JP6720161B2 - 複数の標的核酸の検出キット及びそれを用いる検出方法 - Google Patents

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Description

本発明は、ＰＣＲ法を改善し、複数の標的核酸を測定する検出キット及びその関連技術に関する。
遺伝子検査において、複数の標的遺伝子の測定が必要なことも多い。たとえばインフルエンザのＡ型とＢ型、インフルエンザとＲＳＶ、さらにはヒトメタニューモウイルス、性感染症のクラミジアと淋菌、マイコプラズマとその耐性因子などである。
病状が似ている上に同じ時期に同時に感染が拡大する場合などは、これらを鑑別して診断し、治療方針を立てることも考えられる。また、耐性因子の存在は投薬の選定判断などにも使われる。
一方、単独の測定項目においても、その測定が本当にうまく進んだかどうかを確認する手段として内部コントロールを設定することも有用である。これは検出目的である標的遺伝子とは関係ない核酸配列を増幅するようにあらかじめ準備しておき、標的遺伝子の有無にかかわらず反応がうまく進んだかどうかを確認できるものである。このことで測定試薬や装置が有効に作用したかどうかを測定内で確認できる。
この様に、複数の標的核酸を検出するには、別々の測定を実施するか、或いは、それぞれの標的核酸の検出に異なる標識色素などを用いて識別する手段が考えられる。
または、同時に増幅反応を行った後に、緩やかに温度を上昇（または下降）させて、蛍光シグナルの変化率がピークを示す温度と標的核酸の融解温度から識別判断すること（熱融解曲線分析法）も可能である。
しかしながら、別々の測定では時間やコストがかかり、異なる標識物を識別することも、複数の標識試薬の準備のみならず分析装置の波長設定などでコストがかかってしまう。
熱融解曲線分析法を用いる場合には、コストは低いが緩やかに温度の変化をさせる必要があるため、正確な分析を行うためには５〜１０分ほどの時間をかけて温度変化を行わなければならない。
特許文献１（日本国特開２００２−１３６３００号公報）では、異なる反応液が入った複数の反応容器を用意し、それぞれ増幅検出する。項目ごとに試薬調製、分注作業があり手間がかかるという問題点がある。
特許文献２（日本国特開２００４−２０３号公報）では、１種類の反応液が入った１つの反応容器で複数の遺伝子を同時増幅する。遺伝子ごとに標識色素を変えておくことで識別する。用いる標識色素の数だけ、検出する装置の光学系が複数必要になってくるため装置のコストが高くなってしまうという問題点がある。
特許文献３（日本国特開２００８−１７３１２７号公報）では、１種類の反応液が入った１つの反応容器で複数の遺伝子を同時増幅する。項目ごとに、ＰＣＲ産物や標識プローブの解離温度を変え、増幅後に低温側から高温側に徐々に温度を上昇させ蛍光値をモニタリングする解離曲線分析（「熱融解曲線分析」と同義。）を行い、塩基配列に依存するそれぞれの解離温度におけるピークの有無をモニタリングすることによって識別する。
融解曲線分析時の温度変化の速度を上げると各項目の融解温度を識別するのが困難になるため、ＰＣＲ反応後５〜１０分ほど時間が余計にかかってしまうという問題点がある。
特許文献４（日本国特表２０１２−５１３２１５号公報）では、１個の反応液容器で複数の遺伝子を同時増幅する。遺伝子ごとに、ＰＣＲ産物の解離温度とプライマーの融解温度を変え、それぞれの融解温度で蛍光をモニタリングして識別する。
通常のＰＣＲプロファイルは１サイクル中に、変性、アニーリング・伸長ステップを設けるが、特許文献４では、項目ごとにＰＣＲ産物の融解温度を変えるため、考慮すべき条件が多く、プロファイルの設計が困難であり、測定時間も長くなる。温度変化が激しいため、装置の負担も大きいという問題点がある。
日本国特開２００２−１３６３００号公報 日本国特開２００４−２０３号公報 日本国特開２００８−１７３１２７号公報 日本国特表２０１２−５１３２１５号公報 日本国特許第４７２４３８０号公報
そこで本発明は、１種類の反応液が入った１つの反応容器及び単一の標識を用いて、複数の遺伝子を同時に増幅・検出できる、複数の標的核酸の検出キットを提供することを目的とする。
第１の発明に係る複数の標的核酸の検出キットは、変性温度をＴ０、アニーリング温度をＴ１、伸長温度をＴ２、第２標的検出温度をＴ３とすると、Ｔ０＞Ｔ２≧Ｔ１＞Ｔ３を満たすように温度設定される複数の標的核酸の検出キットであって、変性温度Ｔ０において、２本鎖の水素結合が切断され、それぞれ２本の１本鎖に解離する、第１標的核酸及び第２標的核酸を含み得る溶液に、
アニーリング温度Ｔ１において、第１標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれかに特異的に結合する第１標的用プライマーと、アニーリング温度Ｔ１において、第２標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれかに特異的に結合する第２標的用プライマーと、アニーリング温度Ｔ１において、第１標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれかに特異的に結合する第１標的用プローブであって、結合により蛍光シグナルが変化する第１標識物を有するものと、ＤＮＡポリメラーゼと、伸長温度Ｔ２において、ＤＮＡポリメラーゼの作用により、第１標的核酸が解離した２本の１本鎖及び第２標的核酸が解離した２本の１本鎖に結合するデオキシリボヌクレオチド３リン酸と、アニーリング温度Ｔ１においては、第１標的核酸が解離した２本の１本鎖及び第２標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれにも結合せず、第２標的検出温度Ｔ３において、第２標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれかに特異的に結合する第２標的用プローブであって、結合により蛍光シグナルが変化する第２標識物を有するものとを含有する。
好ましくは、第１、第２標識物は、ＱＰｒｏｂｅ（登録商標）プローブ、Ｅｐｒｏｂｅ（登録商標）プローブ及びＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブからなる群から選択される。
蛍光シグナルは、アニールすると消光するもの、アニールすると発光するもののいずれであってもよい。
第１標的核酸及び第２標的核酸は、好ましくは、マイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロール、或いは、クラミジア内在性プラスミド遺伝子と淋菌ＣＭＴ遺伝子である。
以上述べたように、本発明によれば、１種類の標識物を用いて複数の標的核酸を、１種類の混合液で検出できる。熱融解曲線分析なしで複数の標的核酸の識別が可能であるため、測定時間を大幅に短縮でき、実用的効果が高い。
本発明者らは、ＰＣＲ法における、プローブのアニーリング温度の条件設定と温度変化プロファイルを組み合わせた、１種類の反応液が入った１つの反応容器で単一蛍光標識を用いた複数核酸を検出するキットを開発した。
本キットでは、図３５に示すように、４つの温度、即ち、変性温度Ｔ０（９５℃）、アニーリング温度Ｔ１（７０℃）、伸長温度Ｔ２（７２℃）及び第２標的検出温度Ｔ３（５５℃）を使用する。これらの温度は、Ｔ０＞Ｔ２≧Ｔ１＞Ｔ３を満たすように温度設定される。勿論、これらの温度数値は、例示に過ぎず、後述するように、種々変更することができる。
複数の標的核酸とは、第１標的核酸及び第２標的核酸であるが、必要とあれば、第３標的検出温度Ｔ４（Ｔ３＞Ｔ４）等の設定温度を増やすことにより、第３標的核酸その他の標的核酸を追加することもできる。
図３６を参照しながら、本キットの内容について説明する。まず、本キットでは、第１標的核酸１０と、第２標的核酸２０とを検出対象とする。以下説明の便宜のため、容器１内の溶液２（詳細は後述する。）には、第１標的核酸１０と第２標的核酸２０の両方が含まれている場合（つまり、陽性と陽性である場合）のみを説明する。
勿論、片方又は両方が陰性である場合には、第１標的核酸１０と第２標的核酸２０の少なくとも一方又は両方が溶液２に含まれていないことになり、以下の説明において、含まれていない標的核酸に関する、蛍光シグナル及び増幅が行われないことになる。
図３７（ａ）に示すように、溶液２の温度を上昇させ変性温度Ｔ０になると、第１標的核酸１０及び第２標的核酸２０は、いずれも２本鎖の水素結合が切断され、それぞれ２本の１本鎖（第１標的核酸１０は、第１の１本鎖１１と第２の１本鎖１２に、第２標的核酸２０は、第１の１本鎖２１と第２の１本鎖２２に）解離する。
図３７（ｂ）に示すように、変性温度Ｔ０から温度を下げてアニーリング温度Ｔ１になると、第１標的核酸１０について、第１標的用Ｆプライマー１３が第１の１本鎖１１の相補的な配列に特異的に結合し、第１標的用Ｒプライマー１４が第２の１本鎖１２の相補的な配列に特異的に結合する。同様に、第２標的核酸２０について、第２標的用Ｆプライマー２３が第１の１本鎖２１の相補的な配列に特異的に結合し、第２標的用Ｒプライマー２４が第２の１本鎖２２の相補的な配列に特異的に結合する。
また、第１標識物１６により標識された第１標的用プローブ１５が、図３７（ｂ）に示すアニーリング温度Ｔ１において、第１標的核酸１０由来の第１の１本鎖１１の特定部位に特異的に結合し、第１標識物１６は蛍光サインを発生する。しかしながら、第２標識物２６により標識された第２標的用プローブ２５は、アニーリング温度Ｔ１では第２標的検出温度Ｔ３よりも温度が高いため、第２標的核酸２０由来の第１の１本鎖２１には結合せず、第２標識物２６は蛍光サインを発生しない。
図３７（ｃ）に示すように、温度をアニーリング温度Ｔ１から伸長温度Ｔ２に上げると、溶液２に、ＰＣＲサイクルを繰り返すために十分な量の、ＤＮＡポリメラーゼ３０とデオキシリボヌクレオチド３リン酸３１とが含まれているため、次のように増幅反応が進行する。
即ち、第１標的核酸１０について、第１の１本鎖１１に結合する第１標的用Ｆプライマー１３から、また、第２の１本鎖１２に結合する第１標的用Ｒプライマー１４から、それぞれデオキシリボヌクレオチド３リン酸３１が結合し伸長してゆく。
また、第２標的核酸２０について、第１の１本鎖２１に結合する第２標的用Ｆプライマー２３から、また、第２の１本鎖２２に結合する第２標的用Ｒプライマー２４から、それぞれデオキシリボヌクレオチド３リン酸３１が結合し伸長してゆく。
そして、増幅反応が完了すると、図３７（ｄ）を図３６と比較すると分かるように、第１標的核酸１０及び第２標的核酸２０の両方が、２倍に増えたことになる。
再び、図３７（ａ）に示すステップに戻り、以上のステップ（図３７（ａ）〜図３７（ｄ））を繰り返すと、第１標的物１６による蛍光シグナルの変化と増幅反応を繰り返すことができる。
次に、図３８を参照しながら、変性温度Ｔ０から温度を下げて第２標的温度検出温度Ｔ３となる場合について説明する。
変性温度Ｔ０では、図３８（ａ）に示すように、図３７（ａ）と同様の状態となる。ところが、温度を第２標的温度検出温度Ｔ３に下げると、図３７（ｂ）とは異なり、図３８（ｂ）に示す状態となる。
即ち、図３８（ｂ）に示すように、第１標識物１６により標識された第１標的用プローブ１５が、第１標的核酸１０由来の第１の１本鎖１１の特定部位に特異的に結合し、第１標識物１６の蛍光シグナルが変化する点では、図３７（ｂ）と同様であるが、第２標識物２６により標識された第２標的用プローブ２５も、第２標的検出温度Ｔ３となっているため、第２標的核酸２０由来の第１の１本鎖２１に結合し、第２標識物２６の蛍光シグナルが変化する。なお、第１標識物１６と第２標識物２６は同一であるのが好ましい。
その結果、第２標識物２６による蛍光シグナルの変化による差分を捉えれば、第２標識物２０の有無（陽性／陰性）を判定できることになる。
しかも、以上説明したところから明らかなように、１種類の反応液が入った１つの反応容器を用いて一連でとぎれないステップ中に複数の標的核酸を検出できることが理解されよう。
以下、さらに具体的に、ＱＰｒｏｂｅ（登録商標）法、Ｅｐｒｏｂｅ（登録商標）法、ＴａｑＭａｎ（登録商標）法による、３種類のプローブを用いた複数核酸を検出する実施の形態を示す。実施するのに必要なプライマー配列及び各プローブの塩基配列、核酸試料の情報もあわせて示す。
（実施の形態１）
＜ＱＰｒｏｂｅ法におけるマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールの検出＞
ＱＰｒｏｂｅ法におけるマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールの検出を行った。
＜材料及び方法＞
（プライマー）
実施の形態１におけるＰＣＲ法に用いたプライマー対は、（表１）に示すとおりである。
Figure 0006720161
配列番号１、配列番号２は、Ｉｅｖｅｎらの報告（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１９９６；１７３；１４４５−５２）に記載されている（Ｐ１アドへシン遺伝子に対するプライマー対）配列を使用した。
（核酸試料）
実施の形態１でＰＣＲ法に用いた核酸試料を以下に示す。
（ｐＭＹＣ）
マイコプラズマ肺炎の病原体であるマイコプラズマ・ニューモニエ由来の膜タンパク質であるＰ１タンパク質をコードする遺伝子断片（配列番号１と２のプライマー対で増幅される配列）を人工合成後、ｐＭＤ２０Ｔベクターに組み込んだプラスミドＤＮＡである。このプラスミドＤＮＡは、タカラバイオ株式会社に合成を委託して作製した。
（ｐＩＣＭ５）
配列番号１と２のプライマー対を共通プライマーとして増幅できるように、プライマー対と相補的な塩基配列を含む配列を人工合成後、ｐＭＤ２０Ｔベクターに組み込んだプラスミドＤＮＡである。このプラスミドＤＮＡはタカラバイオ株式会社に合成を委託して作製した。
（核酸試料の調製）
上記のプラスミドの長さは、ｐＭＹＣは２９４２ｂｐ、ｐＩＣＭ５は２８８６ｂｐである。
各プラスミドの長さとプラスミド溶液の濃度（μｇ／μｌ）から１μＬあたりのコピー数を計算した後、ＴＥ緩衝溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）を用い、ｐＭＹＣは１×１０＾５ｃｏｐｉｅｓ／μｌ、ｐＩＣＭ５は１×１０＾３ｃｏｐｉｅｓ／μｌとなるように希釈した。
（プローブ）
実施の形態１におけるＰＣＲ法に用いるプローブの情報は、（表２）に示すとおりである。
Figure 0006720161
（表１）のプライマー対で増幅し得るＰＣＲ産物の塩基配列から、配列番号３及び配列番号４は、Ｊ−Ｂｉｏ２１センターのホームページ上のＱＰｒｏｂｅ設計支援ツールを用い計算したＴｍ値を参考にし、特定領域を選択した。
ｐＭＹＣに特異的にアニールするＱＰｒｏｂｅであるＭＹＣ ＱＰと、ｐＩＣＭ５に特異的にアニールするＱＰｒｏｂｅであるＩＣ ＱＰの蛍光色素にはＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬを使用し、それぞれ３’末端のＣを標識した。ＱＰｒｏｂｅは日鉄住金環境株式会社に合成を委託して作製した。
（ＰＣＲ・蛍光測定条件）
実施の形態１では、１種類の反応液が入った１つの反応容器中で増幅する２つの標的核酸について、第１標的であるｐＭＹＣに特異的にアニールするＱＰｒｏｂｅ（ＭＹＣ ＱＰ）のＴｍ値をプライマーのＴｍ値よりも高い温度に設定し、増幅反応中に検出した。
次に、第２標的であるｐＩＣＭ５に特異的にアニールするＱＰｒｏｂｅ（ＩＣ ＱＰ）のＴｍ値を増幅反応中の変化温度（７０℃―９５℃）よりも低い温度に設定し、増幅反応後に検出した。
ＰＣＲ反応液組成、反応条件を（表３）と（表４）に示し、また、混合液の温度変化をグラフ化したものを図１に示す。
Figure 0006720161
Figure 0006720161
ＰＣＲ及び蛍光測定には、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ｎａｎｏ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を使用した。
蛍光測定時の励起波長と蛍光波長の組み合わせは５１０−５２８ｎｍを選択した。各サイクルの変性ステップ（９５℃）と伸長ステップ（７２℃）で蛍光値を測定し、更に、増幅反応後に第２標的を検出するためのステップ（９５℃と５５℃）において蛍光測定を行った。
増幅反応の最終サイクルと、第２標的検出ステップにおける蛍光測定条件を図２に示す。
（データの処理方法）
ＱＰｒｏｂｅを用いた際の解析方法は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ｎａｎｏに備え付けの解析ソフトが対応していないため、特許文献５（日本国特許第４７２４３８０号公報）に記載されている方法を参考に、得られた生データに対して補正演算処理を行った。
増幅反応と第２標的検出ステップの全てのサイクル毎に、次の数式による演算を行った。
ｆｎ＝ｆｈｙｂ．ｎ／ｆｄｅｎ．ｎ （数１）
ｆｅ＝ｆｈｙｂ．ｅ／ｆｄｅｎ．ｅ （数１’）
ｆｎ：（数１）により算出されたｎサイクルにおける蛍光強度値
ｆｈｙｂ．ｎ：ｎサイクル目の伸長ステップの蛍光強度値
ｆｄｅｎ．ｎ：ｎサイクル目の変性ステップの蛍光強度値
ｆｅ：（数１’）により算出された第２標的検出ステップにおける蛍光強度値
ｆｈｙｂ．ｅ：第２標的検出ステップ５５℃の蛍光強度値
ｆｄｅｎ．ｅ：第２標的検出ステップ９５℃の蛍光強度値
次に、増幅反応の全てのサイクルと第２標的検出ステップについて、次の数式で演算を行った。
Ｆｎ＝ｆｎ／ｆ１０ （数２）
Ｆｅ＝ｆｅ／ｆ１０ （数２’）
Ｆｎ：１０サイクル目の（数１）により得られた蛍光強度値を１とした時のｎサイクル目の相対値
Ｆｅ：１０サイクル目の（数１’）により得られた蛍光強度値を１とした時の第２標的検出ステップの相対値
増幅反応の最終サイクルのＦｎの値であるＦ４４を、第１標的核酸の有無の判定に用いた。
更に、次の数式による演算を行った。
Ｆｓ＝Ｆｅ−Ｆ４４ （数３）
Ｆｓ：第２標的の測定値
Ｆｓの値を、第２標的核酸の有無の判定に用いた。
ＱＰｒｏｂｅ法における判定は下記に示す方法で行った。
第１標的核酸の有無は、測定試料のＦ４４の値と閾値１を比較して［測定試料のＦ４４＜閾値１］を陽性と判定した。
閾値１は、陰性対照（ＤＮＡの代わりにＴＥ緩衝液を添加した試薬）のＦ４４の平均値−標準偏差の３倍（以下ｍｅａｎ−３ＳＤ）の値を用いた。
第２標的核酸の有無は、第１標的核酸が陽性、陰性に関わらず、Ｆｓの値と閾値２を比較して［Ｆｓ＜閾値２］を陽性と判定した。
閾値２は、ｐＭＹＣだけを添加した試料のＦｓのｍｅａｎ−３ＳＤの値を用いた。判定方法のフローチャートは、図３に示すとおりである。
マイコプラズマＰ１遺伝子はｐＭＹＣ、内部コントロールはｐＩＣＭ５を、それぞれ核酸試料に用いてＰＣＲを実施した。
ＭＹＣ ＱＰの配列はＴｍ値を７２．５℃、ＩＣ ＱＰの配列はＴｍ値を５７．５℃に設定した。そのため、ＰＣＲ中の温度範囲（７０℃から９５℃）では、プローブはＭＹＣ ＱＰだけがアニールすると推測された。
第２標的検出ステップの蛍光測定は、９５℃とＩＣ ＱＰのＴｍ値よりも低い５５℃で行うため、第２標的検出ステップの測定値はＭＹＣ ＱＰとＩＣ ＱＰの消光を同時に検出すると推測された。
陰性対照の増幅曲線は、ＰＣＲが終了する４４サイクル目まで消光が見られず（Ｆ４４の値０．９９８が閾値１の値０．９９７よりも低くないため）、この時のｍｅａｎ−３ＳＤは０．９９７となり、実施の形態１の第１標的検出のための閾値１とし、（表５）に示す。増幅曲線を図４に示す。
第１標的核酸であるｐＭＹＣの増幅曲線は、２８サイクル付近からＭＹＣ ＱＰのアニーリングに伴う消光が観察された。
Ｆ４４の値０．９１３は閾値１より低く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。この時のＦｓのｍｅａｎ−３ＳＤは−０．０５６であり、第２標的検出のための閾値２とし、（表５）に示す。増幅曲線を図５に示す。
第２標的核酸であるｐＩＣＭ５の増幅曲線は、増幅反応中は全く消光が見られず（Ｆ４４の値０．９９７が閾値１の値０．９９７よりも低くないため）Ｆｓの値−０．１１８は、閾値２より低かった。
この結果より、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅しなかったことと、ｐＩＣＭ５の目的の領域が増幅したことが示された。
Ｆｓの値を（表５）に示す。増幅曲線を図６に示す。
Figure 0006720161
第１標的核酸であるｐＭＹＣと第２標的核酸であるｐＩＣＭ５の両方を添加した際の増幅曲線は、ｐＭＹＣの増幅曲線と同様に、２８サイクル付近からＭＹＣ ＱＰのアニーリングに伴う消光が観察され、Ｆ４４の値０．９１２は閾値１より低く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。
Ｆｓの値−０．１１６は、閾値２より低く、ｐＩＣＭ５の目的の領域が増幅したことが示された。Ｆｓの値を（表５）に示す。増幅曲線を図７に示す。
これらのＰＣＲ産物はＰＣＲ終了後にアガロース電気泳動し、ｐＭＹＣを添加した試料では２０６ｂｐ付近、ｐＩＣＭ５を添加した試料では１５０ｂｐ付近に目的のＰＣＲ産物が確認された。
以上の結果より、ＱＰｒｏｂｅ法において、プローブの設計方法と温度変化プロファイルを組み合わせ、１種類の反応液が入った１つの反応容器で単一蛍光標識を用い、マイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールを検出できることが示された。
（実施の形態２）
＜第２検出ステップのプロファイルを変更したＱＰｒｏｂｅ法におけるマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールの検出＞
実施の形態１の第２標的検出ステップのプロファイルを変更した方法でＱＰｒｏｂｅ法におけるマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールの検出を行った。
ＰＣＲに用いたプライマー、プローブ、反応液組成と核酸試料は実施の形態１と同じものを用いた。本形態の反応条件は、（表６）に示すとおりである。
Figure 0006720161
実施の形態２では、第２標的検出ステップで５５℃において蛍光測定を行った。増幅反応の最終サイクルと、第２標的検出ステップにおける蛍光測定条件を図８に示す。
実施の形態２においてｆｅは次の演算を用い、その他は実施の形態１と同様な演算処理を行った。
ｆｅ＝ｆｈｙｂ．ｅ／ｆｄｅｎ．４４
ｆｅ：第２標的検出ステップにおける蛍光強度値
ｆｈｙｂ．ｅ：第２標的検出ステップ５５℃の蛍光強度値
ｆｄｅｎ．４４：増幅反応の最終サイクルの９５℃の蛍光強度値
以下に、実施の形態２の判定方法を示す。第１標的核酸の有無は、測定試料のＦ４４の値と閾値３を比較して［測定試料のＦ４４＜閾値３］を陽性と判定した。
閾値３は、陰性対照のＦ４４の平均値−標準偏差の３倍（以下ｍｅａｎ−３ＳＤ）の値を用いた。
第２標的核酸の有無は、第１標的核酸が陽性、陰性に関わらず、Ｆｓの値と閾値４を比較して［Ｆｓ＜閾値４］を陽性と判定した。
閾値４は、ｐＭＹＣだけを添加した試料のＦｓのｍｅａｎ−３ＳＤの値を用いた。
陰性対照の増幅曲線は、増幅反応が終了する４４サイクル目まで消光が見られず（Ｆ４４の値０．９９８が閾値３の値０．９９７よりも低くないため）、この時のｍｅａｎ−３ＳＤは０．９９７となり、本例の第１標的検出のための閾値３とし、（表７）に示す。増幅曲線は、図９に示すとおりである。
第１標的核酸であるｐＭＹＣの増幅曲線は、２８サイクル付近からＭＹＣ ＱＰのアニーリングに伴う消光が観察され、Ｆ４４の値０．９１２は閾値３より低く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。
また、この時のＦｓのｍｅａｎ−３ＳＤは−０．０５２であり、第２標的検出のための閾値４とし、（表７）に示す。増幅曲線は、図１０に示すとおりである。
第２標的核酸であるｐＩＣＭ５の増幅曲線は、増幅反応中は全く消光が見られず（Ｆ４４の値０．９９７が閾値３の値０．９９７よりも低くないため）、Ｆｓの値−０．１７０は、閾値４より低かった。
この結果より、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅しなかったことと、ｐＩＣＭ５の目的の領域が増幅したことが示された。Ｆｓの値を（表７）に示す。増幅曲線を図１１に示す。
Figure 0006720161
第１標的核酸であるｐＭＹＣと第２標的核酸であるｐＩＣＭ５の両方を添加した際の増幅曲線は、ｐＭＹＣの増幅曲線と同様に、２８サイクル付近からＭＹＣ ＱＰのアニーリングに伴う消光が観察され、Ｆ４４の値０．９１１は閾値３より低く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。
Ｆｓの値−０．１１４は、閾値４より低く、ｐＩＣＭ５の目的の領域が増幅したことが示された。Ｆｓの値を（表７）に示す。増幅曲線を図１２に示す。
以上の結果より、ｆｅの算出に、増幅反応の最終サイクルの９５℃の蛍光強度値（ｆｄｅｎ．４４）を用いても、第２標的を検出できることが示された。
（実施の形態３）
＜Ｅｐｒｏｂｅ法におけるマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールの検出＞
Ｅｐｒｏｂｅ法におけるマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールの検出を行った。
ＰＣＲに用いたプライマーと核酸試料は実施の形態１と同じものを用いた。実施の形態３におけるＰＣＲ法に用いるプローブの情報は、（表８）に示すとおりである。
Figure 0006720161
Ｅｐｒｏｂｅは、株式会社ダナフォームが作製したソフトウェアである「Ｅｄｅｓｉｇｎ」を用い計算したＴｍ値を参考にし、特定領域を選択した。
ｐＭＹＣに特異的にアニールするＥｐｒｏｂｅであるＭＹＣ ＥＰとｐＩＣＭ５に特異的にアニールするＥｐｒｏｂｅであるＩＣ ＥＰの蛍光色素にはＤ５１４を使用し、ＭＹＣ ＥＰは５’末端から１９番目のＴを標識し、ＩＣ ＥＰは５’末端から９番目のＴを標識した。
Ｅｐｒｏｂｅはユーロフィンジェノミクス株式会社に合成を委託して作製した。ＰＣＲ反応液組成、反応条件を（表９）と（表１０）に示す。
Figure 0006720161
Figure 0006720161
蛍光測定時の励起波長と蛍光波長の組み合わせは５３０−５４８ｎｍを選択した。
実施の形態３におけるＦｓは次の演算を用い、その他は実施の形態１と同様な演算処理を行った。
Ｆｓ＝Ｆｅ−Ｆ４０
実施の形態３における判定は下記に示す方法で行った。第１標的核酸の有無は、測定試料のＦ４０の値と閾値５を比較して［測定試料のＦ４０＞閾値５］を陽性と判定した。
閾値５は、陰性対照のＦ４０の平均値＋標準偏差の３倍（以下ｍｅａｎ＋３ＳＤ）の値を用いた。
第２標的核酸の有無は、第１標的核酸が陽性、陰性に関わらず、Ｆｓの値と閾値６を比較して［Ｆｓ＞閾値６］を陽性と判定した。
閾値６は、ｐＭＹＣだけを添加した試料のＦｓのｍｅａｎ＋３ＳＤの値を用いた。判定方法のフローチャートは、図１３に示すとおりである。
ＭＹＣ ＥＰの配列はＴｍ値を７６．４℃に、ＩＣ ＥＰの配列はＴｍ値を５９．８℃に設定した。そのため、ＰＣＲ中の温度範囲（７０℃から９５℃）では、プローブはＭＹＣ ＥＰだけがアニールすると推測された。
又、第２標的検出ステップの蛍光測定は、９５℃とＩＣ ＥＰのＴｍ値よりも低い５５℃で行うため、第２標的検出ステップの測定値はＭＹＣ ＥＰとＩＣ ＥＰの発光を同時に検出すると推測された。
陰性対照の増幅曲線は、ＰＣＲが終了する４０サイクル目まで発光が見られず（Ｆ４０の値１．００７が閾値５の値１．０１３よりも高くないため）、この時のｍｅａｎ＋３ＳＤは１．０１３となり、第１標的核酸検出のための閾値５とし、（表１１）に示す。増幅曲線を図１４に示す。
第１標的核酸であるｐＭＹＣの増幅曲線は、２９サイクル付近からＭＹＣ ＥＰのアニーリングに伴う発光が観察され、Ｆ４０の値２．３１４が閾値５より高く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。
また、この時のＦｓのｍｅａｎ＋３ＳＤは３．６９５であり、第２標的検出のための閾値６とし（表１１）に示す。増幅曲線を図１５に示す。
第２標的核酸であるｐＩＣＭ５の増幅曲線は、増幅反応中は全く発光が見られず（Ｆ４０の値１．０１２が閾値５の値１．０１３よりも高くないため）、Ｆｓの値４．０１２は、閾値６より高かった。
この結果より、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅しなかったことと、ｐＩＣＭ５の目的の領域が増幅したことが示された。Ｆｓの値を（表１１）に示す。増幅曲線を図１６に示す。
Figure 0006720161
第１標的核酸であるｐＭＹＣと第２標的核酸であるｐＩＣＭ５の両方を添加した際の増幅曲線は、ｐＭＹＣの増幅曲線と同様に、２９サイクル付近からＭＹＣ ＥＰのアニーリングに伴う発光が観察され、Ｆ４０の値２．３５５は閾値５より高く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。
Ｆｓの値４．２５４は、閾値６より高く、ｐＩＣＭ５の目的の領域が増幅したことが示された。Ｆｓの値を（表１１）に示す。増幅曲線を図１７に示す。
以上の結果より、Ｅｐｒｏｂｅ法においてもプローブの設計方法と温度変化プロファイルを組み合わせ、１種類の反応液が入った１つの反応容器で単一蛍光標識を用い、マイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールを検出できることが示された。
（実施の形態４）
＜ＴａｑＭａｎプローブ法におけるマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールの検出＞
ＴａｑＭａｎプローブ法におけるマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールの検出を行った。ＰＣＲに用いたプライマーと核酸試料は実施の形態１と同じものを用いた。
実施の形態４におけるＰＣＲ法に用いるプローブの情報は、（表１２）に示すとおりである。
Figure 0006720161
ＴａｑＭａｎプローブは、ｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ法を用い計算したＴｍ値を参考にし、特定領域を選択した。
ｐＭＹＣに特異的にアニールするＴａｑＭａｎプローブであるＭＹＣ ＴａｑとｐＩＣＭ５に特異的にアニールするＴａｑＭａｎプローブであるＩＣ Ｔａｑの蛍光色素には、それぞれ５’末端にＦＡＭ（登録商標）、３’末端にＴＡＭＲＡ（登録商標）を標識した。
ＴａｑＭａｎプローブはタカラバイオ株式会社に合成を委託して作製した。ＰＣＲ反応液組成、反応条件を（表１３）と（表１４）に示す。
Figure 0006720161
Figure 0006720161
蛍光測定時の励起波長と蛍光波長の組み合わせは５３０−５４８ｎｍを選択した。
増幅反応後の第２標的を検出するためのステップでは９５℃と５０℃において蛍光測定を行った。
実施の形態４ではｆｈｙｂ．ｅ：第２標的検出ステップ５０℃の蛍光強度値とし、その他は実施の形態１と同様な演算ステップを行った。
実施の形態４における判定方法は下記に示す方法で行った。第１標的核酸の有無は、測定試料のＦ４４の値と閾値７を比較して［測定試料のＦ４４＞閾値７］を陽性と判定した。
閾値７は、陰性対照のＦ４４の平均値＋標準偏差の３倍（以下ｍｅａｎ＋３ＳＤ）の値を用いた。
第２標的核酸の有無は、第１標的核酸が陽性、陰性に関わらず、Ｆｓの値と閾値８を比較して［Ｆｓ＞閾値８］を陽性と判定した。
閾値８は、ｐＭＹＣだけを添加した試料のＦｓのｍｅａｎ＋３ＳＤの値を用いた。
ＭＹＣ Ｔａｑの配列はＴｍ値を７５．８℃に、ＩＣ Ｔａｑの配列はＴｍ値を５３．７℃に設定した。そのため、ＰＣＲ中の温度範囲（７０℃から９５℃）では、プローブはＭＹＣ Ｔａｑだけがアニールすると推測された。
又、第２標的検出ステップの蛍光測定は、９５℃とＩＣ ＴａｑのＴｍ値よりも低い５０℃で行うため、第２標的検出ステップの測定値はＭＹＣ ＴａｑとＩＣ Ｔａｑの発光を同時に検出すると推測された。
陰性対照の増幅曲線は、ＰＣＲが終了する４４サイクル目まで発光が見られず（Ｆ４４の値１．０２８が閾値７の値１．０２８よりも高くないため）、この時のｍｅａｎ＋３ＳＤは１．０２８となり、第１標的核酸検出のための閾値７とし、（表１５）に示す。増幅曲線を図１８に示す。
第１標的核酸であるｐＭＹＣの増幅曲線は、２８サイクル付近からＭＹＣ Ｔａｑのアニーリングに伴う発光が観察され、Ｆ４４の値１．４２７が閾値７より高く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。
また、この時のＦｓのｍｅａｎ＋３ＳＤは０．１１０であり、第２標的検出のための閾値８とし（表１５）に示す。増幅曲線を図１９に示す。
Figure 0006720161
第２標的核酸であるｐＩＣＭ５の増幅曲線は、増幅反応中は全く発光が見られず（Ｆ４４の値１．０２８が閾値７の値１．０２８よりも高くないため）、Ｆｓの値０．１３０は、閾値８より高かった。
この結果より、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅しなかったことと、ｐＩＣＭ５の目的の領域が増幅したことが示された。
Ｆｓの値を（表１５）に示す。増幅曲線を図２０に示す。
第１標的核酸であるｐＭＹＣと第２標的核酸であるｐＩＣＭ５の両方を添加した際の増幅曲線は、ｐＭＹＣの増幅曲線と同様に、２９サイクル付近からＭＹＣ Ｔａｑのアニーリングに伴う発光が観察され、Ｆ４０の値１．３４８は閾値７より高く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。
Ｆｓの値０．１７７は、閾値８より高く、ｐＩＣＭ５の目的の領域が増幅したことが示された。Ｆｓの値を（表１５）に示す。増幅曲線を図２１に示す。
以上の結果より、ＴａｑＭａｎプローブ法においてもプローブの設計方法と温度変化プロファイルを組み合わせ、１種類の反応液が入った１つの反応容器で単一蛍光標識を用い、マイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールを検出できることが示された。
（実施の形態５）
＜実検体を用いたＱＰｒｏｂｅ法におけるマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールの検出＞
実検体を用いた、ＱＰｒｏｂｅ法におけるマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールの検出を行った。
マイコプラズマＰ１遺伝子は、ＬＡＭＰ法（日本国特許第３３１３３５８号）によって、マイコプラズマ・ニューモニエが陽性と判定された（検査は株式会社ビー・エム・エルに委託）咽頭拭い液からＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて抽出したトータルＤＮＡを用いた。
また、陰性試料としてＬＡＭＰ法によって、マイコプラズマ・ニューモニエが陰性と判定された咽頭拭い液からＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いて抽出したトータルＤＮＡを用いた。その他条件は、実施の形態１と同様にＰＣＲを実施した。
得られた生データに対して実施の形態１と同様の演算処理を行った。
以下に、実施の形態５の判定方法を示す。第１標的核酸の有無は、測定試料のＦ４４の値と閾値９を比較して［測定試料のＦ４４＜閾値９］を陽性と判定した。
閾値９は、陰性試料のＦ４４の平均値−標準偏差の３倍（以下ｍｅａｎ−３ＳＤ）の値を用いた。
第２標的核酸の有無は、第１標的核酸が陽性、陰性に関わらず、Ｆｓの値と閾値１０を比較して［Ｆｓ＜閾値１０］を陽性と判定した。閾値１０は、陽性試料のＦｓのｍｅａｎ−３ＳＤの値を用いた。
陰性試料の増幅曲線は、ＰＣＲが終了する４４サイクル目まで消光が見られず（Ｆ４４の値０．９９７が閾値９の値０．９９７よりも低くないため）、この時のｍｅａｎ−３ＳＤは０．９９７となり、本例の第１標的検出のための閾値９とし、（表１６）に示す。増幅曲線を図２２に示す。
第１標的核酸である陽性試料の増幅曲線は、３５サイクル付近からＭＹＣ ＱＰのアニーリングに伴う消光が観察され、Ｆ４４の値０．９５１は閾値９より低く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。
また、この時のＦｓのｍｅａｎ−３ＳＤは−０．１３２であり、第２標的検出のための閾値１０とし、（表１６）に示す。増幅曲線を図２３に示す。
第２標的核酸であるｐＩＣＭ５の増幅曲線は、増幅反応中は全く消光が見られず（Ｆ４４の値０．９９８が閾値９の値０．９９７よりも低くないため）、Ｆｓの値−０．２２７は、閾値１０より低かった。
この結果より、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅しなかったことと、ｐＩＣＭ５の目的の領域が増幅したことが示された。Ｆｓの値を（表１６）に示す。増幅曲線を図２４に示す。
第１標的核酸である陽性試料に第２標的核酸であるｐＩＣＭ５を添加した際の増幅曲線は、陽性試料の増幅曲線と同様に、３５サイクル付近からＭＹＣ ＱＰのアニーリングに伴う消光が観察され、Ｆ４４の値０．９５３は閾値９より低く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。
Ｆｓの値−０．２３５は、閾値１０より低く、ｐＩＣＭ５の目的の領域が増幅したことが示された。Ｆｓの値を（表１６）に示す。増幅曲線を図２５に示す。
Figure 0006720161
以上の結果より、実際の臨床検体でも、プローブの設計方法と温度変化プロファイルを組み合わせ、１種類の反応液が入った１つの反応容器で単一蛍光色素を用い、マイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールを検出できることが示された。
本発明は、感染症の病原体の亜型識別や一塩基多型の識別にも応用可能である。
（実施の形態６）
＜ＱＰｒｏｂｅ法におけるクラミジア内在性プラスミド遺伝子と淋菌ＣＭＴ遺伝子の検出＞
ＱＰｒｏｂｅ法におけるクラミジア内在性プラスミド遺伝子と淋菌ＣＭＴ遺伝子の検出を行った。
（ｐＣＴ）
性器クラミジア感染症の病原体であるクラミジア・トラコマチス共通の内在性プラスミド（ｐＬＧＶ４４０）遺伝子断片を人工合成後、ｐＵＣ５７ベクターに組み込んだプラスミドＤＮＡは、北海道システムサイエンス株式会社に合成を委託して作製した。
（ｐＮＧ）
淋病の病原体であるナイセリア・ゴノレアのシトシンＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＣＭＴ）遺伝子断片を人工合成後、ｐＵＣ５７ベクターに組み込んだプラスミドＤＮＡは北海道システムサイエンス株式会社に合成を委託して作製した。
上記のプラスミドの長さは、ｐＣＴは３０６４ｂｐ、ｐＮＧは３０５９ｂｐである。
各プラスミドの長さとプラスミド溶液の濃度（μｇ／μｌ）から１μＬあたりのコピー数を計算した後、ＴＥ緩衝溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）を用いて、ｐＣＴ、ｐＮＧ共に１×１０＾５ｃｏｐｉｅｓ／μｌとなるように希釈した。
実施の形態６におけるＰＣＲ法に用いたプライマー対は、（表１７）に示すとおりである。
Figure 0006720161
実施の形態６におけるＰＣＲ法に用いるプローブの情報は、（表１８）に示すとおりである。
Figure 0006720161
ＣＴ ＱＰは配列番号６と配列番号７のプライマー対で増幅し得るＰＣＲ産物の塩基配列から日鉄住金環境株式会社Ｊ−Ｂｉｏ２１センターのホームページ上のＱＰｒｏｂｅ設計支援ツールを用い計算したＴｍ値を参考にし、特定領域を選択した。
ＮＧ ＱＰは配列番号８と配列番号９のプライマー対で増幅し得るＰＣＲ産物の塩基配列から、Ｊ−Ｂｉｏ２１センターのホームページ上のＱＰｒｏｂｅ設計支援ツールを用い計算したＴｍ値を参考にし、特定領域を選択した。
ｐＣＴに特異的にアニールするＱＰｒｏｂｅであるＣＴ ＱＰとｐＮＧに特異的にアニールするＱＰｒｏｂｅであるＮＧ ＱＰの蛍光色素にはそれぞれＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬを使用し、それぞれ３’末端のＣを標識した。
ＱＰｒｏｂｅは日鉄住金環境株式会社に合成を委託して作製した。ＰＣＲ反応液組成、反応条件を（表１９）と（表２０）に示す。
Figure 0006720161
Figure 0006720161
蛍光測定時の励起波長と蛍光波長の組み合わせは５１０−５２８ｎｍを選択した。
各サイクルの変性ステップ（９５℃）と伸長ステップ（６８℃）で蛍光値を測定し、更に、増幅反応後に第２標的を検出するためのステップ（９５℃と５５℃）において蛍光測定を行った。
得られた生データに対して実施の形態１と同様の演算処理を行った。
以下に、本実施の形態の判定方法を示す。第１標的核酸の有無は、測定試料のＦ４４の値と閾値１１を比較して［測定試料のＦ４４＜閾値１１］を陽性と判定した。
閾値１１は、陰性対照のＦ４４の平均値−標準偏差の３倍（以下ｍｅａｎ−３ＳＤ）の値を用いた。
第２標的核酸の有無は、第１標的核酸が陽性、陰性に関わらず、Ｆｓの値と閾値１２を比較して［Ｆｓ＜閾値１２］を陽性と判定した。
閾値１２は、ｐＮＧだけを添加した試料のＦｓのｍｅａｎ−３ＳＤの値を用いた。
ＣＴ ＱＰの配列はＴｍ値を７３．４℃に、ＮＧ ＱＰの配列はＴｍ値を６２．５℃に設定した。そのため、ＰＣＲ中の温度範囲（６８℃から９５℃）では、プローブはＣＴ ＱＰだけがアニールすると推測された。
又、第２標的検出ステップの蛍光測定は、９５℃とＮＧ ＱＰのＴｍ値よりも低い５５℃で行うため、第２標的検出ステップの測定値はＣＴ ＱＰとＮＧ ＱＰの消光を同時に検出すると推測された。
陰性対照の増幅曲線は、ＰＣＲが終了する４４サイクル目まで消光が見られず（Ｆ４４の値０．９９８が閾値１１の値０．９９６よりも低くないため）、この時のｍｅａｎ−３ＳＤは０．９９６となり、本例の第１標的検出のための閾値１１とし、（表２１）に示す。増幅曲線を図２６に示す。
第１標的核酸であるｐＣＴの増幅曲線は、２８サイクル付近からＣＴ ＱＰのアニーリングに伴う消光が観察され、Ｆ４４の値０．７２０は閾値１１より低く、ｐＣＴの目的の領域が増幅したことが示された。
また、この時のＦｓのｍｅａｎ−３ＳＤは−０．０３９であり、第２標的検出のための閾値１２とし、（表２１）に示す。増幅曲線を図２７に示す。
第２標的核酸であるｐＮＧの増幅曲線は、増幅反応中は全く消光が見られず（Ｆ４４の値０．９９８が閾値１１の値０．９９６よりも低くないため）、Ｆｓの値−０．０６５は、閾値１２より低かった。
この結果より、ｐＣＴの目的の領域が増幅しなかったことと、ｐＮＧの目的の領域が増幅したことが示された。Ｆｓの値を（表２１）に示す。増幅曲線を図２８に示す。
Figure 0006720161
第１標的核酸であるｐＣＴと第２標的核酸であるｐＮＧの両方を添加した際の増幅曲線は、ｐＣＴの増幅曲線と同様に、２８サイクル付近からＣＴ ＱＰのアニーリングに伴う消光が観察され、Ｆ４４の値０．７２９は閾値１１より低く、ｐＣＴの目的の領域が増幅したことが示された。
Ｆｓの値−０．１１１は、閾値１２より低く、ｐＮＧの目的の領域が増幅したことが示された。Ｆｓの値を（表２１）に示す。増幅曲線を図２９に示す。
以上の結果より、２項目の遺伝子においてもプローブの設計方法と温度変化プロファイルを組み合わせ、１種類の反応液が入った１つの反応容器で単一蛍光色素を用い、クラミジア内在性プラスミド遺伝子と淋菌ＣＭＴ遺伝子を検出できることが示された。
（実施の形態７）
＜増幅反応中に複数回第２標的を検出するＱＰｒｏｂｅ法におけるマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールの検出＞
第２標的検出ステップを最終サイクルの後だけではなく、増幅反応中に折り込んだ方法でＱＰｒｏｂｅ法におけるマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールの検出を行った。
ＰＣＲに用いたプライマー、プローブ、反応液組成と核酸試料は実施の形態１と同じものを用いた。反応条件は、（表２２）に示すとおりである。
Figure 0006720161
また増幅反応の温度変化をグラフ化したものを図３０に示す。
実施の形態７の解析においては次の演算を行い、その他は実施の形態１同様のステップを行った。
ｆｅｎ＝ｆｈｙｂ．ｅｎ／ｆｄｅｎ．ｅｎ （数４）
ｆｅｎ：（数４）により算出されたｎ回目の第２標的検出ステップにおける蛍光強度値
ｆｈｙｂ．ｅｎ：ｎ回目の第２標的検出ステップ５５℃の蛍光強度値
ｆｄｅｎ．ｅｎ：ｎ回目の第２標的検出ステップ９５℃の蛍光強度値
Ｆｅｎ＝ｆｅｎ／ｆ１０ （数５）
Ｆｅｎ：１０サイクル目の（数４）により得られた蛍光強度値を１とした時のｎ回目の第２標的検出ステップの相対値
Ｆｓ１＝Ｆｅ１−Ｆ２０ （数６）
Ｆｓ２＝Ｆｅ２−Ｆ２７ （数６’）
Ｆｓ３＝Ｆｅ３−Ｆ３４ （数６’’）
Ｆｓ４＝Ｆｅ４−Ｆ４１ （数６’’’）
Ｆｓ１：１回目の第２標的検出ステップの測定値
Ｆｓ２：２回目の第２標的検出ステップの測定値
Ｆｓ３：３回目の第２標的検出ステップの測定値
Ｆｓ４：４回目の第２標的検出ステップの測定値
判定は下記に示す方法で行った。第１標的核酸の有無は、測定試料のＦ４１の値と閾値１３を比較して［測定試料のＦ４１＜閾値１３］を陽性と判定した。
閾値１３は、陰性対照のＦ４１の平均値−標準偏差の３倍（以下ｍｅａｎ−３ＳＤ）の値を用いた。
第２標的核酸の有無は、１回目の第２標的検出ステップでは、［Ｆｓ１＜閾値１４］を陽性と判定した。
閾値１４は、ｐＭＹＣだけを添加した試料のＦｓ１のｍｅａｎ−３ＳＤの値を用いた。
２回目の第２標的検出ステップでは、［Ｆｓ２＜閾値１５］を陽性と判定した。
閾値１５は、ｐＭＹＣだけを添加した試料のＦｓ２のｍｅａｎ−３ＳＤの値を用いた。
３回目の第２標的検出ステップでは、［Ｆｓ３＜閾値１６］を陽性と判定した。
閾値１６は、ｐＭＹＣだけを添加した試料のＦｓ３のｍｅａｎ−３ＳＤの値を用いた。
４回目の第２標的検出ステップでは、［Ｆｓ４＜閾値１７］を陽性と判定した。
閾値１７は、ｐＭＹＣだけを添加した試料のＦｓ４のｍｅａｎ−３ＳＤの値を用いた。
陰性対照の増幅曲線は、各第２標的検出ステップ以外ではＰＣＲが終了する４１サイクル目まで消光が見られず（Ｆ４１の値０．９９９が閾値１３の値０．９９８よりも低くないため）、この時のｍｅａｎ−３ＳＤは０．９９８となり、本例の第１標的検出のための閾値１３とし、（表２３）に示す。増幅曲線を図３１に示す。
第１標的核酸であるｐＭＹＣの増幅曲線は、３０サイクル付近からＭＹＣ ＱＰのアニーリングに伴う消光が観察され、Ｆ４１の値０．８９２は閾値１３より低く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。
また、この時のＦｓ１のｍｅａｎ−３ＳＤは−０．０５８、Ｆｓ２のｍｅａｎ−３ＳＤは−０．０７０、Ｆｓ３のｍｅａｎ−３ＳＤは−０．０８０、Ｆｓ４のｍｅａｎ−３ＳＤは−０．０８７でそれぞれ第２標的検出のための閾値１４、１５，１６，１７とし、（表２３）に示す。増幅曲線を図３２に示す。
Figure 0006720161
第２標的核酸であるｐＩＣＭ５の増幅曲線は、各第２標的検出ステップ以外では増幅反応中は全く消光が見られず（Ｆ４１の値０．９９９が閾値１３の値０．９９８よりも低くないため）、Ｆｓ１の値−０．０５８は、閾値１４より高く、ｐＩＣＭ５の目的の領域が１回目の第２標的検出ステップまでに検出限界以上に増幅していないことが示された。
Ｆｓ２の値−０．０５７も閾値１５より高く、ｐＩＣＭ５の目的の領域が２回目の第２標的検出ステップまでに検出限界以上に増幅していないことが示された。
Ｆｓ３の値−０．０８４は閾値１６より低く、ｐＩＣＭ５の目的の領域が３回目の第２標的検出ステップまでに検出限界以上に増幅していることが示された。
Ｆｓ４の値−０．１９２も閾値１７より低かった。Ｆｓ１、Ｆｓ２、Ｆｓ３、Ｆｓ４の値を（表２３）に示す。増幅曲線を図３３に示す。
第１標的核酸であるｐＭＹＣと第２標的核酸であるｐＩＣＭ５の両方を添加した際の増幅曲線は、ｐＭＹＣの増幅曲線と同様に、３０サイクル付近からＭＹＣ ＱＰのアニーリングに伴う消光が観察され、Ｆ４１の値０．８９７は閾値１３より低く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。
Ｆｓ１の値−０．０５８は、閾値１４よりも高く、ｐＩＣＭ５の目的の領域が１回目の第２標的検出ステップまでに検出限界以上に増幅していないことが示された。
Ｆｓ２の値−０．０６８も閾値１５よりも高く、ｐＩＣＭ５の目的の領域が２回目の第２標的検出ステップまでに検出限界以上に増幅していないことが示された。
Ｆｓ３の値−０．１０９は閾値１６より低く、ｐＩＣＭ５の目的の領域が３回目の第２標的検出ステップまでに検出限界以上に増幅していることが示された。
Ｆｓ４の値―０．１５４も閾値１７よりも低かった。Ｆｓ１、Ｆｓ２、Ｆｓ３、Ｆｓ４の値は、（表２３）に示すとおりである。増幅曲線を図３４に示す。
以上の結果より、第２標的検出ステップを最終サイクルの後だけではなく、増幅反応中に折り込んだ方法でもマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールを検出できることが示された。
本発明の実施の形態１における混合液の温度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態１における蛍光測定のタイミング説明図 本発明の実施の形態１における判定方法を示すフローチャート 本発明の実施の形態１における陰性対照の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態１における第１標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態１における第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態１における第１、第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態２における蛍光測定のタイミング説明図 本発明の実施の形態２における陰性対照の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態２における第１標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態２における第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態２における第１、第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態３における判定方法を示すフローチャート 本発明の実施の形態３における陰性対照の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態３における第１標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態３における第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態３における第１、第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態４における陰性対照の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態４における第１標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態４における第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態４における第１、第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態５における陰性対照の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態５における第１標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態５における第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態５における第１、第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態６における陰性対照の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態６における第１標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態６における第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態６における第１、第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態７における混合液の温度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態７における陰性対照の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態７における第１標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態７における第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態７における第１、第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態１における温度変化の拡大図 本発明の実施の形態１における混合液成分を示す説明図 （ａ）本発明の実施の形態１における変性ステップの説明図 （ｂ）本発明の実施の形態１におけるアニーリングステップの説明図 （ｃ）本発明の実施の形態１における伸長ステップの説明図 （ｄ）本発明の実施の形態１における伸長完了ステップの説明図 （ａ）本発明の実施の形態１における変性ステップの説明図 （ｂ）本発明の実施の形態１におけるアニーリングステップの説明図
１ 容器
２ 溶液
１０ 第１標的核酸
１３ 第１標的用Ｆプライマー
１４ 第１標的用Ｒプライマー
１５ 第１標的用プローブ
１６ 第１標識物
２０ 第２標的核酸
２３ 第２標的用Ｆプライマー
２４ 第２標的用Ｒプライマー
２５ 第２標的用プローブ
２６ 第２標識物
３０ ＤＮＡポリメラーゼ
３１ デオキシリボヌクレオチド３リン酸
Ｔ０ 変性温度
Ｔ１ アニーリング温度
Ｔ２ 伸長温度
Ｔ３ 第２標的検出温度

Claims (7)

  1. 変性温度をＴ０、アニーリング温度をＴ１、伸長温度をＴ２、第２標的検出温度をＴ３とすると、Ｔ０＞Ｔ２≧Ｔ１＞Ｔ３を満たす、複数の標的核酸の検出キットであって、
    前記変性温度Ｔ０において、２本鎖の水素結合が切断され、それぞれ２本の１本鎖に解離する、第１標的核酸及び第２標的核酸を含み得る溶液に、
    前記アニーリング温度Ｔ１において、前記第１標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれかに特異的に結合する第１標的用プライマーと、
    前記アニーリング温度Ｔ１において、前記第２標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれかに特異的に結合する第２標的用プライマーと、
    前記アニーリング温度Ｔ１において、前記第１標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれかに特異的に結合する第１標的用プローブであって、結合により蛍光シグナルが変化する第１標識物を有するものと、
    ＤＮＡポリメラーゼと、
    前記伸長温度Ｔ２において、前記ＤＮＡポリメラーゼの作用により、前記第１標的核酸が解離した２本の１本鎖及び前記第２標的核酸が解離した２本の１本鎖に結合するデオキシリボヌクレオチド３リン酸と、
    前記アニーリング温度Ｔ１においては、前記第１標的核酸が解離した２本の１本鎖及び前記第２標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれにも結合せず、前記第２標的検出温度Ｔ３において、前記第２標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれかに特異的に結合する第２標的用プローブであって、結合により蛍光シグナルが変化する第２標識物を有するものとを含有すると共に、
    前記第１標識物と前記第２標識物とが同じ標識物であることを特徴とする複数の標的核酸の検出キット。
  2. 前記第１標識物及び前記第２標識物は、ＱＰｒｏｂｅ（登録商標）プローブ、Ｅｐｒｏｂｅ（登録商標）プローブ及びＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブからなる群から選択される請求項１記載の複数の標的核酸の検出キット。
  3. 前記蛍光シグナルは、アニールすると消光するものである請求項１または２記載の複数の標的核酸の検出キット。
  4. 前記蛍光シグナルは、アニールすると発光するものである請求項１または２記載の複数の標的核酸の検出キット。
  5. 前記第１標的核酸はマイコプラズマＰ１遺伝子であり、前記第２標的核酸は内部コントロールである請求項１から４のいずれかに記載の複数の標的核酸の検出キット。
  6. 前記第１標的核酸はクラミジア内在性プラスミド遺伝子であり、前記第２標的核酸は淋菌ＣＭＴ遺伝子である請求項１から４のいずれかに記載の複数の標的核酸の検出キット。
  7. 請求項１から６のいずれかに記載の複数の標的核酸を測定する検出キットを用いる検出方法であって、
    前記溶液の温度を前記変性温度Ｔ０に上げて、含有が疑われる前記第１標的核酸及び前記第２標的核酸のそれぞれを、２本の１本鎖に解離させる解離ステップと、
    前記溶液の温度を前記アニーリング温度Ｔ１まで下げて、前記第１標的用プローブによる蛍光シグナルに基づき、第１標的核酸の存否を検出する第１標的核酸検出ステップと、
    前記溶液の温度を前記伸長温度Ｔ２とし、含有が疑われる前記第１標的核酸及び前記第２標的核酸が解離した、それぞれの２本の１本鎖を２本鎖の第１標的核酸及び第２標的核酸に増幅する増幅ステップと、
    前記溶液の温度を前記第２標的検出温度Ｔ３まで下げて、前記第２標的用プローブによる蛍光シグナルに基づき、第２標的核酸の存否を検出する第２標的核酸検出ステップとを含む検出方法。
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