KR20170139150A - 복수의 표적 핵산의 검출 키트 및 그것을 사용하는 검출 방법 - Google Patents
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Abstract
1종류의 반응액이 들어 있는 1개의 반응용기 및 단일의 표지를 사용하여, 복수의 유전자를 동시에 증폭·검출할 수 있는, 복수의 표적 핵산의 검출 키트를 제공한다. 변성 온도(T0)에서 해리되는, 제1 표적 핵산(10) 및 제2 표적 핵산(20)을 포함한다고 의심되는 용액에, DNA 폴리메라아제(30)와, 어닐링 온도(T1)에서, 제1 표적 핵산 유래의 단일 가닥에 결합하는 제1 표적용 프라이머(13)와, 어닐링 온도(T1)에서, 제2 표적 핵산 유래의 단일 가닥에 결합하는 제2 표적용 프라이머(23)와, 어닐링 온도(T1)에서, 제1 표적 핵산 유래의 단일 가닥에 결합하는 제1 표적용 프로브(15)와, 어닐링 온도(T1) 및 신장 온도(T2)보다도 낮은, 제2 표적 검출 온도(T3)에서, 제2 표적 핵산 유래의 단일 가닥에 결합하는 제2 표적용 프로브(25)를 함유시켜 이루어지고, T0>T2≥T1>T3을 충족시킨다.
Description
본 발명은 PCR법을 개선하고, 복수의 표적 핵산을 측정하는 검출 키트 및 그 관련 기술에 관한 것이다.
유전자 검사에 있어서, 복수의 표적 유전자의 측정이 필요한 경우도 많다. 예를 들면, 인플루엔자의 A형과 B형, 인플루엔자와 RSV, 게다가 인간 메타뉴모바이러스, 성감염증의 클라미디아와 임균, 마이코플라스마와 그 내성 인자 등이다.
병상이 유사한데다 동일한 시기에 동시에 감염이 확대되는 경우 등은 이것들을 감별하여 진단하고, 치료 방침을 세우는 것도 생각할 수 있다. 또한 내성 인자의 존재는 투약의 선정 판단 등에도 사용된다.
한편, 단독의 측정 항목에서도, 그 측정이 정말로 잘 진행되었는지 아닌지를 확인하는 수단으로서 내부 콘트롤을 설정하는 것도 유용하다. 이것은 검출 목적인 표적 유전자와는 관계없는 핵산 배열을 증폭하도록 미리 준비해 두고, 표적 유전자의 유무에 관계없이 반응이 잘 진행되었는지 아닌지를 확인할 수 있는 것이다. 이것으로 측정 시약이나 장치가 유효하게 작용했는지 아닌지를 측정 내에 확인할 수 있다.
이와 같이, 복수의 표적 핵산을 검출하기 위해서는, 별개의 측정을 실시하거나, 또는 각각의 표적 핵산의 검출에 상이한 표지 색소 등을 사용하여 식별하는 수단을 생각할 수 있다.
또는, 동시에 증폭 반응을 행한 후에, 완만하게 온도를 상승(또는 하강)시켜, 형광 시그널의 변화율이 피크를 나타내는 온도와 표적 핵산의 융해 온도로부터 식별 판단하는 것(열융해 곡선 분석법)도 가능하다.
그렇지만, 별개의 측정으로는 시간이나 비용이 들어가며, 상이한 표지물을 식별하는 것도, 복수의 표지 시약의 준비뿐만 아니라 분석 장치의 파장 설정 등에서 비용이 든다.
열융해 곡선 분석법을 사용하는 경우에는, 비용은 낮지만 완만하게 온도의 변화를 시킬 필요가 있기 때문에, 정확한 분석을 하기 위해서는 5∼10분 정도의 시간을 들여 온도 변화를 행하지 않으면 안 된다.
특허문헌 1(일본 특개 2002-136300호 공보)에서는, 상이한 반응액이 들어간 복수의 반응용기를 준비하고, 각각 증폭 검출한다. 항목마다 시약 조제, 분주 작업이 있어 손이 많이 간다고 하는 문제점이 있다.
특허문헌 2(일본 특개 2004-203호 공보)에서는, 1종류의 반응액이 들어 있는 1개의 반응용기에서 복수의 유전자를 동시 증폭한다. 유전자마다 표지 색소를 바꾸어 둠으로써 식별한다. 사용하는 표지 색소의 수만큼, 검출하는 장치의 광학계가 복수 필요하게 되어 가기 때문에 장치의 비용이 높아져 버린다고 하는 문제점이 있다.
특허문헌 3(일본 특개 2008-173127호 공보)에서는, 1종류의 반응액이 들어 있는 1개의 반응용기에서 복수의 유전자를 동시 증폭한다. 항목마다, PCR 산물이나 표지 프로브의 해리 온도를 바꾸어, 증폭 후에 저온측에서 고온측으로 서서히 온도를 상승시켜 형광값을 모니터링 하는 해리 곡선 분석(「열융해 곡선 분석」과 동의.)을 행하여, 염기서열에 의존하는 각각의 해리 온도에 있어서의 피크의 유무를 모니터링 함으로써 식별한다.
융해 곡선 분석시의 온도 변화의 속도를 높이면 각 항목의 융해 온도를 식별하는 것이 곤란하게 되기 때문에, PCR 반응 후 5∼10분 정도 시간이 더 걸려 버린다고 하는 문제점이 있다.
특허문헌 4(일본 특표 2012-513215호 공보)에서는, 1개의 반응액 용기에서 복수의 유전자를 동시 증폭한다. 유전자마다, PCR 산물의 해리온도와 프라이머의 융해 온도를 바꾸어, 각각의 융해 온도에서 형광을 모니터링 하여 식별한다.
통상의 PCR 프로필은 1 사이클 중에, 변성, 어닐링·신장 스텝을 두지만, 특허문헌 4에서는, 항목마다 PCR 산물의 융해 온도를 바꾸기 때문에, 고려해야 할 조건이 많아, 프로필의 설계가 곤란하며, 측정 시간도 길어진다. 온도 변화가 심하기 때문에, 장치의 부담도 크다고 하는 문제점이 있다.
그래서, 본 발명은 1종류의 반응액이 들어 있는 1개의 반응 용기 및 단일의 표지를 사용하여, 복수의 유전자를 동시에 증폭·검출할 수 있는, 복수의 표적 핵산의 검출 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
제1 발명에 따른 복수의 표적 핵산의 검출 키트는 변성 온도를 T0, 어닐링 온도를 T1, 신장 온도를 T2, 제2 표적 검출 온도를 T3라고 하면, T0>T2≥T1>T3을 충족시키도록 온도 설정되는 복수의 표적 핵산의 검출 키트로서, 변성 온도(T0)에 있어서, 이중 가닥의 수소 결합이 절단되어, 각각 2개의 단일 가닥으로 해리되는, 제1 표적 핵산 및 제2 표적 핵산을 포함할 수 있는 용액에,
어닐링 온도(T1)에서, 제1 표적 핵산이 해리된 2개의 단일 가닥 중 어느 하나에 특이적으로 결합하는 제1 표적용 프라이머와, 어닐링 온도(T1)에서, 제2 표적 핵산이 해리된 2개의 단일 가닥 중 어느 하나에 특이적으로 결합하는 제2 표적용 프라이머와, 어닐링 온도(T1)에서, 제1 표적 핵산이 해리된 2개의 단일 가닥 중 어느 하나에 특이적으로 결합하는 제1 표적용 프로브이며, 결합에 의해 형광 시그널이 변화되는 제1 표지물을 갖는 것과, DNA 폴리메라아제와, 신장 온도(T2)에서, DNA 폴리메라아제의 작용에 의해, 제1 표적 핵산이 해리된 2개의 단일 가닥 및 제2 표적 핵산이 해리된 2개의 단일 가닥에 결합하는 데옥시리보뉴클레오티드삼인산과, 어닐링 온도(T1)에서는, 제1 표적 핵산이 해리된 2개의 단일 가닥 및 제2 표적 핵산이 해리된 2개의 단일 가닥의 어느 쪽에도 결합하지 않고, 제2 표적 검출 온도(T3)에서, 제2 표적 핵산이 해리된 2개의 단일 가닥 중 어느 하나에 특이적으로 결합하는 제2 표적용 프로브이며, 결합에 의해 형광 시그널이 변화되는 제2 표지물을 갖는 것을 함유한다.
바람직하게는, 제1, 제2 표지물은 QProbe(등록상표) 프로브, Eprobe(등록상표) 프로브 및 TaqMan(등록상표) 프로브로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
형광 시그널은 어닐링하면 소광하는 것, 어닐링하면 발광하는 것 어느 것이어도 된다.
제1 표적 핵산 및 제2 표적 핵산은, 바람직하게는, 마이코플라스마 P1 유전자와 내부 콘트롤, 또는 클라미디아 내재성 플라스미드 유전자와 임균 CMT 유전자이다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 의하면, 1종류의 표지물을 사용하여 복수의 표적 핵산을 1종류의 혼합액으로 검출할 수 있다. 열융해 곡선 분석 없이 복수의 표적 핵산의 식별이 가능하기 때문에, 측정 시간을 대폭 단축할 수 있어, 실용적 효과가 높다.
도 1은 본 발명의 실시형태 1에 있어서의 혼합액의 온도 변화를 나타내는 그래프,
도 2는 본 발명의 실시형태 1에 있어서의 형광 측정의 타이밍 설명도,
도 3은 본 발명의 실시형태 1에 있어서의 판정 방법을 나타내는 플로우차트,
도 4는 본 발명의 실시형태 1에 있어서의 음성 대조의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 5는 본 발명의 실시형태 1에 있어서의 제1 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 6은 본 발명의 실시형태 1에 있어서의 제2 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 7은 본 발명의 실시형태 1에 있어서의 제1, 제2 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 8은 본 발명의 실시형태 2에 있어서의 형광 측정의 타이밍 설명도,
도 9는 본 발명의 실시형태 2에 있어서의 음성 대조의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 10은 본 발명의 실시형태 2에 있어서의 제1 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 11은 본 발명의 실시형태 2에 있어서의 제2 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 12는 본 발명의 실시형태 2에 있어서의 제1, 제2 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 13은 본 발명의 실시형태 3에 있어서의 판정 방법을 나타내는 플로우차트,
도 14는 본 발명의 실시형태 3에 있어서의 음성 대조의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 15는 본 발명의 실시형태 3에 있어서의 제1 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 16은 본 발명의 실시형태 3에 있어서의 제2 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 17은 본 발명의 실시형태 3에 있어서의 제1, 제2 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 18은 본 발명의 실시형태 4에 있어서의 음성 대조의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 19는 본 발명의 실시형태 4에 있어서의 제1 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 20은 본 발명의 실시형태 4에 있어서의 제2 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 21은 본 발명의 실시형태 4에 있어서의 제1, 제2 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 22는 본 발명의 실시형태 5에 있어서의 음성 대조의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 23은 본 발명의 실시형태 5에 있어서의 제1 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 24는 본 발명의 실시형태 5에 있어서의 제2 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 25는 본 발명의 실시형태 5에 있어서의 제1, 제2 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 26은 본 발명의 실시형태 6에 있어서의 음성 대조의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 27은 본 발명의 실시형태 6에 있어서의 제1 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 28은 본 발명의 실시형태 6에 있어서의 제2 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 29는 본 발명의 실시형태 6에 있어서의 제1, 제2 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 30은 본 발명의 실시형태 7에 있어서의 혼합액의 온도 변화를 나타내는 그래프,
도 31은 본 발명의 실시형태 7에 있어서의 음성 대조의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 32는 본 발명의 실시형태 7에 있어서의 제1 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 33은 본 발명의 실시형태 7에 있어서의 제2 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 34는 본 발명의 실시형태 7에 있어서의 제1, 제2 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 35는 본 발명의 실시형태 1에 있어서의 온도 변화의 확대도,
도 36은 본 발명의 실시형태 1에 있어서의 혼합액 성분을 나타내는 설명도,
도 37(a)는 본 발명의 실시형태 1에 있어서의 변성 스텝의 설명도, (b) 본 발명의 실시형태 1에 있어서의 어닐링 스텝의 설명도, (c) 본 발명의 실시형태 1에 있어서의 신장 스텝의 설명도, (d) 본 발명의 실시형태 1에 있어서의 신장 완료 스텝의 설명도,
도 38(a)는 본 발명의 실시형태 1에 있어서의 변성 스텝의 설명도, (b) 본 발명의 실시형태 1에 있어서의 어닐링 스텝의 설명도.
도 2는 본 발명의 실시형태 1에 있어서의 형광 측정의 타이밍 설명도,
도 3은 본 발명의 실시형태 1에 있어서의 판정 방법을 나타내는 플로우차트,
도 4는 본 발명의 실시형태 1에 있어서의 음성 대조의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 5는 본 발명의 실시형태 1에 있어서의 제1 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 6은 본 발명의 실시형태 1에 있어서의 제2 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 7은 본 발명의 실시형태 1에 있어서의 제1, 제2 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 8은 본 발명의 실시형태 2에 있어서의 형광 측정의 타이밍 설명도,
도 9는 본 발명의 실시형태 2에 있어서의 음성 대조의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 10은 본 발명의 실시형태 2에 있어서의 제1 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 11은 본 발명의 실시형태 2에 있어서의 제2 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 12는 본 발명의 실시형태 2에 있어서의 제1, 제2 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 13은 본 발명의 실시형태 3에 있어서의 판정 방법을 나타내는 플로우차트,
도 14는 본 발명의 실시형태 3에 있어서의 음성 대조의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 15는 본 발명의 실시형태 3에 있어서의 제1 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 16은 본 발명의 실시형태 3에 있어서의 제2 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 17은 본 발명의 실시형태 3에 있어서의 제1, 제2 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 18은 본 발명의 실시형태 4에 있어서의 음성 대조의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 19는 본 발명의 실시형태 4에 있어서의 제1 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 20은 본 발명의 실시형태 4에 있어서의 제2 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 21은 본 발명의 실시형태 4에 있어서의 제1, 제2 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 22는 본 발명의 실시형태 5에 있어서의 음성 대조의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 23은 본 발명의 실시형태 5에 있어서의 제1 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 24는 본 발명의 실시형태 5에 있어서의 제2 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 25는 본 발명의 실시형태 5에 있어서의 제1, 제2 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 26은 본 발명의 실시형태 6에 있어서의 음성 대조의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 27은 본 발명의 실시형태 6에 있어서의 제1 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 28은 본 발명의 실시형태 6에 있어서의 제2 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 29는 본 발명의 실시형태 6에 있어서의 제1, 제2 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 30은 본 발명의 실시형태 7에 있어서의 혼합액의 온도 변화를 나타내는 그래프,
도 31은 본 발명의 실시형태 7에 있어서의 음성 대조의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 32는 본 발명의 실시형태 7에 있어서의 제1 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 33은 본 발명의 실시형태 7에 있어서의 제2 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 34는 본 발명의 실시형태 7에 있어서의 제1, 제2 표적 핵산의 형광 강도 변화를 나타내는 그래프,
도 35는 본 발명의 실시형태 1에 있어서의 온도 변화의 확대도,
도 36은 본 발명의 실시형태 1에 있어서의 혼합액 성분을 나타내는 설명도,
도 37(a)는 본 발명의 실시형태 1에 있어서의 변성 스텝의 설명도, (b) 본 발명의 실시형태 1에 있어서의 어닐링 스텝의 설명도, (c) 본 발명의 실시형태 1에 있어서의 신장 스텝의 설명도, (d) 본 발명의 실시형태 1에 있어서의 신장 완료 스텝의 설명도,
도 38(a)는 본 발명의 실시형태 1에 있어서의 변성 스텝의 설명도, (b) 본 발명의 실시형태 1에 있어서의 어닐링 스텝의 설명도.
본 발명자들은, PCR법에 있어서의, 프로브의 어닐링 온도의 조건 설정과 온도 변화 프로필을 조합한, 1종류의 반응액이 들어 있는 1개의 반응용기에서 단일 형광 표지를 사용한 복수 핵산을 검출하는 키트를 개발했다.
본 키트에서는, 도 35에 도시하는 바와 같이, 4개의 온도, 즉 변성 온도(T0)(95℃), 어닐링 온도(T1)(70℃), 신장 온도(T2)(72℃) 및 제2 표적 검출 온도(T3)(55℃)를 사용한다. 이들 온도는 T0>T2≥T1>T3을 충족시키도록 온도 설정된다. 물론, 이들 온도 수치는 예시에 지나지 않으며, 후술하는 바와 같이, 여러 가지로 변경할 수 있다.
복수의 표적 핵산이란 제1 표적 핵산 및 제2 표적 핵산이지만, 필요하면, 제3 표적 검출 온도(T4)(T3>T4) 등의 설정 온도를 증가시킴으로써, 제3 표적과 그 밖의 표적 핵산을 추가할 수도 있다.
도 36을 참조하면서, 본 키트의 내용에 대해 설명한다. 우선, 본 키트에서는, 제1 표적 핵산(10)과 제2 표적 핵산(20)을 검출 대상으로 한다. 이하 설명의 편의를 위해, 용기(1) 내의 용액(2)(상세는 후술한다.)에는, 제1 표적 핵산(10)과 제2 표적 핵산(20) 양쪽이 포함되어 있는 경우(즉, 양성과 양성인 경우)만을 설명한다.
물론, 한쪽 또는 양쪽이 음성인 경우에는, 제1 표적 핵산(10)과 제2 표적 핵산(20)의 적어도 일방 또는 양방이 용액(2)에 포함되어 있지 않게 되고, 이하의 설명에서, 포함되어 있지 않은 표적 핵산에 관한, 형광 시그널 및 증폭이 행해지지 않게 된다.
도 37(a)에 도시하는 바와 같이, 용액(2)의 온도를 상승시켜 변성 온도(T0)가 되면, 제1 표적 핵산(10) 및 제2 표적 핵산(20)은 모두 이중 가닥의 수소 결합이 절단되고, 각각 2개의 단일 가닥(제1 표적 핵산(10)은 제1 단일 가닥(11)과 제2 단일 가닥(12)으로, 제2 표적 핵산(20)은 제1 단일 가닥(21)과 제2 단일 가닥(22)으로) 해리된다.
도 37(b)에 도시하는 바와 같이, 변성 온도(T0)로부터 온도를 내려 어닐링 온도(T1)가 되면, 제1 표적 핵산(10)에 대하여, 제1 표적용 F 프라이머(13)가 제1 단일 가닥(11)의 상보적인 배열에 특이적으로 결합하고, 제1 표적용 R 프라이머(14)가 제2 단일 가닥(12)의 상보적인 배열에 특이적으로 결합한다. 마찬가지로, 제2 표적 핵산(20)에 대하여, 제2 표적용 F 프라이머(23)가 제1 단일 가닥(21)의 상보적인 배열에 특이적으로 결합하고, 제2 표적용 R 프라이머(24)가 제2 단일 가닥(22)의 상보적인 배열에 특이적으로 결합한다.
또한 제1 표지물(16)에 의해 표지된 제1 표적용 프로브(15)가, 도 37(b)에 도시하는 어닐링 온도(T1)에 있어서, 제1 표적 핵산(10) 유래의 제1 단일 가닥(11)의 특정 부위에 특이적으로 결합하여, 제1 표지물(16)은 형광 싸인을 발생한다. 그렇지만, 제2 표지물(26)에 의해 표지된 제2 표적용 프로브(25)는, 어닐링 온도(T1)에서는 제2 표적 검출 온도(T3)보다도 온도가 높기 때문에, 제2 표적 핵산(20) 유래의 제1 단일 가닥(21)에는 결합하지 않고, 제2 표지물(26)은 형광 싸인을 발생하지 않는다.
도 37(c)에 도시하는 바와 같이, 온도를 어닐링 온도(T1)로부터 신장 온도(T2)로 올리면, 용액(2)에, PCR 사이클을 반복하기 위해 충분한 양의, DNA 폴리메라아제(30)와 데옥시리보뉴클레오티드삼인산(31)이 포함되어 있기 때문에, 다음과 같이 증폭 반응이 진행된다.
즉 제1 표적 핵산(10)에 대하여, 제1 단일 가닥(11)에 결합하는 제1 표적용 F 프라이머(13)로부터, 또한 제2 단일 가닥(12)에 결합하는 제1 표적용 R 프라이머(14)로부터, 각각 데옥시리보뉴클레오티드삼인산(31)이 결합하여 신장해 간다.
또한 제2 표적 핵산(20)에 대하여, 제1 단일 가닥(21)에 결합하는 제2 표적용 F 프라이머(23)로부터, 또한 제2 단일 가닥(22)에 결합하는 제2 표적용 R 프라이머(24)로부터 각각 데옥시리보뉴클레오티드삼인산(31)이 결합하여 신장해 간다.
그리고, 증폭 반응이 완료되면, 도 37(d)를 도 36과 비교하면 알 수 있는 바와 같이, 제1 표적 핵산(10) 및 제2 표적 핵산(20) 양쪽이 2배로 증가하게 된다.
다시, 도 37(a)에 도시하는 스텝으로 되돌아와, 이상의 스텝(도 37(a)∼도 37(d))을 반복하면, 제1 표적물(16)에 의한 형광 시그널의 변화와 증폭 반응을 반복할 수 있다.
다음에 도 38을 참조하면서, 변성 온도(T0)로부터 온도를 내려 제2 표적 온도 검출 온도(T3)가 되는 경우에 대하여 설명한다.
변성 온도(T0)에서는, 도 38(a)에 도시하는 바와 같이, 도 37(a)와 동일한 상태가 된다. 그런데, 온도를 제2 표적 온도 검출 온도(T3)로 내리면, 도 37(b)와는 달리, 도 38(b)에 도시하는 상태가 된다.
즉 도 38(b)에 도시하는 바와 같이, 제1 표지물(16)에 의해 표지된 제1 표적용 프로브(15)가 제1 표적 핵산(10) 유래의 제1 단일 가닥(11)의 특정 부위에 특이적으로 결합하고, 제1 표지물(16)의 형광 시그널이 변화되는 점에서는, 도 37(b)와 동일하지만, 제2 표지물(26)에 의해 표지된 제2 표적용 프로브(25)도, 제2 표적 검출 온도(T3)로 되어 있기 때문에, 제2 표적 핵산(20) 유래의 제1 단일 가닥(21)에 결합하여, 제2 표지물(26)의 형광 시그널이 변화된다. 또한, 제1 표지물(16)과 제2 표지물(26)은 동일한 것이 바람직하다.
그 결과, 제2 표지물(26)에 의한 형광 시그널의 변화에 의한 차분(差分)을 파악하면, 제2 표지물(20)의 유무(양성/음성)를 판정할 수 있게 된다.
게다가, 이상 설명으로부터 명확한 바와 같이, 1종류의 반응액이 들어 있는 1개의 반응용기를 사용하여 일련으로 도중에 끊어지지 않는 스텝 중에 복수의 표적 핵산을 검출할 수 있는 것이 이해될 것이다.
이하, 더욱 구체적으로, QProbe(등록상표)법, Eprobe(등록상표)법, TaqMan(등록상표)법에 의한, 3종류의 프로브를 사용한 복수 핵산을 검출하는 실시형태를 나타낸다. 실시하는데 필요한 프라이머 배열 및 각 프로브의 염기서열, 핵산 시료의 정보도 아울러 나타낸다.
(실시형태 1)
<QProbe법에 있어서의 마이코플라스마 P1 유전자와 내부 콘트롤의 검출>
QProbe법에 있어서의 마이코플라스마 P1 유전자와 내부 콘트롤의 검출을 행했다.
<재료 및 방법>
(프라이머)
실시형태 1에 있어서의 PCR법에 사용한 프라이머 쌍은 (표 1)에 나타내는 바와 같다.
서열번호 1, 서열번호 2는 Ieven 등의 보고(The Journal Of Infectious Diseases, 1996; 173; 1445-52)에 기재되어 있는(P1 부착 인자 유전자에 대한 프라이머 쌍) 서열을 사용했다.
(핵산 시료)
실시형태 1에서 PCR법에 사용한 핵산 시료를 이하에 나타낸다.
(pMYC)
마이코플라스마 폐렴의 병원체인 마이코플라스마·뉴모니에 유래의 막 단백질인 P1 단백질을 코딩하는 유전자 단편(서열번호 1과 2의 프라이머 쌍으로 증폭되는 배열)을 인공 합성 후, pMD20T 벡터에 편입한 플라스미드 DNA이다. 이 플라스미드 DNA는 다카라바이오 가부시키가이샤에 합성을 위탁하여 제작했다.
(pICM5)
서열번호 1과 2의 프라이머 쌍을 공통 프라이머로 하여 증폭할 수 있도록, 프라이머 쌍과 상보적인 염기서열을 포함하는 배열을 인공 합성 후, pMD20T 벡터에 편입한 플라스미드 DNA이다. 이 플라스미드 DNA는 다카라바이오 가부시키가이샤에 합성을 위탁하여 제작했다.
(핵산 시료의 조제)
상기의 플라스미드의 길이는 pMYC는 2942bp, pICM5는 2886bp이다.
각 플라스미드의 길이와 플라스미드 용액의 농도(μg/μl)로부터 1μL당의 카피수를 계산한 후, TE 완충 용액(10mM Tris-HCl, 1.0mM EDTA pH 8.0)을 사용하여, pMYC는 1×10^5copies/μl, pICM5는 1×10^3copies/μl가 되도록 희석했다.
(프로브)
실시형태 1에 있어서의 PCR법에 사용하는 프로브의 정보는 (표 2)에 나타내는 바와 같다.
(표 1)의 프라이머 쌍으로 증폭할 수 있는 PCR 산물의 염기서열에서, 서열번호 3 및 서열번호 4는 J-Bio21 센터의 홈 페이지 상의 QProbe 설계 지원 툴을 사용하여 계산한 Tm값을 참고로 하여, 특정 영역을 선택했다.
pMYC에 특이적으로 어닐링하는 QProbe인 MYC QP와, pICM5에 특이적으로 어닐링하는 QProbe인 IC QP의 형광 색소에는 BODIPY(등록상표)FL을 사용하여, 각각 3' 말단의 C를 표지했다. QProbe는 닛테츠스미킨칸쿄 가부시키가이샤에 합성을 위탁하여 제작했다.
(PCR·형광 측정 조건)
실시형태 1에서는, 1종류의 반응액이 들어 있는 1개의 반응용기 중에서 증폭하는 2개의 표적 핵산에 대하여, 제1 표적인 pMYC에 특이적으로 어닐링하는 QProbe(MYC QP)의 Tm값을 프라이머의 Tm값보다도 높은 온도로 설정하고, 증폭 반응 중에 검출했다.
다음에 제2 표적인 pICM5에 특이적으로 어닐링하는 QProbe(IC QP)의 Tm값을 증폭 반응 중의 변화온도(70℃-95℃)보다도 낮은 온도로 설정하고, 증폭 반응 후에 검출했다.
PCR 반응액 조성, 반응 조건을 (표 3)과 (표 4)에 나타내고, 또한 혼합액의 온도 변화를 그래프화한 것을 도 1에 나타낸다.
PCR 및 형광 측정에는, LightCycler(등록상표) nano(로슈·다이아그노스틱스 가부시키가이샤)를 사용했다.
형광 측정시의 여기 파장과 형광 파장의 조합은 510-528nm를 선택했다. 각 사이클의 변성 스텝(95℃)과 신장 스텝(72℃)에서 형광값을 측정하고, 또한 증폭 반응 후에 제2 표적을 검출하기 위한 스텝(95℃와 55℃)에 있어서 형광 측정을 행했다.
증폭 반응의 최종 사이클과, 제2 표적 검출 스텝에 있어서의 형광 측정 조건을 도 2에 나타낸다.
(데이터의 처리 방법)
QProbe를 사용했을 때의 해석 방법은 LightCycler nano에 설치된 해석 소프트웨어가 대응하고 있지 않기 때문에, 특허문헌 5(일본 특허 제4724380호 공보)에 기재되어 있는 방법을 참고로, 얻어진 생데이터에 대하여 보정 연산 처리를 행했다.
증폭 반응과 제2 표적 검출 스텝의 모든 사이클마다, 다음 수식에 의한 연산을 행했다.
fn=fhyb.n/fden.n (수식 1)
fe=fhyb.e/fden.e (수식 1'）
fn: (수식 1)에 의해 산출된 n 사이클에 있어서의 형광 강도값
fhyb.n: n 사이클째의 신장 스텝의 형광 강도값
fden.n: n 사이클째의 변성 스텝의 형광 강도값
fe: (수식 1'）에 의해 산출된 제2 표적 검출 스텝에 있어서의 형광 강도값
fhyb.e: 제2 표적 검출 스텝 55℃의 형광 강도값
fden.e: 제2 표적 검출 스텝 95℃의 형광 강도값
다음에 증폭 반응의 모든 사이클과 제2 표적 검출 스텝에 대하여, 다음 수식으로 연산을 행했다.
Fn=fn/f10 (수식 2)
Fe=fe/f10 (수식 2'）
Fn: 10 사이클째의 (수식 1)에 의해 얻어진 형광 강도값을 1로 했을 때의 n 사이클째의 상대값
Fe: 10 사이클째의 (수식 1'）에 의해 얻어진 형광 강도값을 1로 했을 때의 제2 표적 검출 스텝의 상대값
증폭 반응의 최종 사이클의 Fn의 값인 F44를 제1 표적 핵산의 유무의 판정에 사용했다.
또한 다음 수식에 의한 연산을 행했다.
Fs=Fe-F44 (수식 3)
Fs: 제2 표적의 측정값
Fs의 값을 제2 표적 핵산의 유무의 판정에 사용했다.
QProbe법에 있어서의 판정은 하기에 나타내는 방법으로 행했다.
제1 표적 핵산의 유무는 측정 시료의 F44의 값과 역치(Threshold) 1을 비교하여 [측정 시료의 F44<역치 1]을 양성으로 판정했다.
역치 1은 음성 대조(DNA 대신에 TE 완충액을 첨가한 시약)의 F44의 평균값-표준편차의 3배(이하 mean-3SD)의 값을 사용했다.
제2 표적 핵산의 유무는 제1 표적 핵산이 양성, 음성에 관계되지 않고, Fs의 값과 역치 2를 비교하여 [Fs<역치 2]를 양성으로 판정했다.
역치 2는 pMYC만을 첨가한 시료의 Fs의 mean-3SD의 값을 사용했다. 판정 방법의 플로우차트는 도 3에 나타내는 바와 같다.
마이코플라스마 P1 유전자는 pMYC, 내부 콘트롤은 pICM5를 각각 핵산 시료에 사용하여 PCR을 실시했다.
MYC QP의 배열은 Tm값을 72.5℃, IC QP의 배열은 Tm값을 57.5℃로 설정했다. 그 때문에 PCR 중의 온도 범위(70℃에서 95℃)에서는, 프로브는 MYC QP만을 어닐링 한다고 추측되었다.
제2 표적 검출 스텝의 형광 측정은 95℃와 IC QP의 Tm값보다도 낮은 55℃에서 행하기 때문에, 제2 표적 검출 스텝의 측정값은 MYC QP과 IC QP의 소광을 동시에 검출한다고 추측되었다.
음성 대조의 증폭 곡선은 PCR이 종료되는 44 사이클째까지 소광이 보이지 않고(F44의 값 0.998이 역치 1의 값 0.997보다도 낮지 않기 때문), 이때의 mean-3SD는 0.997이 되고, 실시형태 1의 제1 표적 검출을 위한 역치 1로 하여, (표 5)에 나타낸다. 증폭 곡선을 도 4에 나타낸다.
제1 표적 핵산인 pMYC의 증폭 곡선은 28 사이클 부근에서부터 MYC QP의 어닐링에 수반되는 소광이 관찰되었다.
F44의 값 0.913은 역치 1보다 낮고, pMYC의 목적의 영역이 증폭된 것이 밝혀졌다. 이때의 Fs의 mean-3SD는 -0.056이며, 제2 표적 검출을 위한 역치 2로 하여, (표 5)에 나타낸다. 증폭 곡선을 도 5에 나타낸다.
제2 표적 핵산인 pICM5의 증폭 곡선은 증폭 반응 중은 전혀 소광이 보이지 않고(F44의 값 0.997이 역치 1의 값 0.997보다도 낮지 않기 때문), Fs의 값 -0.118은 역치 2보다 낮았다.
이 결과로부터, pMYC의 목적의 영역이 증폭되지 않은 것과, pICM5의 목적의 영역이 증폭된 것이 밝혀졌다.
Fs의 값을 (표 5)에 나타낸다. 증폭 곡선을 도 6에 나타낸다.
제1 표적 핵산인 pMYC와 제2 표적 핵산인 pICM5의 양쪽을 첨가했을 때의 증폭 곡선은, pMYC의 증폭 곡선과 마찬가지로, 28 사이클 부근에서부터 MYC QP의 어닐링에 수반되는 소광이 관찰되었고, F44의 값 0.912는 역치 1보다 낮고, pMYC의 목적의 영역이 증폭된 것이 밝혀졌다.
Fs의 값 -0.116은 역치 2보다 낮고, pICM5의 목적의 영역이 증폭된 것이 밝혀졌다. Fs의 값을 (표 5)에 나타낸다. 증폭 곡선을 도 7에 나타낸다.
이들 PCR 산물은 PCR 종료 후에 아가로스 전기영동하여, pMYC를 첨가한 시료에서는 206bp 부근, pICM5를 첨가한 시료에서는 150bp 부근에 목적의 PCR 산물이 확인되었다.
이상의 결과로부터, QProbe법에 있어서, 프로브의 설계 방법과 온도 변화 프로필을 조합하고, 1종류의 반응액이 들어 있는 1개의 반응 용기에서 단일 형광 표지를 사용하여, 마이코플라스마 P1 유전자와 내부 콘트롤을 검출할 수 있는 것이 밝혀졌다.
(실시형태 2)
<제2 검출 스텝의 프로필을 변경한 QProbe법에 있어서의 마이코플라스마 P1 유전자와 내부 콘트롤의 검출>
실시형태 1의 제2 표적 검출 스텝의 프로필을 변경한 방법으로 QProbe법에 있어서의 마이코플라스마 P1 유전자와 내부 콘트롤의 검출을 행했다.
PCR에 사용한 프라이머, 프로브, 반응액 조성과 핵산 시료는 실시형태 1과 동일한 것을 사용했다. 본 형태의 반응 조건은 (표 6)에 나타내는 바와 같다.
실시형태 2에서는, 제2 표적 검출 스텝에서 55℃에 있어서 형광 측정을 행했다. 증폭 반응의 최종 사이클과, 제2 표적 검출 스텝에 있어서의 형광 측정 조건을 도 8에 나타낸다.
실시형태 2에 있어서 fe는 다음 연산을 사용하고, 그 밖은 실시형태 1과 동일한 연산 처리를 행했다.
fe=fhyb.e/fden. 44
fe: 제2 표적 검출 스텝에 있어서의 형광강도값
fhyb.e: 제2 표적 검출 스텝 55℃의 형광강도값
fden. 44: 증폭 반응의 최종 사이클의 95℃의 형광강도값
이하에, 실시형태 2의 판정 방법을 나타낸다. 제1 표적 핵산의 유무는 측정 시료의 F44의 값과 역치 3을 비교하여 [측정 시료의 F44<역치 3]을 양성으로 판정했다.
역치 3은 음성 대조의 F44의 평균값-표준편차의 3배(이하 mean-3SD)의 값을 사용했다.
제2 표적 핵산의 유무는, 제1 표적 핵산이 양성, 음성에 관계없이, Fs의 값과 역치 4를 비교하여 [Fs<역치 4]를 양성으로 판정했다.
역치 4는 pMYC만을 첨가한 시료의 Fs의 mean-3SD의 값을 사용했다.
음성 대조의 증폭 곡선은 증폭 반응이 종료되는 44 사이클째까지 소광이 보이지 않고(F44의 값 0.998이 역치 3의 값 0.997보다도 낮지 않기 때문에), 이때의 mean-3SD는 0.997이 되고, 본 예의 제1 표적 검출을 위한 역치 3으로 하여, (표 7)에 나타낸다. 증폭 곡선은 도 9에 나타내는 바와 같다.
제1 표적 핵산인 pMYC의 증폭 곡선은 28 사이클 부근에서 MYC QP의 어닐링에 수반되는 소광이 관찰되었고, F44의 값 0.912는 역치 3보다 낮고, pMYC의 목적의 영역이 증폭된 것이 밝혀졌다.
또한 이 때의 Fs의 mean-3SD는 -0.052이며, 제2 표적 검출을 위한 역치 4로 하여, (표 7)에 나타낸다. 증폭 곡선은, 도 10에 나타내는 바와 같다.
제2 표적 핵산인 pICM5의 증폭 곡선은 증폭 반응 중은 전혀 소광이 보이지 않고(F44의 값 0.997이 역치 3의 값 0.997보다도 낮지 않기 때문), Fs의 값 -0.170은 역치 4보다 낮았다.
이 결과로부터, pMYC의 목적의 영역이 증폭되지 않은 것과, pICM5의 목적의 영역이 증폭된 것이 밝혀졌다. Fs의 값을 (표 7)에 나타낸다. 증폭 곡선을 도 11에 나타낸다.
제1 표적 핵산인 pMYC와 제2 표적 핵산인 pICM5의 양쪽을 첨가했을 때의 증폭 곡선은 pMYC의 증폭 곡선과 마찬가지로, 28 사이클 부근에서 MYC QP의 어닐링에 수반되는 소광이 관찰되었고, F44의 값 0.911은 역치 3보다 낮고, pMYC의 목적의 영역이 증폭된 것이 밝혀졌다.
Fs의 값 -0.114는 역치 4보다 낮고, pICM5의 목적의 영역이 증폭된 것이 밝혀졌다. Fs의 값을 (표 7)에 나타낸다. 증폭 곡선을 도 12에 나타낸다.
이상의 결과로부터, fe의 산출에, 증폭 반응의 최종 사이클의 95℃의 형광강도값(fden. 44)을 사용해도, 제2 표적을 검출할 수 있는 것이 밝혀졌다.
(실시형태 3)
<Eprobe법에 있어서의 마이코플라스마 P1 유전자와 내부 콘트롤의 검출>
Eprobe법에 있어서의 마이코플라스마 P1 유전자와 내부 콘트롤의 검출을 행했다.
PCR에 사용한 프라이머와 핵산 시료는 실시형태 1과 동일한 것을 사용했다. 실시형태 3에 있어서의 PCR법에 사용하는 프로브의 정보는 (표 8)에 나타내는 바와 같다.
Eprobe는 가부시키가이샤 다나폼이 제작한 소프트웨어인 「Edesign」을 사용하여 계산한 Tm값을 참고로 하여, 특정 영역을 선택했다.
pMYC에 특이적으로 어닐링하는 Eprobe인 MYC EP와 pICM5에 특이적으로 어닐링하는 Eprobe인 IC EP의 형광 색소에는 D514를 사용하여, MYC EP는 5' 말단으로부터 19번째의 T를 표지하고, IC EP는 5' 말단으로부터 9번째의 T를 표지했다.
Eprobe는 유로핀제노믹스 가부시키가이샤에 합성을 위탁하여 제작했다. PCR 반응액 조성, 반응 조건을 (표 9)와 (표 10)에 나타낸다.
형광 측정시의 여기 파장과 형광 파장의 조합은 530-548nm를 선택했다.
실시형태 3에 있어서의 Fs는 다음 연산을 사용하고, 그 밖은 실시형태 1과 동일한 연산 처리를 행했다.
Fs=Fe-F40
실시형태 3에 있어서의 판정은 하기에 나타내는 방법으로 행했다. 제1 표적 핵산의 유무는 측정 시료의 F40의 값과 역치 5를 비교하여 [측정 시료의 F40>역치 5]를 양성으로 판정했다.
역치 5는 음성 대조의 F40의 평균값+표준편차의 3배(이하 mean+3SD)의 값을 사용했다.
제2 표적 핵산의 유무는 제1 표적 핵산이 양성, 음성에 관계없이, Fs의 값과 역치 6을 비교하여 [Fs>역치 6]을 양성으로 판정했다.
역치 6은 pMYC만을 첨가한 시료의 Fs의 mean+3SD의 값을 사용했다. 판정 방법의 플로우차트는 도 13에 나타내는 바와 같다.
MYC EP의 배열은 Tm값을 76.4℃에, IC EP의 배열은 Tm값을 59.8℃에 설정했다. 그 때문에 PCR 중의 온도 범위(70℃에서 95℃)에서는, 프로브는 MYC EP만이 어닐링 한다고 추측되었다.
또한, 제2 표적 검출 스텝의 형광 측정은 95℃와 IC EP의 Tm값보다도 낮은 55℃에서 행하기 때문에, 제2 표적 검출 스텝의 측정값은 MYC EP와 IC EP의 발광을 동시에 검출한다고 추측되었다.
음성 대조의 증폭 곡선은 PCR이 종료되는 40 사이클째까지 발광이 보이지 않고(F40의 값 1.007이 역치 5의 값 1.013보다도 높지 않기 때문에), 이때의 mean+3SD는 1.013이 되고, 제1 표적 핵산 검출을 위한 역치 5로 하여, (표 11)에 나타낸다. 증폭 곡선을 도 14에 나타낸다.
제1 표적 핵산인 pMYC의 증폭 곡선은 29 사이클 부근에서 MYC EP의 어닐링에 수반되는 발광이 관찰되었고, F40의 값 2.314가 역치 5보다 높고, pMYC의 목적의 영역이 증폭된 것이 밝혀졌다.
또한 이 때의 Fs의 mean+3SD는 3.695이며, 제2 표적 검출을 위한 역치 6으로 하여 (표 11)에 나타낸다. 증폭 곡선을 도 15에 나타낸다.
제2 표적 핵산인 pICM5의 증폭 곡선은 증폭 반응 중은 전혀 발광이 보이 않고(F40의 값 1.012가 역치 5의 값 1.013보다도 높지 않기 때문), Fs의 값 4.012는 역치 6보다 높았다.
이 결과로부터, pMYC의 목적의 영역이 증폭되지 않은 것과, pICM5의 목적의 영역이 증폭된 것이 밝혀졌다. Fs의 값을 (표 11)에 나타낸다. 증폭 곡선을 도 16에 나타낸다.
제1 표적 핵산인 pMYC와 제2 표적 핵산인 pICM5의 양쪽을 첨가했을 때의 증폭 곡선은 pMYC의 증폭 곡선과 마찬가지로, 29 사이클 부근에서 MYC EP의 어닐링에 수반되는 발광이 관찰되었고, F40의 값 2.355는 역치 5보다 높고, pMYC의 목적의 영역이 증폭된 것이 밝혀졌다.
Fs의 값 4.254는 역치 6보다 높고, pICM5의 목적의 영역이 증폭된 것이 밝혀졌다. Fs의 값을 (표 11)에 나타낸다. 증폭 곡선을 도 17에 나타낸다.
이상의 결과로부터, Eprobe법에서도 프로브의 설계 방법과 온도 변화 프로필을 조합하고, 1종류의 반응액이 들어 있는 1개의 반응용기에서 단일 형광 표지를 사용하여, 마이코플라스마 P1 유전자와 내부 콘트롤을 검출할 수 있는 것이 밝혀졌다.
(실시형태 4)
<TaqMan 프로브법에 있어서의 마이코플라스마 P1 유전자와 내부 콘트롤의 검출>
TaqMan 프로브법에 있어서의 마이코플라스마 P1 유전자와 내부 콘트롤의 검출을 행했다. PCR에 사용한 프라이머와 핵산 시료는 실시형태 1과 동일한 것을 사용했다.
실시형태 4에 있어서의 PCR법에 사용하는 프로브의 정보는 (표 12)에 나타내는 바와 같다.
TaqMan 프로브는 nearest neighbor법을 사용하여 계산한 Tm값을 참고로 하여, 특정 영역을 선택했다.
pMYC에 특이적으로 어닐링하는 TaqMan 프로브인 MYC Taq와 pICM5에 특이적으로 어닐링하는 TaqMan 프로브인 IC Taq의 형광 색소에는, 각각 5' 말단에 FAM(등록상표), 3' 말단에 TAMRA(등록상표)를 표지했다.
TaqMan 프로브는 다카라바이오 가부시키가이샤에 합성을 위탁하여 제작했다. PCR 반응액 조성, 반응 조건을 (표 13)과 (표 14)에 나타낸다.
형광 측정시의 여기 파장과 형광 파장의 조합은 530-548nm를 선택했다.
증폭 반응 후의 제2 표적을 검출하기 위한 스텝에서는 95℃와 50℃에서 형광 측정을 행했다.
실시형태 4에서는 fhyb.e: 제2 표적 검출 스텝 50℃의 형광강도값으로 하고, 그것 이외는 실시형태 1과 동일한 연산 스텝을 행했다.
실시형태 4에 있어서의 판정 방법은 하기에 나타내는 방법으로 행했다. 제1 표적 핵산의 유무는 측정 시료의 F44의 값과 역치 7을 비교하여 [측정 시료의 F44>역치 7]을 양성으로 판정했다.
역치 7은 음성 대조의 F44의 평균값+표준편차의 3배(이하 mean+3SD)의 값을 사용했다.
제2 표적 핵산의 유무는 제1 표적 핵산이 양성, 음성에 관계없이, Fs의 값과 역치 8을 비교하여 [Fs>역치 8]을 양성으로 판정했다.
역치 8은 pMYC만을 첨가한 시료의 Fs의 mean+3SD의 값을 사용했다.
MYC Taq의 배열은 Tm값을 75.8℃에, IC Taq의 배열은 Tm값을 53.7℃에 설정했다. 그 때문에 PCR 중의 온도 범위(70℃에서 95℃)에서는, 프로브는 MYC Taq만 어닐링 한다고 추측되었다.
또한, 제2 표적 검출 스텝의 형광 측정은 95℃와 IC Taq의 Tm값보다도 낮은 50℃에서 행하기 때문에, 제2 표적 검출 스텝의 측정값은 MYC Taq와 IC Taq의 발광을 동시에 검출한다고 추측되었다.
음성 대조의 증폭 곡선은 PCR이 종료되는 44 사이클째까지 발광이 보이지 않고(F44의 값 1.028이 역치 7의 값 1.028보다도 높지 않기 때문에), 이때의 mean+3SD는 1.028이 되고, 제1 표적 핵산 검출을 위한 역치 7로 하여, (표 15)에 나타낸다. 증폭 곡선을 도 18에 나타낸다.
제1 표적 핵산인 pMYC의 증폭 곡선은 28 사이클 부근에서 MYC Taq의 어닐링에 수반되는 발광이 관찰되었고, F44의 값 1.427이 역치 7보다 높고, pMYC의 목적의 영역이 증폭된 것이 밝혀졌다.
또한 이 때의 Fs의 mean+3SD는 0.110이며, 제2 표적 검출을 위한 역치 8로 하여 (표 15)에 나타낸다. 증폭 곡선을 도 19에 나타낸다.
제2 표적 핵산인 pICM5의 증폭 곡선은 증폭 반응 중은 전혀 발광이 보이지 않아(F44의 값 1.028이 역치 7의 값 1.028보다도 높지 않기 때문), Fs의 값 0.130은 역치 8보다 높았다.
이 결과로부터, pMYC의 목적의 영역이 증폭되지 않은 것과, pICM5의 목적의 영역이 증폭된 것이 밝혀졌다.
Fs의 값을 (표 15)에 나타낸다. 증폭 곡선을 도 20에 나타낸다.
제1 표적 핵산인 pMYC와 제2 표적 핵산인 pICM5의 양쪽을 첨가했을 때의 증폭 곡선은, pMYC의 증폭 곡선과 마찬가지로, 29 사이클 부근에서 MYC EP의 어닐링에 수반되는 발광이 관찰되었고, F40의 값 1.348은 역치 7보다 높고, pMYC의 목적의 영역이 증폭된 것이 밝혀졌다.
Fs의 값 0.177은 역치 8보다 높고, pICM5의 목적의 영역이 증폭된 것이 밝혀졌다. Fs의 값을 (표 15)에 나타낸다. 증폭 곡선을 도 21에 나타낸다.
이상의 결과로부터, TaqMan 프로브법에서도 프로브의 설계 방법과 온도 변화 프로필을 조합하고, 1종류의 반응액이 들어 있는 1개의 반응용기에서 단일 형광 표지를 사용하여, 마이코플라스마 P1 유전자와 내부 콘트롤을 검출할 수 있는 것이 밝혀졌다.
(실시형태 5)
<실검체를 사용한 QProbe법에 있어서의 마이코플라스마 P1 유전자와 내부 콘트롤의 검출>
실검체를 사용한, QProbe법에 있어서의 마이코플라스마 P1 유전자와 내부 콘트롤의 검출을 행했다.
마이코플라스마 P1 유전자는 LAMP법(일본 특허 제3313358호)에 의해, 마이코플라스마·뉴모니에가 양성으로 판정된(검사는 가부시키가이샤 비엠엘 위탁) 인두 와이핑액으로부터 QIAamp(등록상표) DNA mini Kit(QIAGEN사)를 사용하여 추출한 토털 DNA를 사용했다.
또한 음성 시료로서 LAMP법에 의해, 마이코플라스마·뉴모니에가 음성으로 판정된 인두 와이핑액으로부터 QIAamp DNA mini Kit를 사용하여 추출한 토털 DNA를 사용했다. 그 밖의 조건은 실시형태 1과 동일하게 PCR을 실시했다.
얻어진 생데이터에 대하여 실시형태 1과 동일한 연산 처리를 행했다.
이하에, 실시형태 5의 판정 방법을 나타낸다. 제1 표적 핵산의 유무는 측정 시료의 F44의 값과 역치 9를 비교하여 [측정 시료의 F44<역치 9]를 양성으로 판정했다.
역치 9는 음성 시료의 F44의 평균값-표준편차의 3배(이하 mean-3SD)의 값을 사용했다.
제2 표적 핵산의 유무는, 제1 표적 핵산이 양성, 음성에 관계되지 않고, Fs의 값과 역치 10을 비교하여 [Fs<역치 10]을 양성으로 판정했다. 역치 10은 양성 시료의 Fs의 mean-3SD의 값을 사용했다.
음성 시료의 증폭 곡선은 PCR이 종료되는 44 사이클째까지 소광이 보이지 않고(F44의 값 0.997이 역치 9의 값 0.997보다도 낮지 않기 때문), 이때의 mean-3SD는 0.997이 되고, 본 예의 제1 표적 검출을 위한 역치 9로 하여 (표 16)에 나타낸다. 증폭 곡선을 도 22에 나타낸다.
제1 표적 핵산인 양성 시료의 증폭 곡선은 35 사이클 부근에서 MYC QP의 어닐링에 수반되는 소광이 관찰되었고, F44의 값 0.951은 역치 9보다 낮고, pMYC의 목적의 영역이 증폭된 것이 밝혀졌다.
또한 이때의 Fs의 mean-3SD는 -0.132이며, 제2 표적 검출을 위한 역치 10으로 하여 (표 16)에 나타낸다. 증폭 곡선을 도 23에 나타낸다.
제2 표적 핵산인 pICM5의 증폭 곡선은 증폭 반응 중은 전혀 소광이 보이지 않고(F44의 값 0.998이 역치 9의 값 0.997보다도 낮지 않기 때문), Fs의 값 -0.227은 역치 10보다 낮았다.
이 결과로부터, pMYC의 목적의 영역이 증폭되지 않은 것과, pICM5의 목적의 영역이 증폭된 것이 밝혀졌다. Fs의 값을 (표 16)에 나타낸다. 증폭 곡선을 도 24에 나타낸다.
제1 표적 핵산인 양성 시료에 제2 표적 핵산인 pICM5를 첨가했을 때의 증폭 곡선은, 양성 시료의 증폭 곡선과 마찬가지로, 35 사이클 부근에서부터 MYC QP의 어닐링에 수반되는 소광이 관찰되었고, F44의 값 0.953은 역치 9보다 낮고, pMYC의 목적의 영역이 증폭된 것이 밝혀졌다.
Fs의 값 -0.235는 역치 10보다 낮고, pICM5의 목적의 영역이 증폭된 것이 밝혀졌다. Fs의 값을 (표 16)에 나타낸다. 증폭 곡선을 도 25에 나타낸다.
이상의 결과로부터, 실제의 임상 검체에서도, 프로브의 설계 방법과 온도 변화 프로필을 조합하여, 1종류의 반응액이 들어 있는 1개의 반응용기에서 단일 형광 색소를 사용하여, 마이코플라스마 P1 유전자와 내부 콘트롤을 검출할 수 있는 것이 밝혀졌다.
본 발명은 감염증의 병원체의 아형 식별이나 1염기 다형의 식별에도 응용 가능하다.
(실시형태 6)
<QProbe법에 있어서의 클라미디아 내재성 플라스미드 유전자와 임균 CMT 유전자의 검출>
QProbe법에 있어서의 클라미디아 내재성 플라스미드 유전자와 임균 CMT 유전자의 검출을 행했다.
(pCT)
성기 클라미디아 감염증의 병원체인 클라미디아·트라코마티스 공통의 내재성 플라스미드(pLGV440) 유전자 단편을 인공 합성 후, pUC57 벡터에 편입한 플라스미드 DNA는 홋카이도시스템 사이언스 가부시키가이샤에 합성을 위탁하여 제작했다.
(pNG)
임질의 병원체인 나이세리아·고노레아의 시토신 DNA 메틸 트랜스페라제(CMT) 유전자 단편을 인공 합성 후, pUC57 벡터에 편입한 플라스미드 DNA는 홋카이도시스템 사이언스 가부시키가이샤에 합성을 위탁하여 제작했다.
상기의 플라스미드의 길이는 pCT는 3064bp, pNG는 3059bp이다.
각 플라스미드의 길이와 플라스미드 용액의 농도(μg/μl)로부터 1μL당의 카피수를 계산한 후, TE 완충 용액(10mM Tris-HCl, 1.0mM EDTA pH 8.0)을 사용하여, pCT, pNG 모두 1×10^5copies/μl가 되도록 희석했다.
실시형태 6에 있어서의 PCR법에 사용한 프라이머 쌍은 (표 17)에 나타내는 바와 같다.
실시형태 6에 있어서의 PCR법에 사용하는 프로브의 정보는 (표 18)에 나타내는 바와 같다.
CT QP는 서열번호 6과 서열번호 7의 프라이머 쌍으로 증폭할 수 있는 PCR 산물의 염기서열로부터 닛테츠스미킨칸쿄 가부시키가이샤 J-Bio21 센터의 홈 페이지 상의 QProbe 설계 지원 툴을 사용하여 계산한 Tm값을 참고로 하여, 특정 영역을 선택했다.
NG QP는 서열번호 8과 서열번호 9의 프라이머 쌍으로 증폭할 수 있는 PCR 산물의 염기서열로부터, J-Bio21 센터의 홈페이지 상의 QProbe 설계 지원 툴을 사용하여 계산한 Tm값을 참고로 하여, 특정 영역을 선택했다.
pCT에 특이적으로 어닐링하는 QProbe인 CT QP와 pNG에 특이적으로 어닐링하는 QProbe인 NG QP의 형광 색소에는 각각 BODIPY(등록상표) FL을 사용하여, 각각 3' 말단의 C를 표지했다.
QProbe는 닛테츠스미킨칸쿄 가부시키가이샤에 합성을 위탁하여 제작했다. PCR 반응액 조성, 반응 조건을 (표 19)와 (표 20)에 나타낸다.
형광 측정시의 여기 파장과 형광 파장의 조합은 510-528nm를 선택했다.
각 사이클의 변성 스텝(95℃)과 신장 스텝(68℃)에서 형광값을 측정하고, 또한 증폭 반응 후에 제2 표적을 검출하기 위한 스텝(95℃와 55℃)에서 형광 측정을 행했다.
얻어진 생데이터에 대하여 실시형태 1과 동일한 연산 처리를 행했다.
이하에, 본 실시형태의 판정 방법을 나타낸다. 제1 표적 핵산의 유무는 측정 시료의 F44의 값과 역치 11을 비교하여 [측정 시료의 F44<역치 11]을 양성으로 판정했다.
역치 11은 음성 대조의 F44의 평균값-표준편차의 3배(이하 mean-3SD)의 값을 사용했다.
제2 표적 핵산의 유무는 제1 표적 핵산이 양성, 음성에 관계되지 않고, Fs의 값과 역치 12를 비교하여 [Fs<역치 12]를 양성으로 판정했다.
역치 12는 pNG만을 첨가한 시료의 Fs의 mean-3SD의 값을 사용했다.
CT QP의 배열은 Tm값을 73.4℃에, NG QP의 배열은 Tm값을 62.5℃에 설정했다. 그 때문에 PCR 중의 온도 범위(68℃에서 95℃)에서는, 프로브는 CT QP만 어닐링하는 것으로 추측되었다.
또한, 제2 표적 검출 스텝의 형광 측정은 95℃와 NG QP의 Tm값보다도 낮은 55℃에서 행하기 때문에, 제2 표적 검출 스텝의 측정값은 CT QP과 NG QP의 발광을 동시에 검출한다고 추측되었다.
음성 대조의 증폭 곡선은 PCR이 종료되는 44 사이클째까지 소광이 보이지 않고(F44의 값 0.998이 역치 11의 값 0.996보다도 낮지 않기 때문), 이때의 mean-3SD는 0.996이 되고, 본 예의 제1 표적 검출을 위한 역치 11로 하여, (표 21)에 나타낸다. 증폭 곡선을 도 26에 나타낸다.
제1 표적 핵산인 pCT의 증폭 곡선은 28 사이클 부근에서 CT QP의 어닐링에 수반되는 소광이 관찰되었고, F44의 값 0.720은 역치 11보다 낮고, pCT의 목적의 영역이 증폭된 것이 밝혀졌다.
또한 이때의 Fs의 mean-3SD는 -0.039이며, 제2 표적 검출을 위한 역치 12로 하여, (표 21)에 나타낸다. 증폭 곡선을 도 27에 나타낸다.
제2 표적 핵산인 pNG의 증폭 곡선은 증폭 반응 중은 전혀 소광이 보이지 않고(F44의 값 0.998이 역치 11의 값 0.996보다도 낮지 않기 때문), Fs의 값 -0.065는 역치 12보다 낮았다.
이 결과로부터, pCT의 목적의 영역이 증폭되지 않은 것과, pNG의 목적의 영역이 증폭된 것이 밝혀졌다. Fs의 값을 (표 21)에 나타낸다. 증폭 곡선을 도 28에 나타낸다.
제1 표적 핵산인 pCT와 제2 표적 핵산인 pNG의 양쪽을 첨가했을 때의 증폭 곡선은 pCT의 증폭 곡선과 마찬가지로, 28 사이클 부근에서 CT QP의 어닐링에 수반되는 소광이 관찰되었고, F44의 값 0.729는 역치 11보다 낮고, pCT의 목적의 영역이 증폭된 것이 밝혀졌다.
Fs의 값 -0.111은 역치 12보다 낮고, pNG의 목적의 영역이 증폭된 것이 밝혀졌다. Fs의 값을 (표 21)에 나타낸다. 증폭 곡선을 도 29에 나타낸다.
이상의 결과로부터, 2항목의 유전자에서도 프로브의 설계 방법과 온도 변화 프로필을 조합하여, 1종류의 반응액이 들어 있는 1개의 반응용기에서 단일 형광 색소를 사용하여, 마이코플라스마 P1 유전자와 내부 콘트롤을 검출할 수 있는 것이 밝혀졌다.
(실시형태 7)
<증폭 반응 중에 복수회 제2 표적을 검출하는 QProbe법에 있어서의 마이코플라스마 P1 유전자와 내부 콘트롤의 검출>
제2 표적 검출 스텝을 최종 사이클 후뿐만 아니라, 증폭 반응 중에 접어 넣은 방법으로 QProbe법에 있어서의 마이코플라스마 P1 유전자와 내부 콘트롤의 검출을 행했다.
PCR에 사용한 프라이머, 프로브, 반응액 조성과 핵산 시료는 실시형태 1과 동일한 것을 사용했다. 반응 조건은 (표 22)에 나타내는 바와 같다.
또한 증폭 반응의 온도 변화를 그래프화한 것을 도 30에 나타낸다.
실시형태 7의 해석에서는 다음 연산을 행하고, 그 밖은 실시형태 1과 동일한 스텝을 행했다.
fen=fhyb.en/fden.en (수식 4)
fen: (수식 4)에 의해 산출된 n회째의 제2 표적 검출 스텝에 있어서의 형광 강도값
fhyb.en: n회째의 제2 표적 검출 스텝 55℃의 형광강도값
fden.en: n회째의 제2 표적 검출 스텝 95℃의 형광강도값
Fen=fen/f10 (수식 5)
Fen: 10 사이클째의 (수식 4)에 의해 얻어진 형광강도값을 1로 했을 때의 n회째의 제2 표적 검출 스텝의 상대값
Fs1=Fe1-F20 (수식 6)
Fs2=Fe2-F27 (수식 6'）
Fs3=Fe3-F34 (수식 6''）
Fs4=Fe4-F41 (수식 6'''）
Fs1: 1회째의 제2 표적 검출 스텝의 측정값
Fs2: 2회째의 제2 표적 검출 스텝의 측정값
Fs3: 3회째의 제2 표적 검출 스텝의 측정값
Fs4: 4회째의 제2 표적 검출 스텝의 측정값
판정은 하기에 나타내는 방법으로 행했다. 제1 표적 핵산의 유무는 측정 시료의 F41의 값과 역치 13을 비교하여 [측정 시료의 F41<역치 13]을 양성으로 판정했다.
역치 13은 음성 대조의 F41의 평균값-표준편차의 3배(이하 mean-3SD)의 값을 사용했다.
제2 표적 핵산의 유무는 1회째의 제2 표적 검출 스텝에서는, [Fs1<역치 14]를 양성으로 판정했다.
역치 14는 pMYC만을 첨가한 시료의 Fs1의 mean-3SD의 값을 사용했다.
2회째의 제2 표적 검출 스텝에서는, [Fs2<역치 15]를 양성으로 판정했다.
역치 15는 pMYC만을 첨가한 시료의 Fs2의 mean-3SD의 값을 사용했다.
3회째의 제2 표적 검출 스텝에서는, [Fs3<역치 16]을 양성으로 판정했다.
역치 16은 pMYC만을 첨가한 시료의 Fs3의 mean-3SD의 값을 사용했다.
4회째의 제2 표적 검출 스텝에서는, [Fs4<역치 17]을 양성으로 판정했다.
역치 17은 pMYC만을 첨가한 시료의 Fs4의 mean-3SD의 값을 사용했다.
음성 대조의 증폭 곡선은 각 제2 표적 검출 스텝 이외에서는 PCR이 종료되는 41 사이클째까지 소광이 보이지 않고(F41의 값 0.999가 역치 13의 값 0.998보다도 낮지 않기 때문), 이때의 mean-3SD는 0.998이 되고, 본 예의 제1 표적 검출을 위한 역치 13으로 하여, (표 23)에 나타낸다. 증폭 곡선을 도 31에 나타낸다.
제1 표적 핵산인 pMYC의 증폭 곡선은, 30 사이클 부근에서 MYC QP의 어닐링에 수반되는 소광이 관찰되었고, F41의 값 0.892는 역치 13보다 낮고, pMYC의 목적의 영역이 증폭된 것이 밝혀졌다.
또한 이 때의 Fs1의 mean-3SD는 -0.058, Fs2의 mean-3SD는 -0.070, Fs3의 mean-3SD는 -0.080, Fs4의 mean-3SD는 -0.087로 각각 제2 표적 검출을 위한 역치 14, 15, 16, 17로 하여, (표 23)에 나타낸다. 증폭 곡선을 도 32에 나타낸다.
제2 표적 핵산인 pICM5의 증폭 곡선은 각 제2 표적 검출 스텝 이외에서는 증폭 반응 중은 전혀 소광이 보이지 않고(F41의 값 0.999가 역치 13의 값 0.998보다도 낮지 않기 때문), Fs1의 값 -0.058은 역치 14보다 높고, pICM5의 목적의 영역이 1회째의 제2 표적 검출 스텝까지 검출 한계 이상으로 증폭되어 있지 않은 것이 밝혀졌다.
Fs2의 값 -0.057도 역치 15보다 높고, pICM5의 목적의 영역이 2회째의 제2 표적 검출 스텝까지 검출 한계 이상으로 증폭되어 있지 않은 것이 밝혀졌다.
Fs3의 값 -0.084는 역치 16보다 낮고, pICM5의 목적의 영역이 3회째의 제2 표적 검출 스텝까지 검출 한계 이상으로 증폭되어 있는 것이 밝혀졌다.
Fs4의 값 -0.192도 역치 17보다 낮았다. Fs1, Fs2, Fs3, Fs4의 값을 (표 23)에 나타낸다. 증폭 곡선을 도 33에 나타낸다.
제1 표적 핵산인 pMYC와 제2 표적 핵산인 pICM5의 양쪽을 첨가했을 때의 증폭 곡선은 pMYC의 증폭 곡선과 마찬가지로, 30 사이클 부근에서 MYC QP의 어닐링에 수반되는 소광이 관찰되었고, F41의 값 0.897은 역치 13보다 낮고, pMYC의 목적의 영역이 증폭된 것이 밝혀졌다.
Fs1의 값 -0.058은 역치 14보다도 높고, pICM5의 목적의 영역이 1회째의 제2 표적 검출 스텝까지 검출 한계 이상으로 증폭되어 있지 않은 것이 밝혀졌다.
Fs2의 값 -0.068도 역치 15보다도 높고, pICM5의 목적의 영역이 2회째의 제2 표적 검출 스텝까지 검출 한계 이상으로 증폭되지 않은 것이 밝혀졌다.
Fs3의 값 -0.109는 역치 16보다 낮고, pICM5의 목적의 영역이 3회째의 제2 표적 검출 스텝까지 검출 한계 이상으로 증폭되어 있는 것이 밝혀졌다.
Fs4의 값 -0.154도 역치 17보다도 낮았다. Fs1, Fs2, Fs3, Fs4의 값은 (표 23)에 나타내는 바와 같다. 증폭 곡선을 도 34에 나타낸다.
이상의 결과로부터, 제2 표적 검출 스텝을 최종 사이클의 후뿐만 아니라, 증폭 반응 중에 접어 넣은 방법으로도 마이코플라스마 P1 유전자와 내부 콘트롤을 검출할 수 있는 것이 밝혀졌다.
1 용기
2 용액
10 제1 표적 핵산
13 제1 표적용 F 프라이머
14 제1 표적용 R 프라이머
15 제1 표적용 프로브
16 제1 표지물
20 제2 표적 핵산
23 제2 표적용 F 프라이머
24 제2 표적용 R 프라이머
25 제2 표적용 프로브
26 제2 표지물
30 DNA 폴리메라아제
31 데옥시리보뉴클레오티드삼인산
T0 변성 온도
T1 어닐링 온도
T2 신장 온도
T3 제2 표적 검출 온도
2 용액
10 제1 표적 핵산
13 제1 표적용 F 프라이머
14 제1 표적용 R 프라이머
15 제1 표적용 프로브
16 제1 표지물
20 제2 표적 핵산
23 제2 표적용 F 프라이머
24 제2 표적용 R 프라이머
25 제2 표적용 프로브
26 제2 표지물
30 DNA 폴리메라아제
31 데옥시리보뉴클레오티드삼인산
T0 변성 온도
T1 어닐링 온도
T2 신장 온도
T3 제2 표적 검출 온도
SEQUENCE LISTING
<110> Mizuho Medy Co., Ltd.
<120> A Kit to Detect Multiple Nucleic Acids, and Method for The Same
<130> MZM1501
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<210> 1
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<212> DNA
<213> Mycoplasma pneumoniae
<400> 1
gccaccctcg ggggcagtca g 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Mycoplasma pneumoniae
<400> 2
gagtcgggat tccccgcgga gg 22
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Mycoplasma pneumoniae
<400> 3
ccctcgacca agccaacctc cagctc 26
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> random sequence
<400> 4
agtgggactc accaacc 17
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> random sequence
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agtgggactc accaac 16
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<212> DNA
<213> Chlamydia trachomatis
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tgagcaccct aggcgtttgt actccgtcac 30
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<212> DNA
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 7
gcactttcta caagagtaca tcggtcaacg aagagg 36
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<211> 25
<212> DNA
<213> Neisseria gonorrhoeae
<400> 8
gggcgtggtt gaactggcaa aaagc 25
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<211> 27
<212> DNA
<213> Neisseria gonorrhoeae
<400> 9
cagtgatttt ggcattggcg atattgg 27
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<211> 26
<212> DNA
<213> Chlamydia trachomatis
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tgcgggcgat ttgccttaac cccacc 26
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<211> 25
<212> DNA
<213> Neisseria gonorrhoeae
<400> 11
ctaagcaaaa ttcgaggggg aaaac 25
Claims (7)
- 변성 온도를 T0, 어닐링 온도를 T1, 신장 온도를 T2, 제2 표적 검출 온도를 T3이라고 하면, T0>T2≥T1>T3을 충족시키도록 온도 설정되는 복수의 표적 핵산의 검출 키트로서,
상기 변성 온도(T0)에서, 이중 가닥의 수소 결합이 절단되어, 각각 2개의 단일 가닥으로 해리되는, 제1 표적 핵산 및 제2 표적 핵산을 포함할 수 있는 용액에,
상기 어닐링 온도(T1)에서, 상기 제1 표적 핵산이 해리된 2개의 단일 가닥 중 어느 하나에 특이적으로 결합하는 제1 표적용 프라이머와,
상기 어닐링 온도(T1)에서, 상기 제2 표적 핵산이 해리된 2개의 단일 가닥 중 어느 하나에 특이적으로 결합하는 제2 표적용 프라이머와,
상기 어닐링 온도(T1)에서, 상기 제1 표적 핵산이 해리된 2개의 단일 가닥 중 어느 하나에 특이적으로 결합하는 제1 표적용 프로브이며, 결합에 의해 형광 시그널이 변화되는 제1 표지물을 갖는 것과,
DNA 폴리메라아제와,
상기 신장 온도(T2)에서, 상기 DNA 폴리메라아제의 작용에 의해, 상기 제1 표적 핵산이 해리된 2개의 단일 가닥 및 상기 제2 표적 핵산이 해리된 2개의 단일 가닥에 결합하는 데옥시리보뉴클레오티드삼인산과,
상기 어닐링 온도(T1)에서는, 상기 제1 표적 핵산이 해리된 2개의 단일 가닥 및 상기 제2 표적 핵산이 해리된 2개의 단일 가닥의 어느 쪽에도 결합하지 않고, 상기 제2 표적 검출 온도(T3)에서, 상기 제2 표적 핵산이 해리된 2개의 단일 가닥 중 어느 하나에 특이적으로 결합하는 제2 표적용 프로브이며, 결합에 의해 형광 시그널이 변화되는 제2 표지물을 갖는 것을 함유하는 것을 특징으로 하는 복수의 표적 핵산의 검출 키트. - 제 1 항에 있어서, 상기 제1 표지물 및 상기 제2 표지물은 QProbe(등록상표) 프로브, Eprobe(등록상표) 프로브 및 TaqMan(등록상표) 프로브로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 복수의 표적 핵산의 검출 키트.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 형광 시그널은 어닐링하면 소광하는 것인 것을 특징으로 하는 복수의 표적 핵산의 검출 키트.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 형광 시그널은 어닐링하면 발광하는 것인 것을 특징으로 하는 복수의 표적 핵산의 검출 키트.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 표적 핵산은 마이코플라스마 P1 유전자이며, 상기 제2 표적 핵산은 내부 콘트롤인 것을 특징으로 하는 복수의 표적 핵산의 검출 키트.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 표적 핵산은 클라미디아 내재성 플라스미드 유전자이며, 상기 제2 표적 핵산은 임균 CMT 유전자인 것을 특징으로 하는 복수의 표적 핵산의 검출 키트.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 복수의 표적 핵산을 측정하는 검출 키트를 사용하는 검출 방법으로서,
상기 용액의 온도를 상기 변성 온도(T0)로 올리고, 함유가 의심되는 상기 제1 표적 핵산 및 상기 제2 표적 핵산의 각각을 2개의 단일 가닥으로 해리시키는 해리 스텝과,
상기 용액의 온도를 상기 어닐링 온도(T1)까지 내리고, 상기 제1 표적용 프로브에 의한 형광 시그널에 기초하여, 제1 표적 핵산의 존부를 검출하는 제1 표적 핵산 검출 스텝과,
상기 용액의 온도를 상기 신장 온도(T2)로 하고, 함유가 의심되는 상기 제1 표적 핵산 및 상기 제2 표적 핵산이 해리된, 각각의 2개의 단일 가닥을 이중 가닥의 제1 표적 핵산 및 제2 표적 핵산으로 증폭하는 증폭 스텝과,
상기 용액의 온도를 상기 제2 표적 검출 온도(T3)까지 내리고, 상기 제2 표적용 프로브에 의한 형광 시그널에 기초하여, 제2 표적 핵산의 존부를 검출하는 제2 표적 핵산 검출 스텝을 포함하는 검출 방법.
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