JP2008161112A

JP2008161112A - ヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法

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Publication number: JP2008161112A
Application number: JP2006354166A
Authority: JP
Inventors: Masahiro Kusumoto; 楠本　　正博
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 2006-12-28
Filing date: 2006-12-28
Publication date: 2008-07-17

Abstract

【課題】明確かつ再現性よくヘリコバクター・ピロリ菌を識別することができる方法、及びそのための試薬を提供する。
【解決手段】ヘリコバクター・ピロリ菌のＣａｇＡタンパク質のＣ配列をコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーと、東アジア型ＣａｇＡをコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーと、ＣａｇＡをコードする核酸配列に共通の核酸配列を含有するプライマーとを用いて核酸増幅反応を行い、対象とするヘリコバクター・ピロリ菌のＣａｇＡタンパク質が東アジア型であるか西欧型であるかを判定し、さらにＣａｇＡタンパク質の毒性の指標となるＣ配列の有無および該配列の繰り返し数を明確に判定する方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、ＣａｇＡタンパク質Ｃ末端領域の多型性を利用したヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法に関するものである。本発明は、ヘリコバクター・ピロリ菌の病原性や発ガン危険性の推測などに際して特に有用である。

病原性を有するグラム陰性菌の多くは外来性遺伝子群を有することで病原性を発揮することが認められており、この外来性遺伝子群はpathogenicity island（ＰＡＩ）と呼ばれている。ヘリコバクター・ピロリ菌では病原因子の一つである細胞空胞化毒素関連タンパク質（ＣａｇＡ）の遺伝子ｃａｇＡがこのＰＡＩ内に位置し、このｃａｇＡを有する菌株の感染が十二指腸潰瘍、胃癌と関連することが報告されてきた。

ＣａｇＡタンパク質は、胃の上皮細胞に感染したヘリコバクター・ピロリ菌によって送り込まれるとＳｒｃによってリン酸化を受け、Src homology phosphatase-2（ＳＨＰ-２）と結合することで、Ｒａｓ、ＥＲＫを介した異常な細胞増殖と細胞接着に関連するfocal adhesion kinase（ＦＡＫ）を脱リン酸化することで細胞の運動能向上を引き起こす。ＣａｇＡタンパク質には、Ｃ末端領域にＥＰＩＹＡの５つの共通アミノ酸モチーフを持つＡ配列、Ｂ配列、Ｃ配列、Ｄ配列と名付けられたリン酸化を受ける領域があり、Ａ配列、Ｂ配列、Ｃ配列は欧米人に多く感染するヘリコバクター・ピロリ菌に存在し、Ａ配列、Ｂ配列、Ｄ配列は東アジア人に多く感染するヘリコバクター・ピロリ菌に存在する。ＳＨＰ-２はＣ配列またはＤ配列の領域に結合することが分かっており、欧米人ではＣ配列を複数持つ場合にＳＨＰ-２との結合力が強くなり、毒性が強くなり発ガンしやすくなることが知られている（例えば、非特許文献１〜４参照）。

ヘリコバクター・ピロリ菌のＣａｇＡタンパク質が上記のＡ配列、Ｂ配列、Ｃ配列を持ち欧米人に多く感染するタイプ（西欧型）、またはＡ配列、Ｂ配列、Ｄ配列を持ち東アジア人に多く感染するタイプ（東アジア型）のどちらに該当するかを判別するための従来技術としては、例えばｃａｇＡ遺伝子の核酸配列を決定するシークエンシング法がある。シークエンシング法は、核酸配列を直接解析することにより判別に必要な情報を得ることができるが、鋳型核酸の調製、ＤＮＡポリメラーゼ反応、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、核酸配列の解析などを行うため多大な労力と時間が必要である。また近年の自動シークエンサーを用いることで省力化は行うことができるが、高価な装置が必要であるという問題がある。

また最近になって、従来より知られる遺伝子増幅法であるpolymerase chain reaction（ＰＣＲ）法（例えば、特許文献１及び２参照）を利用して、ｃａｇＡ遺伝子を西欧型と東アジア型に分類する試みがなされている（非特許文献５参照）。これは西欧型ＣａｇＡタンパク質の遺伝子または東アジア型ＣａｇＡタンパク質の遺伝子をそれぞれ増幅可能なＰＣＲを別々に実施した後、検出プローブとのハイブリダイゼーション反応により増幅の有無を判断し、ＣａｇＡタンパク質の型を判別する方法であるが、本方法では１試料あたり２反応のリアルタイムＰＣＲが必要なため煩雑な操作を伴い、さらには上記のようにＣａｇＡタンパク質において毒性の指標となり得るＣ配列の繰り返し数に関する知見を得ることができない。
特公平４−６７９６０号公報特公平４−６７９５７号公報 Asahiら、J. Exp. Med. 第１９１巻、第５９３〜６０２頁、（２０００年） Higashiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第９９巻、第１４４２８〜１４４３３頁、（２００２年） Azumaら、J. Infect. Dis. 第１８９巻、第８２０〜８２７頁、（２００４年） Azumaら、J. Clin. Microbiol. 第４２巻、第２５０８〜２５１７頁、（２００４年） Yamazakiら、FEMS Immunol. Med. Microbiol. 第４４巻、第２６１〜２６８頁、（２００５年）

本発明の目的は、上記のような問題点を解決して、明確にかつ再現性よくヘリコバクター・ピロリ菌を識別することができる方法およびそのための試薬を提供することである。

本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究の結果、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
１．ＣａｇＡタンパク質Ｃ末端領域の多型性を利用したヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法であって、該領域におけるＣ配列の有無および該配列の繰り返し数を判定することを特徴とする識別方法。
２．ＣａｇＡタンパク質Ｃ末端領域におけるＣ配列の有無および該配列の繰り返し数を判定することを特徴とするヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法であって、
（ａ）少なくとも１種のプライマーが、Ｃ配列をコードする核酸配列に特異的な核酸配列のうち少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、
（ｂ）また少なくとも１種のプライマーが、Ｃ配列の外部近傍に存在する核酸配列のうち少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、
（ｃ）一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となることを特徴とする方法を用いて核酸断片を増幅し、
（ｄ）該方法で得られた１つまたはそれ以上の増幅核酸断片を解析することからなる識別方法。
３．ＣａｇＡタンパク質Ｃ末端領域の多型性を利用したヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法であって、
（ａ）少なくとも１種のプライマーが、Ｃ配列をコードする核酸配列に特異的な核酸配列のうち少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、
（ｂ）また少なくとも１種のプライマーが、東アジア型ＣａｇＡをコードする核酸配列に特異的な核酸配列のうち少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、
（ｃ）さらに少なくとも１種のプライマーが、ＣａｇＡをコードする核酸配列に共通の核酸配列のうち少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、
（ｄ）一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となることを特徴とする方法を用いて核酸断片を増幅し、
（ｅ）該方法で得られた１つまたはそれ以上の増幅核酸断片を解析することからなる識別方法。
４．配列番号１から３のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
５．ＣａｇＡタンパク質Ｃ末端領域におけるＣ配列の有無および該配列の繰り返し数を判定することを特徴とするヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法であって、
（ａ）Ｃ配列をコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーとして、配列番号１に記載の核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドを使用し、
（ｂ）Ｃ配列の外部近傍に存在する核酸配列を含有するプライマーとして、配列番号２に記載の核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドを使用し、
（ｃ）一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となることを特徴とする方法を用いて核酸断片を増幅し、
（ｄ）該方法で得られた１つまたはそれ以上の増幅核酸断片を解析することからなる識別方法。
６．ＣａｇＡタンパク質Ｃ末端領域の多型性を利用したヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法であって、
（ａ）Ｃ配列をコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーとして、配列番号１に記載の核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドを使用し、
（ｂ）東アジア型ＣａｇＡをコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーとして、配列番号３に記載の核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドを使用し、
（ｃ）ＣａｇＡをコードする核酸配列に共通の核酸配列として、配列番号２に記載の核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドを使用し、
（ｄ）一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となることを特徴とする方法を用いて核酸断片を増幅し、
（ｅ）該方法で得られた１つまたはそれ以上の増幅核酸断片を解析することからなる識別方法。
７．５または６の識別方法を用いてＣａｇＡタンパク質Ｃ末端領域におけるＣ配列の繰り返し数を判定し、欧米人に多く感染するヘリコバクター・ピロリ菌による発ガンの危険性を推測する方法。
８．ＣａｇＡタンパク質Ｃ末端領域におけるＣ配列の有無および該配列の繰り返し数を判定することによりヘリコバクター・ピロリ菌を識別するための試薬であって、
（ａ）少なくとも１種のプライマーが、Ｃ配列をコードする核酸配列に特異的な核酸配列のうち少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、
（ｂ）また少なくとも１種のプライマーが、Ｃ配列の外部近傍に存在する核酸配列のうち少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、
（ｃ）一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となるプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび緩衝液を含むことを特徴とする識別用試薬。
９．ＣａｇＡタンパク質Ｃ末端領域の多型性を利用してヘリコバクター・ピロリ菌を識別するための試薬であって、
（ａ）少なくとも１種のプライマーが、Ｃ配列をコードする核酸配列に特異的な核酸配列のうち少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、
（ｂ）また少なくとも１種のプライマーが、東アジア型ＣａｇＡをコードする核酸配列に特異的な核酸配列のうち少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、
（ｃ）さらに少なくとも１種のプライマーが、ＣａｇＡをコードする核酸配列に共通の核酸配列のうち少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、
（ｄ）一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となるプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび緩衝液を含むことを特徴とする識別用試薬。
１０．８または９の識別用試薬を含んでなり、ＣａｇＡタンパク質Ｃ末端領域におけるＣ配列の繰り返し数から欧米人に多く感染するヘリコバクター・ピロリ菌による発ガンの危険性を推測するための試薬。

本発明により、ヘリコバクター・ピロリ菌を明確にまた簡便に識別できる方法が提供される。また本発明の方法によれば、ＣａｇＡタンパク質において毒性の指標となり得るＣ配列の繰り返し数も判定することができ、これまでの方法より詳細にヘリコバクター・ピロリ菌を識別することが可能である。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において、プライマーとは、ヘリコバクター・ピロリ菌の染色体またはその断片に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであって、核酸増幅のために一般的に利用される特性を有していれば良く、必要に応じて修飾されていても良い。プライマー鎖長は、９〜３５塩基であればよく、好ましくは、１１〜３０塩基である。これらのプライマーを用いた増幅方法は特に限定はされない。既知の増幅方法を用いればよい。既知の増幅方法としては、例えば、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＡ、ＴＭＡ、ＬＡＭＰ、ＩＣＡＮおよびＵＣＡＮ法などがある。

本発明において核酸の増幅とは、試料中の核酸から増幅したい核酸（標的核酸）をその固有の配列の相補性を利用して増幅することを指す。本発明におけるヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法に適用可能な核酸増幅の方法としては、基本的には、従来の方法を用いて行うことができ、通常、一本鎖に変性させたヘリコバクター・ピロリ菌の染色体またはその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）およびＤＮＡポリメラーゼおよび２種類以上のオリゴヌクレオチドすなわちプライマーを作用させることで、標的核酸を鋳型として用いたプライマー間の配列が増幅される。また、標的核酸が検出するのに十分な量が含まれていない場合、あらかじめ前記ヘリコバクター・ピロリ菌の染色体またはその断片を以下に示す増幅反応によって、増幅しておくことも可能である。

核酸増幅方法としては、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence-basedamplification method；Nature 第３５０巻、第９１頁（１９９１年））、ＬＣＲ（国際公開８９／１２６９６号公報、特開平２−２９３４号公報）、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification：Nucleic Acids Res. 第２０巻、第１６９１頁（１９９２年））、ＲＣＡ（国際公開９０／１０６９号公報）、ＴＭＡ（Transcription mediated amplification method；J. Clin. Microbiol. 第３１巻、第３２７０頁（１９９３年））、ＬＡＭＰ（loop-mediated isothermal amplification method：J. Clin Microbiol. 第４２巻：第１，９５６頁（２００４年））、ＩＣＡＮ（isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids：Kekkaku. 第７８巻、第５３３頁（２００３年））、ＵＣＡＮ（日本癌学会（H13.9.26〜H13.9.28、横浜にて開催）または日本鑑識科学技術学会（H13.11.8〜H13.11.9、東京にて開催）参照）などが挙げられる。

なかでもＰＣＲ法は、試料核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のプライマー及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより、上記一対のプライマーで挟まれる試料核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である。すなわち、変性工程で試料の核酸を変性し、続くアニーリング工程において各プライマーと、それぞれに相補的な一本鎖試料核酸上の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、各プライマーを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖試料核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上、上記一対のプライマーで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２のｎ乗倍に増幅される。増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在するので、電気泳動等の方法により容易に検出できる。よって、遺伝子増幅法を用いれば、従来では検出不可能であった、極めて微量（１分子でも可）の試料核酸をも検出することが可能であり、最近非常に広く用いられている技術である。

本発明のヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法に適用可能な増幅核酸断片の解析法としては従来公知の核酸解析法を使用することができ、特に限定されるものではないが、簡便性の観点からアガロースゲル電気泳動が好ましい。「アガロースゲル電気泳動」を使用する場合は、一例として、Ｃ配列をコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーおよびＣａｇＡをコードする核酸配列に共通の核酸配列を含有するプライマーにより生成される増幅核酸断片と、東アジア型ＣａｇＡをコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーおよびＣａｇＡをコードする核酸配列に共通の核酸配列を含有するプライマーにより生成される増幅核酸断片の鎖長が異なるように各プライマーを設計する。これらのプライマーを混合して核酸を増幅することにより、ヘリコバクター・ピロリ菌のＣａｇＡタンパク質が東アジア型であるか西欧型であるか、さらにＣａｇＡタンパク質の毒性の指標となり得るＣ配列の繰り返し数について、増幅された核酸断片のパターンから迅速に判別できる。

本発明の重要な開示の一つは、Ｃ配列をコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーと、Ｃ配列の外部近傍に存在する核酸配列を含有するプライマーとを、一例として図１に示すように設定し、核酸増幅反応を行い、対象とするヘリコバクター・ピロリ菌のＣａｇＡタンパク質について、毒性の指標となるＣ配列の有無および該配列の繰り返し数を明確に判定できるような顕著な効果を見出したことにある。

例えば、ヘリコバクター・ピロリ菌のＣａｇＡタンパク質にＣ配列が１個存在する場合は、図１（Ａ）に示すように、Ｃ配列をコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーと、Ｃ配列の外部近傍に存在する核酸配列を含有するプライマーにより１種類の増幅核酸断片が生成する。また、ヘリコバクター・ピロリ菌のＣａｇＡタンパク質にＣ配列が２個存在する場合は、図１（Ｂ）に示すように、Ｃ配列をコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーと、Ｃ配列の外部近傍に存在する核酸配列を含有するプライマーにより鎖長の異なる２種類の増幅核酸断片が生成する。

本発明に用いるＣ配列をコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーと、Ｃ配列の外部近傍に存在する核酸配列を含有するプライマーは、核酸増幅のために一般的に利用される特性を有していれば良く、必要に応じて修飾されていても良い。当該修飾としても特に限定されず、例えば、ビオチン化、ジゴキシゲニンの結合または蛍光色素の結合などの修飾が施され得る。上記構成によれば、プライマーによって増幅される核酸断片を高感度に検出することが可能になる。例えば、プライマーをビオチン化すれば、該プライマーによって増幅された核酸断片に対して、アビジンまたは抗ビオチン抗体が連結されたマーカーを結合させることができる。また、プライマーにジゴキシゲニンを結合すれば、該プライマーによって増幅された核酸断片に対して、抗ジゴキシゲニン抗体が連結されたマーカーを結合させることができる。そして、増幅された核酸断片に結合したマーカーを検出することによって、プライマーによって増幅される核酸断片の有無を検出することができるとともに、増幅される核酸断片の量を推定することができる。なお、プライマーに蛍光色素を結合させる場合には、増幅される核酸断片中の蛍光色素の有無と、蛍光色素から発せられる蛍光の強度とを検出すればよい。

このとき、上記マーカーとしては特に限定されず、適宜公知のマーカーを用いることができる。例えば、上記マーカーは、酵素であることが好ましい。さらに具体的には、上記マーカーは、アルカリフォスファターゼまたはペルオキシダーゼであることが好ましい。上記マーカーとしてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、基質としてパラニトロフェニルリン酸またはＣＤＰ−ｓｔａｒを用いれば良い。また、上記マーカーとしてペルオキシダーゼを用いる場合には、基質としてＴＭＢ、Ｌｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、またはＳＡＴ−１（同仁化学社製）を用いれば良い。そして、上記酵素と基質との反応を検出すれば、プライマーによって増幅される核酸断片の有無を検出することができるとともに、増幅される核酸断片の量を推定することができる。

Ｃ配列をコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーがヘリコバクター・ピロリ菌の染色体またはその断片に相同的なセンスプライマーである場合には、Ｃ配列の外部近傍に存在する核酸配列を含有するプライマーはヘリコバクター・ピロリ菌の染色体またはその断片に相補的なアンチセンスプライマーであればよく、Ｃ配列をコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーがヘリコバクター・ピロリ菌の染色体またはその断片に相補的なアンチセンスプライマーである場合には、Ｃ配列の外部近傍に存在する核酸配列を含有するプライマーはヘリコバクター・ピロリ菌の染色体またはその断片に相同的なセンスプライマーであればよい。

上記の方法の一つを説明するならば、下記の（ａ）〜（ｂ）の工程を含み、ＣａｇＡタンパク質Ｃ末端領域におけるＣ配列の有無および該配列の繰り返し数を判定することを特徴とするヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法である。
（ａ）互いのプライマー伸長産物が、相互の鋳型となる性質を有する次の(i)と(ii)のプライマーを用いて、核酸増幅をおこなう工程：
(i) Ｃ配列をコードする核酸配列に特異的な核酸配列のうち少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するプライマー
(ii) Ｃ配列の外部近傍に存在する核酸配列のうち少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するプライマー
（ｂ）工程（ａ）で得られた１つまたはそれ以上のプライマー(i)から得られる増幅核酸断片の種類を解析する工程

外部近傍の「近傍」は、Ｃ配列をコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーとＣ配列の外部近傍に存在する核酸配列を含有するプライマー間の鎖長が、一般的な増幅反応により増幅され得る鎖長に設定することを意味する。この一般的な増幅反応により増幅され得る鎖長は当業者にとって周知である。例えばＬｏｎｇＰＣＲなどを用いれば、４０ｋｂ程度の鎖長の増幅産物が得られることが知られている。なお検出感度を向上させるため、該増幅反応により増幅され得る鎖長は５ｋｂ以下が好ましく、２ｋｂ以下がさらに好ましい。また、該鎖長は２０ｂｐ以上が好ましく、４０ｂｐ以上がさらに好ましいが、アガロースゲル電気泳動など従来公知の核酸解析法を用いて解析可能な鎖長であれば特に限定されない。

本発明の重要な開示の別の一つは、Ｃ配列をコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーと、東アジア型ＣａｇＡをコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーと、ＣａｇＡをコードする核酸配列に共通の核酸配列を含有するプライマーとを、一例として図２に示すように設定し、核酸増幅反応を行い、対象とするヘリコバクター・ピロリ菌のＣａｇＡタンパク質について、東アジア型であるか西欧型であるかを判定し、さらにＣａｇＡタンパク質の毒性の指標となるＣ配列の有無および該配列の繰り返し数を明確に判定できるような顕著な効果を見出したことにある。

例えば、ヘリコバクター・ピロリ菌のＣａｇＡタンパク質が東アジア型でありＣ配列が１個存在する場合は、図２（Ａ）に示すように、Ｃ配列をコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーと、ＣａｇＡをコードする核酸配列に共通の核酸配列を含有するプライマーにより１種類の増幅核酸断片が生成する。また、ヘリコバクター・ピロリ菌のＣａｇＡタンパク質が西欧型でありＣ配列が２個存在する場合は、図２（Ｂ）に示すように、Ｃ配列をコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーと、ＣａｇＡをコードする核酸配列に共通の核酸配列を含有するプライマーにより鎖長の異なる２種類の増幅核酸断片が生成する。さらに、ヘリコバクター・ピロリ菌のＣａｇＡタンパク質が東アジア型でありＣ配列が存在しない場合は、図２（Ｃ）に示すように、東アジア型ＣａｇＡをコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーと、ＣａｇＡをコードする核酸配列に共通の核酸配列を含有するプライマーにより１種類の増幅核酸断片が生成する。

本発明に用いるＣ配列をコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーと、東アジア型ＣａｇＡをコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーと、ＣａｇＡをコードする核酸配列に共通の核酸配列を含有するプライマーは、核酸増幅のために一般的に利用される特性を有していれば良く、必要に応じて修飾されていても良い。当該修飾としても特に限定されず、例えば、ビオチン化、ジゴキシゲニンの結合または蛍光色素の結合などの修飾が施され得る。上記構成によれば、プライマーによって増幅される核酸断片を高感度に検出することが可能になる。例えば、プライマーをビオチン化すれば、該プライマーによって増幅された核酸断片に対して、アビジンまたは抗ビオチン抗体が連結されたマーカーを結合させることができる。また、プライマーにジゴキシゲニンを結合すれば、該プライマーによって増幅された核酸断片に対して、抗ジゴキシゲニン抗体が連結されたマーカーを結合させることができる。そして、増幅された核酸断片に結合したマーカーを検出することによって、プライマーによって増幅される核酸断片の有無を検出することができるとともに、増幅される核酸断片の量を推定することができる。なお、プライマーに蛍光色素を結合させる場合には、増幅される核酸断片中の蛍光色素の有無と、蛍光色素から発せられる蛍光の強度とを検出すればよい。

Ｃ配列をコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーと、東アジア型ＣａｇＡをコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーは、ヘリコバクター・ピロリ菌の染色体またはその断片に対して同じ向きに設計する方がよい。Ｃ配列をコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーと東アジア型ＣａｇＡをコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーがヘリコバクター・ピロリ菌の染色体またはその断片に相同的なセンスプライマーである場合には、ＣａｇＡをコードする核酸配列に共通の核酸配列を含有するプライマーはヘリコバクター・ピロリ菌の染色体またはその断片に相補的なアンチセンスプライマーであればよく、Ｃ配列をコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーと東アジア型ＣａｇＡをコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーがヘリコバクター・ピロリ菌の染色体またはその断片に相補的なアンチセンスプライマーである場合には、ＣａｇＡをコードする核酸配列に共通の核酸配列を含有するプライマーはヘリコバクター・ピロリ菌の染色体またはその断片に相同的なセンスプライマーであればよい。

上記の方法の一つを説明するならば、下記の（ａ）〜（ｂ）の工程を含み、ＣａｇＡタンパク質Ｃ末端領域におけるＣ配列の有無および該配列の繰り返し数を判定することを特徴とするヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法である。
（ａ）次の(ii)と(iii)のプライマーは互いのプライマー伸長産物が相互の鋳型となる性質を有し、(i)と(iii)のプライマーは互いのプライマー伸長産物が相互の鋳型となる性質を有する次の(i)〜(iii)のプライマーを用いて、核酸増幅をおこなう工程：
(i) Ｃ配列をコードする核酸配列に特異的な核酸配列のうち少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するプライマー
(ii) 東アジア型ＣａｇＡをコードする核酸配列に特異的な核酸配列のうち少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するプライマー
(iii）ＣａｇＡをコードする核酸配列に共通の核酸配列のうち少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するプライマー
（ｂ）工程（ａ）で得られる１つまたはそれ以上のプライマー（i）から得られる増幅核酸断片の有無及び種類と、プライマー（ii)から得られる増幅核酸断片の有無を解析する工程

本発明のオリゴヌクレオチドは、ヘリコバクター・ピロリ菌の染色体またはその断片を増幅するためのものである。

配列表の配列番号１で示される塩基配列の連続する１５〜２０塩基を有する配列を含んだオリゴヌクレオチドはＣ配列をコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーとして用いられ、Ｃ配列の外部近傍に存在する核酸配列を含有するプライマーまたはＣａｇＡをコードする核酸配列に共通の核酸配列を含有するプライマーと組み合わせて、ヘリコバクター・ピロリ菌のＣａｇＡタンパク質におけるＣ配列の有無および該配列の繰り返し数の判定に用いられる。

配列表の配列番号２で示される塩基配列の連続する１５〜２３塩基を有する配列を含んだオリゴヌクレオチドはＣ配列の外部近傍に存在する核酸配列を含有するプライマーまたはＣａｇＡをコードする核酸配列に共通の核酸配列を含有するプライマーとして用いられ、Ｃ配列をコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーと組み合わせてヘリコバクター・ピロリ菌のＣａｇＡタンパク質におけるＣ配列の有無および該配列の繰り返し数の判定に用いられ、または東アジア型ＣａｇＡをコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーと組み合わせてヘリコバクター・ピロリ菌のＣａｇＡタンパク質が東アジア型であることの判定に用いられる。

配列表の配列番号３で示される塩基配列の連続する１５〜２７塩基を有する配列を含んだオリゴヌクレオチドは東アジア型ＣａｇＡをコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーとして用いられ、ＣａｇＡをコードする核酸配列に共通の核酸配列を含有するプライマーと組み合わせて、ヘリコバクター・ピロリ菌のＣａｇＡタンパク質が東アジア型であることの判定に用いられる。

本発明のヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法を使用するための試薬組成の好ましい一例としては、（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、（ｂ）核酸増幅用プライマー、（ｃ）ｄＮＴＰ、（ｄ）反応バッファー、（ｅ）核酸含有試料などから成る。
（ａ）「ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素」としては、Ｔ４またはＴ７ファージ、大腸菌、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属など種々の起源のＤＮＡポリメラーゼおよびその改良変異体を特に限定されることなく使用できるが、核酸の増幅方法としてＰＣＲ法を使用する場合はＫＯＤＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼなど熱安定性の酵素を使用することが好ましい。中でもＫＯＤＤＮＡポリメラーゼまたは該酵素を改良したＤＮＡポリメラーゼは増幅量および反応速度の観点から最も好ましい。具体的には、ＫＯＤＤａｓｈＤＮＡポリメラーゼの場合は１〜２００単位／ｍｌ程度の使用が好ましく、１０〜１００単位／ｍｌ程度の使用がより好ましい。
（ｂ）「核酸増幅用プライマー」は１〜４０００ｎＭ程度を含む。中でも増幅量および特異性を高めるために、５０〜５００ｎＭ程度がより好ましく、２００ｎＭ程度がさらに好ましい。
（ｃ）「ｄＮＴＰ」は５０〜１０００μＭ程度を含む。１００〜７００μＭ程度がより好ましく、２００〜４００μＭ程度がさらに好ましい。
（ｄ）「反応バッファー」については、本発明のヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法を使用するための試薬に含まれる酵素の能力を最大限に発揮する目的で、緩衝液や金属塩の濃度、溶液のｐＨなどが適宜選択され得る。また、酵素の安定性を高める目的で、該試薬にウシ血清アルブミンなどの添加剤を適宜混合しても良い。
（ｅ）「核酸含有試料」は、例えば、バクテリア、動物または植物組織、個体細胞由来の溶解物などのあらゆる材料から調製することができる。該試料の調製法は特に限定されないが、例えば、患者の血液、組織から、既知の方法により調製してもよい。代表的なものとして、フェノール／クロロホルム抽出法（Biochimica et Biophysica acta 第７２巻、第６１９〜６２９頁、１９６３年）、アルカリＳＤＳ法（Nucleic Acids Res. 第７巻、第１５１３〜１５２３頁、１９７９年）などの液相で行う方法がある。また、核酸の単離に核酸結合用担体を用いる系としては、ガラス粒子とヨウ化ナトリウム溶液を使用する方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第７６−２巻、第６１５〜６１９頁、１９７９年）、ハイドロキシアパタイトを用いる方法（特開昭６３−２６３０９３号公報）等がある。その他の方法としてはシリカ粒子とカオトロピックイオンを用いた方法（Ｊ．ＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ第２８−３巻、第４９５〜５０３頁、１９９０年、特開平２−２８９５９６号公報）が挙げられる。また、核酸は試料中に溶解させてもよいし、固相に固定させてもよい。

本発明のヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法および識別用試薬は、ヘリコバクター・ピロリ菌による発ガンの危険性を予測するために用いられることが好ましい。上記ガンとしては、胃ガンなどを挙げることができる。上述したように、本発明の識別方法および識別用試薬を用いれば、ＣａｇＡタンパク質のＣ末端領域の多型を検出することができる。更に詳細には、本発明の識別方法および識別用試薬を用いれば、発ガンに関係が深いＣ配列の有無を検出することができるとともに、Ｃ配列の数をも検出することができる。そして、Ｃ配列の有無によって、発ガンの可能性の有無を予測することができるとともに、上記Ｃ配列の数によって、発ガンの可能性の大小（Ｃ配列が多いほど、発ガンの危険度が大きい）を予測することができる。

以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

実施例１
ヘリコバクター・ピロリ菌の識別
（１）オリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１〜３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ１〜３と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社ＯＰＣカラムにて実施した。もしくはＤＮＡ合成受託会社（（株）日本バイオサービス、シグマアルドリッチジャパン（株）、オペロンバイオテクノロジー（株）等）に依頼した。
オリゴ１がセンス鎖でありＣ配列をコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーであり、アンチセンス鎖のオリゴ２と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。オリゴ２はＣａｇＡをコードする核酸配列に共通の核酸配列を含有するプライマーである。また、オリゴ３は東アジア型ＣａｇＡをコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーであり、アンチセンス鎖のオリゴ２と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。

（２）ＰＣＲ法によるヘリコバクター・ピロリ菌ｃａｇＡ遺伝子の解析
表１におけるサンプル番号１〜６のヘリコバクター・ピロリ菌からそれぞれフェノール・クロロフォルム法により抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりＰＣＲ法によるヘリコバクター・ピロリ菌のｃａｇＡ遺伝子を解析した。

試薬
以下の試薬を含む２５μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ１５ｐｍｏｌ、
オリゴ２１０ｐｍｏｌ、
オリゴ３５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液２．５μｌ、
２ｍＭｄＮＴＰ２．５μｌ、
２５ｍＭＭｇＣｌ_２１μｌ、
ＫＯＤＤＮＡポリメラーゼ０．５Ｕ、
抽出ＤＮＡ溶液１００ｎｇ

増幅条件
９４℃・５分
９４℃・１５秒、
６０℃・３０秒、
６８℃・３０秒（３５サイクル）
２５℃・１５分。

（３）アガロースゲル電気泳動を用いた検出
増幅反応液５μｌを３％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した後、紫外線照射下での蛍光を検出した。アガロース電気泳動で得られた写真を図３に示す。なお、図３のレーン番号は表１のサンプル番号に対応する。電気泳動の条件は、定電圧１００Ｖ、６０分間にて行った。反応液の他に分子量マーカーも同時に泳動し、検出された増幅核酸断片の鎖長を比較する際の参考とした。

（４）結果
図３（および表１）のサンプル番号１〜６より明らかなように、本発明のヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法によれば、６００ｂｐを境界として増幅核酸断片の鎖長よりＣａｇＡタンパク質を東アジア型または西欧型に分類できる。すなわち増幅核酸断片が６００ｂｐより小さければ西欧型、６００ｂｐより大きければ東アジア型と判定できる。また、６００ｂｐより短い増幅核酸断片の本数より、Ｃ配列の繰り返し数を判定することが可能である。これらの結果は、核酸配列を直接解析することにより判別に必要な情報を得ることができるが多大な労力と時間が必要であるなどの欠点を有するシークエンシング法を用いた該６株の識別結果（表１）と一致する。

すなわち、本発明のヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法では従来の方法と同様の識別能力を実現しながら、解析に必要な作業工程数を大幅に短縮し、容易にかつ迅速にヘリコバクター・ピロリ菌のＣａｇＡタンパク質が東アジア型であるか西欧型であるかを判定し、さらにＣａｇＡタンパク質の毒性の指標となるＣ配列の有無および該配列の繰り返し数を明確に判定することが可能である。

本発明により、ヘリコバクター・ピロリ菌のＣａｇＡタンパク質が東アジア型であるか西欧型であるかを判定し、さらにＣａｇＡタンパク質の毒性の指標となるＣ配列の有無および該配列の繰り返し数を明確に判定することが可能となり、これまでの方法のように煩雑な操作を必要とせず、迅速で容易に再現性の良い結果が得られることからも、産業界に大きく寄与することが期待される。

Ｃ配列をコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーとＣ配列の外部近傍に存在する核酸配列を含有するプライマーを用いたヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法の一例Ｃ配列をコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーとＣ配列の外部近傍に存在する核酸配列を含有するプライマーと東アジア型ＣａｇＡをコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーを用いたヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法の一例ヘリコバクター・ピロリ菌の識別結果

Claims

ＣａｇＡタンパク質Ｃ末端領域の多型性を利用したヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法であって、該領域におけるＣ配列の有無および該配列の繰り返し数を判定することを特徴とする識別方法。
ＣａｇＡタンパク質Ｃ末端領域におけるＣ配列の有無および該配列の繰り返し数を判定することを特徴とするヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法であって、
（ａ）少なくとも１種のプライマーが、Ｃ配列をコードする核酸配列に特異的な核酸配列のうち少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、
（ｂ）また少なくとも１種のプライマーが、Ｃ配列の外部近傍に存在する核酸配列のうち少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、
（ｃ）一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となることを特徴とする方法を用いて核酸断片を増幅し、
（ｄ）該方法で得られた１つまたはそれ以上の増幅核酸断片を解析することからなる識別方法。
ＣａｇＡタンパク質Ｃ末端領域の多型性を利用したヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法であって、
（ａ）少なくとも１種のプライマーが、Ｃ配列をコードする核酸配列に特異的な核酸配列のうち少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、
（ｂ）また少なくとも１種のプライマーが、東アジア型ＣａｇＡをコードする核酸配列に特異的な核酸配列のうち少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、
（ｃ）さらに少なくとも１種のプライマーが、ＣａｇＡをコードする核酸配列に共通の核酸配列のうち少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、
（ｄ）一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となることを特徴とする方法を用いて核酸断片を増幅し、
（ｅ）該方法で得られた１つまたはそれ以上の増幅核酸断片を解析することからなる識別方法。
配列番号１から３のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
ＣａｇＡタンパク質Ｃ末端領域におけるＣ配列の有無および該配列の繰り返し数を判定することを特徴とするヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法であって、
（ａ）Ｃ配列をコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーとして、配列番号１に記載の核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドを使用し、
（ｂ）Ｃ配列の外部近傍に存在する核酸配列を含有するプライマーとして、配列番号２に記載の核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドを使用し、
（ｃ）一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となることを特徴とする方法を用いて核酸断片を増幅し、
（ｄ）該方法で得られた１つまたはそれ以上の増幅核酸断片を解析することからなる識別方法。
ＣａｇＡタンパク質Ｃ末端領域の多型性を利用したヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法であって、
（ａ）Ｃ配列をコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーとして、配列番号１に記載の核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドを使用し、
（ｂ）東アジア型ＣａｇＡをコードする核酸配列に特異的な核酸配列を含有するプライマーとして、配列番号３に記載の核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドを使用し、
（ｃ）ＣａｇＡをコードする核酸配列に共通の核酸配列として、配列番号２に記載の核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドを使用し、
（ｄ）一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となることを特徴とする方法を用いて核酸断片を増幅し、
（ｅ）該方法で得られた１つまたはそれ以上の増幅核酸断片を解析することからなる識別方法。
請求項５または６に記載の識別方法を用いてＣａｇＡタンパク質Ｃ末端領域におけるＣ配列の繰り返し数を判定し、欧米人に多く感染するヘリコバクター・ピロリ菌による発ガンの危険性を推測する方法。
ＣａｇＡタンパク質Ｃ末端領域におけるＣ配列の有無および該配列の繰り返し数を判定することによりヘリコバクター・ピロリ菌を識別するための試薬であって、
（ａ）少なくとも１種のプライマーが、Ｃ配列をコードする核酸配列に特異的な核酸配列のうち少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、
（ｂ）また少なくとも１種のプライマーが、Ｃ配列の外部近傍に存在する核酸配列のうち少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、
（ｃ）一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となるプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび緩衝液を含むことを特徴とする識別用試薬。
ＣａｇＡタンパク質Ｃ末端領域の多型性を利用してヘリコバクター・ピロリ菌を識別するための試薬であって、
（ａ）少なくとも１種のプライマーが、Ｃ配列をコードする核酸配列に特異的な核酸配列のうち少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、
（ｂ）また少なくとも１種のプライマーが、東アジア型ＣａｇＡをコードする核酸配列に特異的な核酸配列のうち少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、
（ｃ）さらに少なくとも１種のプライマーが、ＣａｇＡをコードする核酸配列に共通の核酸配列のうち少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、
（ｄ）一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となるプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび緩衝液を含むことを特徴とする識別用試薬。
請求項８または９に記載の識別用試薬を含んでなり、ＣａｇＡタンパク質Ｃ末端領域におけるＣ配列の繰り返し数から欧米人に多く感染するヘリコバクター・ピロリ菌による発ガンの危険性を推測するための試薬。