KR20160134982A - Ｔｍ 값 분석을 이용한 동시다중 실시간 PCR 산물 분석 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 동시다중 실시간 PCR 산물 분석방법 및 키트에 관한 것으로서, 비특이적 삽입 형광염료 및 주형 핵산분자가 포함된 PCR 반응액 내에, 1 번째 내지 n 번째 Tm 값을 각각 갖는 1 번째 내지 n 번째 비표지 PCR 산물을 각각 증폭할 수 있는 1 번째 내지 n 번째 비표지 프라이머쌍을 혼합한 후, 5 내지 25 cycle의 실시간 PCR 반응을 수행하는 실시간 PCR 단계(상기 n은 2 내지 5 중 어느 한 정수이고, 상기 1번째 내지 n 번째 Tm 값은 서로 다름); 및 상기 실시간 PCR 산물을 열변성 시킨 후 용해점 곡선을 분석하는 용해점 곡선 분석단계를 포함하는 동시다중 실시간 PCR 산물 분석방법에 관한 것이다.

Description

Ｔｍ 값 분석을 이용한 동시다중 실시간 PCR 산물 분석 방법{A mutlflex method for analyzing realtime PCR product using Tm value analysis}
본 발명은 PCR 산물 분석 방법에 관한 것으로서, 상세하게는 용해온도(melting temperature, 'Tm 값'이라 약칭함)를 이용한 동시다중 실시간 PCR 산물 분석방법에 관한 것이다.
실시간 중합효소 연쇄반응(real time polymerase chain reaction, 이하, '실시간 PCR'이라 약칭함)은 표적 DNA 분자를 증폭하여 동시에 검출하거나 정량하기 위해 사용되는 PCR에 기반한 분자생물학적 실험기법의 하나이다. DNA 증폭의 원리는 일반적인 PCR과 동일하나, 형광물질을 사용하여 증폭과정을 실시간으로 모니터링한다는 점에서 일반적인 PCR과 구분된다. 실시간 PCR에서 PCR 산물을 검출하기 위해서 일반적으로 ⅰ) 어떠한 이중가닥 DNA에라도 삽입되는 SYBR Green과 같은 비특이적 형광염료를 사용하는 방법 또는 ⅱ) 세포나 조직에서 mRNA나 비암호화 RNA를 정량하기 위한 상보서열을 가진 탐침(probe)의 교잡 이후에만 검출이 가능한 형광 표지자로 표지된 올리고뉴클레오티드로 구성된 서열-특이적 DNA 탐침을 사용하는 방법이 사용된다. 전자의 경우 동시다중분석이 가능하기는 하나 Tm 값의 편차가 심한 경우에만 제한적으로 사용될 수 있고, 후자의 경우 탐침으로 사용되는 형광 분자를 달리할 경우, 동시에 여러 표적 DNA에 대한 동시다중분석이 가능한데, 상기 방법을 이용한 실시간 PCR 산물 분석장치는 측정할 수 있는 광원과 광필터에 따라 2개의 각기 다른 파장을 검출 할 수 있는 2채널 장비, 4개의 각기 다른 파장을 검출할 수 있는 4채널 장비, 그 이상의 것으로는 6채널, 7채널, 및 8채널 장비로 구분되어진다. 상기와 같은 동시다중분석 PCR 방법과 관련하여, 미국특허 제8,137,616호(특허권자: Roche Molecular Systems, Inc.)는 470 nm의 단일 파장을 방출하는 LED 광원과 530 nm, 555 nm, 610 nm, 640 nm, 670 nm 및 710 nm의 6 채널을 가진 실시간 PCR 장치를 개시한 바 있다.
상기와 같이 동시다중분석이 필요한 이유는 최근 동반진단으로 대변되는 개인의 유전자형의 판별과 그에 따른 맞춤형 의약의 처방이 확산되면서 하나의 DNA 시료로부터 동시에 분석해야 할 유전자 종류 및 유전자형이 급격하게 증가되고 있기 때문이다. 만일 동시에 분석해야 할 대상 유전자수가 50개인데 한 번 반응으로 최대 4개의 유전자만 분석이 가능하다면 적어도 13개의 반응 튜브를 이용하여 PCR 반응을 수행하여야 한다. 따라서, 하나의 튜브 내에서 한 번의 반응으로 동시에 더 많은 DNA를 증폭 검출할 수 있는 동시다중분석 실시간 PCR 방법의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
그러나, 상기 선행기술의 경우 6개의 채널을 가진 실시간 PCR의 경우를 기준으로 설명하면, 대조군(control)을 합하여 총 5개의 유전자를 동시다중(multiplex)으로 분석이 가능하나, 그 이상의 유전자를 동시에 분석하기 위해서는 별도의 반응튜브를 이용하여 분석을 해야만 하는 한계를 가지고 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 종래의 방법보다 더 많은 수의 유전자를 동시다중분석할 수 있는 효율적인 실시간 PCR 산물 분석 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 비특이적 삽입 형광염료 및 주형 핵산분자가 포함된 PCR 반응액 내에, 1 번째 내지 n 번째 Tm 값을 각각 갖는 1 번째 내지 n 번째 비표지 PCR 산물을 각각 증폭할 수 있는 1 번째 내지 n 번째 비표지 프라이머쌍을 혼합한 후, 5 내지 25 cycle의 실시간 PCR 반응을 수행하는 실시간 PCR 단계(상기 n은 2 내지 5 중 어느 한 정수이고, 상기 1번째 내지 n 번째 Tm 값은 서로 다름); 및 상기 실시간 PCR 산물을 열변성 시킨 후 용해점 곡선을 분석하는 용해점 곡선 분석단계를 포함하는 동시다중 실시간 PCR 산물 분석방법.이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 비특이적 삽입 형광염료 및 주형 핵산분자가 포함된 PCR 반응액 내에, 비특이적 삽입 형광염료 및 주형 핵산분자가 포함된 PCR 반응액 내에, 1 번째 내지 n 번째 Tm 값을 각각 갖는 1 번째 내지 n 번째 비표지 PCR 산물을 각각 증폭할 수 있는 1 번째 내지 n 번째 비표지 프라이머쌍(상기 n은 2 내지 5 중 어느 한 정수이고, 상기 1 번째 내지 n 번째 Tm 값은 서로 다름), 및 1 번째 내지 m 번째 파장의 빛을 각각 방출하는 형광분자를 각각 포함하고 있는 1 번째 내지 m 번째 탐침 및 상기 1 번째 내지 m 번째 탐침에 의해 각각 검출이 되는 1 번째 내지 m 번째 표지 PCR 산물을 각각 증폭할 수 있는 1 번째 내지 m 번째 표지 프라이머쌍(상기 m은 2 내지 8 중 어느 한 정수이고, 상기 1 번째 내지 m 번째 파장은 서로 다름)을 혼합한 후, 5 내지 25 cycle의 실시간 PCR 반응을 수행하면서 상기 표지 PCR 산물들에 의해 생성되는 형광을 분석하는 실시간 PCR 단계; 및 상기 비표지 PCR 산물들을 열변성 시킨 후 용해점 곡선을 분석하는 용해점 곡선 분석단계를 포함하는 동시다중 실시간 PCR 산물 분석방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 1 번째 내지 n 번째 Tm 값을 각각 갖는 1 번째 내지 n 번째 비표지 PCR 산물을 각각 증폭할 수 있는 1 번째 내지 n 번째 비표지 프라이머쌍(상기 n은 2 내지 5 중 어느 한 정수이고, 상기 1 번째 내지 n 번째 Tm 값은 서로 다름), 및 1 번째 내지 m 번째 파장의 빛을 각각 방출하는 형광분자를 각각 포함하고 있는 1 번째 내지 m 번째 탐침 및 상기 1 번째 내지 m 번째 탐침에 의해 각각 검출이 되는 1 번째 내지 m 번째 표지 PCR 산물을 각각 증폭할 수 있는 1 번째 내지 m 번째 표지 프라이머쌍(상기 m은 2 내지 8 중 어느 한 정수이고, 상기 1 번째 내지 m 번째 파장은 서로 다름)을 포함하는 동시다중 실시간 PCR 산물 분석용 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 하나의 반응으로 동시에 복수의 유전자를 검출할 수 있기 때문에, 본 발명의 일 실시예에 따른 동시다중 실시간 PCR 산물 분석방법 및 키트는 동반진단 등에 매우 유용하게 사용될 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 1차 다중 실시간 PCR을 수행한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 1차 다중 실시간 PCR을 수행한 후 산출된 PCR 산물에 대한 용해곡선 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 2차 다중 실시간 PCR 중 첫 번째 조건에 따라 수행한 후 산출된 PCR 산물에 대한 용해곡선 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 2차 다중 실시간 PCR 중 두 번째 조건에 따라 수행한 후 산출된 PCR 산물에 대한 용해곡선 그래프이다.
용어의 정의:
이하 본 문서에서 사용되는 용어를 정의한다:
본 문서에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)"는 상기 뉴클레오티드 단위체 분자의 중합체로서 일반적으로 13 내지 25개까지의 뉴클레오티드로 구성된 짧은 핵산 사슬을 의미하는데, 단일쇄(single strand)일 수 있고, 이중쇄(double strand)일 수 있다. 아울러, 경우에 따라서는 6-mer, 7-mer, 8-mer, 9-mer, 10-mer, 11-mer 및 12-mer 등 13개 미만의 뉴클레오티드로 구성되거나 25개 초과의 뉴클레오티드로 구성된 핵산 사슬을 지칭할 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "PCR(polymerase chain reaction)" 또는 "핵산증폭반응"은 열안정성 DNA 중합효소를 이용하여 특정 표적 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. PCR에는 DNA 중합효소 외에 표적 핵산 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드인 프라이머(포워드 프라이머, 리버스 프라이머), 디옥시뉴클레오티드 혼합물(dNTP mixture), Mg2+ 등의 2가 이온을 포함하는 반응 완충액 등이 사용된다. 상기 PCR 반응에 의해 생성된 DNA 분자를 본 문서에서는 "증폭산물"이라고 지칭하였다.
본 문서에서 사용되는 용어 "프라이머(primer)"는 PCR 반응 또는 프라이머 연장반응(primer extension) 반응의 개시를 위해 사용되는, 주형 DNA에 상보적으로 혼성화는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. PCR 반응을 위한 프라이머는 증폭되는 핵산분자의 유전자 코드 진행방향과 동일한 센스 가닥으로부터 선택되는 포워드 프라이머(또는 센스 프라이머) 및 상기 센스 가닥에 상보적인 안티센스 가닥으로부터 선택되는 리버스 프라이머(또는 안티센스 프라이머)의 쌍이 사용되고, 프라이머 연장반응의 경우 통상적으로 단일한 연장용 프라이머가 사용된다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 일 관점에 따르면, 비특이적 삽입 형광염료 및 주형 핵산분자가 포함된 PCR 반응액 내에, 1 번째 내지 n 번째 Tm 값을 각각 갖는 1 번째 내지 n 번째 비표지 PCR 산물을 각각 증폭할 수 있는 1 번째 내지 n 번째 비표지 프라이머쌍을 혼합한 후, 5 내지 25 cycle의 실시간 PCR 반응을 수행하는 실시간 PCR 단계(상기 n은 2 내지 5 중 어느 한 정수이고, 상기 1번째 내지 n 번째 Tm 값은 서로 다름); 및 상기 실시간 PCR 산물을 열변성 시킨 후 용해점 곡선을 분석하는 용해점 곡선 분석단계를 포함하는 동시다중 실시간 PCR 산물 분석방법이 제공된다.
상기 분석방법에 있어서, 상기 PCR 반응액은 dNTP 혼합물, 2가 금속이온 및 열안정성 DNA 중합효소가 포함된 완충수용액일 수 있다.
상기 분석방법에 있어서, 인접한 Tm 값을 갖는 상기 비표지 PCR 산물들 사이의 상기 Tm의 차이는 2 내지 5℃일 수 있고, 바람직하게는 2 내지 4℃일 수 있다. 상기 Tm 값의 차이가 너무 작으면 인접한 Tm 값을 갖는 PCR 산물을 서로 구분하기 어렵고, 상기 Tm 값의 차이가 너무 크면 동시에 분석할 수 있는 핵산분자의 수가 감소되는 단점이 있다.
상기 분석방법에 있어서, 상기 비특이적 삽입 형광염료는 SyBr green(Invitrogen, Inc., USA), EvaGreen(Biotium, Inc, USA) 또는 옥시다졸 옐로우(quinolinium,4-[(3-methyl-2(3H)-benzoxazolylidene)methyl]-1-[3-(trimethylammonio)propyl]-,diiodide)일 수 있다.
상기 분석방법에 있어서, 인접한 크기를 갖는 상기 비표지 PCR 산물들 사이의 상기 크기의 차이는 2 내지 50 bp일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 비특이적 삽입 형광염료 및 주형 핵산분자가 포함된 PCR 반응액 내에, 비특이적 삽입 형광염료 및 주형 핵산분자가 포함된 PCR 반응액 내에, 1 번째 내지 n 번째 Tm 값을 각각 갖는 1 번째 내지 n 번째 비표지 PCR 산물을 각각 증폭할 수 있는 1 번째 내지 n 번째 비표지 프라이머쌍(상기 n은 2 내지 5 중 어느 한 정수이고, 상기 1 번째 내지 n 번째 Tm 값은 서로 다름), 및 1 번째 내지 m 번째 파장의 빛을 각각 방출하는 형광분자를 각각 포함하고 있는 1 번째 내지 m 번째 탐침 및 상기 1 번째 내지 m 번째 탐침에 의해 각각 검출이 되는 1 번째 내지 m 번째 표지 PCR 산물을 각각 증폭할 수 있는 1 번째 내지 m 번째 표지 프라이머쌍(상기 m은 2 내지 8 중 어느 한 정수이고, 상기 1 번째 내지 m 번째 파장은 서로 다름)을 혼합한 후, 5 내지 25 cycle의 실시간 PCR 반응을 수행하면서 상기 표지 PCR 산물들에 의해 생성되는 형광을 분석하는 실시간 PCR 단계; 및 상기 비표지 PCR 산물들을 열변성 시킨 후 용해점 곡선을 분석하는 용해점 곡선 분석단계를 포함하는 동시다중 실시간 PCR 산물 분석방법이 제공된다.
상기 분석방법에 있어서, 인접한 Tm 값을 갖는 상기 비표지 PCR 산물들 사이의 상기 Tm의 차이는 2 내지 5℃일 수 있고, 더 바람직하게는 2 내지 3℃일 수 있다.
상기 분석방법에 있어서, 인접한 크기를 갖는 상기 비표지 PCR 산물들 사이의 상기 크기의 차이는 2 내지 50 bp일 수 있다.
상기 분석방법에 있어서, 상기 비특이적 삽입 형광염료는 SyBr green(Invitrogen, Inc., USA), EvaGreen(Biotium, Inc, USA) 또는 옥시다졸 옐로우(quinolinium,4-[(3-methyl-2(3H)-benzoxazolylidene)methyl]-1-[3-(trimethylammonio)propyl]-,diiodide)일 수 있다.
상기 분석방법에 있어서, 상기 형광분자는 플루오레세인(fluorescein), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(Oregon green) 및 텍사스 레드(Texas red)로 구성된 군으로부터 선택되는 같은 잔틴(Xanthene) 유도체; Cy2, Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, 인도카르보사이아닌(indocarbocyanine), 로다민(rhodamine), 옥사카르보사이아닌(oxacarbocyanine), 티아카르보사이아닌(thiacarbocyanine) 및 메로사이아닌(merocyanine)로 구성된 군으로부터 선택되는 사이아닌 유도체(cyanien derivatives); 피리딜록사졸(pyrodyloxazole), 니트로벤족사디아졸(nitrobenzoxadiazole), 및 벤족사디아졸(benzoxadiazole)로 구성된 군으로부터 선택되는 옥사디아졸(oxadiazole) 유도체; 나일 레드(Nile red), 나일 오렌지(Nile orange), 및 아크리딘 옐로우(acridine yellow)로 구성된 군으로부터 선택되는 아크리딘 유도체(acridine derivative); 오마린(aumarine), 크리스탈 바이올렌(crystal violet), 및 말라카이트 그린(malachite green)으로 구성된 군으로부터 선택되는 아릴메틴 유도체(arylmethine derivative); 포르핀(porphin), 프탈로사이아닌(phthalocyanine) 및 빌리루빈(bilirubin)로 구성된 군으로부터 선택되는 테트라피롤 유도체(tetrapyrrole derivative); 및 X-SIGHT, Pz 247, DyLight 750, DyLight 800, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 750, IRDye 680, IRDye 800CW 및 인도시아닌 그린(indocyanine green) 및 양성이온 근적외광 형광체(zwitterionic near-infrared fluorophores)로 구성된 군으로부터 선택되는 근적외광 형광체(NIR fluorophore)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 1 번째 내지 n 번째 Tm 값을 각각 갖는 1 번째 내지 n 번째 비표지 PCR 산물을 각각 증폭할 수 있는 1 번째 내지 n 번째 비표지 프라이머쌍(상기 n은 2 내지 5 중 어느 한 정수이고, 상기 1 번째 내지 n 번째 Tm 값은 서로 다름), 및 1 번째 내지 m 번째 파장의 빛을 각각 방출하는 형광분자를 각각 포함하고 있는 1 번째 내지 m 번째 탐침 및 상기 1 번째 내지 m 번째 탐침에 의해 각각 검출이 되는 1 번째 내지 m 번째 표지 PCR 산물을 각각 증폭할 수 있는 1 번째 내지 m 번째 표지 프라이머쌍(상기 m은 2 내지 8 중 어느 한 정수이고, 상기 1 번째 내지 m 번째 파장은 서로 다름)을 포함하는 동시다중 실시간 PCR 산물 분석용 조성물이 제공된다.
상기 조성물에 있어서, 인접한 Tm 값을 갖는 상기 비표지 PCR 산물들 사이의 상기 Tm의 차이는 2 내지 5℃일 수 있고, 바람직하게는 2 내지 4℃일 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 인접한 크기를 갖는 상기 비표지 PCR 산물들 사이의 상기 크기의 차이는 2 내지 50 bp일 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 비특이적 삽입 형광염료는 SyBr green(Invitrogen, Inc., USA), EvaGreen(Biotium, Inc, USA) 또는 옥시다졸 옐로우(quinolinium,4-[(3-methyl-2(3H)-benzoxazolylidene)methyl]-1-[3-(trimethylammonio)propyl]-,diiodide)일 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 형광분자는 플루오레세인(fluorescein), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(Oregon green) 및 텍사스 레드(Texas red)로 구성된 군으로부터 선택되는 같은 잔틴(Xanthene) 유도체; Cy2, Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, 인도카르보사이아닌(indocarbocyanine), 로다민(rhodamine), 옥사카르보사이아닌(oxacarbocyanine), 티아카르보사이아닌(thiacarbocyanine) 및 메로사이아닌(merocyanine)로 구성된 군으로부터 선택되는 사이아닌 유도체(cyanien derivatives); 피리딜록사졸(pyrodyloxazole), 니트로벤족사디아졸(nitrobenzoxadiazole), 및 벤족사디아졸(benzoxadiazole)로 구성된 군으로부터 선택되는 옥사디아졸(oxadiazole) 유도체; 나일 레드(Nile red), 나일 오렌지(Nile orange), 및 아크리딘 옐로우(acridine yellow)로 구성된 군으로부터 선택되는 아크리딘 유도체(acridine derivative); 오마린(aumarine), 크리스탈 바이올렌(crystal violet), 및 말라카이트 그린(malachite green)으로 구성된 군으로부터 선택되는 아릴메틴 유도체(arylmethine derivative); 포르핀(porphin), 프탈로사이아닌(phthalocyanine) 및 빌리루빈(bilirubin)로 구성된 군으로부터 선택되는 테트라피롤 유도체(tetrapyrrole derivative); 및 X-SIGHT, Pz 247, DyLight 750, DyLight 800, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 750, IRDye 680, IRDye 800CW 및 인도시아닌 그린(indocyanine green) 및 양성이온 근적외광 형광체(zwitterionic near-infrared fluorophores)로 구성된 군으로부터 선택되는 근적외광 형광체(NIR fluorophore)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상일 수 있다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
실시예
실시예 1: 1차 다중분석 실시간 PCR
본 발명자는 표적 유전자로 CYP2C19*2를 사용하였고, 첫 번째 PCR 산물 및 두 번째 PCR 산물의 두 가지 PCR 산물 산출을 위해 하기 표 1 및 2와 같은 프라이머쌍을 고안하였다. PCR 산물은 각각 69 bp 및 86 bp로 그 크기의 차이가 17 bp에 불과하였다(*2는 대립유전자 번호를 나타냄).
첫 번째 PCR 산물의 핵산 서열 및 이의 증폭을 위한 프라이머 정보
프라이머 명칭 핵산서열(서열번호) 크기(bp) GC함량(%) Tm(℃)
CYP2C19*2 -Tm F 5'-GTGACTGCTTGCGTATTTGTG-3'(1) 21 47.6 57.8
CYP2C19*2 -Tm 69R 5'-CCTTGACCTGTTAAACATCCG-3'(2) 21 47.6 57.8
두 번째 PCR 산물의 핵산 서열 및 이의 증폭을 위한 프라이머 정보
프라이머 명칭 핵산서열(서열번호) 크기(bp) GC함량(%) Tm(℃)
CYP2C19*2 -Tm F 5'-GTGACTGCTTGCGTATTTGTG-3'(1) 21 47.6 57.8
CYP2C19*2 -Tm 86R 5'-GCTTCTCAAGCATTACTCCTTG-3'(3) 22 45.5 58.3
1차 PCR 반응을 위한 반응액 조성 및 상기 두 PCR 산물을 혼합하여 수행한 2차 멀티플렉스 실시간 PCR을 위한 반응액 조성은 각각 하기 표 3 및 4에 기재된 바와 같다.
단계 실시간 PCR 반응을 위한 반응액의 조성
반응요소 부피(㎕) 최종농도
5X PCR Buffer 4 1X
Go Taq DNA polymerase 0.1 1.25 U
dNTP Mix (10 mM) 0.4 0.2 mM
프라이머 포워드 1 500 nM
리버스 1 500 nM
주형 2 0.1 pg
탈이온수 11.5 　
총 부피 20
2단계 용해곡석 분석 반응을 위한 반응액의 조성
반응요소 부피(㎕) 최종농도
SYBR Green Supermix(2X) 7.5 1X
69 bp PCR 산물 3.75 1.875 　
　
　
86 bp PCR 산물 3.75 1.875
탈이온수 0 3.75
총 부피 15 　
상기 2차 멀티플렉스 실시간 PCR 반응은 상기 1차 PCR 최종 반응액으로부터 각각 7.5 μl씩을 취하여 한 튜브에는 각각 3.5 μl씩 혼합하였고(편의상, 이를 '1:1 혼합물'이라 함), 다른 한 튜브에는 이의 절반인 1.875 μl씩을 혼합하였다(편의상, 이를 '0.5:0.5 혼합물'이라 함).
그런 다음 1단계 반응으로 하기 표 5에 기재된 것과 같은 사이클 조건으로 30회 실시간 PCR 반응을 수행한 후(도 1), 표 6에 도시된 것과 같은 온도 프로파일로 실시간 PCR 분석장치를 이용하여 용해곡선 분석을 수행하였다(도 2). 1단계 반응의 경우 세 번의 독립적인 반응을 통해 평균값을 구하였고, 2단계의 경우 네 번의 독립적인 반응을 통해 평균값을 구하였다.
1단계 실시간 PCR 반응을 위한 온도 프로파일
95℃ 15 min Cycle #
95℃ 30 sec
30
58℃ 30 sec
72℃ 30 sec
72℃ 5 min
2단계 용해곡선 분석 반응을 위한 온도 프로파일
95℃ 15 min Cycle #
95℃ 30 sec
3
58℃ 30 sec
72℃ 30 sec
72℃ 5 min
95℃ 10 sec
용해곡선 분석
65℃ 5초당
0.5℃ 상승
90℃
1단계 실시간 PCR 반응의 결과
형광염료 시료 한계 사이클(C(t)) 평균 C(t)
SYBR 69 bp 8.04
7.52
SYBR 69 bp 7.39
SYBR 69 bp 7.12
SYBR 86 bp 6.34
6.86
SYBR 86 bp 7.18
SYBR 86 bp 7.06
2단계 용해곡선 반응의 결과
형광염료 표적 시료번호 Tm(℃) 피크 높이 시작온도(℃) 종료온도(℃)
SYBR 3.75 1 72.00 15.04 69.50 75.00
SYBR 3.75 2 71.50 13.16 69.00 74.50
SYBR 3.75 3 71.50 14.70 69.00 76.50
SYBR 3.75 4 71.50 14.11 69.00 75.50
SYBR 1.875 1 73.00 10.10 69.50 77.00
SYBR 1.875 2 72.50 10.88 69.00 75.50
SYBR 1.875 3 72.50 10.71 69.00 76.50
SYBR 1.875 4 72.50 9.14 70.00 75.00
우선 1단계 실시간 PCR 결과 상기 첫 번째 1PCR 산물의 검출 한계 사이클(C(t))은 평균 7.52이었고, 제2PCR 산물의 검출 한계 사이클은 평균 6.86이었다. 이는 두 번째 PCR 산물의 크기가 더 크기 때문에 어쩌면 당연한 결과라 할 수 있다. 2단계 용해곡선 분석에서 1:1 혼합물의 경우 Tm 값이 약 71.625℃로 나타났고, 0.5:0.5 혼합물의 경우 Tm 값 평균이 72.625℃로 나타나, 양 혼합물 사이에 1℃ 정도 차이가 나타났다.
그러나 도 2 및 표 8에 나타난 것과 같이, 예상했던 바와 달리 각각의 반응에서 각각 Tm 값을 달리하는 상기 첫 번째 PCR 산물 및 상기 두 번째 PCR 산물을 구분할 수 있는 두 개의 피크가 나타나지 않았다.
상기 현상의 원인에 대하여 본 출원인은 1단계의 실시간 PCR 반응의 사이클 수가 너무 높았기 때문인 것으로 추측하였다. 이에 본 발명자는 1단계 및 2단계의 반응 조건을 달리하여 실험을 수행하기로 하였다.
실시예 2: 2차 다중분석 실시간 PCR
2차 다중분석 실시간 PCR 분석에서는 주형을 CYP2C19*2, CYP2C19*4 및 CYP2C19*5를 사용하였고, PCR 반응에 사용된 각각의 PCR 산물(편의상, '세 번째 PCR 산물' 내지 '다섯 번째 PCR 산물'이라 함)의 서열정보 및 프라이머 정보는 하기 표 9 내지 11에 기재된 바와 같다.
세 번째 PCR 산물의 핵산 서열 및 이의 증폭을 위한 프라이머 정보
프라이머 명칭 핵산서열(서열번호) 크기(bp) GC함량(%) Tm(℃)
CYP2C19*2 -Tm F 5'-GTGACTGCTTGCGTATTTGTG-3'(1) 21 47.6 57.8
CYP2C19*2 -Tm 69R 5'-CCTTGACCTGTTAAACATCCG-3'(2) 21 47.6 57.8
네 번째 PCR 산물의 핵산 서열 및 이의 증폭을 위한 프라이머 정보
프라이머 명칭 핵산서열(서열번호) 크기(bp) GC함량(%) Tm(℃)
CYP2C19*4 -Tm F 5'-CCACTCCTCTCCCAGTGATTG-3'(4) 21 57.1 61.7
CYP2C19*4 -Tm R 5'-GCCACTGAAGGAGCATACTTAC-3'(5) 22 50.0 60.2
다섯 번째 PCR 산물의 핵산 서열 및 이의 증폭을 위한 프라이머 정보
프라이머 명칭 핵산서열(서열번호) 크기(bp) GC함량(%) Tm(℃)
CYP2C19*5 -Tm F 5'-CCCTCCTATGATTCACCGAAC-3'(6) 21 52.4 59.8
CYP2C19*5 -Tm R 5'-TCCTCATGTGTAACTGTGAGAG-3'(7) 22 45.5 58.3
아울러, PCR 반응을 위한 반응액 조성은 표 12에 기재된 것과 같다. 시료번호 중 1 내지 3은 단일반응 PCR이고 4 내지 6은 다중반응 PCR이다.
반응요소 부피(㎕) 최종농도
1 2 3 4 5 6
SYBR Green Supermix(2X) 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 1X

주형		 CYP2C19*2 105copy 1.5 - - 1.5 1.5 - 0.1 pg
CYP2C19*4 105copy - 1.5 - 1.5 - 1.5 0.1 pg
CYP2C19*5 105copy - - 1.5 - 1.5 1.5 0.1 pg


프라이머
 CYP2C19*2 -Tm F 10 μM 0.75 - - 0.75 0.75 - 500 nM
CYP2C19*2 -Tm 69R 10 μM 0.75 - - 0.75 0.75 - 500 nM
CYP2C19*4 -Tm F 10 μM - 0.75 - 0.75 - 0.75 500 nM
CYP2C19*4 -Tm R 10 μM - 0.75 - 0.75 - 0.75 500 nM
CYP2C19*5 -Tm F 10 μM - - 0.75 - 0.75 0.75 500 nM
CYP2C19*5 -Tm R 10 μM - - 0.75 - 0.75 0.75 500 nM
증류수 4.5 4.5 4.5 1.5 1.5 1.5
최종부피 15 15 15 15 15 15
반응은 상기 실시예 1과 유사하게 두 단계(1단계: 실시간 PCR 반응 및 2단계: 용해곡선 분석 반응)로 나누어서 수행하되, 조건을 표 13 및 14와 같이 사이클 수를 각각 20 및 17의 두 가지로 달리하여 분석하였다.
첫 번째 조건의 동시다중 분석 반응을 위한 온도 프로파일
95℃ 15 min Cycle # 구분
95℃ 30 sec
20
1단계 실시간 PCR 반응
58℃ 30 sec
72℃ 30 sec
95℃ 10 sec
2단계 용해곡선 분석
65℃ 5초당
0.5℃ 상승
90℃
두 번째 조건의 동시다중 분석 반응을 위한 온도 프로파일
95℃ 15 min Cycle # 구분
95℃ 30 sec
17
1단계 실시간 PCR 반응
58℃ 30 sec
72℃ 30 sec
95℃ 10 sec
2단계 용해곡선 분석
65℃ 5초당
0.5℃ 상승
90℃
상기 분석 결과 첫 번째 및 두 번째 조건 모두 Tm 값이 약 3℃정도 차이가 나는 CYP2C19*2 및 CYP2C19*5 혼합시료에서 두 개의 피크를 확인할 수 있었고, Tm 값의 차이가 더 적은 CYP2C19*2 및 CYP2C19*4 혼합시료 또는 CYP2C19*4 및 CYP2C19*5 혼합시료에서는 두 개의 피크를 확인할 수 없었다(표 15 내지 18 및 도 3 및 4).
첫 번째 조건의 실측 시료별 한계 사이클
형광염료 시료번호 한계 사이클(C(t)) 평균 C(t)

SYBR
1
 18.7
18.44
18.27
18.37

SYBR
2
 18.29
18.42
18.56
18.42

SYBR
3
 17.83
18.01
18.04
18.17

SYBR
4
 17.34
17.19
17.07
17.17

SYBR
5
 16.86
16.93
16.92
16.99

SYBR
6
 17.02
17.06
17.05
17.12
첫 번째 조건의 2단계 용해곡선 반응의 결과
형광염료 시료번호 Tm(℃) 평균 Tm(℃) 피크 높이 시작온도(℃) 종료온도(℃)

SYBR
1		 72.5
72.67		 128.63 68.5 77.5
72.5 153.02 68 81.5
73 147.37 68.5 77

SYBR
2		 74
74		 164.07 68 77.5
74 127.7 68.5 77.5
74 163.17 68 77.5

SYBR
3		 75.5
75.5		 131.56 68.5 79.5
75.5 120.79 68.5 80
75.5 117.89 68.5 79

SYBR
4		 73.5
73.5		 153.13 69 77.5
73.5 194.35 69 77.5
73.5 181.1 69 77.5

SYBR
5		 75.5
75.5		 127.73 69 79
75.5 125.07 69 79.5
75.5 116.6 69 79

SYBR
6		 75
75		 141.71 69 79
75 140.53 68.5 79
75 139.81 69 80
두 번째 조건의 실측 시료별 한계 사이클
형광염료 시료번호 한계 사이클(C(t)) 평균 C(t)

SYBR
1		 17.63
16.8
16.56
16.22

SYBR
2		 16.42
16.22
16.21
16.02

SYBR
3		 16.27
16.22
16.04
16.35

SYBR
4		 15.66
15.3
15.05
15.19

SYBR
5		 15.29
14.82
14.47
14.69

YBR
6		 15.09
15.09
14.96
15.22
두 번째 조건의 2단계 용해곡선 반응의 결과
형광염료 시료번호 Tm(℃) 평균 Tm(℃) 피크 높이 시작온도(℃) 종료온도(℃)

SYBR
1		 72.5
72.83		 31.04 68 76.5
73 39.52 67.5 77
73 35.75 67.5 76.5

SYBR
2		 74
74		 38.74 67.5 77.5
74 39.92 67.5 78.5
74 40.62 68 80

SYBR
3		 75.5
75.5		 28.79 67.5 80.5
75.5 31.56 67.5 81.5
75.5 27.11 68 79

SYBR
4		 73.5
73.5		 48.87 67.5 77
73.5 65.07 67.5 79
73.5 59.5 67.5 77.5

SYBR
5		 73
73		 37.19 67.5 78.5
73 40.13 68 79
73 40.68 67.5 79

SYBR
6		 74.5
74.33		 49.26 67.5 79
74 49.52 67.5 83.5
74.5 51.93 67.5 81.5
따라서, SYBR Green과 같은 비특이적 삽입 형광염료를 이용한 실시간 PCR 반응시 표적 DNA의 Tm 값의 차이 및 PCR 반응 사이클의 조절에 따라 동시다중분석이 가능함을 확인할 수 있었다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구 범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
<110> HeimBiotek Inc. <120> A mutlflex method for analyzing realtime PCR product using Tm value analysis <130> PD14-5152 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2C19*2 -Tm F <400> 1 gtgactgctt gcgtatttgt g 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2C19*2 -Tm 69R <400> 2 ccttgacctg ttaaacatcc g 21 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2C19*2 -Tm 86R <400> 3 gcttctcaag cattactcct tg 22 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2C19*4 -Tm F <400> 4 ccactcctct cccagtgatt g 21 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2C19*4 -Tm R <400> 5 gccactgaag gagcatactt ac 22 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2C19*5 -Tm F <400> 6 ccctcctatg attcaccgaa c 21 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2C19*5 -Tm R <400> 7 tcctcatgtg taactgtgag ag 22

Claims (10)

  1. 비특이적 삽입 형광염료 및 주형 핵산분자가 포함된 PCR 반응액 내에, 1 번째 내지 n 번째 Tm 값을 각각 갖는 1 번째 내지 n 번째 비표지 PCR 산물을 각각 증폭할 수 있는 1 번째 내지 n 번째 비표지 프라이머쌍을 혼합한 후, 5 내지 25 cycle의 실시간 PCR 반응을 수행하는 실시간 PCR 단계(상기 n은 2 내지 5 중 어느 한 정수이고, 상기 1번째 내지 n 번째 Tm 값은 서로 다름); 및
    상기 실시간 PCR 산물을 열변성 시킨 후 용해점 곡선을 분석하는 용해점 곡선 분석단계를 포함하는 동시다중 실시간 PCR 산물 분석방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 PCR 반응액은 dNTP 혼합물, 2가 금속이온 및 열안정성 DNA 중합효소가 포함된 완충수용액인, 동시다중 실시간 PCR 산물 분석방법.
  3. 제1항에 있어서,
    인접한 Tm 값을 갖는 상기 비표지 PCR 산물들 사이의 상기 Tm의 차이는 2 내지 5℃인, 동시다중 실시간 PCR 산물 분석방법.
  4. 제1항에 있어서,
    인접한 크기를 갖는 상기 비표지 PCR 산물들 사이의 상기 크기의 차이는 2 내지 50 bp인, 동시다중 실시간 PCR 산물 분석방법.
  5. 비특이적 삽입 형광염료 및 주형 핵산분자가 포함된 PCR 반응액 내에, 비특이적 삽입 형광염료 및 주형 핵산분자가 포함된 PCR 반응액 내에, 1 번째 내지 n 번째 Tm 값을 각각 갖는 1 번째 내지 n 번째 비표지 PCR 산물을 각각 증폭할 수 있는 1 번째 내지 n 번째 비표지 프라이머쌍(상기 n은 2 내지 5 중 어느 한 정수이고, 상기 1 번째 내지 n 번째 Tm 값은 서로 다름), 및 1 번째 내지 m 번째 파장의 빛을 각각 방출하는 형광분자를 각각 포함하고 있는 1 번째 내지 m 번째 탐침 및 상기 1 번째 내지 m 번째 탐침에 의해 각각 검출이 되는 1 번째 내지 m 번째 표지 PCR 산물을 각각 증폭할 수 있는 1 번째 내지 m 번째 표지 프라이머쌍(상기 m은 2 내지 8 중 어느 한 정수이고, 상기 1 번째 내지 m 번째 파장은 서로 다름)을 혼합한 후, 5 내지 25 cycle의 실시간 PCR 반응을 수행하면서 상기 표지 PCR 산물들에 의해 생성되는 형광을 분석하는 실시간 PCR 단계; 및
    상기 비표지 PCR 산물들을 열변성 시킨 후 용해점 곡선을 분석하는 용해점 곡선 분석단계를 포함하는 동시다중 실시간 PCR 산물 분석방법.
  6. 제5항에 있어서,
    인접한 Tm 값을 갖는 상기 비표지 PCR 산물들 사이의 상기 Tm의 차이는 2 내지 5℃인, 동시다중 실시간 PCR 산물 분석방법.
  7. 제5항에 있어서,
    인접한 크기를 갖는 상기 비표지 PCR 산물들 사이의 상기 크기의 차이는 2 내지 50 bp인, 동시다중 실시간 PCR 산물 분석방법.
  8. 1 번째 내지 n 번째 Tm 값을 각각 갖는 1 번째 내지 n 번째 비표지 PCR 산물을 각각 증폭할 수 있는 1 번째 내지 n 번째 비표지 프라이머쌍(상기 n은 2 내지 5 중 어느 한 정수이고, 상기 1 번째 내지 n 번째 Tm 값은 서로 다름), 및 1 번째 내지 m 번째 파장의 빛을 각각 방출하는 형광분자를 각각 포함하고 있는 1 번째 내지 m 번째 탐침 및 상기 1 번째 내지 m 번째 탐침에 의해 각각 검출이 되는 1 번째 내지 m 번째 표지 PCR 산물을 각각 증폭할 수 있는 1 번째 내지 m 번째 표지 프라이머쌍(상기 m은 2 내지 8 중 어느 한 정수이고, 상기 1 번째 내지 m 번째 파장은 서로 다름)을 포함하는 동시다중 실시간 PCR 산물 분석용 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    인접한 Tm 값을 갖는 상기 비표지 PCR 산물들 사이의 상기 Tm의 차이는 2 내지 5℃인, 동시다중 실시간 PCR 산물 분석용 조성물.
  10. 제8항에 있어서,
    인접한 크기를 갖는 상기 비표지 PCR 산물들 사이의 상기 크기의 차이는 2 내지 50 bp인, 동시다중 실시간 PCR 산물 분석용 조성물.
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