JPWO2016194552A1 - 複数の標的核酸の検出キット及びそれを用いる検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
アニーリング温度T1において、第1標的核酸が解離した2本の1本鎖のいずれかに特異的に結合する第1標的用プライマーと、アニーリング温度T1において、第2標的核酸が解離した2本の1本鎖のいずれかに特異的に結合する第2標的用プライマーと、アニーリング温度T1において、第1標的核酸が解離した2本の1本鎖のいずれかに特異的に結合する第1標的用プローブであって、結合により蛍光シグナルが変化する第1標識物を有するものと、DNAポリメラーゼと、伸長温度T2において、DNAポリメラーゼの作用により、第1標的核酸が解離した2本の1本鎖及び第2標的核酸が解離した2本の1本鎖に結合するデオキシリボヌクレオチド3リン酸と、アニーリング温度T1においては、第1標的核酸が解離した2本の1本鎖及び第2標的核酸が解離した2本の1本鎖のいずれにも結合せず、第2標的検出温度T3において、第2標的核酸が解離した2本の1本鎖のいずれかに特異的に結合する第2標的用プローブであって、結合により蛍光シグナルが変化する第2標識物を有するものとを含有する。
<QProbe法におけるマイコプラズマP1遺伝子と内部コントロールの検出>
(プライマー)
実施の形態1におけるPCR法に用いたプライマー対は、(表1)に示すとおりである。
実施の形態1でPCR法に用いた核酸試料を以下に示す。
マイコプラズマ肺炎の病原体であるマイコプラズマ・ニューモニエ由来の膜タンパク質であるP1タンパク質をコードする遺伝子断片(配列番号1と2のプライマー対で増幅される配列)を人工合成後、pMD20Tベクターに組み込んだプラスミドDNAである。このプラスミドDNAは、タカラバイオ株式会社に合成を委託して作製した。
配列番号1と2のプライマー対を共通プライマーとして増幅できるように、プライマー対と相補的な塩基配列を含む配列を人工合成後、pMD20Tベクターに組み込んだプラスミドDNAである。このプラスミドDNAはタカラバイオ株式会社に合成を委託して作製した。
上記のプラスミドの長さは、pMYCは2942bp、pICM5は2886bpである。
実施の形態1におけるPCR法に用いるプローブの情報は、(表2)に示すとおりである。
実施の形態1では、1種類の反応液が入った1つの反応容器中で増幅する2つの標的核酸について、第1標的であるpMYCに特異的にアニールするQProbe(MYC QP)のTm値をプライマーのTm値よりも高い温度に設定し、増幅反応中に検出した。
QProbeを用いた際の解析方法は、LightCycler nanoに備え付けの解析ソフトが対応していないため、特許文献5(日本国特許第4724380号公報)に記載されている方法を参考に、得られた生データに対して補正演算処理を行った。
fn=fhyb.n/fden.n (数1)
fe=fhyb.e/fden.e (数1’)
fn:(数1)により算出されたnサイクルにおける蛍光強度値
fhyb.n:nサイクル目の伸長ステップの蛍光強度値
fden.n:nサイクル目の変性ステップの蛍光強度値
fe:(数1’)により算出された第2標的検出ステップにおける蛍光強度値
fhyb.e:第2標的検出ステップ55℃の蛍光強度値
fden.e:第2標的検出ステップ95℃の蛍光強度値
Fn=fn/f10 (数2)
Fe=fe/f10 (数2’)
Fn:10サイクル目の(数1)により得られた蛍光強度値を1とした時のnサイクル目の相対値
Fe:10サイクル目の(数1’)により得られた蛍光強度値を1とした時の第2標的検出ステップの相対値
Fs=Fe−F44 (数3)
Fs:第2標的の測定値
Fsの値を、第2標的核酸の有無の判定に用いた。
第1標的核酸の有無は、測定試料のF44の値と閾値1を比較して[測定試料のF44<閾値1]を陽性と判定した。
<第2検出ステップのプロファイルを変更したQProbe法におけるマイコプラズマP1遺伝子と内部コントロールの検出>
fe=fhyb.e/fden.44
fe:第2標的検出ステップにおける蛍光強度値
fhyb.e:第2標的検出ステップ55℃の蛍光強度値
fden.44:増幅反応の最終サイクルの95℃の蛍光強度値
<Eprobe法におけるマイコプラズマP1遺伝子と内部コントロールの検出>
Fs=Fe−F40
<TaqManプローブ法におけるマイコプラズマP1遺伝子と内部コントロールの検出>
<実検体を用いたQProbe法におけるマイコプラズマP1遺伝子と内部コントロールの検出>
<QProbe法におけるクラミジア内在性プラスミド遺伝子と淋菌CMT遺伝子の検出>
性器クラミジア感染症の病原体であるクラミジア・トラコマチス共通の内在性プラスミド(pLGV440)遺伝子断片を人工合成後、pUC57ベクターに組み込んだプラスミドDNAは、北海道システムサイエンス株式会社に合成を委託して作製した。
淋病の病原体であるナイセリア・ゴノレアのシトシンDNAメチルトランスフェラーゼ(CMT)遺伝子断片を人工合成後、pUC57ベクターに組み込んだプラスミドDNAは北海道システムサイエンス株式会社に合成を委託して作製した。
<増幅反応中に複数回第2標的を検出するQProbe法におけるマイコプラズマP1遺伝子と内部コントロールの検出>
fen=fhyb.en/fden.en (数4)
fen:(数4)により算出されたn回目の第2標的検出ステップにおける蛍光強度値
fhyb.en:n回目の第2標的検出ステップ55℃の蛍光強度値
fden.en:n回目の第2標的検出ステップ95℃の蛍光強度値
Fen=fen/f10 (数5)
Fen:10サイクル目の(数4)により得られた蛍光強度値を1とした時のn回目の第2標的検出ステップの相対値
Fs1=Fe1−F20 (数6)
Fs2=Fe2−F27 (数6’)
Fs3=Fe3−F34 (数6’’)
Fs4=Fe4−F41 (数6’’’)
Fs1:1回目の第2標的検出ステップの測定値
Fs2:2回目の第2標的検出ステップの測定値
Fs3:3回目の第2標的検出ステップの測定値
Fs4:4回目の第2標的検出ステップの測定値
閾値13は、陰性対照のF41の平均値−標準偏差の3倍(以下mean−3SD)の値を用いた。
2 溶液
10 第1標的核酸
13 第1標的用Fプライマー
14 第1標的用Rプライマー
15 第1標的用プローブ
16 第1標識物
20 第2標的核酸
23 第2標的用Fプライマー
24 第2標的用Rプライマー
25 第2標的用プローブ
26 第2標識物
30 DNAポリメラーゼ
31 デオキシリボヌクレオチド3リン酸
T0 変性温度
T1 アニーリング温度
T2 伸長温度
T3 第2標的検出温度
Claims (7)
- 変性温度をT0、アニーリング温度をT1、伸長温度をT2、第2標的検出温度をT3とすると、T0>T2≧T1>T3を満たすように温度設定される複数の標的核酸の検出キットであって、
前記変性温度T0において、2本鎖の水素結合が切断され、それぞれ2本の1本鎖に解離する、第1標的核酸及び第2標的核酸を含み得る溶液に、
前記アニーリング温度T1において、前記第1標的核酸が解離した2本の1本鎖のいずれかに特異的に結合する第1標的用プライマーと、
前記アニーリング温度T1において、前記第2標的核酸が解離した2本の1本鎖のいずれかに特異的に結合する第2標的用プライマーと、
前記アニーリング温度T1において、前記第1標的核酸が解離した2本の1本鎖のいずれかに特異的に結合する第1標的用プローブであって、結合により蛍光シグナルが変化する第1標識物を有するものと、
DNAポリメラーゼと、
前記伸長温度T2において、前記DNAポリメラーゼの作用により、前記第1標的核酸が解離した2本の1本鎖及び前記第2標的核酸が解離した2本の1本鎖に結合するデオキシリボヌクレオチド3リン酸と、
前記アニーリング温度T1においては、前記第1標的核酸が解離した2本の1本鎖及び前記第2標的核酸が解離した2本の1本鎖のいずれにも結合せず、前記第2標的検出温度T3において、前記第2標的核酸が解離した2本の1本鎖のいずれかに特異的に結合する第2標的用プローブであって、結合により蛍光シグナルが変化する第2標識物を有するものとを含有することを特徴とする複数の標的核酸の検出キット。 - 前記第1標識物及び前記第2標識物は、QProbe(登録商標)プローブ、Eprobe(登録商標)プローブ及びTaqMan(登録商標)プローブからなる群から選択される請求の範囲第1項記載の複数の標的核酸の検出キット。
- 前記蛍光シグナルは、アニールすると消光するものである請求の範囲第1項または第2項記載の複数の標的核酸の検出キット。
- 前記蛍光シグナルは、アニールすると発光するものである請求の範囲第1項または第2項記載の複数の標的核酸の検出キット。
- 前記第1標的核酸はマイコプラズマP1遺伝子であり、前記第2標的核酸は内部コントロールである請求の範囲第1項から第4項のいずれかに記載の複数の標的核酸の検出キット。
- 前記第1標的核酸はクラミジア内在性プラスミド遺伝子であり、前記第2標的核酸は淋菌CMT遺伝子である請求の範囲第1項から第4項のいずれかに記載の複数の標的核酸の検出キット。
- 請求の範囲第1項から第6項のいずれかに記載の複数の標的核酸を測定する検出キットを用いる検出方法であって、
前記溶液の温度を前記変性温度T0に上げて、含有が疑われる前記第1標的核酸及び前記第2標的核酸のそれぞれを、2本の1本鎖に解離させる解離ステップと、
前記溶液の温度を前記アニーリング温度T1まで下げて、前記第1標的用プローブによる蛍光シグナルに基づき、第1標的核酸の存否を検出する第1標的核酸検出ステップと、
前記溶液の温度を前記伸長温度T2とし、含有が疑われる前記第1標的核酸及び前記第2標的核酸が解離した、それぞれの2本の1本鎖を2本鎖の第1標的核酸及び第2標的核酸に増幅する増幅ステップと、
前記溶液の温度を前記第2標的検出温度T3まで下げて、前記第2標的用プローブによる蛍光シグナルに基づき、第2標的核酸の存否を検出する第2標的核酸検出ステップとを含む検出方法。
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