JP2008161121A - ヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法および識別キット - Google Patents

Abstract

【課題】簡便に、明確かつ再現性良くヘリコバクター・ピロリ菌を識別する方法および識別キットを提供する。
【解決手段】ＣａｇＡタンパク質のＣ末端領域中のＤ配列の有無、および前記Ｃ末端領域中のＤ配列の数を検出する多型検出工程を有する。
【選択図】図１

Description

本発明は、ＣａｇＡタンパク質のＣ末端領域の多型性に基づいたヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法および識別キットに関するものである。

病原性を有するグラム陰性菌の多くは、外来性遺伝子群を有することによって病原性を発揮することが知られている。上記外来性遺伝子群は、pathogenicity island（ＰＡＩ）と呼ばれている。ヘリコバクター・ピロリ菌では、病原因子の一つである細胞空胞化毒素関連タンパク質（ＣａｇＡ）をコードするｃａｇＡ遺伝子が上記ＰＡＩ内に位置し、当該ｃａｇＡ遺伝子を有する菌株の感染が十二指腸潰瘍、胃癌と関連することが報告されている。

ＣａｇＡタンパク質は、胃の上皮細胞に感染したヘリコバクター・ピロリ菌によって細胞内に送り込まれると、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼによってリン酸化を受ける。リン酸化されたＣａｇＡタンパク質は、Src homology phosphatase-2（ＳＨＰ-２）と結合することによって、ＲａｓおよびＥＲＫを介した異常な細胞増殖を引き起こすとともに、細胞接着に関連するfocal adhesion kinase（ＦＡＫ）を脱リン酸化して細胞の運動能の向上を引き起こす。

ＣａｇＡタンパク質のＣ末端領域には、ＥＰＩＹＡにて示されるアミノ酸配列からなるモチーフをそれぞれ持つＡ配列、Ｂ配列、Ｃ配列、Ｄ配列と名付けられた領域が存在し、当該Ａ配列、Ｂ配列、Ｃ配列およびＤ配列は、それぞれリン酸化を受けることが知られている。

上記Ａ配列、Ｂ配列およびＣ配列は欧米人に感染するヘリコバクター・ピロリ菌に高確率で存在し、Ａ配列、Ｂ配列およびＤ配列は東アジア人に感染するヘリコバクター・ピロリ菌に高確率で存在する。また、上記Ａ配列、Ｂ配列、Ｃ配列およびＤ配列は、個々のヘリコバクター・ピロリ菌中に複数存在する場合があることも知られている。そして、ＣａｇＡタンパク質における上記Ａ配列、Ｂ配列、Ｃ配列およびＤ配列の組み合わせの多様性が、ＣａｇＡタンパク質のＣ末端領域の多型を生み出す原因になっている。また、ＣａｇＡタンパク質中の上記Ａ配列、Ｂ配列、Ｃ配列およびＤ配列以外の領域（以下、周辺領域と呼ぶ）は、欧米人に感染するヘリコバクター・ピロリ菌と東アジア人に感染するヘリコバクター・ピロリ菌とでは、一部同じ領域を含むものの、多くの領域が異なっている。

上記知見に基づいて、ＣａｇＡタンパク質を分類することが可能である。例えば、図７（Ａ）に示すように、上記周辺領域として欧米人に感染するヘリコバクター・ピロリ菌に特有の核酸配列を有するとともに、Ａ配列、Ｂ配列およびＣ配列を有するＣａｇＡタンパク質を西欧型ＣａｇＡタンパク質と呼び、当該西欧型ＣａｇＡタンパク質をコードする遺伝子を西欧型ｃａｇＡ遺伝子と呼ぶ。また、図７（Ｂ）に示すように、上記周辺領域として欧米人に感染するヘリコバクター・ピロリ菌に特有の核酸配列を有するとともに、Ａ配列、Ｂ配列およびＤ配列を有するＣａｇＡタンパク質を混合型ＣａｇＡタンパク質と呼び、当該混合型ＣａｇＡタンパク質をコードする遺伝子を混合型ｃａｇＡ遺伝子と呼ぶ。つまり、当該混合型ＣａｇＡタンパク質とは、西欧型ＣａｇＡタンパク質において、Ｄ配列がＣ配列に置き換わったＣａｇＡタンパク質である。また、図７（Ｃ）に示すように、上記周辺領域として東アジア人に感染するヘリコバクター・ピロリ菌に特有の核酸配列を有するとともに、Ａ配列、Ｂ配列およびＤ配列を有するＣａｇＡタンパク質を東アジア型ＣａｇＡタンパク質と呼び、当該東アジア型ＣａｇＡタンパク質をコードする遺伝子を東アジア型ｃａｇＡ遺伝子と呼ぶ。なお、各型のＣａｇＡタンパク質中に含まれるＡ配列、Ｂ配列、Ｃ配列またはＤ配列の数は１つとは限らず、複数である場合も確認されている。

ＳＨＰ-２は、上記Ｃ配列またはＤ配列に結合するとともに、上記Ｃ配列よりもＤ配列の方に強く結合することが知られている。そして、Ｄ配列を有するヘリコバクター・ピロリ菌の方が、Ｃ配列を有するヘリコバクター・ピロリ菌と比較して毒性が強くなり、その結果、癌を誘発しやすくなることが知られている。さらに、欧米人に感染するヘリコバクター・ピロリ菌では、Ｃ配列を複数持つ場合にＳＨＰ-２との結合力が強くなり、東アジア人に感染するヘリコバクター・ピロリ菌では、Ｄ配列を複数持つ場合にＳＨＰ-２との結合力が強くなり、そして、ＳＨＰ−２との結合力が強くなるほど毒性が強くなって癌を誘発しやすくなることが知られている（例えば、非特許文献１〜４参照）。したがって、ＣａｇＡタンパク質のＣ末端領域の多型を検出することによって、当該ＣａｇＡタンパク質を有するヘリコバクター・ピロリ菌の毒性の有無、および毒性の程度を予測することが可能となる。

従来から、ヘリコバクター・ピロリ菌のＣａｇＡタンパク質が、上記Ａ配列、Ｂ配列およびＣ配列を有する欧米人に感染するタイプ（西欧型）であるのか、または上記Ａ配列、Ｂ配列およびＤ配列を有する東アジア人に感染するタイプ（東アジア型）であるのかを判別するために、例えば、ｃａｇＡ遺伝子の核酸配列を決定するシークエンシング法が用いられている。

また、従来から、polymerase chain reaction（ＰＣＲ）法（例えば、特許文献１および２参照）を利用して、ｃａｇＡ遺伝子を西欧型と東アジア型とに分類する方法が用いられている（例えば、特許文献３、非特許文献５参照）。当該方法は、西欧型ｃａｇＡ遺伝子または東アジア型ｃａｇＡ遺伝子を、それぞれ、西欧型ピロリ菌検出用のフォワードプライマーおよびリバースプライマー、または東アジア型ピロリ菌検出用のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて、ＰＣＲ法にてそれぞれ別々に増幅した後、検出用プローブと増幅産物とのハイブリダイゼーション反応によって増幅の有無を判断し、ＣａｇＡタンパク質の型を判別する方法である。
特公平４−６７９６０号公報（平成４年１０月２９日公開） 特公平４−６７９５７号公報（平成４年１０月２９日公開） 特開２００６−７５１３９号公報（平成１８年３月２３日公開） Asahi等著、J. Exp. Med. 第１９１巻、第５９３〜６０２頁、２０００年 Higashi等著、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第９９巻、第１４４２８〜１４４３３頁、２００２年 Azuma等著、J. Infect. Dis. 第１８９巻、第８２０〜８２７頁、２００４年 Azuma等著、J. Clin. Microbiol. 第４２巻、第２５０８〜２５１７頁、２００４年 Yamazaki等著、FEMS Immunol. Med. Microbiol. 第４４巻、第２６１〜２６８頁、２００５年

しかしながら、上記従来の方法では、簡便に、明確かつ再現性良くヘリコバクター・ピロリ菌を識別することができなかった。

例えば、上記従来のシークエンシング法では、核酸配列を直接解析することによって、判別に必要な情報を得ることができる。つまり、ヘリコバクター・ピロリ菌の核酸配列を直接読み取ることによって、ＣａｇＡタンパク質の型を判別することができるとともに、ＣａｇＡタンパク質中のＤ配列の数を判定することができる。しかしながら、当該方法では、鋳型となる核酸の調製、ＤＮＡポリメラーゼを用いた反応、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、核酸配列の解析などの多数の工程を必要とするため、多大な労力と時間を必要とするという問題点を有している。また、自動シークエンサーを用いることによって省力化を実現することは可能であるが、この場合には高価な装置が必要であるという問題点を有している。

また、上記従来のＰＣＲ法を用いる方法では、１試料あたり２反応のリアルタイムＰＣＲが必要なため、煩雑な操作を伴うという問題点を有している。さらには、当該方法では上述したようなＣａｇＡタンパク質において毒性の指標となり得るＤ配列の数に関する知見を得ることができないという問題点を有している。

本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、簡便に、明確かつ再現性良くヘリコバクター・ピロリ菌を識別する方法および識別キットを提供することにある。

本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、独自に見出したプライマー対を用いてＣａｇＡタンパク質のＣ末端領域の少なくとも一部をコードする核酸配列を増幅することによって、当該Ｃ末端領域の多型を詳細に検出することが可能となり、その検出結果に基づいて、簡便に、明確かつ再現性良くヘリコバクター・ピロリ菌を識別することが可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明のヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法は、上記課題を解決するために、ＣａｇＡタンパク質のＣ末端領域中のＤ配列の有無、および前記Ｃ末端領域中のＤ配列の数を検出する多型検出工程を有することを特徴としている。

本発明のヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法では、前記多型検出工程は、以下の第１プライマーおよび第２プライマー、つまり、
（ａ）Ｄ配列をコードする核酸配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖中の連続した少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドからなる第１プライマー、
（ｂ）Ｄ配列の外部に存在し、かつ西欧型、混合型および東アジア型ＣａｇＡタンパク質をコードする核酸配列に共通する核酸配列中の連続した少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドからなる第２プライマーであって、前記第１プライマーとは逆鎖側の核酸配列をコードする第２プライマー、
を用いて前記Ｃ末端領域の少なくとも一部をコードする核酸配列を増幅する増幅工程を含むことが好ましい。

本発明のヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法では、前記第１プライマーは、配列番号１または配列番号５に記載の核酸配列に含まれる、連続した少なくとも１５塩基よりなるオリゴヌクレオチドであり、前記第２プライマーは、配列番号２または配列番号６に記載の核酸配列に含まれる、連続した少なくとも１５塩基よりなるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。

本発明のヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法では、前記増幅工程は、さらに、以下の第３プライマー、つまり、
（ｃ）西欧型および混合型ＣａｇＡタンパク質に共通して存在するとともに、東アジア型ＣａｇＡタンパク質には存在しない領域をコードする核酸配列中、または、東アジア型ＣａｇＡタンパク質に存在するとともに、西欧型および混合型ＣａｇＡタンパク質には存在しない領域をコードする核酸配列中の、連続した少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドからなる第３プライマーであって、前記第１プライマーと同鎖側の核酸配列をコードする第３プライマー、
を用いて前記Ｃ末端領域の少なくとも一部をコードする核酸配列を増幅することが好ましい。

本発明のヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法では、前記第３プライマーは、配列番号３または配列番号４に記載の核酸配列に含まれる、連続した少なくとも１５塩基よりなるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。

本発明のヘリコバクター・ピロリ菌による発癌の危険性を予測する予測方法は、上記課題を解決するために、前記ヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法の何れかによって、ＣａｇＡタンパク質のＣ末端領域中のＤ配列の有無、および当該Ｄ配列の数を検出する工程を含むことを特徴としている。

本発明のキットは、上記課題を解決するために、ＣａｇＡタンパク質のＣ末端領域中のＤ配列の有無および当該Ｄ配列の数を検出することによってヘリコバクター・ピロリ菌を識別するためのキットであって、少なくとも以下の第１プライマーおよび第２プライマー、つまり、
（ａ）Ｄ配列をコードする核酸配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖中の連続した少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドからなる第１プライマー
（ｂ）Ｄ配列の外部に存在し、かつ西欧型、混合型および東アジア型ＣａｇＡタンパク質をコードする核酸配列に共通する核酸配列中の連続した少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドからなる第２プライマーであって、前記第１プライマーとは逆鎖側の核酸配列をコードする第２プライマー
を含むことを特徴としている。

本発明のキットは、さらに、以下の第３プライマー、つまり、
（ｃ）西欧型および混合型ＣａｇＡタンパク質に共通して存在するとともに、東アジア型ＣａｇＡタンパク質には存在しない領域をコードする核酸配列中、または、東アジア型ＣａｇＡタンパク質に存在するとともに、西欧型および混合型ＣａｇＡタンパク質には存在しない領域をコードする核酸配列中の、連続した少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドからなる第３プライマーであって、前記第１プライマーと同鎖側の核酸配列をコードする第３プライマー、
を含むことが好ましい。

本発明のキットは、ヘリコバクター・ピロリ菌による発癌の危険性を予測するために用いられることが好ましい。

本発明のオリゴヌクレオチドは、上記課題を解決するために、配列番号１〜６のいずれかに示される核酸配列または当該核酸配列に相補的な核酸配列の、連続した少なくとも１５塩基を含有することを特徴としている。

本発明は、以上のように、ＣａｇＡタンパク質のＣ末端領域中のＤ配列の有無、および前記Ｃ末端領域中のＤ配列の数を検出する多型検出工程を有するものである。

それゆえ、詳細にヘリコバクター・ピロリ菌を詳細に識別することが可能となり、その結果、発癌等の危険性の有無、および発癌の危険性の程度を予測することができるという効果を奏する。

〔１：ヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法〕
本実施の形態のヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法は、ＣａｇＡタンパク質のＣ末端領域の多型を検出する多型検出工程を含んでいる。

本明細書において「ＣａｇＡタンパク質のＣ末端領域」とは、ＥＰＩＹＡにて示されるアミノ酸配列を含むモチーフをそれぞれ持つＡ配列、Ｂ配列、Ｃ配列、Ｄ配列と名付けられた領域からなる領域を意図する。

また、本明細書において「ＣａｇＡタンパク質のＣ末端領域の多型」とは、上記Ｃ末端領域を形成するＡ配列、Ｂ配列、Ｃ配列およびＤ配列の組み合わせの多様性を意図する。

上記多型検出工程は、ＣａｇＡタンパク質のＣ末端領域の少なくとも一部をコードする核酸配列を増幅する増幅工程を含むことが好ましい。当該増幅工程では、試料中の全核酸配列中から増幅したい核酸配列（標的核酸）のみが、その固有の配列に対して相補性を有するプライマーを利用して増幅される。具体的に上記増幅工程では、一本鎖に変性させたヘリコバクター・ピロリ菌の染色体またはその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、ＤＮＡポリメラーゼおよび２種類以上のオリゴヌクレオチド（プライマー）等を作用させることによって、上記プライマー間の配列が増幅される。

上記増幅工程に用いられる具体的な核酸増幅方法としては特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、上記核酸増幅方法としては、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence-basedamplification method；Nature 第350巻、第91頁、1991年参照）、ＬＣＲ（国際公開８９／１２６９６号公報、特開平２−２９３４号公報参照）、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification：Nucleic Acids Res. 第20巻、第1691頁、1992年参照）、ＲＣＡ（国際公開９０／１０６９号公報参照）、ＴＭＡ（Transcription mediated amplification method；J. Clin. Microbiol. 第31巻、第3270頁、1993年参照）、ＬＡＭＰ（loop-mediated isothermal amplification method：J. Clin Microbiol. 第42巻：第1，956頁、2004年参照）、ＩＣＡＮ（isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids：Kekkaku. 第78巻、第533頁、2003年参照）、ＵＣＡＮ（日本癌学会（H13.9.26〜H13.9.28、横浜にて開催）または日本鑑識科学技術学会（H13.11.8〜H13.11.9、東京にて開催）参照）などを挙げることができるが、これらに限定されない。上記核酸増幅方法を用いれば、従来では検出不可能であった、極めて微量（１分子でも可）の試料核酸をも検出することが可能であり、上記増幅工程に好適に用いることが可能である。

また、試料中の核酸量が少ない場合には、上記増幅工程に先立って、ヘリコバクター・ピロリ菌の染色体またはその断片を上記増幅工程と同じ方法によって増幅しておくことも可能である。

上記増幅工程において用いられる核酸増幅方法としては、上記方法の中でもＰＣＲ法を用いることが好ましい。ＰＣＲ法は、試料核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のプライマーおよび耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性工程、アニーリング工程、伸長反応の３工程からなる反応サイクルを繰り返すことによって、上記一対のプライマーによって挟まれる試料核酸中の領域を、指数関数的に増幅させることができる。すなわち、変性工程にて試料核酸を変性し、続くアニーリング工程にて各プライマーと当該プライマーに相補的な試料核酸中の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程にて各プライマーを起点として、試料核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させる。この１サイクルによって、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上、上記一対のプライマーで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２のｎ乗倍に増幅される。増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在するので、例えば電気泳動等の方法によって容易に検出することができる。

上記増幅工程にて、前記Ｃ末端領域の少なくとも一部をコードする核酸配列を増幅するために用いるプライマーとしては、２種類のプライマーセット（プライマーセットＡ、またはプライマーセットＢ）を用いることができる。上記プライマーセットＡは、２つのプライマーからなるプライマーセットであり、上記プライマーセットＢは、３つのプライマーからなるプライマーセットである。当該プライマーセットについては、後に詳細に説明する。

本実施の形態のヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法では、プライマーセットＡを用いれば、ＣａｇＡタンパク質の毒性の指標となり得るＤ配列の有無、およびＤ配列の数について迅速に検出することができる。また、本実施の形態のヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法では、プライマーセットＢを用いれば、ＣａｇＡタンパク質の毒性の指標となり得るＤ配列の有無、およびＤ配列の数について迅速に検出することができるのみならず、ヘリコバクター・ピロリ菌のＣａｇＡタンパク質が東アジア型、西欧型または混合型の何れであるかを確認することができる。

以下に、プライマーセットＡおよびプライマーセットＢの各々について説明する。

（ａ：プライマーセットＡ）
本実施の形態のヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法では、上記増幅工程にて、プライマーセットＡを用いることが可能である。当該プライマーセットＡは、下記の第１プライマーおよび第２プライマーからなるプライマーセットである。そして、上記増幅工程では、上記第１プライマーと第２プライマーとによって挟まれる塩基配列が増幅される。

（ａ）Ｄ配列をコードする核酸配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖中の連続した少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドからなる第１プライマー
（ｂ）Ｄ配列の外部に存在し、かつ西欧型、混合型および東アジア型ＣａｇＡタンパク質をコードする核酸配列に共通する核酸配列中の連続した少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドからなる第２プライマーであって、前記第１プライマーとは逆鎖側の核酸配列をコードする第２プライマー
上記第１プライマーとしては、Ｄ配列をコードする核酸配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖中の連続した少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドからなるプライマーであればよく特に限定されないが、例えば、配列番号１または配列番号５に記載の核酸配列に含まれる核酸配列であることが好ましい。

５’−ＴＴＧＡＴＧＡＧＧＣＡＡＡＴＣＡＡＧＣＡＧＧ−３’（配列番号１）
５’−ＧＣＡＡＡＴＣＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＣＣＣ−３’（配列番号５）
また、第１プライマーの長さとしては、配列特異的なＰＣＲ反応が可能な程度の長さであればよく特に限定されないが、少なくとも１５塩基の長さを有することが好ましく、長ければ長いほど、より好ましい。第１プライマーの長さが１５塩基以上であれば、第１プライマーと試料核酸とのアニーリングの特異性を高めることができるため、上記増幅工程において、非特異的な増幅を防ぐことができる。その結果、明確かつ再現性よくヘリコバクター・ピロリ菌を識別することができる。

また、第１プライマーは、核酸増幅のために用いられるプライマーが一般的に有する特性を有していてもよい。例えば、第１プライマーは、修飾されていてもよい。当該修飾としても特に限定されず、例えば、ビオチン化、ジゴキシゲニンの結合または蛍光色素の結合などの修飾が施され得る。上記構成によれば、第１プライマーによって増幅される核酸断片を高感度に検出することが可能になる。例えば、第１プライマーをビオチン化すれば、当該第１プライマーによって増幅された核酸断片に対して、アビジンまたは抗ビオチン抗体が連結されたマーカーを結合させることができる。また、第１プライマーにジゴキシゲニンを結合すれば、当該第１プライマーによって増幅された核酸断片に対して、抗ジゴキシゲニン抗体が連結されたマーカーを結合させることができる。そして、増幅された核酸断片に結合したマーカーを検出することによって、第１プライマーによって増幅される核酸断片の有無を検出することができるとともに、増幅される核酸断片の量を推定することができる。なお、第１プライマーに蛍光色素を結合させる場合には、増幅される核酸断片中の蛍光色素の有無と、蛍光色素から発せられる蛍光の強度とを検出すればよい。

この時、上記マーカーとしては特に限定されず、適宜公知のマーカーを用いることができる。例えば、上記マーカーは、酵素であることが好ましい。更に具体的には、上記マーカーは、アルカリフォスファターゼまたはペルオキシダーゼであることが好ましい。上記マーカーとしてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、基質としてパラニトロフェニルリン酸またはＣＤＰ−ｓｔａｒを用いればよい。また、上記マーカーとしてペルオキシダーゼを用いる場合には、基質としてＴＭＢ、Ｌｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）またはＳＡＴ−１（同仁化学社製）を用いればよい。そして、上記酵素と基質との反応を検出すれば、第１プライマーによって増幅される核酸断片の有無を検出することができるとともに、増幅される核酸断片の量を推定することができる。

また、上記第２プライマーとしては、Ｄ配列の外部に存在し、かつ西欧型、混合型および東アジア型ＣａｇＡタンパク質をコードする核酸配列に共通する核酸配列中の連続した少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドからなるプライマーであって、上記第１プライマーとは逆鎖側の核酸配列をコードするプライマーであればよく特に限定されないが、配列番号２または配列番号６に記載の核酸配列に含まれる核酸配列であることが好ましい。

５’−ＧＣＴＡＴＴＡＡＴＧＣＧＴＧＴＧＴＧＧＣＴＧＴ−３’（配列番号２）
５’−ＡＡＡＧＣＡＴＴＣＴＴＴＴＴＴＧＴＡＧＡＡＴＣＴＴＴＧＡＧ−３’（配列番号６）
また、第２プライマーの長さとしても、配列特異的なＰＣＲ反応が可能な程度の長さであればよく特に限定されないが、少なくとも１５塩基の長さを有することが好ましく、長ければ長いほど、より好ましい。第２プライマーの長さが１５塩基以上であれば、第２プライマーと試料核酸とのアニーリングの特異性を高めることができるため、上記増幅工程において、非特異的な増幅を防ぐことができる。その結果、明確かつ再現性よくヘリコバクター・ピロリ菌を識別することができる。

なお、本明細書において「Ｄ配列の外部」とは、ＣａｇＡタンパク質におけるＤ配列以外の領域が意図され、当該領域には、Ａ配列、Ｂ配列、Ｃ配列および周辺領域が含まれる。

また、第２プライマーは、核酸増幅のために用いられるプライマーが一般的に有する特性を有していてもよい。具体的には、第２プライマーは、修飾されていてもよい。当該修飾としても特に限定されず、例えば、ビオチン化、ジゴキシゲニンの結合または蛍光色素の結合などの修飾が施され得る。上記構成によれば、第１プライマーの場合と同様の効果を得ることができる。

また、上述したように第２プライマーは、上記第１プライマーとは逆鎖側の核酸配列をコードするプライマーである。つまり、第１プライマーがヘリコバクター・ピロリ菌の染色体またはその断片のセンスプライマーである場合には、第２プライマーは、ヘリコバクター・ピロリ菌の染色体またはその断片に相補的なアンチセンスプライマーであればよい。一方、第１プライマーがヘリコバクター・ピロリ菌の染色体またはその断片に相補的なアンチセンスプライマーである場合には、第２プライマーは、ヘリコバクター・ピロリ菌の染色体またはその断片のセンスプライマーであればよい。これによって、試料核酸中の核酸配列であって、上記第１プライマーと第２プライマーとによって挟まれる核酸配列が増幅され得る。

また、上記第１プライマーおよび第２プライマーは、近いＴｍ値を有するプライマーであることが好ましい。Ｔｍ値が近ければ、試料核酸中の配列において第１プライマーと第２プライマーとによって挟まれる領域を特異的に増幅させることができる。なお、Ｔｍ値とは、２本鎖を形成したＤＮＡ分子の５０％が乖離する温度する温度のことである。Ｔｍ値の計算方法としては適宜公知の方法を用いればよく、例えば、Nearest neighbor method、ＧＣ％法等によって求めることができる。

以下に、図１を用いて、上記第１プライマーおよび第２プライマーによって、ＣａｇＡタンパク質のＣ末端領域の多型を検出する方法について具体的に説明する。

上述したように、ＣａｇＡタンパク質のＣ末端領域には、Ａ配列、Ｂ配列、Ｃ配列およびＤ配列が、様々な組み合わせにて存在している。そして、当該組み合わせの多様性が、ＣａｇＡタンパク質のＣ末端領域の多型を生み出す要因となっている。また、上記Ａ配列、Ｂ配列、Ｃ配列およびＤ配列の中で、Ｄ配列を有するＣａｇＡタンパク質が最も毒性が強く、さらに、ＣａｇＡタンパク質中に含まれるＤ配列の数が多くなるほど、毒性が強くなる。上記プライマーセットＡを用いれば、西欧型ＣａｇＡタンパク質、東アジア型ＣａｇＡタンパク質または混合型ＣａｇＡタンパク質の何れであるかに関わらず、ＣａｇＡタンパク質中のＤ配列の有無を確認することができるとともに、ＣａｇＡタンパク質中のＤ配列の数を検出することができる。

図１（Ａ）・（Ｂ）にはｃａｇＡ遺伝子（西欧型ｃａｇＡ遺伝子、東アジア型ｃａｇＡ遺伝子または混合型ｃａｇＡ遺伝子の何れであってもよい）中のＡ配列およびＢ配列をコードする核酸配列の近傍が示されている。更に具体的には、図１（Ａ）には、１つのＤ配列をコードする核酸配列を有するｃａｇＡ遺伝子が示されており、図１（Ｂ）には、２つのＤ配列をコードする核酸配列を有するｃａｇＡ遺伝子が示されている。

上記第２プライマーは、西欧型、混合型および東アジア型ＣａｇＡタンパク質をコードする核酸配列に共通する核酸配列中の連続した少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドからなるプライマーであるので、ＣａｇＡタンパク質の型に関わらず、Ｄ配列をコードする領域の外部に存在する核酸配列にアニーリングすることができる。一方、上記第１プライマーは、Ｄ配列をコードする核酸配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖中の連続した少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドからなるプライマーであるので、Ｄ配列が存在する場合にのみ、Ｄ配列をコードする核酸配列にアニーリングすることができる。したがって、図１（Ａ）に示すように、ＣａｇＡタンパク質が１個のＤ配列を有する場合には、第１プライマーは、ｃａｇＡ遺伝子上の１箇所にアニーリングすることになる。その結果、第１プライマーおよび第２プライマーを用いた増幅工程において、１本の増幅核酸断片が検出されることになる。一方、図１（Ｂ）に示すように、ＣａｇＡタンパク質が２個のＤ配列を有する場合には、第１プライマーは、ｃａｇＡ遺伝子上の２箇所にアニーリングすることになる。その結果、第１プライマーおよび第２プライマーを用いた増幅工程において、長さが異なる２本の増幅核酸断片が検出されることになる。つまり、本実施形態のヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法では、増幅工程において、ＣａｇＡタンパク質中のＤ配列と等しい数の増幅核酸断片を検出することができる。なお、ＣａｇＡタンパク質中のＤ配列の数が０個の場合には、増幅核酸断片は検出されない。

以上のように、本実施の形態のヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法では、増幅核酸断片の有無によってＣａｇＡタンパク質中のＤ配列の有無がわかるとともに、増幅核酸断片の数によってＣａｇＡタンパク質中のＤ配列の数がわかる。そして、ＣａｇＡタンパク質中のＤ配列の有無によって、発癌の可能性の有無が予測でき、ＣａｇＡタンパク質中のＤ配列の数によって、発癌の可能性の大小（Ｄ配列の数が多いほど、発癌の可能性が大きい）を予測することができる。

（ｂ：プライマーセットＢ）
本実施の形態のヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法では、上記増幅工程にて、第１プライマー、第２プライマーおよび第３プライマーからなるプライマーセットＢを用いることが可能である。

当該プライマーセットＢを用いれば、上記プライマーセットＡの効果に加えて、更に優れた効果を得ることができる。この点、以下に詳説する。

上述したように、従来から、ＰＣＲ法を用いてＣａｇＡ遺伝子の型を分類する方法が用いられている。当該従来の方法では、西欧型ピロリ菌検出用のフォワードプライマーおよびリバースプライマー、または東アジア型ピロリ菌検出用のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いてＰＣＲ反応を行う。つまり、上記従来の方法では、Ａ配列、Ｂ配列、Ｃ配列およびＤ配列からなる配列を挟むようにプライマー対が設計されている。

このため、西欧型ｃａｇＡ遺伝子と東アジア型ｃａｇＡ遺伝子とを区別することはできるものの、西欧型ｃａｇＡ遺伝子と混合型ｃａｇＡ遺伝子とを区別することができないという技術的課題を有している。この技術的課題は、本願発明者らが独自に見出したものである。

上記の課題を解決すべく、本願発明者らは上記増幅工程にてプライマーセットＢを用いる技術を完成させた。本技術によれば、ＣａｇＡタンパク質中のＤ配列の有無、およびＣａｇＡタンパク質中のＤ配列の数がわかるのみならず、西欧型ｃａｇＡ遺伝子、東アジア型ｃａｇＡ遺伝子、混合型ｃａｇＡ遺伝子を区別することが可能になる。このことは、以下の説明によって明らかになる。

当該プライマーセットＢは、下記の第１プライマー、第２プライマーおよび第３プライマーからなるプライマーセットである。そして、上記増幅工程では、第１プライマーと第２プライマーとによって挟まれる塩基配列が増幅されるとともに、第３プライマーと第２プライマーとによって挟まれる塩基配列が増幅される。

（ａ）Ｄ配列をコードする核酸配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖中の連続した少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドからなる第１プライマー、
（ｂ）Ｄ配列の外部に存在し、かつ西欧型、混合型および東アジア型ＣａｇＡタンパク質をコードする核酸配列に共通する核酸配列中の連続した少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドからなる第２プライマーであって、前記第１プライマーとは逆鎖側の核酸配列をコードする第２プライマー、
（ｃ）西欧型および混合型ＣａｇＡタンパク質に共通して存在するとともに、東アジア型ＣａｇＡタンパク質には存在しない領域をコードする核酸配列中、または、東アジア型ＣａｇＡタンパク質に存在するとともに、西欧型および混合型ＣａｇＡタンパク質には存在しない領域をコードする核酸配列中の、連続した少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドからなる第３プライマーであって、前記第１プライマーと同鎖側の核酸配列をコードする第３プライマー。

上記第１プライマーおよび第２プライマーの具体的構成は、上述したプライマーセットＡに含まれる構成として説明したので、ここでは、その説明を省略する。

上記第３プライマーとしては、以下に記すｉ）またはｉｉ）のうちの何れかを用いることができる。つまり、
ｉ）西欧型および混合型ＣａｇＡタンパク質に共通して存在するとともに、東アジア型ＣａｇＡタンパク質には存在しない領域をコードする核酸配列中の連続した少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドからなるプライマーであって、上記第１プライマーと同鎖側の核酸配列をコードするプライマー（特に、第４プライマーと呼ぶ）、
ｉｉ）東アジア型ＣａｇＡタンパク質に存在するとともに、西欧型および混合型ＣａｇＡタンパク質には存在しない領域をコードする核酸配列中の連続した少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドからなるプライマーであって、上記第１プライマーと同鎖側の核酸配列をコードするプライマー（特に、第５プライマーと呼ぶ）。

例えば、上記第４プライマーとしては、配列番号３に記載の核酸配列中に含まれる核酸配列であることが好ましい。

５’−ＡＡＴＴＧＡＣＴＣＡＡＣＡＡＧＣＴＣＡＡＡＡＡＡＡＴＧ−３’（配列番号３）
また、上記第５プライマーとしては、配列番号４に記載の核酸配列中に含まれる核酸配列であることが好ましい。
５’−ＧＡＡＣＴＣＡＡＡＡＡＣＴＴＧＴＣＡＴＴＧＧＡＴＣＴＴ−３’（配列番号４）。

また、第３プライマーの長さとしても配列特異的なＰＣＲ反応が可能な程度の長さであればよく特に限定されないが、少なくとも１５塩基の長さを有することが好ましく、長ければ長いほど、より好ましい。第３プライマーの長さが１５塩基以上であれば、第３プライマーと試料核酸とのアニーリングの特異性を高めることができるため、上記増幅工程において、非特異的な増幅を防ぐことができる。その結果、明確かつ再現性よくヘリコバクター・ピロリ菌を識別することができる。

また、第３プライマーは、核酸増幅のために用いられるプライマーが一般的に有する特性を有していてもよい。具体的には、第３プライマーは、修飾されていてもよい。当該修飾としても特に限定されず、例えば、ビオチン化、ジゴキシゲニンの結合または蛍光色素の結合などの修飾が施され得る。上記構成によれば、第１プライマーの場合と同様の効果を得ることができる。

また、第１プライマーと第３プライマーとは、ヘリコバクター・ピロリ菌の染色体またはその断片に対して同じ向きに設計することが好ましい。また、このとき第２プライマーは、上記第１プライマーおよび第３プライマーとは逆鎖側の核酸配列をコードするプライマーである。つまり、上記第１プライマーと第３プライマーとがヘリコバクター・ピロリ菌の染色体またはその断片のセンスプライマーである場合には、上記第２プライマーは、ヘリコバクター・ピロリ菌の染色体またはその断片に相補的なアンチセンスプライマーであればよい。一方、第１プライマーと第３プライマーとがヘリコバクター・ピロリ菌の染色体またはその断片に相補的なアンチセンスプライマーである場合には、第２プライマーは、ヘリコバクター・ピロリ菌の染色体またはその断片のセンスプライマーであればよい。これによって、試料核酸中の核酸配列であって、上記第１プライマーと第２プライマーとによって挟まれる核酸配列、および上記第３プライマーと第２プライマーとによって挟まれる核酸配列が、同時に（同じＰＣＲ反応にて）増幅され得る。したがって、１つの試料核酸に関する詳細な情報を、１回のＰＣＲ反応によって得ることができる。

上記第１プライマー、第２プライマーおよび第３プライマーは、近いＴｍ値を有するプライマーであることが好ましい。Ｔｍ値が近ければ、試料核酸中の配列において第１プライマーと第２プライマーとによって挟まれる領域、および第３プライマーと第２プライマーとによって挟まれる領域を、同時に特異的に増幅させることができる。

以下に、まず、図２（Ａ）・（Ｂ）および図３（Ａ）・（Ｂ）を用いて、上記第１プライマー、第２プライマーおよび第４プライマーを用いて、ＣａｇＡタンパク質のＣ末端領域の多型を検出する方法について具体的に説明する。

上述したように、ＣａｇＡタンパク質のＣ末端領域には、Ａ配列、Ｂ配列、Ｃ配列およびＤ配列が、様々な組み合わせにて存在している。そして、当該組み合わせの多様性が、ＣａｇＡタンパク質のＣ末端領域の多型を生み出す要因となっている。また、上記Ａ配列、Ｂ配列、Ｃ配列およびＤ配列の中で、Ｄ配列を有するＣａｇＡタンパク質が最も毒性が強く、さらに、ＣａｇＡタンパク質中に含まれるＤ配列の数が多くなるほど、毒性が強くなる。当該プライマーセットＢを用いれば、ＣａｇＡタンパク質が西欧型、東アジア型または混合型の何れの型であるのかを確認することができるとともに、ＣａｇＡタンパク質中のＤ配列の有無、およびＣａｇＡタンパク質中のＤ配列の数を検出することができる。

図２（Ａ）・（Ｂ）には東アジア型ｃａｇＡ遺伝子（東アジア型ＣａｇＡタンパク質をコードする遺伝子）中のＡ配列およびＢ配列をコードする核酸配列の近傍が示されている。更に具体的には、図２（Ａ）には、１つのＤ配列をコードする核酸配列を有する東アジア型ｃａｇＡ遺伝子が示されており、図２（Ｂ）には、２つのＤ配列をコードする核酸配列を有する東アジア型ｃａｇＡ遺伝子が示されている。

上記第２プライマーは、西欧型、混合型および東アジア型ＣａｇＡタンパク質をコードする核酸配列に共通する核酸配列中の連続した少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドからなるプライマーであるので、ＣａｇＡタンパク質の型に関わらず、Ｄ配列をコードする領域の外部に存在する核酸配列にアニーリングすることができる。一方、上記第１プライマーは、Ｄ配列をコードする核酸配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖中の連続した少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドからなるプライマーであるので、Ｄ配列が存在する場合にのみ、Ｄ配列をコードする核酸配列にアニーリングすることができる。

したがって、図２（Ａ）に示すように、ＣａｇＡタンパク質が１個のＤ配列を有する場合には、第１プライマーは、東アジア型ｃａｇＡ遺伝子上の１箇所にアニーリングすることになる。その結果、第１プライマーおよび第２プライマーを用いた増幅工程において、１本の増幅核酸断片が検出されることになる。一方、図２（Ｂ）に示すように、ＣａｇＡタンパク質が２個のＤ配列を有する場合には、第１プライマーは、東アジア型ｃａｇＡ遺伝子上の２箇所にアニーリングすることになる。その結果、第１プライマーおよび第２プライマーを用いた増幅工程において、長さが異なる２本の増幅核酸断片が検出されることになる。つまり、本実施形態のヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法では、増幅工程において、ＣａｇＡタンパク質中のＤ配列と等しい数の増幅核酸断片を検出することができる。なお、ＣａｇＡタンパク質中のＤ配列の数が０個の場合には、増幅核酸断片は検出されない。

さらに、当該増幅工程には、第４プライマーが用いられている。しかしながら、当該第４プライマーは、西欧型および混合型ＣａｇＡタンパク質に共通して存在するとともに、東アジア型ＣａｇＡタンパク質には存在しない領域をコードする核酸配列中の連続した少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドからなるプライマーであるので、東アジア型ｃａｇＡ遺伝子に対してアニーリングすることはない。したがって、ｃａｇＡ遺伝子が東アジア型である場合には、上記第４プライマーおよび第２プライマーからなるプライマー対によって、核酸断片が増幅されることはない。換言すれば、上記第４プライマーおよび第２プライマーからなるプライマー対によって核酸断片が増幅されないことが確認できれば、試料核酸は東アジア型ｃａｇＡ遺伝子であることが確認できる。なお、上記第４プライマーおよび第２プライマーからなるプライマー対によって増幅される増幅核酸断片は、上記第１プライマーおよび第２プライマーからなるプライマー対によって増幅される増幅核酸断片と比較して長いので、両者を容易に区別することができる。

また、図３（Ａ）には西欧型ｃａｇＡ遺伝子（西欧型ＣａｇＡタンパク質をコードする遺伝子）中のＡ配列およびＢ配列をコードする核酸配列の近傍が示されており、図３（Ｂ）には混合型ｃａｇＡ遺伝子（混合型ＣａｇＡタンパク質をコードする遺伝子）中のＡ配列およびＢ配列をコードする核酸配列の近傍が示されている。更に具体的には、図３（Ａ）には、１つのＣ配列をコードする核酸配列を有する西欧型ｃａｇＡ遺伝子が示されており、図３（Ｂ）には、１つのＤ配列をコードする核酸配列を有する混合型ｃａｇＡ遺伝子が示されている。

上記第２プライマーは、西欧型、混合型および東アジア型ＣａｇＡタンパク質をコードする核酸配列に共通する核酸配列中の連続した少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドからなるプライマーであるので、ＣａｇＡタンパク質の型に関わらず、Ｄ配列をコードする領域の外部に存在する核酸配列にアニーリングすることができる。一方、上記第１プライマーは、Ｄ配列をコードする核酸配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖中の連続した少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドからなるプライマーであるので、Ｄ配列が存在する場合にのみ、Ｄ配列をコードする核酸配列にアニーリングすることができる。

したがって、図３（Ａ）に示すように、ＣａｇＡタンパク質がＤ配列を有しない場合には、第１プライマーは、西欧型ｃａｇＡ遺伝子上にアニーリングすることができない。その結果、上記第１プライマーおよび第２プライマーからなるプライマー対によって、核酸断片が増幅されることはない。一方、上記第４プライマーは、西欧型および混合型ＣａｇＡタンパク質に共通して存在するとともに、東アジア型ＣａｇＡタンパク質には存在しない領域をコードする核酸配列中の連続した少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドからなるプライマーであるので、西欧型ｃａｇＡ遺伝子上にアニーリングすることができる。その結果、上記第４プライマーおよび第２プライマーからなるプライマー対によって、核酸断片が増幅される。換言すれば、上記第４プライマーおよび第２プライマーからなるプライマー対によってのみ核酸断片が増幅されることが確認できれば、試料核酸は西欧型ｃａｇＡ遺伝子であることが確認できる。つまり、上記第４プライマーおよび第２プライマーからなるプライマー対によって増幅される比較的長い増幅核酸断片のみが検出されれば、試料核酸は西欧型ｃａｇＡ遺伝子であることが確認できる。

また、図３（Ｂ）に示すように、ＣａｇＡタンパク質が１個のＤ配列を有する場合には、第１プライマーは、混合型ｃａｇＡ遺伝子上の１箇所にアニーリングすることになる。その結果、上記第１プライマーおよび第２プライマーからなるプライマー対によって、１本の増幅核酸断片が増幅される。なお、本実施形態のヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法では、上記第１プライマーおよび第２プライマーからなるプライマー対によって、ＣａｇＡタンパク質中のＤ配列と等しい数の増幅核酸断片が検出される（図示せず）。このことは、当業者であれば、図２（Ｂ）に関する説明から容易に理解できるであろう。一方、上記第４プライマーは、西欧型および混合型ＣａｇＡタンパク質に共通して存在するとともに、東アジア型ＣａｇＡタンパク質には存在しない領域をコードする核酸配列中の連続した少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドからなるプライマーであるので、混合型ｃａｇＡ遺伝子上にアニーリングすることができる。その結果、上記第４プライマーおよび第２プライマーからなるプライマー対によって、核酸断片が増幅される。換言すれば、上記第１プライマーおよび第２プライマーからなるプライマー対によって核酸断片が増幅されるとともに、上記第４プライマーおよび第２プライマーからなるプライマー対によって核酸断片が増幅されることが確認できれば、試料核酸は混合型ｃａｇＡ遺伝子であることが確認できる。つまり、上記第１プライマーおよび第２プライマーからなるプライマー対によって増幅される比較的短い増幅核酸断片と、上記第４プライマーおよび第２プライマーからなるプライマー対によって増幅される比較的長い増幅核酸断片との両方が検出されれば、試料核酸は混合型ｃａｇＡ遺伝子であることが確認できる。

なお、上記第３プライマーおよび第２プライマーからなるプライマー対によって増幅される増幅核酸断片は、上記第１プライマーおよび第２プライマーからなるプライマー対によって増幅される増幅核酸断片と比較して大きいので、両者を容易に区別することができる。

次いで、図４（Ａ）・（Ｂ）および図５（Ａ）・（Ｂ）を用いて、上記第１プライマー、第２プライマーおよび第５プライマーによって、ＣａｇＡタンパク質のＣ末端領域の多型を検出する方法について具体的に説明する。

上述したように、上記第５プライマーは、東アジア型ＣａｇＡタンパク質に存在するとともに、西欧型および混合型ＣａｇＡタンパク質には存在しない領域をコードする核酸配列中の連続した少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドからなるプライマーであるので、試料核酸が東アジア型ｃａｇＡ遺伝子である場合のみ、第５プライマーは、試料核酸に対してアニーリングすることができる。したがって、図２（Ａ）・（Ｂ）および図３（Ａ）・（Ｂ）にて説明したことに基づけば、増幅工程にて上記第１プライマー、第２プライマーおよび第５プライマーによって増幅される増幅核酸断片の種類を容易に理解することができる。

つまり、図４（Ａ）・（Ｂ）に示すように、試料核酸が東アジア型ｃａｇＡ遺伝子である場合には、第１プライマーおよび第２プライマーによって増幅される比較的短い増幅核酸断片と、第５プライマーおよび第２プライマーによって増幅される比較的長い増幅核酸断片との両方が、上記増幅工程において増幅される。なお、図４（Ｂ）に示すように、第１プライマーおよび第２プライマーによって増幅される比較的短い増幅核酸断片の数は、Ｄ配列の数と同じである。また、図５（Ａ）に示すように、試料核酸が西欧型ｃａｇＡ遺伝子である場合には、上記増幅工程において核酸断片が増幅されることはない。また、図５（Ｂ）に示すように、試料核酸が混合型ｃａｇＡ遺伝子である場合には、上記増幅工程において、第１プライマーおよび第２プライマーによって増幅される比較的短い増幅核酸断片のみが増幅される。

したがって、当該プライマーセットＢを用いても、ＣａｇＡタンパク質が西欧型、東アジア型または混合型の何れの型であるのかを確認することができるとともに、ＣａｇＡタンパク質中のＤ配列の有無、およびＣａｇＡタンパク質中のＤ配列の数を検出することができる。

以上のように、本実施の形態のヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法では、ＣａｇＡタンパク質が西欧型、東アジア型または混合型の何れの型であるのかを確認することができるとともに、ＣａｇＡタンパク質中のＤ配列の有無、およびＣａｇＡタンパク質中のＤ配列の数を検出することができる。そして、増幅核酸断片の有無によって、発癌の可能性の有無を予測することができるとともに、上記増幅核酸断片の本数によって、発癌の可能性の大小（本数が多いほど、発癌の危険度が大きい）を予測することができる。

上記増幅工程にてプライマーセットＡまたはプライマーセットＢによって増幅された増幅核酸断片は、適宜公知の方法によって検出され得る。例えば、当該検出方法としては、簡便性の観点から電気泳動法を用いることが好ましい。なお、電気泳動に用いるゲルの種類も特に限定されず、アガロースゲルまたはアクリルアミドゲル等を用いることが可能である。電気泳動法を使用する場合には、例えば、上記増幅工程にて増幅される各核酸断片の長さが異なるように各プライマーを設計するとともに、当該増幅断片を適切に分離できるように電気泳動用のゲルを選択することが好ましい。

また、上記第３プライマーおよび第２プライマーからなるプライマー対によって増幅される増幅核酸断片と、上記第１プライマーおよび第２プライマーからなるプライマー対によって増幅される増幅核酸断片とを区別する方法は、各増幅核酸断片の長さに基づく区別に限定されない。例えば、各プライマーに対して異なる種類のラベル（例えば、蛍光色素）を施して、当該プライマーを用いて上記増幅工程を行えばよい。そして、増幅核酸断片中の上記ラベルの有無および強度を検出すればよい。つまり、増幅核酸断片中のラベルの有無によって当該プライマーによって核酸配列が増幅されたか否かを確認することができる。また、増幅核酸断片中の上記ラベルの強度によって、例えば、上記第１プライマーおよび第２プライマーからなるプライマー対によって異なる長さの増幅核酸断片が何種類増幅されたかを推測することが可能である。

〔２：キット〕
本実施の形態のキットは、ＣａｇＡタンパク質のＣ末端領域中のＤ配列の有無および当該Ｄ配列の数を検出することによってヘリコバクター・ピロリ菌を識別するためのキットであって、少なくとも以下の第１プライマーおよび第２プライマーが含まれる。
（ａ）Ｄ配列をコードする核酸配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖中の連続した少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドからなる第１プライマー、
（ｂ）Ｄ配列の外部に存在し、かつ西欧型、混合型および東アジア型ＣａｇＡタンパク質をコードする核酸配列に共通する核酸配列中の連続した少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドからなる第２プライマーであって、前記第１プライマーとは逆鎖側の核酸配列をコードする第２プライマー。

なお、上記キットでは、上記第１プライマーは、配列番号１または配列番号５に記載の核酸配列の、少なくとも一部を含むオリゴヌクレオチドであり、上記第２プライマーは、配列番号２または配列番号６に記載の核酸配列の、少なくとも一部を含むオリゴヌクレオチドであることが好ましい。

なお、上記第１プライマーおよび第２プライマーは、本願発明のヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法の説明において既に説明した第１プライマーおよび第２プライマーと同じプライマーであるので、ここではその詳細な説明を省略する。

また、本発明における別の実施形態のキットは、ＣａｇＡタンパク質のＣ末端領域中のＤ配列の有無および当該Ｄ配列の数を検出することによってヘリコバクター・ピロリ菌を識別するためのキットであって、少なくとも以下の第１プライマー、第２プライマーおよび第３プライマーを含む。
（ａ）Ｄ配列をコードする核酸配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖中の連続した少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドからなる第１プライマー、
（ｂ）Ｄ配列の外部に存在し、かつ西欧型、混合型および東アジア型ＣａｇＡタンパク質をコードする核酸配列に共通する核酸配列中の連続した少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドからなる第２プライマーであって、前記第１プライマーとは逆鎖側の核酸配列をコードする第２プライマー、
（ｃ）西欧型および混合型ＣａｇＡタンパク質に共通して存在するとともに、東アジア型ＣａｇＡタンパク質には存在しない領域をコードする核酸配列中、または、東アジア型ＣａｇＡタンパク質に存在するとともに、西欧型および混合型ＣａｇＡタンパク質には存在しない領域をコードする核酸配列中の、連続した少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドからなる第３プライマーであって、前記第１プライマーと同鎖側の核酸配列をコードする第３プライマー。

なお、上記キットでは、上記第１プライマーは、配列番号１または配列番号５に記載の核酸配列の、少なくとも一部を含むオリゴヌクレオチドであり、上記第２プライマーは、配列番号２または配列番号６に記載の核酸配列の、少なくとも一部を含むオリゴヌクレオチドであり、上記第３プライマーは、配列番号３または配列番号４に記載の核酸配列の、少なくとも一部を含むオリゴヌクレオチドであることが好ましい。

なお、上記第１プライマー、第２プライマーおよび第３プライマーは、本願発明のヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法の説明において既に説明した第１プライマー、第２プライマーおよび第３プライマーと同じプライマーであるので、ここではその詳細な説明を省略する。

なお、上記第１プライマー、第２プライマーおよび第３プライマーは、上記増幅工程において、１〜４０００ｎＭ程度の濃度で用いられることが好ましく、増幅量および特異性を高めるためには、５０〜５００ｎＭ程度の濃度で用いられることがより好ましく、２００ｎＭ程度の濃度で用いられることが、最も好ましい。

本実施の形態のキットには、上記プライマーの他に、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ｄＮＴＰ、反応バッファーおよび核酸含有試料からなる群より選択される少なくとも１つが含まれることが好ましい。

ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としては特に限定されず、適宜公知の酵素を用いることができる。例えば、当該酵素としては、Ｔ４またはＴ７ファージ、大腸菌、サーモコッカス（Thermococcus）属、サーマス（Thermus）属、パイロコッカス（Pyrococcus）属、バシラス（Bacillus）属など種々の生物由来のＤＮＡポリメラーゼまたはその変異体を用いることが可能である。例えば、上記増幅工程にてＰＣＲ法を使用する場合には、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼなどの熱安定性の酵素を使用することが好ましい。中でもＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼおよび当該酵素を改良したＤＮＡポリメラーゼは、増幅量および反応速度の観点から、最も好ましい。更に具体的には、上記酵素としてＫＯＤ Ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼを用いる場合には、上記増幅工程において１〜２００単位／ｍｌ程度の濃度にて使用されることが好ましく、１０〜１００単位／ｍｌ程度の濃度にて使用されることが、より好ましい。

上記ｄＮＴＰは、上記増幅工程において５０〜１０００μＭ程度の濃度で用いられることが好ましく、１００〜７００μＭ程度の濃度で用いられることがより好ましく、２００〜４００μＭ程度の濃度で用いられることがさらに好ましい。

上記反応バッファーとしては、適宜公知の反応バッファーを用いることができる。例えば、本実施の形態のキットに含まれるＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素の能力を最大限に発揮するために、バッファーおよび金属塩の濃度、反応バッファーのｐＨなどが適宜選択され得る。また、上記酵素の安定性を高めるために、当該反応バッファー中に、ウシ血清アルブミンなどの添加剤が適宜混合され得る。

上記核酸含有試料は、例えば、バクテリア、動物または植物組織、個体細胞由来の溶解物、患者の血液または組織などのあらゆる材料から調製することができる。当該核酸含有試料の調製法は特に限定されず、適宜公知の方法によって調製され得る。例えば、当該調製方法として、フェノール／クロロホルム抽出法（Biochimica et Biophysica acta 第72巻、第619〜629頁、1963年）、アルカリＳＤＳ法（Nucleic Acids Res. 第7巻、第1513〜1523頁、1979年）などの液相で行う方法を用いることが可能である。また、核酸の単離に核酸結合用担体を用いる方法としては、ガラス粒子とヨウ化ナトリウム溶液を使用する方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第76-2巻、第615〜619頁、1979年）、ハイドロキシアパタイトを用いる方法（特開昭６３−２６３０９３号公報）等を用いることが可能である。また、その他の方法としては、シリカ粒子とカオトロピックイオンとを用いた方法（J. Clinical Microbiology 第28-3巻、第495〜503頁、1990年、特開平２−２８９５９６号公報）等を用いることが可能である。また、上記核酸含有試料中の核酸は、試料中に溶解されていてもよいし、固相に固定されていてもよい。

また、本実施の形態のキットは、ヘリコバクター・ピロリ菌による発癌の危険性を予測するために用いられることが好ましい。上記癌としては、胃癌などを挙げることができる。上述したように、本実施の形態のキットを用いれば、ＣａｇＡタンパク質のＣ末端領域の多型を検出することができる。更に詳細には、本実施の形態のキットを用いれば、発癌に関係が深いＤ配列の有無を検出することができるとともに、Ｄ配列の数をも検出することができる。そして、Ｄ配列の有無によって、発癌の可能性の有無を予測することができるとともに、上記Ｄ配列の数によって、発癌の可能性の大小（Ｄ配列が多いほど、発癌の危険度が大きい）を予測することができる。

〔３：発癌の危険性を予測する予測方法〕
本実施の形態の発癌の危険性を予測する方法は、本願発明のヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法によって、ＣａｇＡタンパク質のＣ末端領域中のＤ配列の有無、および当該Ｄ配列の数を検出する工程が含まれる。

本願発明のヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法に関しては既に説明したので、ここでは説明を省略する。

また、本実施の形態の予測方法によって発癌の危険性が検討される癌としては、胃癌などを挙げることができる。上述したように、本実施の形態の予測方法を用いれば、ＣａｇＡタンパク質のＣ末端領域中のＤ配列の有無によって、発癌の可能性の有無を予測することができるとともに、上記Ｄ配列の数によって、発癌の可能性の大小（Ｄ配列が多いほど、発癌の危険度が大きい）を予測することができる。

〔１：オリゴヌクレオチドの合成〕
ＤＮＡシンセサイザー３９２型（パーキンエルマー社製）を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１〜３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、Ｐｒｉｍ１〜３と呼ぶ）を合成した。

Ｐｒｉｍ１：５’−ＴＴＧＡＴＧＡＧＧＣＡＡＡＴＣＡＡＧＣＡＧＧ−３’（配列番号１）
Ｐｒｉｍ２：５’−ＧＣＴＡＴＴＡＡＴＧＣＧＴＧＴＧＴＧＧＣＴＧＴ−３’（配列番号２）
Ｐｒｉｍ３：５’−ＡＡＴＴＧＡＣＴＣＡＡＣＡＡＧＣＴＣＡＡＡＡＡＡＡＴＧ−３’（配列番号３）
上記オリゴヌクレオチドの合成は、上記ＤＮＡシンセサイザー３９２型のマニュアルに従った。また、各種オリゴヌクレオチドの保護基の解離は、５５℃の条件下で各オリゴヌクレオチドを、アンモニア水中に一昼夜放置することによって行った。オリゴヌクレオチドの精製は、ＯＰＣカラム（パーキンエルマー社製）を用いて行った。なお、オリゴヌクレオチドの合成は、ＤＮＡ合成受託会社（（株）日本バイオサービス、シグマアルドリッチジャパン（株）、オペロンバイオテクノロジー（株）等）に依頼した。

上記Ｐｒｉｍ１は、Ｄ配列をコードする核酸配列に特異的な核酸配列のセンス鎖の一部を含むオリゴヌクレオチドである。また、上記Ｐｒｉｍ２は、西欧型および東アジア型ＣａｇＡをコードする核酸配列に共通する核酸配列のアンチセンス鎖の一部を含むオリゴヌクレオチドである。また、上記Ｐｒｉｍ３は、西欧型ＣａｇＡをコードする核酸配列に特異的な核酸配列のセンス鎖の一部を含むオリゴヌクレオチドである。そして、ＰＣＲ法によって、Ｐｒｉｍ１とＰｒｉｍ２とが１対のプライマーとして働いて核酸配列を増幅することができるとともに、Ｐｒｉｍ３とＰｒｉｍ２とが１対のプライマーとして働いて核酸配列を増幅することができる。

〔２：ＰＣＲ法によるヘリコバクター・ピロリ菌ｃａｇＡ遺伝子の解析〕
下記の表１に示すヘリコバクター・ピロリ菌（サンプル１〜１０）からＤＮＡを精製して、ＰＣＲ反応における鋳型ＤＮＡとして用いた。なお、ＤＮＡの精製は、フェノール・クロロホルム法を用いて行った。

以下に、ＰＣＲの条件について説明する。本実施例では、抽出ＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）を１００ｎｇ、Ｐｒｉｍ１を５ｐｍｏｌ、Ｐｒｉｍ２を１０ｐｍｏｌ、Ｐｒｉｍ３を５ｐｍｏｌ、×１０Ｂｕｆｆｅｒを２．５μＬ、２ｍＭ ｄＮＴＰを２．５μＬ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２を１μＬおよびＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを０．５Ｕ、を混合した後、Ｈ_２Ｏを加えて全量を２５μＬとしてＰＣＲ用の反応溶液とした。

ＰＣＲ反応としては、まず、９４℃にて５分間の変性反応を行った。そして、当該変性反応の後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、および６８℃にて３０秒間の伸長反応からなる反応を、３５サイクル行った。そして、当該反応の後、反応産物を２５℃にて１５分間放置した。

〔３：アガロースゲル電気泳動を用いた検出〕
５μＬの上記反応産物を３％のアガロースゲルにて電気泳動した後、電気泳動後のアガロースゲルをエチジウムブロマイドによって染色した。そして、染色後のアガロースゲルに紫外線を照射して、ＰＣＲ反応によって増幅された核酸配列を確認した。なお、上記電気泳動は、定電圧１００Ｖ、６０分間にて行った。また、反応産物の他に分子量マーカーも同時に電気泳動し、増幅された核酸配列の鎖長を比較するときの参考とした。

〔４：結果〕
図６に示すように、サンプル１〜６は東アジア型のヘリコバクター・ピロリ菌であり、当該サンプル１〜６では、増幅された核酸断片は、５００ｂｐよりも短かった。また、Ｄ配列を２つ有するサンプル６では、５００ｂｐよりも短い核酸断片が２つ観察された。一方、サンプル７〜１０は西欧型のヘリコバクター・ピロリ菌であり、当該サンプル７〜１０では、増幅された核酸断片は、５００ｂｐよりも長かった。

つまり、本実施例では、増幅された核酸断片の長さに基づいて、ヘリコバクター・ピロリ菌を東アジア型または西欧型に分類することができた。さらに詳細には、本実施例では、増幅された核酸断片が５００ｂｐよりも短ければ東アジア型であり、増幅された核酸断片が５００ｂｐよりも長ければ西欧型であると判断することができた。

また、本実施例では、５００ｂｐよりも短い核酸断片の本数に基づいて、ヘリコバクター・ピロリ菌が有するＤ配列の繰り返し数を判定することができた。換言すれば、Ｄ配列の繰り返し数を判定することによって、ヘリコバクター・ピロリ菌の毒性を判定することができた。

つまり、本実施例では、従来の方法と比較して、解析に必要な作業工程数を大幅に短縮し、容易かつ迅速に、ヘリコバクター・ピロリ菌のＣａｇＡタンパク質が東アジア型であるか西欧型であるかを判定するとともに、さらにＣａｇＡタンパク質の毒性の指標となるＤ配列の有無および当該Ｄ配列の数を明確に判定することができた。

なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。

以上のように、本発明では、ＣａｇＡタンパク質の型を判別することができるとともに、ＣａｇＡタンパク質のＣ末端領域中のＤ配列の有無、およびＣ末端領域中のＤ配列の数が検出されるため、明確かつ再現性良くヘリコバクター・ピロリ菌を識別することができる。そのため、本発明は、ヘリコバクター・ピロリ菌を識別する必要のある分野に利用することができるのみならず、ヘリコバクター・ピロリ菌の病原性や発癌の危険性の推測などに広く利用することができる。本発明は、これまでの方法のように煩雑な操作を必要とせず、迅速かつ容易に再現性の良い結果が得られるので、産業界に大きく寄与することが期待される。

（Ａ）・（Ｂ）は、本発明におけるヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法の実施の一形態を示す模式図であって、プライマーと増幅核酸断片との関係を示す模式図である。 （Ａ）・（Ｂ）は、本発明におけるヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法の他の実施の一形態を示す模式図であって、プライマーと増幅核酸断片との関係を示す模式図である。 （Ａ）・（Ｂ）は、本発明におけるヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法のさらに他の実施の一形態を示す模式図であって、プライマーと増幅核酸断片との関係を示す模式図である。 （Ａ）・（Ｂ）は、本発明におけるヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法のさらに他の実施の一形態を示す模式図であって、プライマーと増幅核酸断片との関係を示す模式図である。 （Ａ）・（Ｂ）は、本発明におけるヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法のさらに他の実施の一形態を示す模式図であって、プライマーと増幅核酸断片との関係を示す模式図である。 実施例におけるヘリコバクター・ピロリ菌の識別結果を示す電気泳動図である。 （Ａ）〜（Ｃ）は、それぞれ、西欧型ｃａｇＡ遺伝子、混合型ｃａｇＡ遺伝子および東アジア型ｃａｇＡ遺伝子を示す模式図である。

Claims (10)

1. ＣａｇＡタンパク質のＣ末端領域中のＤ配列の有無、および前記Ｃ末端領域中のＤ配列の数を検出する多型検出工程を有することを特徴とするヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法。
2. 前記多型検出工程は、以下の第１プライマーおよび第２プライマーを用いて前記Ｃ末端領域の少なくとも一部をコードする核酸配列を増幅する増幅工程を含むことを特徴とする請求項１に記載のヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法。
   （ａ）Ｄ配列をコードする核酸配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖中の連続した少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドからなる第１プライマー
   （ｂ）Ｄ配列の外部に存在し、かつ西欧型、混合型および東アジア型ＣａｇＡタンパク質をコードする核酸配列に共通する核酸配列中の連続した少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドからなる第２プライマーであって、前記第１プライマーとは逆鎖側の核酸配列をコードする第２プライマー
3. 前記第１プライマーは、配列番号１または配列番号５に記載の核酸配列に含まれる、連続した少なくとも１５塩基よりなるオリゴヌクレオチドであり、
   前記第２プライマーは、配列番号２または配列番号６に記載の核酸配列に含まれる、連続した少なくとも１５塩基よりなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項２に記載のヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法。
4. 前記増幅工程は、さらに、以下の第３プライマーを用いて前記Ｃ末端領域の少なくとも一部をコードする核酸配列を増幅することを特徴とする請求項２または３に記載のヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法。
   （ｃ）西欧型および混合型ＣａｇＡタンパク質に共通して存在するとともに、東アジア型ＣａｇＡタンパク質には存在しない領域をコードする核酸配列中、または、東アジア型ＣａｇＡタンパク質に存在するとともに、西欧型および混合型ＣａｇＡタンパク質には存在しない領域をコードする核酸配列中の、連続した少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドからなる第３プライマーであって、前記第１プライマーと同鎖側の核酸配列をコードする第３プライマー
5. 前記第３プライマーは、配列番号３または配列番号４に記載の核酸配列に含まれる、連続した少なくとも１５塩基よりなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項４に記載のヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法。
6. 請求項１〜５の何れか１項に記載のヘリコバクター・ピロリ菌の識別方法によって、ＣａｇＡタンパク質のＣ末端領域中のＤ配列の有無、および当該Ｄ配列の数を検出する工程を含む、ヘリコバクター・ピロリ菌による発癌の危険性を予測する予測方法。
7. ＣａｇＡタンパク質のＣ末端領域中のＤ配列の有無および当該Ｄ配列の数を検出することによってヘリコバクター・ピロリ菌を識別するためのキットであって、少なくとも以下の第１プライマーおよび第２プライマーを含むことを特徴とするキット。
   （ａ）Ｄ配列をコードする核酸配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖中の連続した少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドからなる第１プライマー
   （ｂ）Ｄ配列の外部に存在し、かつ西欧型、混合型および東アジア型ＣａｇＡタンパク質をコードする核酸配列に共通する核酸配列中の連続した少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドからなる第２プライマーであって、前記第１プライマーとは逆鎖側の核酸配列をコードする第２プライマー
8. さらに、以下の第３プライマーを含むことを特徴とする請求項７に記載のキット。
   （ｃ）西欧型および混合型ＣａｇＡタンパク質に共通して存在するとともに、東アジア型ＣａｇＡタンパク質には存在しない領域をコードする核酸配列中、または、東アジア型ＣａｇＡタンパク質に存在するとともに、西欧型および混合型ＣａｇＡタンパク質には存在しない領域をコードする核酸配列中の、連続した少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドからなる第３プライマーであって、前記第１プライマーと同鎖側の核酸配列をコードする第３プライマー
9. ヘリコバクター・ピロリ菌による発癌の危険性を予測するために用いられることを特徴とする請求項７または８に記載のキット。
10. 配列番号１〜６のいずれかに示される核酸配列または当該核酸配列に相補的な核酸配列の、連続した少なくとも１５塩基を含有することを特徴とするオリゴヌクレオチド。