KR101939601B1 - 단일파장으로 다중검출이 가능한 실시간 pcr 방법 및 이를 위한 실시간 pcr 장치 - Google Patents

단일파장으로 다중검출이 가능한 실시간 pcr 방법 및 이를 위한 실시간 pcr 장치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 실시간 PCR 방법 및 장치에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 단일파장으로 다중검출이 가능하도록 단일파장의 광원에서 방사되는 여기 광에 반응하여 동일 파장 대의 형광을 발산하는 인터칼레이터 타입(intercalator type) 형광물질과 프로브 타입(probe type) 형광물질을 혼합하여 사용하되, DNA 변성단계에서 프로브 타입 형광물질에서 발광하는 형광을 실시간으로 측정하여 목표 유전자의 증폭 산물을 정량하고, 용해곡선 측정단계에서 인터칼레이터 타입 형광물질에서 발광하는 형광이 온도의 증가에 따라 감소하는 추세를 보여주는 융해곡선(melting curve)의 융해온도(Tm)를 이용하여 목표 유전자 또는 내부대조 유전자의 검출 여부를 확인하여 PCR 공정 및 장치의 신뢰성을 검증할 수 있는 단일파장으로 다중검출이 가능한 실시간 PCR 방법 및 이를 위한 실시간 PCR 장치에 관한 것이다.

Description

단일파장으로 다중검출이 가능한 실시간 PCR 방법 및 이를 위한 실시간 PCR 장치{SYSTEM AND METHOD OF MULTIPLEX-DETECTING REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION USING SINGLE WAVELENGTH}
본 발명은 실시간 PCR 방법 및 장치에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 단일파장으로 다중검출이 가능하도록 단일파장의 광원에서 방사되는 여기 광에 반응하여 동일 파장 대의 형광을 발산하는 인터칼레이터 타입(intercalator type) 형광물질과 프로브 타입(probe type) 형광물질을 혼합하여 사용하되, DNA 변성단계에서 프로브 타입 형광물질에서 발광하는 형광을 실시간으로 측정하여 목표 유전자의 증폭 산물을 정량하고, 용해곡선 측정단계에서 인터칼레이터 타입 형광물질에서 발광하는 형광이 온도의 증가에 따라 감소하는 추세를 보여주는 융해곡선(melting curve)의 용해온도(Tm)를 이용하여 목표 유전자 또는 내부대조 유전자의 검출 여부를 확인하여 PCR 공정 및 장치의 신뢰성을 검증할 수 있는 단일파장으로 다중검출이 가능한 실시간 PCR 방법 및 이를 위한 실시간 PCR 장치에 관한 것이다.
PCR(Polymerase Chain Reaction: 중합효소 연쇄반응)은 핵산을 포함하는 유전물질을 반복적으로 가열 및 냉각하여 핵산의 특정 염기서열을 갖는 부위를 연쇄적으로 복제하여 그 측정 염기서열 부위를 갖는 핵산을 기하급수적으로 증폭하는 기술로서, 유전물질을 조작하여 실험하는 거의 모든 과정에 사용된다.
PCR 공정은 DNA 변성(Denaturation), 어닐링(Annealing) 및 DNA 합성(Extension) 단계로 이루어진다. 또한, 종래의 PCR 공정은 증폭 산물을 검출하기 위해 전기영동법을 사용한다. 그러나 전기영동법은 PCR 후의 증폭 산물을 분석하여 증폭된 부분의 크기에 관한 정보만을 얻을 수 있고, 증폭 부위의 염기 서열에 대한 추측만이 가능하다. 이 경우 증폭된 부위 길이에 유전정보 이외에 밴드의 특이성도 확인할 수 있지만 이러한 실험과정은 2~3일 정도 소요되며 특이성에 관한 확신을 갖기 위해 프로브 결합에 필요한 상동성 정도(stringency)를 여러 조건으로 조절하여야 하는 단점이 있다.
이러한 전기영동법의 단점을 보완하기 위해서 PCR의 각 사이클에서 나오는 시그널(형광)을 분석하여 시료 내에 존재하는 증폭 산물의 농도를 계산하고, 특이적 프로브를 사용함으로써 신속하고 정확하게 PCR 결과를 얻기 위한 기술이 소위, 실시간 중합효소 연쇄 반응(Real-time PCR)이다.
실시간 PCR은 특정한 파장의 광원에 반응하는 형광물질을 사용한다. 형광물질은 DNA 증폭의 매 주기마다 증폭 산물이 축적됨에 따라 비례하여 증가한다. 즉, DNA 증폭의 초기에는 형광의 증가가 감지되지 아니하지만 일정 횟수 이상의 증폭이 진행되면서 축적된 형광 량이 감지되기 시작한다. 주형 초기 량의 로그(log)값과 주형을 실시간 중합효소 연쇄 반응을 통하여 증폭할 때　해당하는 한계 주기 사이에는 직선적으로 비례하는 관계가 있다.
이러한 실시간 PCR 공정은, 도 1의 흐름도에서 보는 바와 같이, 증폭 반응이 진행되는 어닐링 단계나 합성단계에서 여기 광선(excitation light)을 조사하고 이로부터 발생하는 형광(emission light)을 검출하여 증폭 산물을 실시간으로 정량할 수 있다. 실시간 PCR에서 증폭 산물을 검출하기 위해서 일반적으로 ⅰ) 어떠한 이중가닥 DNA에라도 삽입되는 SYBR Green과 같은 비특이적 형광물질(intercalator type)을 사용하는 방법 또는 ⅱ) 목표 유전자를 정량하기 위한 상보서열을 가진 탐침(probe)의 결합 이후에만 검출이 가능한 형광 표지자로 표지된 올리고뉴클레오티드로 구성된 서열-특이적 DNA 탐침(probe type)을 사용하는 방법이 있다. 전자의 경우 다중분석이 가능하나 융해온도(Tm) 값의 편차가 큰 경우에만 제한적으로 사용될 수 있고, 후자의 경우 탐침으로 사용되는 형광염료를 달리할 경우, 동시에 여러 표적 유전자에 대한 다중검출이 가능하다.
인터칼레이터 타입 형광물질은, 도 2에서 보는 바와 같이, 단일 가닥 DNA(ssDNA)에는 결합하지 않고 프라이머 결합(annealing) 후 DNA가 합성(extension)되어 형성되는 이중나선 DNA(dsDNA)에 결합할 때 형광을 발광하게 된다. 따라서 인터칼레이터 타입 형광물질은 어닐링 또는 DNA 합성단계에서 형광을 측정하여야만 증폭 산물을 정량할 수 있다. 그런데 인터칼레이터 타입은 이중나선 DNA라면 모두 인식하여 결합하기 때문에 비특이적 증폭에 의한 잡신호가 발생하는 단점이 있다. 이를 보완하기 위해서 융해곡선(melting curve)을 분석한다. 즉, 융해곡선은, PCR 증폭이 끝난 후 마지막 DNA 변성단계 이후에 온도를 점차 올려서 증폭 산물의 열 변성에 따라 이중나선 DNA가 단일 가닥 DNA로 분리되면서 인터칼레이터 타입 형광물질의 형광 강도가 감소하는 추세를 표시하는 융해곡선을 분석하여 목표 유전자와 다른 비특이적인 유전자의 증폭을 확인하게 된다.
즉, 융해곡선을 그리면 이중나선 DNA의 50%가 단일 가닥 DNA로 변성되는 하나 이상의 융해온도(Tm)를 확인할 수 있다. 융해온도(Tm)는 염기서열의 길이나 배열에 따라 다른 온도를 나타내기 때문에 융해온도(Tm)를 통해 서로 다른 유전자의 증폭 산물을 구분할 수 있다. 다시 말해, 인터칼레이터 타입 형광물질을 사용하는 경우에는 융해온도(Tm) 값의 차이를 이용하여 다중검출이 가능하게 된다.
프로브 타입 형광물질은 도 3에서 보는 바와 같이, 목표 유전자의 염기서열에 결합하는 특이적 염기서열을 갖도록 제작된 프라이머가 포함된 것으로, 어닐링 단계에서 프라이머가 목표 유전자에 특이적으로 결합하지만 형광억제물질(quencher)에 의해 형광이 발현하지 못하고 있다가 DNA 합성단계에서 DNA 중합효소의 작용으로 주형 DNA에서 형광물질과 형광억제물질이 분리될 때 비로소 형광을 발광하게 되고 또 형광억제물질에서 분리된 형광물질은 계속하여 형광을 발광하게 된다. 이와 같이, 프로브 타입 형광물질은 DNA 합성단계뿐만 아니라 그 이후에도 형광을 계속 발광하기 때문에 일정 사이클 이후의 DNA 변성단계에서도 실시간 측정이 가능하다.
또한, 프로브 타입 형광물질은 탐침으로 사용되는 형광염료를 달리할 경우, 동시에 여러 표적 유전자에 대한 다중검출이 가능하다. 그러나 프로브 타입 형광물질을 사용하여 다중검출을 하기 위해서는 상이한 파장 대를 갖는 형광염료에 의해 표지된 여러 개의 프로브를 사용하여야 한다. 그런데 여러 개의 프로브를 사용할 경우, 프로브 간의 간섭이 있기 때문에 이를 방지하기 위한 프로브 디자인이 까다롭다. 따라서 다중검출이 가능한 프로브 타입 형광물질은 제작비용이 비싸다는 단점이 있다. 또한, 여러 형광염료에서 발광하는 형광을 구분하여 측정하기 위해서는 다수의 광원 모듈과 다수의 광검출 모듈이 구비되어야 하므로 PCR 기기의 구조가 복잡해지는 문제가 있다.
도 4에 도시된 바와 같이, 종래의 실시간 PCR 장치는, PCR칩(300)과, 히터블록(110), 히터블록의 온도를 정밀 제어하는 온도 제어부(200), PCR칩(300)에 입사광(40)을 제공하도록 배치된 광원(400) 및 상기 PCR칩(300)으로부터 방출되는 방사광(50)을 수용 및 검출하도록 배치된 것으로서 상기 PCR칩(300)으로부터 방출되는 방사광(50)을 검출하는 광 검출부(500)를 포함한다.
이러한 실시간 PCR 장치는, PCR 공정이 진행되는 동안에 다수의 채널(303)에서 발광하는 형광의 세기를 실시간으로 검출함으로써 목표 유전자의 증폭 여부 및 증폭 정도를 실시간으로 측정할 수 있다. 그러나 다중검출을 위해 여러 종류의 형광염료(Reporter)를 사용할 경우, 여러 형광염료에서 발광하는 파장을 구분하여 측정하기 위해서 다수의 광원(400)과 다수의 광 검출부(500)가 구비되어야 한다. 이에 따라 종래의 다중검출이 가능한 실시간 PCR 장치는 구조가 복잡하고 소형화가 어렵다는 문제점이 있었다.
이에 따라 최근에는 다중검출이 가능하면서도 단일파장의 광원에서 방사되는 여기 광에 반응하여 동일 파장 대의 형광을 발산하는 다수의 형광물질을 사용함으로써 실시간 PCR 장치의 구조를 단순하게 하여 소형화 및 경량화할 수 있는 단일파장으로 다중검출이 가능한 실시간 PCR 방법 및 이를 위한 실시간 PCR 장치의 개발이 요청되고 있다.
(0001) 대한민국 특허공개번호 10-2016-0134982 (공개일:2016.11.24) (0002) 대한민국 특허등록번호 10-0906749 (등록일:2009.07.01) (0001) 대한민국 특허공개번호 10-2012-0139206(공개일:2012.12.27)
본 발명은 이러한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 주된 목적은 단일파장의 광원에서 방사되는 여기 광에 반응하여 동일 파장 대의 형광을 발산하는 다수의 형광물질을 사용하여 다중검출이 가능하도록 함으로써 실시간 PCR 장치의 구조를 단순하게 하고 소형화 및 경량화할 수 있는 다중검출이 가능한 실시간 PCR 방법 및 이를 위한 실시간 PCR 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 지금까지 혼합하여 사용하지 않고 독자적으로 사용하여 왔던 인터칼레이터 타입 형광물질과 프로브 타입 형광물질을 혼합하여 사용함으로써 단일파장의 광원을 사용하여 다중검출이 가능하도록 함으로써 실시간 PCR 장치의 구조를 단순하게 하고 소형화 및 경량화할 수 있는 다중검출이 가능한 실시간 PCR 방법 및 이를 위한 실시간 PCR 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 인터칼레이터 타입 형광물질과 프로브 타입 형광물질을 혼합하여 사용함으로써 두 형광물질에서 발광하는 형광을 구분하여 측정하기 어려운 문제를 해결하기 위해서 DNA 변성단계에서 융해용도(Tm95)(예, 85~97℃) 이상으로 가열될 때 단독으로 나타나는 프로브 타입 형광물질의 형광을 측정하여 목표 유전자의 증폭 산물을 실시간으로 정량할 수 있도록 하는 단일파장으로 다중검출이 가능한 실시간 PCR 방법 및 이를 위한 실시간 PCR 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 비특이적으로 반응하는 인터칼레이터 타입은 융해곡선을 이용하여 목표 유전자 및/또는 내부대조 유전자의 검출 여부를 확인함으로써PCR 공정의 신뢰성을 검증할 수 있는 단일파장으로 다중검출이 가능한 실시간 PCR 방법 및 이를 위한 실시간 PCR 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 과제의 해결수단들로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위한 수단으로서, 본 발명에 따른 단일파장으로 다중검출이 가능한 실시간 PCR 방법은, DNA 변성(Denaturation), 어닐링(Annealing) 및 DNA 합성(Extension)단계를 반복적으로 실시하여 목표 유전자 및 내부대조 유전자를 증폭하고 다수의 형광물질에서 발광하는 형광을 측정하여 증폭 산물을 실시간으로 정량하는 다중검출이 가능한 실시간 PCR 방법에 있어서,
인터칼레이터 타입(intercalator type) 형광물질과 프로브 타입(probe type) 형광물질의 혼합물을 사용하여 다중검출이 가능하도록 하되, 상기 인터칼레이터 타입 형광물질과 프로브 타입 형광물질은 단일 파장 대의 광원에서 방사되는 여기 광에 반응하여 동일 파장 대의 형광을 발광하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 인터칼레이터 타입 형광물질은 SYBR Green I또는 EvaGree을 포함하고, 상기 프로브 타입 형광물질은 TaqMan probe을 포함한다.
상기 프로브 타입 형광물질에서 발광하는 형광을 DNA 변성단계에서 실시간으로 측정하여 프로브 타입 형광물질이 결합한 목표 유전자의 증폭 산물을 실시간으로 정량하되, 이중나선 DNA (dsDNA) 중 95% 이상이 단일 가닥 DNA(ssDNA)로 분리되는 융해온도(Tm95) 이상에서 형광을 측정하여 상기 인터칼레이터 타입 형광물질에서 발광하는 형광은 배제하고 상기 프로브 타입 형광물질에서 발광하는 형광만을 측정한다.
상기 융해온도(Tm95)는 이중나선 DNA(dsDNA) 중 95%가 단일 가닥 DNA(ssDNA)로 분리되는 온도로, 85~98℃ 이상이다.
상기 DNA 변성, 어닐링 및 DNA 합성단계를 반복적으로 수행하여 목표 유전자 및 내부대조 유전자를 증폭한 후, 온도를 점차로 증가시키면서 일정한 시간 간격으로 형광을 측정하여, 인터칼레이터 타입 형광물질에서 발광하는 형광의 강도가 온도의 증가에 따라 감소하는 추세를 나타내는 융해곡선(melting curve)을 도출하고 형광의 강도가 급격히 감소하는 융해온도(Tm50)를 이용하여 목표 유전자 또는 내부대조 유전자의 증폭 여부를 확인하여 PCR 공정 및 장치의 신뢰도를 검증한다.
상기 융해온도(Tm50)는 이중나선 DNA(dsDNA)의 50%가 단일 가닥 DNA(ssDNA)로 분리되는 온도이다.
본 발명의 단일파장으로 다중검출이 가능한 실시간 PCR 장치는, DNA 변성(Denaturation), 어닐링(Annealing) 및 DNA 합성(Extension)단계를 반복적으로 실시하여 목표 유전자와 내부대조 유전자를 증폭하고 형광물질에서 발광하는 형광을 측정하여 증폭 산물을 실시간으로 정량하는 실시간 PCR 장치에 있어서, 히터블록과; 상기 히터블록 위에 놓여 지고 내부에 다수의 채널이 구비된 PCR칩과; 상기 PCR칩의 일 측면에 설치되고 상기 PCR칩에 형성된 다수의 채널을 수평으로 관통하도록 단일 파장 대의 여기 광을 방사 하는 하나의 LED광원과; 상기 PCR칩의 상부에 설치되어 상기 PCR칩의 채널에서 발광하는 형광을 측정하는 하나의 디지털 카메라와; 상기 히터블록에 공기를 공급하는 송풍기와, 상기 히터블록, 송풍기, LED광원 및 디지털 카메라를 제어하는 제어부를 포함하되, 상기 제어부는, 상기 DNA 변성단계에서 상기 히터블록의 온도가 이중나선 DNA(dsDNA) 중 95% 이상이 단일 가닥 DNA(ssDNA)로 분리되는 융해온도(Tm95) 이상이 될 때, 상기 PCR칩의 채널에서 발광하는 형광을 측정하도록 상기 LED광원과 디지털 카메라를 제어하는 것을 특징으로 한다.
상기 제어부는, DNA 변성(Denaturation), 어닐링(Annealing) 및 DNA 합성(Extension) 단계를 반복적으로 실시하여 목표 유전자와 내부대조 유전자를 증폭한 후 마지막 DNA 변성단계 이후에 상기 히터블록의 온도를 60℃에서 98℃까지 점차로 상승시키면서 일정한 시간 간격으로 상기 PCR칩의 채널에서 발광하는 형광을 측정하여 온도의 증가에 따라 형광의 강도가 점차 감소하는 추세를 나타내는 융해곡선을 도출하고, 상기 융해곡선을 분석하여 이중나선 DNA(dsDNA)의 50%가 단일 가닥 DNA(ssDNA)로 분리되는 하나 이상의 융해온도(Tm50)를 이용하여 목표 유전자 또는 내부대조 유전자의 증폭 여부를 확인하여 PCR 공정 및 장치의 신뢰도를 검증한다.
또한, 본 발명의 단일파장으로 다중검출이 가능한 실시간 PCR 방법은, 히터블록과, 상기 히터블록 위에 놓여 지고 내부에 다수의 채널이 구비된 PCR칩과, 상기 PCR칩의 일 측면에 설치되고 상기 PCR칩에 형성된 다수의 채널을 수평으로 관통하도록 단일 파장 대의 여기 광을 방사 하는 하나의 LED광원과, 상기 PCR칩의 상부에 설치되어 상기 PCR칩의 채널에서 발광하는 형광을 측정하는 하나의 디지털 카메라와, 상기 히터블록에 공기를 공급하는 송풍기와, 상기 히터블록, 송풍기, LED광원 및 디지털 카메라를 제어하는 제어부를 포함하는 실시간 PCR 장치를 이용하여 목표 유전자와 내부대조 유전자를 증폭하는 실시간 PCR 방법에 있어서,
(a) 상기 PCR칩의 채널에 단일 파장 대의 광원에서 방사되는 여기 광에 반응하여 동일한 파장 대의 형광을 발광하는 인터칼레이터 타입 형광물질과 프로브 타입 형광물질을 혼합하여 이루어진 PCR 혼합액과, 목표 주형 유전자 및 내부대조 주형 유전자를 주입하고 상기 PCR칩에 주입하여 혼합하는 PCR 준비단계와;
(b) 상기 히터블록과 송풍기에 전원을 공급하여 DNA 변성단계, 어닐링 단계 및 DNA 합성단계를 미리 설정된 사이클만큼 반복하여 목표 유전자 및 내부대조 유전자를 증폭하되, 각 사이클의 DNA 변성단계에서 상기 LED광원과 디지털 카메라를 제어하여 프로브 타입 형광물질에서 발하는 형광만을 실시간으로 측정하여 목표 유전자의 증폭 산물을 실시간으로 정량하는 실시간 형광 측정단계와;
(c) 상기 DNA 변성단계, 어닐링 단계 및 DNA 합성단계를 설정된 사이클만큼 반복하여 목표 유전자와 내부대조 유전자를 증폭한 후, 마지막 DNA 변성단계 이후에 상기 히터블록의 온도를 점차로 증가시키면서 상기 LED광원 및 디지털 카메라를 제어하여 일정한 시간 간격으로 형광을 측정하여 인터칼레이터 타입 형광물질에서 발광하는 형광이 점차 감소하는 추세를 나타내는 융해곡선을 도출하는 융해곡선 측정단계;를 포함하되,
(d) 상기 (b) 단계에서는, 각 사이클의 DNA 변성단계에서 이중나선 DNA (dsDNA) 중 95% 이상이 단일 가닥 DNA(ssDNA)로 분리되는 융해온도(Tm95) 이상에서 프로브 타입 형광물질에서 발광하는 형광을 측정하고,
(e) 상기 (c) 단계에서는, 상기 융해곡선을 분석하여 이중나선 DNA(dsDNA)의 50%가 단일 가닥 DNA(ssDNA)로 분리되는 하나 이상의 융해온도(Tm50)를 이용하여 목표 유전자 또는 내부대조 유전자의 증폭 여부를 확인하여 PCR 공정이 정상적으로 수행되었는지를 검증하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 동일한 파장 대의 형광을 발산하는 인터칼레이터 타입 형광물질과 프로브 타입 형광물질을 혼합하여 사용함으로써 다중검출이 가능하도록 하되, 단일파장의 광원과 하나의 디지털 카메라를 이용하여 형광을 측정할 수 있도록 하여 실시간 PCR 장치의 구조를 단순하게 하고 소형화 및 경량화할 수 있는 효과가 있다.
본 발명은 또한, 동일한 파장 대의 형광을 발산하는 인터칼레이터 타입 형광물질과 프로브 타입 형광물질을 혼합하여 다중검출을 가능하도록 하되, 프로브 타입 형광물질은 DNA 변성단계에서 융해용도(Tm95)(예, 85~97℃) 이상으로 가열될 때 형광을 측정하여 인터칼레이터 타입 형광물질에서 발광하는 형광을 배제시킴으로써 목표 유전자의 증폭 산물을 실시간의 증폭할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 DNA 변성단계, 어닐링 단계 및 DNA 합성단계를 설정된 사이클만큼 반복하여 목표 유전자와 내부대조 유전자를 증폭한 후, 마지막 DNA 변성단계 이후에 상기 히터블록의 온도를 점차로 증가시키면서 일정한 시간 간격으로 형광을 측정하여 인터칼레이터 타입 형광물질에서 발광하는 형광이 점차 감소하는 추세를 측정하여 융해곡선을 도출하고, 이 융해곡선을 분석하여 이중나선 DNA(dsDNA)의 50%가 단일 가닥 DNA(ssDNA)로 분리되는 하나 이상의 융해온도(Tm50)를 이용하여 목표 유전자 또는 내부대조 유전자의 증폭 여부를 확인하여 PCR 공정이 정상적으로 수행되었는지를 검증할 수 있는 효과가 있다.
아울러 본 발명은 인터칼레이터 타입 형광물질과 프로브 타입 형광물질을 혼합하여 사용함으로써 형광물질의 설계가 용이하게 하고 가격이 저렴하며 취급이 용이한 효과가 있다.
도 1은 종래 기술에 실시간 PCR 방법의 일 예를 보여주는 흐름도,
도 2는 종래의 실시간 PCR 방법에서 사용하는 인터칼레이터 타입 형광물질의 발광작용을 보여주는 개념도,
도 3은 종래의 실시간 PCR 방법에서 사용하는 프로브 타입 형광물질의 발광작용을 보여주는 개념도,
도 4는 종래 기술에 따른 실시간 PCR 장치의 일 예를 보여주는 개략적인 구성도,
도 5는 본 발명에 따른 실시간 PCR 방법에서 사용하는 인터칼레이터 타입 형광물질과 프로브 타입 형광물질의 발광작용을 보여주는 개념도,
도 6은 본 발명에 따른 증폭곡선의 일 예를 보여주는 그래프.
도 7은 본 발명에 따른 실시간 PCR 방법의 가열 및 냉각 사이클로서, DNA 증폭단계와 융해곡선 측정단계를 보여주는 그래프,
도 8은 본 발명에 따른 융해곡선의 일 예를 보여주는 그래프.
도 9는 도 8에 도시된 융해곡선을 변형한 융해점곡선(melting peak graph)의 일 예를 보여주는 그래프,
도 10은 본 발명에 따른 단일파장으로 다중검출이 가능한 실시간 PCR 장치의 바람직한 실시 예를 보여주는 개략적인 구성도,
도 11은 본 발명에 따른 실시간 PCR 장치를 이용한 단일파장으로 다중검출이 가능한 실시간 PCR 방법을 보여주는 흐름도이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술 되는 실시 예를 통해 설명될 것이다. 그러나 본 발명은 여기에서 설명되는 실시 예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 단지, 본 실시 예는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 기술적 사상을 용이하게 실시할 수 있을 정도로 상세히 설명하기 위하여 제공되는 것이다. 또한, 본 발명의 실시 예를 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 실시 예에 대한 이해를 방해한다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다.
-용어의 정의-
먼저, 본 특허 명세서에서 사용되는 용어를 정의한다.
본 특허 명세서에서 사용되는 용어 "PCR(polymerase chain reaction)" 또는 "중합효소 연쇄반응"은 열 안정성 DNA 중합효소를 이용하여 특정 표적 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. PCR에는 DNA 중합효소 외에 표적 핵산 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드인 프라이머(포워드 프라이머, 리버스 프라이머), 디옥시뉴클레오티드트리포스페이트 혼합물(dNTP mixture), Mg2+ 등의 2가 이온을 포함하는 반응 혼합물이 사용된다. 상기 PCR 반응에 의해 생성된 DNA 분자를 본 특허 명세서에서는 "증폭 산물"이라고 지칭하였다.
본 특허 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머(primer)"는 PCR 반응의 개시를 위해 사용되는 것으로, 주형 DNA에 상보적으로 혼성화는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. PCR 반응을 위한 프라이머는 증폭되는 핵산분자의 유전자 코드 진행방향과 동일한 센스 가닥으로부터 선택되는 포워드 프라이머(또는 센스 프라이머) 및 상기 센스 가닥에 상보적인 안티센스 가닥으로부터 선택되는 리버스 프라이머(또는 안티센스 프라이머)의 쌍이 사용된다.
본 특허 명세서에서 사용되는 용어 "실시간 PCR 장치"는 특정 염기서열을 갖는 핵산을 증폭함과 아울러 PCR 산물의 발생 유무 및 정도를 실시간으로 측정 및 분석할 수 있다. 또한, '멀티플렉스 PCR 장치'는 다양한 핵산을 증폭하는 멀티플렉스 PCR(Multiplex Polymerase Chain Reaction)을 수행하기 위한 장치로서, 멀티플렉스 PCR칩에 PCR 반응에 필요한 시약뿐만 아니라 형광물질이 첨가되고, PCR 산물의 생성에 따라 형광물질이 특정 파장의 광에 의해 발광함으로써 측정 및 분석 가능한 광신호를 유발하게 된다.
본 특허 명세서에서 사용되는 용어 'PCR 공정'은, 특정 염기서열을 갖는 DNA(deoxyribonucleic acid)를 증폭하기 위해, 이중나선 DNA를 포함하는 시료 용액을 특정 온도, 예를 들어 약 95℃로 가열하여 이중나선 DNA를 단일 가닥 DNA로 분리하는 DNA 변성단계(denaturing step), 시료 용액에 증폭하고자 하는 특정 염기서열과 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프라이머를 제공하고, 분리된 단일 가닥 DNA와 함께 특정 온도, 예를 들어 55℃로 냉각하여 단일 가닥 DNA의 특정 염기서열에 프라이머를 결합시켜 부분적인 DNA-프라이머 복합체를 형성하는 어닐링단계(annealing step), 및 어닐링 단계 이후 시료 용액을 적정 온도, 예를 들어 72℃로 유지하여 DNA 중합효소(polymerase)에 의해 부분적인 DNA-프라이머 복합체의 프라이머를 기초로 이중나선 DNA를 형성하는 DNA 합성단계(extension step)를 수행하고, 3단계를 예를 들어, 20회 내지 40회로 반복함으로써 특정 염기서열을 갖는 DNA를 기하급수적으로 증폭할 수 있다. 이때, 경우에 따라, PCR 장치는 어닐링 단계와 합성단계를 동시에 수행할 수 있다.
본 특허 명세서에서 사용되는 용어 'PCR 혼합액'은 증폭하고자 하는 주형이 되는 유전물질과, 프라이머(Primer), DNA 중합효소(Taq polymerase or DNA polymerase), dNTP, 완충액(buffer solution), 염화마그네슘(MgCl2), 형광염료, 프로브 등을 포함한다. 여기서, 주형이 되는 유전물질로는 보통 플라스미드 DNA, genomic DNA, cDNA, total RNA등을 사용하고, 프라이머는 목표 유전자의 특정 부위 양끝에 결합할 수 있는 25~40bp 길이의 프라이머 한 쌍으로 이루어진다. 또한, DNA 중합효소는 90℃ 이상의 고온에서도 활성을 잃지 않는 효소를 사용한다. dNTP는 합성의 재료인 뉴크레오티드로서 dATP, dCTP, dGTP, dTTP로 구성된다. 또한, DNA 중합효소가 작용하고 dNTP와 프라이머가 결합하기 위하여 Mg2+가 필요하다. 완충액은 중합효소의 활성을 위해 필요하다.
본 특허 명세서에서 사용되는 용어 '융해'는 온도의 증가에 따라 이중나선 DNA(dsDNA)가 단일 가닥 DNA(ssDNA)로 분리되어 형광의 강도가 시간에 따라 변하는데, 이 관계를 나타내는 그래프가 융해곡선(mating curve)이고, 중간점을 Tm(융해온도)이라 부른다. 특히, 본 특허 명세서에서는 융해온도(Tm)를 Tm50과 Tm95로 구분되는데, 융해온도(Tm50)는 이중나선 DNA(dsDNA)의 50%가 단일 가닥 DNA(ssDNA)로 분리되는 종래의 융해온도(Tm)와 같은 개념이다. 반면 융해온도(Tm95)는 이중나선 DNA (dsDNA) 중 95% 이상이 단일 가닥 DNA(ssDNA)로 분리되는 융해온도로서 종래의 융해온도(Tm)와 다른 것이다. 즉, 융해온도(Tm50)는 형광이 급격히 감소하는 온도이고, 융해온도(Tm95)는 인터칼레이터 타입 형광물질에서 발광하는 형광이 거의 검출되지 않는 온도이다.
-발명의 상세한 설명-
이하, 첨부 도면을 참조하여, 본 발명에 따른 단일파장으로 다중검출이 가능한 실시간 PCR 방법 및 장치에 대해서 상세히 설명한다.
본 발명의 단일파장으로 다중검출이 가능한 실시간 PCR 방법(이하 '단일파장 실시간 PCR 방법'이라 함)은, 다수의 형광물질을 사용하여 다중검출이 가능하도록 하되, 단일파장의 광원을 사용하여 실시간 PCR 장치의 구조를 단순하게 하고 소형화 및 경량화할 수 있도록 하는 것이다.
이를 위해서, 본 발명은, 도 5에서 보는 바와 같이, 인터칼레이터 타입(intercalator type) 형광물질과 프로브 타입(probe type) 형광물질을 혼합하여 사용하되, 두 형광물질에서 발광하는 형광을 구분하여 측정할 수 있도록 DNA 변성단계에서 융해용도(Tm95)(예, 85~97℃) 이상으로 온도가 올라갈 때 프로브 타입 형광물질에서 발광하는 형광을 측정하여 목표 유전자의 증폭 산물을 실시간으로 정량할 수 있도록 하는 것이다.
즉, 본 발명은 인터칼레이터 타입 형광물질과 프로브 타입 형광물질의 혼합물을 사용함으로써 두 가지 이상의 유전자를 검출할 수 있도록 한다. 다시 말해, 다중검출을 위해서는 두 가지 이상의 유전자의 증폭 산물을 표지할 수 있도록 두 가지 이상의 형광물질을 사용하여야 한다. 이를 위해 종래에는 형광염료를 달리하는 여러 가지 프로브 타입 형광물질을 주로 사용하였다. 그러나 여러 개의 프로브 타입 형광물질을 사용할 경우, 프로브 간의 간섭이 예상되기 때문에 이를 방지하기 위한 프로브의 디자인이 까다로운 문제가 있었다. 따라서 다중검출이 가능한 프로브 타입 형광물질은 제작비용이 비싸고 취급이 어렵다는 단점이 있었다. 또한, 다중검출을 위해서는 여러 형광염료에서 발광하는 형광을 구분하여 측정할 수 있도록 다수의 광원 모듈과 다수의 광검출 모듈이 구비되어야 하기 때문에 PCR 기기의 구조가 복잡해지는 문제가 있었다.
한편, 인터칼레이터 타입 형광물질은 모든 이중나선 DNA에 결합하는 비특이적 특성으로 기본적으로 다중검출이 어렵고, 융해곡선(melting curve)의 융해온도(Tm)를 이용할 경우만 다중검출이 가능하다는 한계가 있었다. 그리고 융해온도를 이용하여 다중검출을 하는 경우에도 융해온도(Tm) 간의 차이가 큰 경우에만 제한적으로 가능하다.
반면에 본 발명은 인터칼레이터 타입(intercalator type) 형광물질과 프로브 타입(probe type) 형광물질의 혼합물을 이용하여 다중검출을 수행하는 것이다. 즉, 인터칼레이터 타입 형광물질은 유전자 증폭과정에서 이중나선 DNA에 결합할 때 형광을 발광하는 일련의 형광물질이고, 프로브 타입 형광물질은 유전자 증폭과정에서 이중나선 DNA에 결합한 후 형광억제물질(quencher)과 형광물질(reporter)이 분리된 이후에 형광을 발광하는 일련의 형광물질이다.
바람직하게, 인터칼레이터 타입 형광물질은 SYBR Green I, SYBR Gold, YoYo, EvaGreen 및 LCGreen 등을 포함하고, 프로브 타입 형광물질은 Taqman probe(Fluorogeninc 5' nuclease assay), Molecular beacon 등을 포함한다. 이와 같이 프로브 타입 형광물질과 인터칼레이터 타입 형광물질을 혼합하여 사용하면 다수의 프로브 타입 형광물질을 사용하는 것보다 비용이 저렴하고 취급이 용이하다. 또한, 프로브 타입 형광물질과 인터칼레이터 타입 형광물질 간에는 간섭이 없기 때문에 설계 및 취급이 용이하여 사용이 편리하다.
그러나 프로브 타입 형광물질과 인터칼레이터 타입 형광물질을 혼합하여 사용할 경우, DNA 합성과정 중 어닐링단계 및 합성단계에서 형광을 측정하면, 인터칼레이터 타입 형광물질에서 발광하는 형광뿐만 아니라 프로브 타입 형광물질에서 발광하는 형광이 모두 측정되기 때문에 두 형광물질을 구분할 수 없고 결국 두 형광물질과 결합한 유전자의 증폭 산물을 구분하여 검출할 수가 없다. 이러한 이유로 현재까지 인터칼레이터 타입 형광물질과 프로브 타입 형광물질을 혼합하여 사용하지 않았다.
본 발명은 이러한 문제를 해결하기 위해서, 프로브 타입 형광물질과 인터칼레이터 타입 형광물질을 혼합하여 사용하되, DNA 변성단계에서 인터칼레이터 타입 형광물질에서 발광하는 형광의 세기가 온도의 증가에 따라 점차 감소하는 특성을 이용한다. 즉, DNA 변성단계에서 일정 온도이상에서 발광하는 형광을 측정하면 인터칼레이터 타입 형광물질은 형광이 발광하지 않기 때문에 프로브 타입 형광물질에서 발광하는 형광만을 분리하여 측정함으로써 프로브 타입 형광물질과 특이적으로 결합하는 목표 유전자의 증폭 산물을 실시간으로 정량할 수 있다는 원리에 기초하는 것이다.
또한, 본 발명은 인터칼레이터 타입 형광물질과 프로브 타입 형광물질을 적절히 선택하여 조합하면, 단일 파장 대의 광원에서 방사되는 여기 광에 반응하여 동일한 파장 대의 형광을 발광할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 사용하는 SYBR Green I과 TaqMan probe는 동일 파장 대의 형광을 발산한다. 즉, SYBR Green I의 여기 파장은 497nm이고, 방사 파장은 520nm이다. TaqMan probe는 형광염료로서 6-FAM을 사용하는데, 6-FAM의 여기 파장은 494nm이고 방사 파장은 520nm이다. 이와 같이, 단일 파장 대의 광원에서 방사되는 여기 광에 반응하여 동일한 파장 대의 형광을 발광하는 인터칼레이터 타입 형광물질과 프로브 타입 형광물질을 적절히 선택하여 혼합하면, 하나의 광원과 하나의 디지털 카메라를 이용하여 인터칼레이터 타입 형광물질과 프로브 타입 형광물질에서 발광하는 형광을 모두 측정할 수 있기 때문에 PCR 장치의 구조를 단순하게 하고 소형화 및 경량화하며 측정시간을 단축할 수 있다.
도 5에서 보는 바와 같이, 인터칼레이터 타입 형광물질은 이중나선 DNA에 결합한 때만 형광을 발하기 때문에 어닐링 단계와 DNA 합성단계에서 형광이 검출된다. 그러나 인터칼레이터 타입 형광물질은 DNA 변성단계에 진입한 후 온도가 일정 이상으로 상승하면 이중나선 DNA가 단일 가닥 DNA로 분리되면 인터칼레이터 타입 형광물질이 유전물질로부터 분리되어 더 이상 형광을 발광하지 않게 된다.
반면에 프로브 타입 형광물질은 이중나선 DNA에 결합한 후 가수분해효소작용으로 목표 주형 유전자에 결합한 프로브가 가수분해되어 형광억제물질(quencher)과 형광물질(reporter)이 분리될 때 형광이 발광한다. 그리고 DNA 변성단계에서 이중나선 DNA가 단일 가닥 DNA로 분리되어도 계속하여 형광이 발광한다. 따라서 프로브 타입 형광물질은 DNA 증폭단계의 초기를 제외하고는 모든 단계에서 형광의 측정이 가능하다.
이와 같이, 프로브 타입 형광물질은 DNA 증폭과정의 모든 단계에서 형광이 발광 되지만 인터칼레이터 타입 형광물질은 DNA 변성단계에서 온도의 증가에 따라 점차 형광의 강도가 약해지기 때문에 DNA 변성단계에서 형광을 측정함으로써 인터칼레이터 타입 형광물질의 형광을 배제시키고 프로브 타입 형광물질에서 발광하는 형광만을 분리하여 측정할 수 있게 된다.
즉, DNA 변성단계에서 온도가 상승함에 따라 이중나선 DNA(dsDNA)가 단일 가닥 DNA(ssDNA)로 점차 분리된다. 따라서 이중나선 DNA 중 95% 이상이 단일 가닥 DNA로 분리되는 융해온도(Tm95) 이상에서 형광을 측정하면 인터칼레이터 타입 형광물질에서 발광하는 형광은 배제되고 프로브 타입 형광물질에서 발광하는 형광만을 실시간으로 측정할 수 있게 된다.
이와 같이, 본 발명은 동일 파장 대의 인터칼레이터 타입 형광물질과 프로브 타입 형광물질을 사용하되, DNA 변성단계에서 프로브 타입 형광물질에서 발광하는 형광을 측정하여 목표 유전자의 증폭 산물을 실시간으로 정량할 수 있다.
또한, 본 발명은 어닐링 또는 DNA 합성단계에서는 형광을 측정하면, 프로브 타입 형광물질과 인터칼레이터 타입 형광물질에서 발광하는 형광을 모두 측정하여 증폭곡선을 도출할 수 있다. 즉, 프로브 타입 형광물질과 인터칼레이터 타입 형광물질은 단일 파장 대의 광원에서 방사되는 여기 광에 반응하여 동일한 파장 대의 형광을 발광하기 때문에 어닐링 또는 DNA 합성단계에서 프로브 타입 형광물질과 인터칼레이터 타입 형광물질에서 발광하는 형광을 모두 측정할 수 있다. 도 6은 사이클의 증가에 따라 증가하는 형광의 세기를 보여주는 증폭곡선이다.
이와 같이, 본 발명에 따른 프로브 타입 형광물질은 목표 유전자에 대한 특이성이 우수하기 때문에 목표 유전자의 증폭 산물을 정량하는데 사용된다. 반면에 인터칼레이터 타입 형광물질은 모든 유전자에 결합하는 비특이적인 특성으로 인해 내부대조 유전자의 증폭 산물을 정량하거나 융해온도(Tm)를 이용하여 PCR 공정의 신뢰성을 검증하는데 사용된다. 즉, 단일광원으로 목표 유전자를 정량하는 종래의 PCR 공정 및 장치는 PCR 공정의 신뢰성을 검증할 수 없었다. 예를 들어, 목표 유전자가 검출되지 않은 경우 실제로 시료에 목표 유전자가 없는 것인지 PCR 증폭과정에 잘못이 있어서 목표 유전자가 검출되지 않은 것인지 확인할 수 없었다.
본 발명은 이러한 문제를 해결하기 위해서 인터칼레이터 타입 형광물질을 통해 내부대조 유전자의 증폭 산물을 정량하여 PCR 공정의 신뢰성을 검증할 수 있다. 즉, 단일광원으로 목표 유전자와 내부대조 유전자를 모두 정량하여 PCR 공정의 신뢰성을 검증한다. 예를 들어, 목표 유전자는 검출되지 않았으나 내부대조 유전자가 정상적으로 검출된 경우라면 PCR 증폭과정에는 잘못이 없는 것이어서 실제 시료에 목표 유전자가 없다는 것을 검증할 수 있다.
도 7에서 보는 바와 같이, 이러한 검증은 PCR 증폭단계의 이후에 실행되는 융해곡선 측정단계에서 실현될 수 있다. 즉, DNA 변성단계, 어닐링 단계 및 DNA 합성단계를 설정된 사이클만큼 반복하여 목표 유전자와 내부대조 유전자를 증폭한 후, 마지막 DNA 변성단계 이후에 온도를 점차로 증가시키면서 일정한 시간 간격으로 형광을 측정하면, 인터칼레이터 타입 형광물질에서 발광하는 형광이 점차 감소하는 추세를 나타내는 융해곡선을 도출할 수 있다.
도 8에서 보는 바와 같이, 융해곡선은 온도의 증가에 따라 형광의 강도가 일정한 패턴으로 감소하는 것을 나타낸다. 또한, 융해곡선은 형광의 강도가 급격히 감소하는 융해온도(Tm)를 보여준다. 그리고 두 가지 이상의 유전자가 포함된 경우 2개 이상의 융해온도가 나타나게 된다. 즉, 용해온도(Tm50)는 이중나선 DNA(dsDNA)의 50%가 단일 가닥 DNA(ssDNA)로 분리되는 온도를 말한다. 이와 같이, 단일 가닥 DNA가 증가하면 인터칼레이터 타입 형광물질에서 발광하는 형광이 급격히 감소하게 되기 때문에 전체적으로 형광의 강도가 온도에 따라 감소하는 추세를 보이게 된다. 그리고 도 9는 융해곡선을 변형한 융해점곡선으로서, 융해온도(Tm)를 더욱 명확히 나타내 준다.
그런데 이러한 융해온도(Tm50 )는 인터칼레이터 타입 형광물질이 결합하는 DNA의 염기서열의 길이, 염기서열의 차이, G+C 함량(G+C content) 등에 따라 다르게 나타난다. 즉, 유전물질의 종류에 따라 이중나선 DNA가 단일 가닥 DNA로 분리되는 속도와 양상이 다르기 때문이다. 예를 들어, 염기서열의 길이가 서로 다르거나 길이가 같더라고 염기서열이 다르고, 특히 G+C 함량에 따라 서로 다른 융해온도를 나타낸다. 이에 따라서 시료에 하나 이상의 유전자 주형이 존재하거나 증폭과정에서 비특이적인 증폭이 일어나는 경우에는 서로 다른 융해온도(Tm50)가 나타나게 된다. 그러므로 융해곡선에서 나타나는 융해온도(Tm50 )를 이용하면, 목표 유전자, 내부대조 유전자 및 비특이적으로 증폭된 유전자 등을 구분할 수 있게 된다.
이와 같이 본 발명은 융해곡선 측정단계에서 측정되는 융해온도(Tm50 )를 이용하여 실시간 PCR 공정이 제대로 수행된 것인지를 검증할 수 있다. 즉, 실시간 PCR 공정은 사용되는 프라이머와 반응조건 등에 의해 결정되는데, 프라이머가 잘 디자인되고 반응조건이 잘 세팅된 경우라면 목표 유전자 또는 내부대조 유전자의 증폭 산물만 증폭되어야 한다. 그러나 실제로는 목표 유전자 또는 내부대조 유전자의 증폭 산물 외에 프라이머 타이머 등과 같이 비특이적으로 증폭된 증폭 산물이 나타나기도 한다. 또한, 목표 유전자의 증폭 산물이 검출되지 않더라도 내부대조 유전자의 증폭 산물이 정상적으로 검출된 경우라면 목표 유전자의 검출 여부에 관계없이 PCR 공정이 제대로 수행된 것으로 판단할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 단일파장 실시간 PCR 방법은, 첫째, 인터칼레이터 타입 형광물질과 프로브 타입 형광물질을 혼합하여 다중검출이 가능하다. 둘째, 본 발명은 인터칼레이터 타입 형광물질과 프로브 타입 형광물질을 혼합하여 사용하되, 단일 파장 대의 광원에서 방사되는 여기 광에 반응하여 동일한 파장 대의 형광을 발산하는 인터칼레이터 타입 형광물질과 프로브 타입 형광물질을 선택하여 사용함으로써 실시간 PCR 장치의 구조를 단순하게 하고 소형화 및 경량화한다. 셋째, 본 발명은 DNA 변성단계에서 이중나선 DNA 중 95% 이상이 단일 가닥 DNA로 분리되는 융해온도(Tm95) 이상에서 형광을 측정함으로써 인터칼레이터 타입 형광물질에서 발광하는 형광을 배제하고 프로브 타입 형광물질에서 발광하는 형광만을 측정하여 프로브 타입 형광물질이 특이적으로 결합하는 목표 유전자를 실시간으로 정량할 수 있다. 넷째, 본 발명은 DNA 변성단계, 어닐링단계 및 DNA 합성단계를 반복적으로 실시하여 목표 유전자와 내부대조 유전자를 증폭한 후 마지막 DNA 변성단계 이후에 온도를 점차 높이면서 일정한 시간 간격으로 형광을 측정하는 용해곡선 측정단계를 통해서 인터칼레이터 타입 형광물질이 온도의 증가에 따라 감소하는 추세를 나타내는 융해곡선을 도출하고 이 융해곡선을 분석하여 목표 유전자 또는 내부대조 유전자의 증폭 여부를 확인하여 실시간 PCR 공정 및 장치의 신뢰성을 검증할 수 있다.
이어, 도 10은 본 발명에 따른 단일파장으로 다중검출이 가능한 실시간 PCR 장치의 일 실시 예를 보여주는 개략적인 구성도이다.
도시된 바와 같이, 본 실시 예에 따른 단일파장으로 다중검출이 가능한 실시간 PCR 장치(이하 '단일파장 실시간 PCR 장치'라 함)(1)는, 크게 히터블록(10)과, 상기 히터블록(10) 위에 놓여 지고 내부에 다수의 채널이 구비된 PCR칩(20)과, 상기 PCR칩(20)의 일 측면에 설치되고 상기 PCR칩(20)에 형성된 다수의 채널을 수평방향으로 관통하도록 단일파장의 여기 광을 방사 하는 하나의 LED광원(30)과, 상기 PCR칩(20)의 상부에 설치되고 상기 PCR칩(20)의 각 채널에서 방사되는 형광을 측정할 수 있도록 설치된 하나의 디지털 카메라(40)를 포함한다.
즉, 본 발명의 단일파장 실시간 PCR 장치(1)는 하나의 LED광원(30)과 하나의 디지털 카메라(40)를 사용하여 적어도 두 개 이상의 유전자를 검출할 수 있도록 하는 것이다. 또한, 본 발명은 상기 히터블록(10), LED광원(30) 및 디지털 카메라(40)에 전원을 공급하기 위한 전원부(도시되지 않음)와, 상기 히터블록(10)에 공기를 공급하여 냉각하기 위한 송풍기(50)와, 상기 히터블록(10), 디지털 카메라(40) 및 송풍기(50)를 제어할 수 있도록 전기적으로 연결되는 제어부(60)를 더 포함한다. 그리고 제어부(60)에는 타이머가 구비될 수 있다.
본 실시 예에 따른 단일파장 실시간 PCR 장치(1)는, 단일파장의 여기 광을 방사 하는 하나의 LED광원(30)을 구비된다. 이를 위해서, 상기 PCR 칩(20)의 채널에는 단일 파장 대의 광원에서 방사되는 여기 광에 반응하여 동일한 파장 대의 형광을 발산하는 인터칼레이터 타입 형광물질과 프로브 타입 형광물질이 주입된다. 예를 들어, 인터칼레이터 타입 형광물질은 SYBR Green I이고 프로브 타입 형광물질은 TaqMan probe이다. 이때, SYBR Green I과 TaqMan probe는 494nm의 여기 광을 흡수(Excitation max)하고 520nm의 단일파장의 형광을 발광한다. 이와 같이, 동일 파장 대의 광원에서 방사되는 여기 광에 반응하여 동일한 파장 대의 형광을 발산하는 인터칼레이터 타입 형광물질과 프로브 타입 형광물질을 사용함으로써 하나의 광원(30)과 하나의 디지털 카메라(40)만을 사용하여 목표 유전자와 내부대조 유전자의 목표 산물을 정량할 수 있다.
바람직하게, 상기 제어부(60)는, DNA 변성단계에서 상기 히터블록(10)에 전원을 공급하여 온도를 올려서 이중나선 DNA가 단일 가닥 DNA로 분리되도록 한다. 그리고 상기 제어부(60)는 DNA 변성단계에서 이중나선 DNA 중 95% 이상이 단일 가닥 DNA로 분리되는 융해온도(Tm95)에 이르면, 디지털 카메라(40)를 제어하여 PCR칩(20)의 다수의 채널에서 발광하는 형광을 측정하도록 한다. 이때, 융해온도(Tm95)는 85~98℃이다. 이러한 융해온도(Tm95)는 유전물질의 종류에 따라 계산하여 미리 설정된다. 즉, 히터블록(10)이 85~98℃ 이상으로 가열될 때 형광을 실시간으로 측정함으로써 인터칼레이터 타입 형광물질에서 발광하는 형광은 배제하고 프로브 타입 형광물질에서 발광하는 형광만을 측정하여 프로브 타입 형광물질과 결합하는 목표 유전자를 실시간으로 정량할 수 있게 된다.
또한, 상기 제어부(60)는 어닐링 또는 DNA 합성단계에서 LED광원(30)과 디지털 카메라(40)를 제어하여 PCR칩(20)의 다수의 채널에서 방사되는 인터칼레이터 타입 형광물질과 프로브 타입 형광물질에서 발광하는 형광을 측정할 수 있다. 또한, 상기 제어부(60)는 목표 유전자와 내부대조 유전자를 증폭한 후, 융해곡선을 도출하기 위해서, 히터블록(10), LED광원(30)과 디지털 카메라(40)를 제어하여, 마지막 DNA 변성단계 이후에 온도를 점차 증가시키면서 일정한 시간 간격으로 형광을 측정하여 융해곡선(Melting curve)을 도출한다. 즉, 마지막 DNA 변성단계 이후에 온도를 서서히 증가시키면 이중나선 DNA가 단일 가닥 DNA로 분리되어 인터칼레이터 타입 형광물질에서 발광하는 형광의 강도가 점차 감소하게 된다. 그리고 융해곡선을 변형한 융해점곡선(Melting peak graph)을 분석하면, 형광이 급격히 감소하는 하나 이상의 융해온도(Tm50)를 확인할 수 있다. 그리고 상기 제어부(60)는 하나 이상의 융해온도(Tm50)를 이용하여 실시간 PCR 반응이 성공적으로 이루어진 것인지를 검증할 수 있다. 이를 위해서 상기 제어부(60)에는 융해곡선, 융해점곡선을 도출하기 위한 프로그램과 융해온도의 차이 등을 분석할 수 있는 소프트웨어가 구비될 수 있다.
이하에서는 본 발명에 따른 단일파장 실시간 PCR 장치를 이용한 단일파장 실시간 PCR 방법에 대해서 설명한다.
도 11에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 단일파장 실시간 PCR 장치를 이용한 단일파장 실시간 PCR 방법(이하 '단일파장 실시간 PCR 방법'이라 함)은, 크게 PCR 준비 단계(S100), DNA 증폭단계(S200), 융해곡선 측정단계(S300), PCR 종료단계(S400)를 포함한다.
그리고 상기 DNA 증폭단계(S200)는, DNA 변성단계(S210), 어닐링 단계(S220), DNA 합성단계(S230)가 포함된다. 상기 DNA 변성단계(S210), 어닐링 단계(S220) 및 DNA 합성단계(S230)는 미리 정해진 사이클만큼 반복하여 실행된다.
먼저, PCR 준비단계(S100)는, 동일 파장 대를 갖는 인터칼레이터 타입 형광물질과 프로브 타입 형광물질을 포함하는 PCR 혼합액을 준비한다. 예를 들어, 인터칼레이터 타입 형광물질은 494nm의 여기 광을 흡수하고 520nm의 광을 발산하는 SYBR Green I 또는 Evagreen일 수 있다. 프로브 타입 형광물질은 94nm의 여기 광을 흡수하고 520nm의 광을 발산하는 TaqMan probe일 수 있다. 또한, PCR 혼합액에는 두 종류의 프라이머(Primer), DNA 중합효소(Taq polymerase or DNA polymerase), dNTPs(디옥시뉴클레오티드혼합물), 완충액(buffer solution), 염화마그네슘(MgCl2), 프로브 등이 더 포함된다. 또한, 상기 PCR 혼합액에는 목표 주형 유전자, 내부대조 주형 유전자가 포함된다. 이어 준비된 PCR 혼합물을 PCR칩(20)에 구비된 다수의 채널에 주입한다.
여기서 목표 주형 유전자와 내부대조 주형 유전자가 PCR 혼합액에 포함된 것으로 설명하였으나 PCR칩(20)의 각 채널에 PCR 혼합액과 별도로 목표 주형 유전자 및 내부대조 주형 유전자를 주입할 수 있다. 이때, 주형이 되는 유전자로는 보통 플라스미드 DNA, genomic DNA, cDNA, total RNA등을 사용하고, 프라이머(Primer)는 목표 유전자의 특정 부위 양끝에 결합할 수 있는 25~40bp 길이의 프라이머 한 쌍으로 이루어진다. 그리고 DNA 중합효소(polymerase)는 90℃ 이상의 고온에서도 활성을 잃지 않는 것을 사용한다. dNTPs(디옥시뉴클레오티드트리포스페이트 혼합물)는 합성의 재료인 뉴크레오티드로서 dATP, dCTP, dGTP, dTTP로 구성된다. 또한, DNA 중합효소가 원활하게 작용하고 dNTP와 프라이머가 결합하기 위하여 Mg2 +가 필요하다. 또한, 완충액(buffer)은 중합효소의 활성을 위해 필요하다. 그러나 본 발명의 PCR 혼합액은 이러한 것으로 한정되는 것은 아니다.
이어, DNA 증폭단계(S200)는, 히터블록(10)의 상면에 PCR 혼합액이 주입된 PCR칩(20)을 오려놓은 후, 히터블록(10)과 송풍기(50)로 공급되는 전원을 선택적으로 제어함으로써 DNA 변성단계(S210), 어닐링단계(S220), DNA 합성단계(S230)를 미리 설정된 사이클만큼(예30~40 사이클) 반복하여 목표 유전자와 내부대조 유전자를 증폭한다.
구체적으로, DNA 변성단계(S210)는, 히터블록(10)에 전원을 공급하여 온도를 높여 이중나선 DNA를 단일 가닥 DNA로 분리시킨다. 즉, 온도를 가하면 이중나선 DNA이 단일 가닥 DNA로 분리된다. 예를 들어 DNA 변성단계는 약 93~95℃에서 약 1분간 진행된다. 이어, 어닐링 단계(S220)는, 송풍기(50)에 전원을 공급하여 히터블록(10)을 냉각한다. 그러면 두 종류의 프라이머(Primer)가 단일 가닥의 주형DNA에 상보적 염기순서에 따라 각각 결합한다. 즉, 온도를 약 48~64℃로 낮추면, 두 종류의 프라이머가 주형 DNA 가닥의 자신과 상보적인 염기서열과 결합을 형성한다. 이어서, DNA 합성단계(S230)는, 히터블록(10)에 다시 전원을 공급하여 온도를 올려준다. 그러면 두 종류의 프라이머가 붙은 주형 DNA에 상보적인 새로운 염기순서를 합성하여 DNA 사슬을 연장한다. 이 단계에서의 온도는 DNA중합효소의 적정온도(68~74℃)를 따르고 반응시간은 증폭된 산물의 크기에 따라 조절할 수 있다.
이러한 3단계의 DNA 증폭단계(S200)는 PCR 장치(1)에 온도 값과 시간을 세팅해주면 자동으로 진행된다. 위 3단계를 한번 마치면 1cycle이 완성된다. 그리고 중합효소 연쇄반응 1회를 시행하면 목표 유전자나 내부대조 유전자가 2배로 증폭된다. 따라서 중합효소 연쇄반응의 반복에 의해 기하급수적인 유전자가 증폭되고, 중합효소 연쇄반응을 n회 반복하면 이론상으로 2의 n승 배로 유전자자 증폭된다.
한편, 상기 DNA 증폭단계(S200)의 매 사이클의 DNA 변성단계(S210)에서는 프로브 타입 형광물질에서 발광하는 형광을 실시간으로 측정한다. 이중나선 DNA 중 95% 이상이 단일 가닥 DNA으로 분리되는 융해온도(Tm95)에서 형광을 측정하면, 프로브 타입 형광물질에서 발광하는 형광만을 측정할 수 있다. 그리고 각 DNA 변성단계(S210)에서 측정된 프로브 타입 형광물질은 형광은 매 주기마다 증폭 산물이 축적됨에 따라 비례하여 증가하게 된다. 이를 통해서 목표 유전자의 증폭 산물을 실시간으로 정량한다.
이어, 각 어닐링단계(S220) 또는 DNA 합성단계(S230)에서 인터칼레이터 타입 형광물질과 프로브 타입 형광물질에서 발광하는 형광을 측정한다. 즉, 각 사이클의 어닐링단계(S220) 또는 DNA 합성단계(S230)에서는 이중 나선 DNA와 결합하여 있는 인터칼레이터 타입 형광물질에서 발광하는 형광과 프로브 타입 형광물질의 형광억제물질에서 분리된 형광염료에서 발광하는 형광이 모두 측정된다. 따라서 각 어닐링단계(S220) 또는 DNA 합성단계(S230)에서 발광하는 형광을 측정하여 증폭곡선을 도출할 수 있고 이 증폭곡선을 분석하여 내부대조 유전자와 목표 유전자의 증폭 산물을 정량할 수 있다.
이어서, DNA 변성단계(S210), 어닐링 단계(S220) 및 DNA 합성단계(S230)로 이루어진 DNA 증폭단계(S200)를 수행하여 목표 유전자와 내부대조 유전자를 증폭시킨 후, 용해곡선 측정단계(S300)에서는 히터블록(10)의 온도를 60℃에서 98℃까지 점차 증가시키면서 일정한 시간 간격(예, 1분)으로 형광의 강도를 측정한다. 그러면 온도의 증가에 따라 형광이 점차 감소하는 추세를 나타내는 융해곡선을 얻을 수 있다. 그리고 융해곡선(Melting curve)을 변형시킨 융해점곡선(melting peak graph)을 이용하면 하나 이상의 융해온도(Tm50)를 확인할 수 있다.
융해온도는 "Tm=[4X(C+G)+2X(A+T)]"로 표현된다. 즉, DNA의 길이, 염기서열의 차이, G+C 함량 등에 따라 용해온도가 다르게 된다. 그러므로 인터칼레이터 타입 형광물질이 결합한 유전자의 염기서열이 다르면 서로 다른 위치에 융해온도(Tm50)가 나타나게 된다. 이러한 융해온도(Tm50)를 이용하면 목표 유전자 또는 내부대조 유전자와 비특이적인 증폭에 의한 유전자를 구분하여 확인할 수 있다. 그리고 이러한 융해온도(Tm50)를 이용하면 실시간 PCR 공정이 성공적으로 수행되었는지 검증할 수 있다. 예를 들어, 목표 유전자와 내부대조 유전자의 융해온도(Tm50)가 정상적으로 나타나지 않으면, 실험자의 실수, 잘못된 시약혼합물, 장비의 문제 등이 있음을 의미한다. 반면에 내부대조 유전자에 대응하는 융해온도(Tm50)가 정상적으로 나타났으면 목표 유전자가 나타나지 않더라도 실시간 PCR 공정 자체는 정상적으로 수행되었음을 의미한다.
이와 같이, 본 발명에 따른 실시간 PCR 방법은, 프로브 타입 형광물질을 이용하여 목표 유전자의 증폭 산물을 실시간으로 정량하여, 시료에 목표 유전자가 포함되었는지를 확인할 수 있다. 또한, 본 발명은 인터칼레이터 타입 형광물질을 이용하여 실시간 PCR 공정이 정상적으로 이루어졌는지를 검증할 수 있다.
이상의 본 명세서와 도면에는 본 발명의 바람직한 실시 예에 대하여 개시하였으며, 비록 특정 용어들이 사용되었으나, 이는 단지 본 발명의 기술 내용을 쉽게 설명하고 발명의 이해를 돕기 위한 일반적인 의미에서 사용된 것이지, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다. 또한, 본 발명은 이상에서 개시되는 실시 예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있다. 단지 본 실시 예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 오로지 특허청구범위에 기재된 청구항의 범주에 의하여 정의될 뿐이다.
1: 단일파장 실시간 PCR 장치 10: 히터블록
20: PCR칩 30: LED광원
40: 디지털 카메라 50: 송풍기
60: 제어부

Claims (9)

  1. DNA 변성(Denaturation), 어닐링(Annealing) 및 DNA 합성(Extension)단계를 반복적으로 실시하여 목표 유전자 및 내부대조 유전자를 증폭하고 다수의 형광물질에서 발광하는 형광을 측정하여 증폭 산물을 실시간으로 정량하는 다중검출이 가능한 실시간 PCR 방법에 있어서,
    단일 파장 대의 광원에서 방사되는 여기 광에 반응하여 동일 파장 대의 형광을 발광하는 인터칼레이터 타입(intercalator type) 형광물질과 프로브 타입(probe type) 형광물질을 사용하여 유전자를 증폭하고;
    상기 프로브 타입 형광물질에서 발광하는 형광은, DNA 변성단계에서 실시간으로 측정하여 프로브 타입 형광물질과 결합되는 목표 유전자의 증폭 산물을 실시간으로 정량하되, 이중나선 DNA (dsDNA) 중 95% 이상이 단일 가닥 DNA(ssDNA)로 분리되는 융해온도(Tm95) 이상에서 형광을 측정하여 상기 인터칼레이터 타입 형광물질에서 발광하는 형광을 배제하고 상기 프로브 타입 형광물질에서 발광하는 형광만을 측정하며;
    상기 DNA 변성, 어닐링 및 DNA 합성단계를 반복적으로 수행하여 목표 유전자 및 내부대조 유전자를 증폭한 후, 온도를 점차로 증가시키면서 일정한 시간 간격으로 형광을 측정하되, 이중나선 DNA (dsDNA) 중 50% 이상이 단일 가닥 DNA(ssDNA)로 분리되는 융해온도(Tm50)를 이용하여 목표 유전자 또는 내부대조 유전자의 증폭 여부를 확인하여 PCR 공정 및 장치의 신뢰도를 검증하는 것을 특징으로 하는 단일파장으로 다중검출이 가능한 실시간 PCR 방법.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 인터칼레이터 타입 형광물질은 SYBR Green I또는 EvaGree을 포함하고, 상기 프로브 타입 형광물질은 TaqMan probe을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일파장으로 다중검출이 가능한 실시간 PCR 방법.
  3. 삭제
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  7. 삭제
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  9. 히터블록과, 상기 히터블록 위에 놓여 지고 내부에 다수의 채널이 구비된 PCR칩과, 상기 PCR칩의 일 측면에 설치되고 상기 PCR칩에 형성된 다수의 채널을 수평으로 관통하도록 단일 파장 대의 여기 광을 방사 하는 하나의 LED광원과, 상기 PCR칩의 상부에 설치되어 상기 PCR칩의 채널에서 발광하는 형광을 측정하는 하나의 디지털 카메라와, 상기 히터블록에 공기를 공급하는 송풍기와, 상기 히터블록, 송풍기, LED광원 및 디지털 카메라를 제어하는 제어부를 포함하는 실시간 PCR 장치를 이용하여 목표 유전자와 내부대조 유전자를 증폭하는 실시간 PCR 방법에 있어서,
    (a) 상기 PCR칩의 채널에 단일 파장 대의 광원에서 방사되는 여기 광에 반응하여 동일한 파장 대의 형광을 발광하는 인터칼레이터 타입 형광물질과 프로브 타입 형광물질을 혼합하여 이루어진 PCR 혼합액과, 목표 주형 유전자 및 내부대조 주형 유전자를 주입하고 상기 PCR칩에 주입하여 혼합하는 PCR 준비단계와;
    (b) 상기 히터블록과 송풍기에 전원을 공급하여 DNA 변성단계, 어닐링 단계 및 DNA 합성단계를 미리 설정된 사이클만큼 반복하여 목표 유전자 및 내부대조 유전자를 증폭하되, 각 사이클의 DNA 변성단계에서 상기 LED광원과 디지털 카메라를 제어하여 프로브 타입 형광물질에서 발하는 형광만을 실시간으로 측정하여 목표 유전자의 증폭 산물을 실시간으로 정량하는 실시간 형광 측정단계와;
    (c) 상기 DNA 변성단계, 어닐링 단계 및 DNA 합성단계를 설정된 사이클만큼 반복하여 목표 유전자와 내부대조 유전자를 증폭한 후, 마지막 DNA 변성단계 이후에 상기 히터블록의 온도를 점차로 증가시키면서 상기 LED광원 및 디지털 카메라를 제어하여 일정한 시간 간격으로 형광을 측정하여 인터칼레이터 타입 형광물질에서 발광하는 형광이 점차 감소하는 추세를 나타내는 융해곡선을 도출하는 융해곡선 측정단계;를 포함하되,
    (d) 상기 (b) 단계에서는, 각 사이클의 DNA 변성단계에서 이중나선 DNA (dsDNA) 중 95% 이상이 단일 가닥 DNA(ssDNA)로 분리되는 융해온도(Tm95) 이상에서 프로브 타입 형광물질에서 발광하는 형광을 측정하고,
    (e) 상기 (c) 단계에서는, 상기 융해곡선을 분석하여 이중나선 DNA(dsDNA)의 50%가 단일 가닥 DNA(ssDNA)로 분리되는 하나 이상의 융해온도(Tm50)를 이용하여 목표 유전자 또는 내부대조 유전자의 증폭 여부를 확인하여 PCR 공정이 정상적으로 수행되었는지를 검증하는 것을 특징으로 하는 단일파장으로 다중검출이 가능한 실시간 PCR 방법.
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