CN108004299B - 一种使用基因组dna测定端粒长度的荧光定量原位杂交(q-fish)方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种使用基因组DNA测定端粒长度的荧光定量原位杂交(Q‑FISH)方法:将基因组DNA固定于玻片后与端粒‑特异性PNA探针杂交,再采集荧光数据;该方法同时适用于分裂活跃及衰老细胞的端粒长度测定;可获得多个端粒长度参数:平均端粒长度,端粒长度变异,长度异常端粒的频率,消除了单一依赖平均端粒长度评价端粒功能获得信息的缺陷。本发明还提供了一种特异性更强的端粒‑特异性PNA探针,将TTAGGG缩短到2个重复,使探针用量减半而荧光信号加倍。本发明同时提供了一种端粒长度标准品及其制备方法,可用于测量每个端粒的碱基长度,还可作为不同试验间的校正标准。若本发明采用自动化的检测方法,可大量样品的处理,较其他方法节省人力。
Description
技术领域
本发明涉及一种使用基因组DNA来测量个体端粒的长度的方法及端粒长度的标准品及其制备方法,具体涉及一种使用基因组DNA测定端粒长度的荧光定量原位杂交(Q-FISH)方法,属于分子生物学检测领域。
背景技术
端粒是位于真核细胞线性染色体末端的一小段DNA-蛋白质复合体,其作用是保护染色体DNA的末端,避免染色体DNA的降解、末端融合以及非正常重组等。在哺乳动物细胞中,端粒DNA由TTAGGG序列重复串联组成。由于DNA的末端复制问题,细胞的每次分裂都伴随着端粒DNA一小段序列的丢失。细胞的每次分裂都会伴随着染色体末端端粒的缩短,细胞也因此逐渐老化、直至丧失复制能力而死亡。一部分丧失关键细胞周期检测点功能的细胞可能会跃过细胞复制性衰老继续分裂最终进入危机期。这个时期的极少数细胞获得了端粒酶活性,并且继续分裂转化为肿瘤细胞。
端粒长度的变化与多种疾病密切相关,如癌症、早衰综合征等。端粒缩短不仅与老化有关,而且与几种与年龄相关的疾病有关,如肿瘤,糖尿病,神经变性疾病,心血管疾病,特别是心力衰竭。端粒长度可作为生物或细胞衰老的生物标志物,作为染色体稳定性,端粒酶活性,增殖能力和衰老过程的有用指标。因此,测量端粒长度能提供与疾病相关的重要信息。最常用的端粒长度检测方法包括:端粒末端限制性片段分析(terminal restrictionfragment,TRF),定量PCR(qPCR),单链端粒长度分析(single telomere length analysis,STELA),荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)和流式荧光原位杂交(flow cytometry and flow fluorescence in situ hybridization,Flow FISH)。
端粒末端限制性片段分析是最早最经典的端粒长度检测的方法。此方法是根据端粒序列特异且重复的特性,用一组缺乏端粒识别位点的频繁切割限制性内切酶消化基因组DNA,基因组DNA被消化成短片段,端粒DNA则不被切割以较长的片段保留。不同长度的DNA消化产物在琼脂糖凝胶上分离,用端粒DNA特异的探针通过Southern blotting方法检测端粒长度。提取的基因组DNA的完整性对TRF法定量端粒长度十分重要,DNA降解会导致对端粒长度评估的不准确。TRF的局限在于测量的是群体细胞的平均端粒长度(平均TL),且需要的DNA量多。此外,这种方法检测的端粒长度包含了亚端粒DNA。
为了克服分析端粒长度需要DNA量多的局限,以qPCR为基础的端粒长度检测方法得以研发。用与端粒C链和G链都能退火但与其他碱基不匹配的引物通过PCR扩增端粒,前两个循环用低温退火使引物与端粒DNA模板配对产生端粒产物,其余循环用高温退火确保仅扩增前两个循环得到的端粒产物(抑制引物和端粒DNA模板退火和引物二聚体产生)。端粒扩增产物(T)的量与扩增的单拷贝基因的量(S)进行比值来对端粒长度定量。qPCR的局限是需要扩增对照基因,而扩增的对照基因在基因组中是独特的,其拷贝数的变异和染色体的复制会改变基因拷贝数,从而显著改变T/S值。因此,qPCR法只适合用于二倍体和核型稳定的细胞和样本,转化细胞系和肿瘤组织样本是不适合的。此外,qPCR法也只能评估平均端粒长度,而且样本内和样本间的差异还是比较高的,不同实验室得出的结果相差很大。
STELA测定利用所有端粒末端都有富含G的3'单链突出,以突出的3’单链为模板退火并连接一个接头到端粒的5’末端,以接头引物和一条染色体上特异亚端粒引物扩增单个染色体端粒单链区。但不是所有端粒末端都有合适的用于设计亚端粒引物的序列,因此这种方法仅适合于几个特征性染色体末端。STELA方法需要具备单分子PCR技术经验,对技术操作要求较高,操作过程比较耗时。尽管能检测单个染色体末端端粒长度的微小改变,但不能代表细胞整体端粒长度状态,也不适合分析较长的端粒(>20kb)。
Q-FISH是用荧光标记的(CCCTAA或TTAGGG)3肽核酸探针与分裂中期细胞的变性端粒DNA重复序列杂交,荧光信号可以被检测,通过软件与已知端粒长度的标准品比对来分析端粒长度。Q-FISH能检测每条染色体上的端粒长度,还能检测极短端粒重复序列(<0.5 kb)的末端和端粒融合事件。分裂中期Q-FISH分析不仅能评估不同染色体端粒的差异也能分析无端粒染色体不稳定的频率。为了解决Q-FISH不能检测衰老细胞、不分裂细胞和高度畸变细胞的端粒,对检测低有丝分裂指数的细胞型困难等问题,研究开发了分裂间期(Interphase)Q-FISH,这种方法能够分析来源于分裂间期血细胞和组织切片细胞的端粒长度,通过端粒探针荧光信号和中心体探针信号的比值分析端粒长度。但是,组织切片可能不含有完整的胞核,此外分裂间期Q-FISH不能分析每个染色体端粒长度和无端粒染色体,得出的也是平均端粒长度。
Flow FISH是用荧光标记的(CCCTAA或TTAGGG)3肽核酸探针与悬浮细胞杂交,端粒荧光信号用流式细胞仪分析。Flow FISH能够精确检测每个细胞的平均端粒长度,能够用于检测经流式分离的细胞亚群(根据大小、抗体标记等)的端粒长度,但检测的也是平均端粒长度。而且Flow-FISH要求完整的细胞核,就要求迅速处理样本。
目前基于基因组DNA检测的端粒长度或者评估平均端粒长度或者仅适于测定较短端粒长度,然而使用平均端粒长度作为评价端粒功能的指标,不能提供端粒封端状态的全部信息,因为人细胞为二倍体,含有92个单独的端粒,如果平均端粒长度作为唯一参数使用,将丢失许多端粒编码的生物标记物与临床相关的信息。小鼠的遗传研究表明,最短的端粒对于染色体稳定性和细胞活力至关重要,并且是与年龄有关的病理学的原因,证明等位基因端粒长度在端粒功能障碍方面的重要性。在流行病学或临床研究中以端粒长度测定结果为依据,验证了与人类老化生物学有关的一系列假想,结论通常与假想不一致。尽管这些不一致可能源于使用不同的端粒长度测量技术,但是使用平均端粒长度作为唯一的参数也许是以前研究中最大的限制。为了充分界定端粒和疾病的关系,需要开发更好地评估人体细胞端粒功能和健康状况的工具。
我们前期的研究中,使用端粒Q-FISH与中期染色体的核型分析。该方法允许测量所有染色体末端的个体端粒长度。通过使用这种方法,证明端粒长度变异(TLV)是膀胱,肺和乳腺癌癌症风险的生物标志物。更重要的是,发现TLV与平均TL组合是癌症风险预测的更好的生物标志物,比单纯TL或TLV更好,提供了多个端粒参数可以更好地定义端粒功能的初步证据。然而,这种核型分析方法是非常劳动密集的,并且需要从培养细胞制备染色体。
基于上述几种测定端粒的方法的缺陷,急需开发一种新的测定端粒长度的方法,不但可以评估平均端粒长度,而且能够表征端粒长度异常的情况,以更好地评估端粒功能。
发明内容
针对现有技术中仅能测定平均端粒长度,不能同时测定端粒长度变异等问题,本发明提供一种使用基因组DNA测定端粒长度的荧光定量原位杂交(Q-FISH)方法,可以使用保存的DNA样品,得到多个端粒长度参数:平均端粒长度(TL),端粒长度变异(TLV),非常短的端粒的频率和非常长的端粒的频率。
本发明的另一目的是提供一种特异更强的端粒-特异性PNA探针,能够避免与亚端粒区域发生杂交。
本发明的再一目的是提供一种端粒长度的标准品及其制备方法,该端粒长度的标准品含有多个重复端粒序列。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案。
一种使用基因组DNA测定端粒长度的荧光定量原位杂交(Q-FISH)方法,采用以下步骤:
(1)提取基因组DNA;
(2)将步骤(1)中的基因组DNA涂覆并固定于载玻片上,与端粒-特异性PNA探针完成杂交;
(3)采集荧光信号和图像并测量荧光强度,计算端粒长度参数。
所述端粒长度指标包括平均端粒长度、端粒长度变异,长度异常端粒的频率,如非常短的端粒的频率和非常长的端粒的频率;端粒的长度可以以相对荧光强度单位(FIU)进行计量。
作为优化,步骤(2)中还包括将不同长度的端粒长度标准品涂覆并固定于载玻片上,与端粒-特异性PNA探针完成杂交;步骤(3)为采集荧光信号和图像并测量荧光强度,根据不同长度的端粒长度标准品的荧光强度获得荧光强度-碱基长度的标准曲线及方程,进而计算端粒长度参数;端粒长度以碱基对数量(bp)表示。
所述基因组DNA在杂交前不需要使用限制性内切酶消化处理。基因组DNA的提取可以采用苯酚/氯仿抽提法、纯化柱法或者其他提取方法;获取基因组DNA的材料可来源于人体一切含有细胞核的细胞或组织,比如血液、脱落细胞或冰冻组织,这些组织或细胞可以提取完整基因组DNA。杂交使用的基因组DNA的量为0.1 ng-200 ng,优选为50 ng-100 ng,过多的DNA量将导致端粒相互重叠,使荧光强度增强。
载玻片为常规的表面抛光的无色透明玻璃载玻片,可从商业途径购买得到,如Arrayit Corporation(Sunnyvale,CA)的载玻片,其大小为22×70 mm。由于玻片表面光滑,可减少背景荧光信号,从而提高检测非常短的端粒的灵敏度。每个DNA样品在载玻片上的涂覆形状可以是方形的,也可以是圆形的,每片载玻片上可涂覆容纳1到多个样品,优选为16-24个样品,本发明的一个实施例中涂覆形状为圆形,直径为5mm。每片载玻片上涂覆多个样品可减少样品之间的杂交变化,降低实验成本,有助于一次处理大量样品。
基因组DNA或不同长度的端粒长度标准品与端粒-特异性PNA探针的杂交可以在8-64孔的杂交盒上完成,杂交盒可从商业途径购买获得。
所述端粒-特异性PNA探针为N端带有荧光基团的miniPEG-γ PNA;端粒-特异性PNA探针碱基序列如SEQ ID NO:1所示,其中,第3位碱基A与第7位碱基T的γ位修饰二甘醇(miniPEG);所述荧光基团可以选择发射红光、绿光、蓝光或其它稳定的不易光漂白(Photobleaching)的荧光基团,如,发射红光的Cy3或绿光的Alexa 488。本发明的一个实施例中为Cy3荧光基团。为了使PNA探针更易结合并增加PNA探针的溶解度,荧光基团与N端碱基间可添加1-2个O-linker,其分子式为-NH(CH2)2O(CH2)2OCH2CO-。
上述端粒-特异性PNA探针还可用于基于细胞的测定端粒长度的Q-FISH法。
所述端粒长度标准品包含多个端粒重复序列(TTAGGG),优选的端粒重复序列长度为100bp-4kb。
上述端粒长度标准品通过以下方法获得:
a)合成包含XhoI和SalI酶切位点的TTAGGG重复片段(端粒片段);
b)以端粒重复片段为模板进行PCR,得PCR产物;
c)将序列正确的步骤b)获得的PCR产物最终克隆入质粒载体,获得重组质粒;
d)将步骤c)的重组质粒XhoI酶切为开链;
e)以步骤c)的重组质粒为模板进行PCR,得PCR产物SalI酶切后获得端粒插入片段;
f)将步骤d)的开链与步骤e)的端粒插入片段以Chew-back方式(单链退火拼接)连接,获得新的闭环质粒;
g)以步骤f)获得的新的闭环质粒为对象重复步骤d)-f)一到多次;
h)将步骤g)获得的闭环质粒在非端粒片段区域一侧酶切为开链或两侧酶切后释放出端粒片段,即为端粒长度标准品。
所述端粒重复片段,包含多个端粒重复序列,优选为5-15个重复;其紧邻端粒重复序列的5’端与3’端分别连接有XhoI和SalI限制性内切酶位点。在本发明的一个实施例中选择包含12个端粒重复片段的模板,其5’端包含KpnI和XhoI酶切位点,3’端包含SalI酶切位点。
作为优选,步骤(2)中具体的步骤为:
a)将基因组DNA或不同长度的端粒长度标准品分别溶于结合缓冲液,再涂覆于载玻片上;
b)上述步骤a)获得的载玻片于75℃下加热1小时,然后在0-4℃冷甲醇中固定,然后烘干玻片,得覆载DNA的载玻片;
c)端粒-特异性PNA探针溶于杂交缓冲液,涂覆于上述覆载DNA的载玻片完成杂交并漂洗。
通过上述步骤a)-b)获得的覆载DNA的载玻片可以在室温下黑暗中保存,以这种方式存储的覆载DNA的载玻片可以在4周内进行步骤c),以用于端粒长度测定。
所述杂交缓冲液含有3-5wt%阻断剂,pH为7.5;所述阻断剂可选择常用商业化的核酸杂交阻断剂,在本发明的一个实施例中使用了罗氏阻断剂(货号1096176)。
步骤c)的漂洗过程可以采用Q-FISH操作中常用的漂洗液,如磷酸盐缓冲液(PBS)或者柠檬酸钠缓冲液(SSC),还可以添加去污剂,如0.1 wt%的Tween-20。
作为优选,所述步骤(3)中每个样品随机分析2000个以上端粒用于计算,优选为3000-5000个。
所述平均端粒长度为所观测所有端粒长度的平均值,可以荧光强度或碱基数量为单位;端粒长度变异为所观测所有端粒长度的变异系数(CV),用来表示端粒之间端粒长度分布的总体变化;非常短的端粒的频率或非常长的端粒的频率为所观测所有端粒中非常短或者非常长的端粒的数量所占总体端粒数量的百分比(%)。
本发明具有以下优点:
本发明的Q-FISH方法为基于DNA的方法,DNA不需要酶切消化,不但适用于分裂活跃的细胞,而且还可以测定衰老细胞;本发明可以获得4个端粒长度的参数,消除了单一依赖平均端粒长度评价端粒功能获得信息的缺陷;本发明可测量所有染色体末端端粒长度,不仅适用于新鲜样品而且也适用于保存的DNA样品;本发明提供的端粒长度标准品可以作为不同试验间的校正标准,消除平行试验或者不同研究中的误差,提高不同试验结果的准确性;若本发明采用自动化的检测方法,还适于大量样品的处理;本发明的端粒-特异性PNA探针对碱基进行了修饰,获得了更高的特异性和亲和性,将重复缩短到2个重复,使探针用量减少了一半,而荧光信号实现了加倍。
附图说明
图1为YoYo-1染料和端粒-特异性PNA探针与DNA结合后的荧光图像;
图2为端粒长度标准品的制备过程示意图;
图3为不同端粒长度标准品片段的琼脂糖凝胶电泳;
图4为含400bp端粒重复片段的端粒长度标准品的荧光图像;
图5为含2400bp端粒重复片段的端粒长度标准品的荧光图像;
图6为原代人胚肺成纤维细胞(WI38)基因组DNA的端粒荧光图像;
图7为人乳腺癌细胞(MCF-7)基因组DNA的端粒荧光图像;
图8为原代人胚肺成纤维细胞(WI38)端粒长度分布;
图9为人乳腺癌细胞(MCF-7)端粒长度分布;
图10为Q-FISH后原代人胚肺成纤维细胞(WI38)代表性中期图像;
图11为Q-FISH后人乳腺癌细胞(MCF-7)代表性中期图像;
图12为不同来源细胞端粒长度分布(百分比)的比较。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明,但本发明不受下述实施例的限制。
下述实施例中结合缓冲液配制方法如下:10 g NaI (Sigma-Aldrich)以6.6 mL0.5% NaH2PO2(Sigma-Aldrich)溶解,避光保存至4℃中备用。
下述实施例中杂交缓冲液采用以下方法配制:取10 mL甲酰胺加入200 µL浓度为1M Tris-HCl缓冲液(pH 7.5),再加入6 mL浓度为10wt%的阻断剂(罗氏,货号1096176),然后加入400 µL 50× Denhart’s溶液,最后加入4 mL ddH2O补至总体积20 mL。上述杂交缓冲液分装为1 mL包装后于-20℃下保存,可保存至少6个月。
上述50×Denhardt's溶液含有(500 mL):多聚蔗糖5 g,聚乙烯吡咯烷酮5 g,牛血清白蛋白5 g,可自行配置或通过商业途径购买。
上述10wt%的阻断剂采用以下方法配制:将1g阻断剂溶于10 mL马来酸缓冲液配制为10wt%的溶液,所述马来酸缓冲液含0.1 M马来酸,0.15 M NaCl,pH为7.5。
实施例1 端粒-特异性PNA探针的制备与效果。
1.1 端粒长度标准品的制备
端粒-特异性PNA探针碱基序列如SEQ ID NO:1所示,N端修饰荧光基团Cy3,荧光基团与N端碱基间添加1个O-linker,其序列为:Cy3-O-TTAGGGTTAGGG,下划线碱基为修饰miniPEG,由PNA Bio(Thousands Oaks,CA)合成。
1.2 端粒-特异性PNA探针与端粒结合的荧光检测
将两片覆载相同的从血液白细胞中提取的DNA样品的载玻片以0.3 M的YoYo-1染料和端粒-特异性PNA探针处理,拍摄100倍油镜下的荧光图像(Leica DM400B荧光显微镜连接Hamamatsu ORCA-flash 2.8数码相机,曝光250 ms,Metamorph图像采集软件),图片如图1所示:图1A是经YoYo-1染料染色的图像,显示DNA覆盖的部分(右半边);而图1B是端粒-特异性PNA探针处理后的图像,图像中随机分布着点状的明亮端粒荧光信号。
实施例2 端粒长度标准品的制备。
2.1 端粒长度标准品的制备
端粒长度标准品的制备过程如图2,具体过程如下:
(1)合成单链端粒重复片段,包含12个端粒重复序列,5’端包含KpnI和XhoI位点,3’端包含SalI位点,其序列如SEQ ID NO:2所示,由Integrated DNA Technologies,Inc合成;
(2)以上述端粒重复片段为模板进行PCR,PCR的正向引物(TLM-F)序列如SEQ IDNO:3所示,反向引物序列(TLM-R)如SEQ ID NO:4所示,55度退火,30个循环放大,得PCR产物;将PCR产物克隆连接到pCR4-TOPO TA载体(Life Technologies,Grand Island,NY)中,并通过Sanger DNA测序(Genwiz,Germantown,MD)验证序列正确,然后通过KpnI和SalI酶切后从TA载体释放双链端粒重复片段。通过在1.5%琼脂糖凝胶上电泳分离,并用Qiagen的DNA凝胶纯化试剂盒纯化条带;
c)将序列正确的步骤b)获得的片段克隆入pUC19质粒载体,获得重组质粒;上述重组质粒进行PCR,PCR的正向引物(pUC19-F)序列如SEQ ID NO:5所示,反向引物(pUC19-R)序列如SEQ ID NO:6所示,55度退火,30个循环放大,得PCR产物;
d)将步骤c)的重组质粒以XhoI酶切为开链;
e)将步骤c)的PCR产物以SalI酶切获得端粒插入片段;
f)将步骤d)的开链与步骤e)的端粒插入片段用Gibson Assembly克隆试剂盒以Chew-back方式连接,获得新的闭环质粒;
g)以步骤f)获得的新的闭环质粒为对象重复步骤d)-f)一到多次;
h)将步骤g)获得的闭环质粒以XhoI酶切为开链,即为端粒长度标准品。
为了检查长度,将不同重复次数的端粒长度标准品用XhoI酶和SalI酶双酶切,并在1.5%琼脂糖凝胶上电泳以确认长度,结果如图3所示,其中Telo为不同大小的端粒长度标准品,Vector为XhoI酶切后的空白pUC19质粒载体,Ladder为碱基量为100bp-4kb的DNAMarker。最后,获得100,200,400,600,900 bp以及1.2,2.4和3.6 kb端粒重复片段,并选择为端粒长度标准品。
2.2 端粒长度标准品的荧光
将0.1 ng的含有400 bp与2.4 kp端粒重复片段的端粒长度标准品涂覆于直径为0.5 cm的载玻片区域,与探针杂交后拍摄100倍油镜下的荧光图像(Leica DM400B荧光显微镜连接Hamamatsu ORCA-flash 2.8数码相机,曝光250 ms,Metamorph图像采集软件),如图4和图5所示:不同长度的端粒长度标准品可以产生由长度决定的强弱不同的荧光信号,且均高于背景噪声,说明制备的端粒长度标准品适用于本测定端粒长度的方法。
实施例3 使用基因组DNA的Q-FISH法测定端粒长度。
3.1 使用基因组DNA的Q-FISH法测定端粒长度
(1)分别从原代人胚肺成纤维细胞(WI38)和人乳腺癌细胞(MCF-7)提取基因组DNA。
(2)分别将两细胞系提取的100 ng基因组DNA和不同长度的端粒长度标准品(100bp,200 bp,400 bp,600 bp,900 bp,1.2 kb,2.4 kb,3.6 kb)分别涂覆于直径为0.5 cm的载玻片区域,于75℃下加热1小时,然后在0-4℃冷甲醇中固定,之后烘干玻片,得到覆载DNA的载玻片。
再将端粒-特异性PNA探针溶于杂交缓冲液,其浓度为0.3 μg/mL,涂覆于上述覆载DNA的载玻片,75℃下变性5 min,30℃孵育3 h以完成杂交,然后以不同浓度SSC于42℃下漂洗三次(1× SSC-0.5× SSC-0.1× SSC),每次10min。
(3)将上述载玻片拍摄100倍油镜下的荧光图像(Leica DM400B荧光显微镜连接Hamamatsu ORCA-flash 2.8数码相机,曝光250 ms,Metamorph图像采集软件),如图6(WI38)和图7(MCF-7)所示:不同长度的端粒长度产生由长度决定的强弱不同的荧光信号。
最终,两个细胞系分别采集3000个左右的端粒荧光点(约30个细胞的端粒量)进行数据分析,采用Image J,自定义插件Telometer,来量化荧光端粒信号,此软件由约翰霍普金斯大学Alan Meeker博士团队开发,用于计数和量化端粒点在FISH后的选定区域,非特异性荧光斑点将被排除在分析之外。
计算WI38和MCF-7细胞的端粒长度、平均端粒长度,根据其进行长度分组,并将长度大于3倍平均端粒长度的端粒定义为非常长的端粒;低于0.1倍平均端粒长度的端粒定义为非常短的端粒,结果见表1;以不同长度端粒所占百分比为纵坐标,对不同组别的端粒作图,如图8(WI38)和图9(MCF-7)所示:其中,图8中1-10分别代表长度为小于58(FIU),58-582,583-1459,1460-2919,2920-5840,5841-8760,8761-11681,11682-17522,17523-23363,等于和大于23364的端粒;图9中1-10分别代表长度为小于6,6-61,62-153,154-307,308-614,615-921,922-1228,1229-1842,1843-2456,等于和大于2456的端粒。WI38是原代细胞系,平均端粒长度与正常细胞相似,MCF-7是乳腺癌细胞系,由图8-9及表1可知,与WI38细胞的端粒长度相比,MCF-7平均端粒长度较短,长度异常的端粒(非常短的端粒和非常长的端粒)有着较高的百分比。
表1 WI38和MCF-7细胞端粒长度参数
3.2 细胞中期Q-FISH测定端粒长度
为了检测使用基因组DNA的Q-FISH法测定端粒长度与基于细胞的Q-FISH方法的结果差异,对原代人胚肺成纤维细胞(WI38)和人乳腺癌细胞(MCF-7)进行Q-FISH法测定端粒长度。具体方法如下:
制备染色体溶液后,滴加到干净的显微镜载玻片上,并与含0.3 μg/mL 端粒-特异性PNA探针,1 μL FITC标记的着丝粒PNA探针的的杂交缓冲液杂交。然后将载玻片置于Hybex微阵列杂交炉中,75℃下变性5 min,30℃杂交3 h。杂交后,将载玻片在42℃依次洗涤10 min:1×SSC中一次,0.5×SSC中一次,0.1×SSC中一次。将载玻片置于含300 ng/mL4%-6二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的抗褪色载体培养基中。
在Q-FISH后拍摄荧光图像,如图10(WI38)和图11(MCF-7)所示。使用Isis FISH成像软件(MetaSystems Inc.,Boston,MA,USA)分析数字化图像,该软件允许同时测量92个端粒信号。由于WI38是正常的细胞具有较长的端粒长度,MCF-7是乳腺癌细胞端粒长度较短,因此,图10中端粒荧光强度比图11中端粒荧光强度高。采用DNA的Q-FISH法中,图6中荧光点比图7中荧光点荧光强度高。因此,使用基因组DNA的Q-FISH法测定端粒长度的结果与传统Q-FISH法一致、可信,可以用于端粒长度测定。
实施例4 使用基因组DNA的Q-FISH法测定端粒长度。
参照实施例3中的测定与分析方法,对两种正常的白细胞(A和B)和白血病白细胞(R83)的端粒长度进行分析,将长度大于3倍平均端粒长度的端粒定义为非常长的端粒;低于0.1倍平均端粒长度的端粒定义为非常短的端粒,结果见表2。根据端粒长度对其进行分组,以不同长度端粒所占百分比为纵坐标,对不同组别的端粒作图12,其中,1-10分别代表长度为下列长度的端粒:<0.01倍,0.1倍-0.01倍,0.25倍-0.1倍,0.5倍-0.25倍,0.5倍-1倍,1倍-1.5倍,1.5倍-2倍,2倍-3倍,3倍-4倍,>4倍平均端粒长度。由图12可以看出,除了白血病细胞的平均端粒长度较短外,正常细胞的非常短的端粒和非常长的端粒所占百分比较低,而白血病细胞非常短的端粒和非常长的粒所占百分比较高;而且白血病细胞的长度差异也比较大。
表2 不同白细胞端粒长度参数
<110> 济南海湾生物工程有限公司
<120> 一种使用基因组DNA测定端粒长度的定量荧光原位杂交(Q-FISH)方法
<130> 20170930
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttagggttag gg 12
<210> 2
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggtacctcga gggttagggt tagggttagg gttagggtta gggttagggt tagggttagg 60
gttagggtta gggttagggt tagggtcgac 90
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tggtacctcg agggttagg 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtcgacccta accctaacc 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
agtgaattcg agctcggtac 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
caagcttgca tgcctgcag 19
Claims (11)
1.一种用于端粒长度测定的端粒-特异性PNA探针,其特征在于,端粒-特异性PNA探针为N端带有荧光基团的miniPEG-γ PNA,端粒-特异性PNA探针碱基序列如SEQ ID NO:1所示;其第3位碱基与第7位碱基的γ位修饰miniPEG。
2.根据权利要求1所述的端粒-特异性PNA探针,其特征在于,荧光基团选自Cy3或Alexa488。
3.根据权利要求1所述的端粒-特异性PNA探针,其特征在于,荧光基团与N端碱基间添加1-2个O-linker。
4.一种端粒长度标准品的制备方法,其特征在于,通过以下步骤获得:
a)合成包含XhoI和SalI酶切位点的TTAGGG重复片段;
b)以端粒重复片段为模板进行PCR,得PCR产物;
c)将序列正确的步骤b)获得的PCR产物最终克隆入质粒载体,获得重组质粒;
d)将步骤c)的重组质粒XhoI酶切为开链;
e)以步骤c)的重组质粒为模板进行PCR,得PCR产物SalI酶切后获得端粒插入片段;
f)将步骤d)的开链与步骤e)的端粒插入片段以Chew-back方式连接,获得新的闭环质粒;
g)以步骤f)获得的新的闭环质粒为对象重复步骤d)-f)一到多次;
h)将步骤g)获得的闭环质粒在非端粒片段区域酶切为开链或释放出端粒片段,即为端粒长度标准品;
所述端粒重复片段,包含多个端粒重复序列;其紧邻端粒重复序列的5’端与3’端分别连接有XhoI 和SalI限制性内切酶位点。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,包含多段端粒重复序列TTAGGG;所述多段端粒重复序列总长度为100bp-4kb。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述多段端粒重复序列总长度为100,200,400,600,900 bp以及1.2,2.4和3.6 kb。
7.一种非诊断目的的使用基因组DNA测定每个端粒长度的荧光定量原位杂交方法,其特征在于,采用以下步骤:
(1)提取基因组DNA;
(2)将步骤(1)中的基因组DNA涂覆并固定于载玻片上,与端粒-特异性PNA探针完成杂交;将不同长度的端粒长度标准品涂覆并固定于载玻片上,与端粒-特异性PNA探针完成杂交;
(3)采集不同长度的端粒长度标准品的荧光信号和图像并测量荧光强度,获得荧光强度-碱基长度标准曲线及方程,进而计算端粒长度参数;
步骤(2)中具体的步骤为:
a)将基因组DNA或不同长度的端粒长度标准品分别溶于结合缓冲液,再涂覆于载玻片上;
b)上述步骤a)获得的载玻片于75℃下加热1小时,然后在0-4℃冷甲醇中固定,然后烘干玻片,得覆载DNA的载玻片;
c)端粒-特异性PNA探针溶于杂交缓冲液,涂覆于上述覆载DNA的载玻片完成杂交并漂洗;
所述结合缓冲液配制方法如下:10 g NaI以6.6 mL0.5% NaH2PO2溶解;
所述端粒-特异性PNA探针为权利要求1-3任一所述的端粒-特异性PNA探针;
所述端粒长度标准品为权利要求4-6任一所述的制备方法获得的端粒长度标准品。
8.根据权利要求7所述的荧光定量原位杂交方法,其特征在于,杂交使用的基因组DNA的量为0.1 ng-200 ng。
9.根据权利要求7所述的荧光定量原位杂交方法,其特征在于,每片载玻片上可涂覆容纳1到多个样品。
10.根据权利要求7所述的荧光定量原位杂交方法,其特征在于,每片载玻片上可涂覆容纳样品数为16-24个。
11.根据权利要求7所述的荧光定量原位杂交方法,其特征在于,步骤(3)中每个样品随机分析2000个以上端粒。
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