며, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위해 예시적으로 제시된 것일 뿐, 통상의 기술자라면 본 발명의 권리범위 내에서 본 명세서에 기재된 내용의 여러 가지 변형된 형태를 실시할 수 있음을 밝혀두고자 한다.

[제조예 1]

GenBank로부터 ACTB의 서열을 파악하여, 서열목록 1의 올리고뉴클레오타이드(제조예 1-1)와 서열목록 2의 올리고뉴클레오타이드(제조예 1-2)를 합성하여 ACTB 프라이머 한 쌍을 제조하였다.

[제조예 2]

dNTPs. SYBR Green, 조효소 성분 등이 포함된 2x Buffer 10uL, 역전사효소 또는 Taq 중합효소 등이 포함된 용액인 Enzyme Mix 1uL, RdRP 유전자에 대해 서열목록 3 및 4의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머 한 쌍을 포함하는 5x Oligo A 4uL 및 피검체자로부터 추출한 시료(비인두도말물 또는 구인두도말물) 5uL를 혼합하여 PCR 준비용액 20uL를 제조하였다.

(RdRP gene Forward primer(서열목록 3): 5'-TCTGTGATGCCATGCGAAAT-3', RdRP gene Reverse primer(서열목록 4): 5'-ACTACCTGGCGTGGTTTGTA-3')

[제조예 3]

dNTPs. SYBR Green, 조효소 성분 등이 포함된 2x Buffer 10uL, 역전사효소 또는 Taq 중합효소 등이 포함된 용액인 Enzyme Mix 1uL, N 유전자에 대해 서열목록 5 및 6의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머 한 쌍과 제조예 1에 따른 ACTB 프라이머를 한 쌍으로 포함하는 5x Oligo B 4uL 및 피검체자로부터 추출한 시료(비인두도말물 또는 구인두도말물) 5uL를 혼합하여 PCR 준비용액 20uL를 제조하였다.

(N gene Forward primer(서열목록 5): 5'-GCTGCAATCGTGCTACAACT-3', N gene Reverse primer(서열목록 6): 5'-TGAACTGTTGCGACTACGTG-3')

[실시예 1]

다중 분석이 용이하도록 Tm값의 차이를 가진 프라이머를 선택하기 위해 표 1과 같은 GC%를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 합성하고, PCR 반응을 진행하였다.

제조예 1 및 실험예 1 내지 4에 따른 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 올리고뉴클레오타이드(프라이머)를 제외하고는 제조예 3에 따라 제조된 PCR 준비용액과 PCR 장치(QuatStudio 3 (Thermo Fisher Scientific))를 이용하여 PCR 공정 과정을 거친 후 결과를 분석하여 표 1에 나타내었다. 상기 PCR 공정 과정은, 구체적으로, 95℃의 온도에서 DNA 변성 과정을 10초간, 58℃의 온도에서 어닐링 과정을 10초간, 72℃의 온도에서 DNA 합성 과정을 15초간 순차적으로 수행하였고, 상기 DNA 변성과정부터 DNA 합성까지를 1주기로 하여, 총 45주기를 반복하였다.

제조예 3에 따라 제조된 PCR 준비용액(제조예 1을 포함)을 이용하여 PCR 공정 과정을 거치고, 이를 실시간으로 관찰한 융해곡선은 도 7에 나타내었다. 또한, 실험예 1 내지 4에 따른 올리고뉴클레오타이드를 포함한 PCR 준비용액을 이용하여 PCR 공정 과정을 거치고, 이를 실시간으로 관찰한 융해곡선은 순차로 도 8의 (a), (b), (c) 및 (d)에 나타내었다. 융해곡선을 도출하기 위해 사용된 파장범위는 약 483nm~583nm이다.

	Primer GC% (Forward / Reverse)	PCR product Tm (℃)	Difference between Tm of target gene (℃)	Multiplexed reaction
제조예 1	75.8% / 68.4%	87±1	6	Good
실험예 1	55.0% / 55.0%	82±1	1	Fail
실험예 2	47.6% / 55.6%	78±1	3	Not good
실험예 3	43.5% / 42.9%	82±1	1	Fail
실험예 4	82.2% / 68.4%	NA	NA	Fail

(NA ; Not Applicable due to no amplification)

상기 표 1 및 도 7에서 확인되듯이, Forward primer의 GC%가 약 76%, Reverse primer의 GC%가 약 68%인 제조예 1의 경우 다중 분석 과정에서 목표 유전자와 기준 유전자와의 구별이 뚜렷하였고 적정한 민감도가 유지되었다.

반면, 상기 표 1에서 확인되듯이, GC tail을 붙이지 않은 실험예 1 내지 3의 경우, 목표 유전자와의 Tm값의 차이가 1~3으로 나타났고, GC tail을 추가로 합성한 실험예 4에서는 Tm값이 측정되지 않았다.

도 8의 (a), (b), (c) 및 (d)에서 확인되듯이, 실험예 1 내지 4의 경우 목표 유전자와의 Tm값의 차이가 너무 낮거나 높아서, 융해곡선상에서 두 개의 peak가 명확하게 구별되는 양상 대신, N 유전자와 ACTB 유전자 중 하나의 peak만 나타나거나 두 peak가 서로 합쳐진 모양으로 나타나므로 다중 분석의 정확도가 감소하는 것을 확인할 수 있다.

[실시예 2]

제조예 1에 따른 올리고뉴클레오타이드와 병원균의 염기서열에 대하여 In Silico 교차반응을 진행하였다. 각 병원균의 서열은 NCBI 데이터베이스에서 검색하였고, 구체적인 결과는 하기의 표 2에 나타내었다.

	병원균(pathogen)	Genbank ACC#	Number of mismatches
	병원균(pathogen)	Genbank ACC#	서열목록 1 (forward primer)	서열목록 2 (reverse primer)
1	SARS-CoV-2	NC_045512	8/19	10/20
2	SARS-CoV	NC_004718	8/19	10/20
3	Human coronavirus 229E	NC_002645	9/19	10/20
4	Human coronavirus OC43	NC_006213	11/19	9/20
5	Human coronavirus NL63	NC_005831	8/19	10/20
6	Human coronavirus HKU1	NC_006577	9/19	8/20
7	MERS-CoV	NC_019843	9/19	8/20

상기 표 2에서 확인되듯이, 제조예 1에 따라 제조된 올리고뉴클레오타이드의 서열은 ACTB 유전자에만 특이적으로 반응하며, 상기 표 2에 기재된 병원균에 대하여 낮은 상동성을 나타냄을 확인하였다.

[실시예 3]

시료의 농도(Limit of Detection, LOD)에 따른 분석 결과의 정확도를 확인하기 위해, 제조예 2 내지 3과 같이 PCR 준비용액을 제조하되, 피검체자로부터 추출한 시료 대신 복제(copies) 수를 알고 있는 코로나바이러스의 RNA 물질(AMPLIRUN SARS-CoV-2 RNA Control, Vircell, Granada, Spain)을 혼합하였다. 역전사과정을 거친 후, 각 농도별로 20번 반복 실험하여 분석하였으며, A 반응은 제조예 2를 이용하고, B 반응은 제조예 3을 이용하여 실시예 1에서와 같은 PCR 공정과정을 거친 것이다.

목표 유전자 농도 (copies/㎕)	A 반응
목표 유전자 농도 (copies/㎕)	positive 결과	탐지비율(Detection Rate)
100	20/20	100%
50	20/20	100%
10	20/20	100%
5	14/20	70%

목표 유전자 농도 (copies/㎕)	B 반응
목표 유전자 농도 (copies/㎕)	positive 결과	탐지비율(Detection Rate)
500	20/20	100%
100	20/20	100%
50	19/20	95%
10	17/20	85%

상기 표 3 및 표 4에서 확인되듯이, 유전자가 95% 이상이 탐지된 최소검출한계는, RdRP 유전자의 경우 10 copies/㎕로 확인되었고, N 유전자의 경우 50copies/㎕로 확인되었다.

따라서, 시료 내 목표 유전자가 상당히 저농도로 존재하더라도 유전자 분석 방법의 정확도가 매우 높음을 확인할 수 있다.

[실시예 4]

교차반응(Cross-reactivity)를 통해 분석 결과의 정확도를 확인하기 위해, 제조예 2 및 3에 따라 준비용액을 제조하되, 피검체자로부터 채취한 시료 대신 표 5와 같이 29개의 유기체(Organism)를 첨가하여 PCR 공정 과정을 진행하였다. A반응은 제조예 2를 이용하고, B반응은 제조예 3을 이용하여 실시예 1에서와 같은 PCR 공정 과정을 거친 것이다. 바이러스의 RNA는 Korea Bank for Pathogenic Viruses (KBPV)로부터 구매하여 희석없이 10⁵PFU(Plaque Forming Unit)/mL의 농도로, 박테리아는 American Type Culture Collection (ATCC)로부터 구매하고 DNA를 추출하여 10⁶CFU(Colony Forming Unit)/ml의 농도로 교차반응이 수행되었다.

상기 표 5에서 확인되듯이, 제조예 2 및 제조예 3에 따라 제조된 PCR 준비용액을 사용하여 PCR 공정과정을 거치고 이를 분석하는 경우, 코로나바이러스(SARS-CoV-2)의 RdRP 유전자와 N 유전자 및 사람유전자인 ACTB 유전자만을 특이적으로 검출하고, 다른 유기체들이 검출되지 않는다는 것을 확인하였다.

[실시예 5]

COVID-19 의심환자들로부터 채취된 시료를 포함한 125개의 시료에 대하여 PCR 장비(QuantStudio 3 Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific))를 통해 PCR 공정과정을 수행하고, 결과를 분석하였다. 임상시료들에 대하여는 대한민국 식품의약품안전처와 미국 FDA가 음성 혹은 양성 여부를 판단하였다. 구체적으로, 제조예 2 및 3에 따른 PCR 준비용액을 제조하되, 피검체자로부터 채취한 시료 대신 125개의 RNA 시료 중 일부, Positive Control 또는 Negative Control(RNase-free water)을 무작위로 첨가하여 각각 125개씩 총 250개의 PCR 준비용액을 제조하였다. A 반응은 제조예 2를 이용하고, B 반응은 제조예 3을 이용하여 실시예 1에서와 같은 PCR 공정과정을 거친 것이다. A 반응의 경우 Ct≤42, Tm(RdRP)=77±1℃를 기준으로 하고, B 반응의 경우에는 Ct≤42, Tm(N)=81±1℃, Tm(ACTB)=87±1℃를 기준으로 하여 PCR 결과를 분석하였고, 그 결과는 하기의 표 6과 같다. 또한, 같은 시료로 Comparator RT-PCR TEST를 수행하여 음성/양성을 판단한 결과는 표 7과 같다.

	A 반응		B 반응
	Ct값	Tm값	Ct값	Tm(N) 값	Tm(ACTB) 값
Positive 결과 수	37	54	124	31	122
Positive 결과에서의 수치 범위	23.91~41.88	76.05~77.99	28.43~41.71	80.94~81.91	86.14~87.96
Positive 결과의평균	35.75	77.13	36.28	81.33	87.07
표준편차	4.10	0.39	3.00	0.26	0.30
분산계수(%)	11.48	0.50	8.28	0.32	0.34

	Comparator RT-PCR Test		Agreement (%)	95% CI (Confidence interval)
	음성(Negative)	양성(Positive)	Agreement (%)	95% CI (Confidence interval)
음성(Negative)	88	0	NPA 88/88	95.82% ~ 100%
양성(Positive)	0	37	PPA 37/37	90.59% ~ 100%

(NPA; Negative Percent Agreement, PPA; Positive Percent Agreement)

상기 표 7에서 확인되듯이, 125개의 시료 중에서 COVID-19에 대하여 양성인 시료는 37개였으며, 상기 표 6에서 확인되듯이, A 반응의 Ct값에 해당하는 시료는 37개였고, B 반응에서 N 유전자와 ACTB 유전자가 동시에 검출되는 시료의 수는 31개였다. 따라서 본 발명에 따른 유전자 검출 방법을 이용하여 높은 정확도로 시료 내 유전자의 존재여부를 알아낼 수 있었다.

<110> PHiCS institute, Inc. <120> Primer for gene detection and gene detecting method by using such primer <130> P2020-168 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for ACTB <400> 1 gcgggcaggg cggcccgcca gctcaccatg gat 33 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for ACTB <400> 2 caccatcacg ccctggtgc 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for RdRP <400> 3 tctgtgatgc catgcgaaat 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for RdRP <400> 4 actacctggc gtggtttgta 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for N <400> 5 gctgcaatcg tgctacaact 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for N <400> 6 tgaactgttg cgactacgtg 20

Claims

삭제
서열목록 1 및 서열목록 2의 유전자 검출용 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머 세트가 포함된 코로나바이러스(SARS-CoV-2) 유전자 검출용 조성물.
서열목록 1 및 서열목록 2의 유전자 검출용 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머 세트가 포함된 코로나바이러스(SARS-CoV-2) 유전자 검출용 PCR 키트.
인터칼레이트 타입 형광 물질, 시료 및 올리고뉴클레오타이드를 혼합하여 PCR 준비용액을 제조하는 PCR 준비 단계;
DNA 변성(Denaturation), 어닐링(Annealing) 및 DNA 합성(Extension) 과정이 순차적으로 반복되는 PCR 공정 단계;
상기 PCR 공정 단계에서 실시간으로 측정된 결과를 그래프로 도출하는 그래프 도출 단계; 및
도출된 그래프를 토대로 상기 시료를 분석하는 결과 분석 단계를 포함하고,
상기 올리고뉴클레오타이드는 다수 개로, 목표 유전자 올리고뉴클레오타이드 및 기준 유전자 올리고뉴클레오타이드가 포함되며,
상기 기준 유전자 올리고뉴클레오타이드로는, 서열목록 1 및 서열목록 2의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오타이드 한 쌍이 프라이머 세트로 사용되고,
상기 목표 유전자 올리고뉴클레오타이드의 Tm값과 기준 유전자 올리고뉴클레오타이드의 Tm값의 차이는 6인 것을 특징으로 하는, 코로나바이러스(SARS-CoV-2) 유전자 검출 방법.
샘플에 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 이용하여 첫 번째 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하여 상기 PCR에서 측정된 결과를 그래프로 도출하여 Ct(Cycle Threshold) 값 및 융해 곡선의 Tm값을 구하고,
상기 Ct값이 42 이하(Ct≤42)이고, 상기 융해 곡선의 Tm값이 77±1인 경우에 상기 샘플을 코로나바이러스(SARS-CoV-2) 양성으로 판단하고,
만약에 상기 Ct 값이 42를 초과하거나, 증폭 곡선에 변화가 없어 ND(Not Detected)로 측정되는 경우 또는 상기 Tm 값이 77±1에서 벗어나는 경우에는,
해당 샘플을 추가로 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트 및 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트를 이용하여 두 번째 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 수행하여 상기 PCR에서 측정된 결과를 그래프로 도출하여 Ct(Cycle Threshold) 값 및 융해 곡선의 Tm값을 구하여,
상기 Ct 값이 42 이하(Ct≤42)이고, 상기 서열번호 5 및 6의 프라이머를 이용하여 얻어진 Tm 값이 81±1이면서 동시에 상기 서열번호 1 및 2의 프라이머를 이용하여 얻어진 Tm 값이 87±1 경우에는 상기 샘플을 코로나바이러스(SARS-CoV-2) 양성으로 판단하고,
상기 두 번째 PCR 반응의 Ct 값이 42를 초과하거나, ND(Not Detected)로 측정되는 경우 또는 상기 서열번호 1 및 2의 프라이머를 이용하여 얻어진 Tm 값이 87±1이 아닌 경우에는 PCR 결과가 유효하지 않은 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스(SARS-CoV-2) 유전자 검출 방법.
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