JP2002136300A - 白血病キメラ遺伝子の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 白血病の診断測定系として有用な白血病キメラ遺伝子の
検出方法を提供する。 【解決手段】Ｍａｊｏｒ−ｂｃｒ／ａｂｌ、ｍｉｎｏｒ
−ｂｃｒ／ａｂｌ、ＰＭＬ／ＲＡＲα及びＡＭＬ１／Ｍ
ＴＧ８の白血病キメラ遺伝子を検出する方法であって、
当該検出を可能とする領域を含むＰＣＲ増幅産物を与え
るように設定した上記各白血病キメラ遺伝子に特異的な
各プライマーセット及び当該検出を可能とする上記各白
血病キメラ遺伝子に特異的な各プローブを利用したリア
ルタイムＰＣＲ法に従い検出することからなり、上記各
プライマーセット及び各プローブはいずれもひとつのＰ
ＣＲ条件下において同時に作動可能であるように設定さ
れていることを特徴とする白血病キメラ遺伝子の検出方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は白血病キメラ遺伝子
の検出方法に関する。より詳細には本発明は複数存在す
る白血病キメラ遺伝子の有無を迅速にスクリーニングで
きる系として、また白血病のスクリーニング系として有
用な検出方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】染色体転座は、白血病の発症、分類、治
療法の選択及び予後と密接に関係している為、白血病の
診断には規則的染色体転座の検出が必須である。

【０００３】染色体転座は染色体解析法により検出でき
るが、これは、熟練した検査員と１週間以上の解析時間
を必要とする。また、検体から十分量のメタフェーズが
得られないことにより解析が行えないことも希ではな
い。

【０００４】また、染色体転座は上記染色体解析法の
他、分子生物学的手法によっても検出可能である。例え
ば、多くの染色体転座は融合遺伝子（キメラ遺伝子）／
転写産物を生成することから、染色体転座の検出には、
かかるキメラ遺伝子／転写産物の検出に有力な方法であ
る逆転写酵素を用いたＲＴ−ＰＣＲ（reverse transcri
ptase-polymerase chain reaction）が有用である。

【０００５】従来知られている白血病キメラ遺伝子とし
ては、Ｍａｊｏｒ−ｂｃｒ／ａｂｌ（Ｍ−ｂｃｒ／ａｂ
ｌ）、ｍｉｎｏｒ−ｂｃｒ／ａｂｌ（ｍ−ｂｃｒ／ａｂ
ｌ）、ｍｉｃｒｏ−ｂｃｒ／ａｂｌ（μ−ｂｃｒ／ａｂ
ｌ）、ＰＭＬ／ＲＡＲα、ＡＭＬ１／ＭＴＧ８、ＴＥＬ
／ＡＭＬ１、Ｅ２Ａ／ＰＢＸ１、ＣＢＦβ／ＭＹＨ１
１、ＭＬＬ／ＡＦ４及びＭＬＬ／ＡＦ９が挙げられる
が、これらは例えば以下の文献等に教示されている：Le
ukemia and Lymphoma, 14, 341-346 (1994)；Br.J.Haem
atol.,103, 1104-1105 (1998)；Leukemia and Lymphom
a, 8, 253-260 (1992)；Blood, 82, 1270-1276 (199
3)；Leukemia, 10, 991-993 (1996)；Leukemia and Lym
phoma, 26, 57-65 (1997)；Blood, 83, 1750-1756 (199
4)；Blood, 92, 810-821 (1998)；Leukemia, 13, 1519-
1524 (1999)。

【０００６】一方、ＰＣＲ法は、染色体解析法に比し、
患者の検体量が少量ですむ、特別な技術を要しない、結
果を得るのに短時間ですむ等の利点を有する。また、Ｐ
ＣＲ法は、検査室間での標準化も可能である。しかしな
がら、今までＰＣＲ法は白血病特有のキメラ遺伝子をス
クリーニングすることによる白血病診断には不向きであ
ると考えられていた。これは、白血病には測定対象とな
るキメラ遺伝子が多数存在し、それらを検出するために
は、個々のキメラ遺伝子に対応して各々異なったプライ
マーセット、反応チューブ、温度条件等の検出条件の設
定が必要とされることにある。

【０００７】かかる課題に鑑み、マルチプレックスＲＴ
−ＰＣＲ法が提案されている（Blood, 92(2), 574-588
(1998) ）。当該方法によれば２９種のキメラ遺伝子の
検出が可能であるが、８回ものＰＣＲと電気泳動による
検出が必要とされるため煩雑という欠点がある。

【０００８】一方、ＤＮＡのＰＣＲ増幅と増幅産物の特
異的検出を同時に行う定量的ＰＣＲ法としてリアルタイ
ムＰＣＲ法（real-time PCR; Proc. Natl. Acad. Sci.,
88,7276-7280 (1991); 特表平６−５０００２１号公報
等）が知られており、当該分野においては、ｂｃｒ／ａ
ｂｌ（International J. Cancer, 86, 741-746 (200
0)）、ＡＭＬ１／ＭＴＧ８（Leukemia, 14, 329-335 (2
000)）或いはＰＭＬ／ＲＡＲα（Leukemia, 14, 324-32
8 (2000)）等の白血病キメラ遺伝子の定量に基づく、微
小残存病変（ＭＲＤ）の定量に主として応用されてきて
いる。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、多数の白血
病キメラ遺伝子を同時に迅速にスクリーニングする方法
を提供することを目的とする。より詳細には、多数ある
白血病キメラ遺伝子を同一条件下で同時に検出すること
によって、ＲＮＡ抽出からデータ解析までが数時間で実
施可能である白血病キメラ遺伝子の新規検出方法を提供
するものである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決すべく日夜研究を重ねた結果、特定のプライマーセ
ット及びプローブを用いることによって上記検出系を構
築することが可能であることを見出し、かかる知見に基
づき本発明を完成した。

【００１１】すなわち、本発明は、Ｍａｊｏｒ−ｂｃｒ
／ａｂｌ（Ｍ−ｂｃｒ／ａｂｌ）、ｍｉｍｏｒ−ｂｃｒ
／ａｂｌ（ｍ−ｂｃｒ／ａｂｌ）、ＰＭＬ／ＲＡＲα及
びＡＭＬ１／ＭＴＧ８の白血病キメラ遺伝子を検出する
方法であって、当該検出を可能とする領域を含むＰＣＲ
増幅産物を与えるように設定した上記各白血病キメラ遺
伝子に特異的な各プライマーセット及び当該検出を可能
とする上記各白血病キメラ遺伝子に特異的な各プローブ
を利用してリアルタイムＰＣＲ法に従い検出することか
らなり、上記各プライマーセット及び各プローブはいず
れもひとつのＰＣＲ条件下において同時に作動可能であ
るように設定されていることを特徴とする白血病キメラ
遺伝子の検出方法である。

【００１２】また、本発明は、上記検出方法において、
測定対象である白血病キメラ遺伝子としてｍｉｃｒｏ−
ｂｃｒ／ａｂｌ（μ−ｂｃｒ／ａｂｌ）、ＴＥＬ／ＡＭ
Ｌ１、Ｅ２Ａ／ＰＢＸ１、ＣＢＦβ／ＭＹＨ１１、ＭＬ
Ｌ／ＡＦ４及びＭＬＬ／ＡＦ９からなる群から選択され
る１又は２以上を更に包含するものである。当該検出法
は、前述するプライマーセット及びプローブに加えて、
ひとつのＰＣＲ条件下において同時に作動可能であるよ
うに設定されてなる、上記各白血病キメラ遺伝子の検出
を可能とする領域を含むＰＣＲ増幅産物を与えるように
設定した上記各白血病キメラ遺伝子に特異的な各プライ
マーセット及び上記ＰＣＲ増幅産物の検出を可能とする
上記各白血病キメラ遺伝子に特異的な各プローブを用い
て行うことができる。

【００１３】更に本発明は、上記検出方法において、Ｐ
ＣＲ条件として９５℃−１５秒のデナチュレーション工
程、６０℃−６０秒のアニーリング工程及びＤＮＡ伸長
反応工程を採用し、プライマーセットとプローブとし
て、検出対象の遺伝子に応じて図１に示されるプライマ
ーセットとプローブを採用してなるものを包含するもの
である。

【００１４】本発明は、また別の局面としてリアルタイ
ムＰＣＲ法に従う白血病キメラ遺伝子の検出用キットを
提供する。当該白血病キメラ遺伝子の検出用キットは、
検出対象の遺伝子に応じて、前述の検出方法において用
いられるプライマーセット及びプライマーを有効成分と
して含有するものである。

【００１５】本発明によれば、上記した１０種の白血病
キメラ遺伝子を同時に同一条件下で検出することがで
き、更にそれらの遺伝子の定量も可能である。このため
本発明の検出系は、白血病の迅速なスクリーニング系と
して、またＭＲＤ検査に好適に使用できる。特に本発明
は白血病の診断（白血病キメラ遺伝子の検出）に際して
多量の検体を短時間で処理するのに適しており、例えば
実施例に示すようにＲＮＡ抽出からデータ取得までに数
時間しかかからない。

【００１６】更に、本発明の検出系によれば、プライマ
ーセット及びプローブを設定することによって、上記１
０種の白血病キメラ遺伝子以外にさら白血病関連遺伝子
であるＷＴ１（Blood, 84, 3071-3079 (1994)）や内在
性コントロール遺伝子としてのＧＡＰＤＨ（Glyceralde
hyde-3-phosphate dehydrogenase）を検出することがで
きる。このため、これらの各種プライマーセット及びプ
ローブを適宜選択して利用することによって、白血病の
因子をより詳細に検出できるスクリーニング系を提供す
ることができる。

【００１７】このように、本発明によれば、各種プライ
マーセットとプローブを合わせて使用することによっ
て、１０種の白血病キメラ遺伝子と上記ＷＴ１遺伝子及
びＧＡＰＤＨの同時検出も可能である。

【００１８】しかしながら、白血病のスクリーニング系
としての利用に際しては、必ずしもこれらの全てを検出
する必要はない。白血病に関しては多くの染色体転座が
報告されているが、急性白血病で頻繁に検出される転座
は限られており、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）で最もよ
く出現する４種の染色体転座はｔ（８；２１）、ｉｎｖ
（１６）、ｔ（１５；１７）及びｔ（９；２２）であっ
て、これがＡＭＬ症例の１／３を占めている。また、ｔ
（１２；２１）、ｔ（１；１９）及びｔ（９；２２）と
いった染色体転座は小児及び成人急性リンパ系白血病の
症例の１／４で検出される。これらの染色体転座はその
臨床的意義が定まっているため、現在の治療においては
これらの染色体転座の有無を検出するだけで十分ともい
える。従って、白血病のスクリーニング系においては、
これらの染色体転座の検出に対応するＭ−ｂｃｒ／ａｂ
ｌ、ｍ−ｂｃｒ／ａｂｌ、ＰＭＬ／ＲＡＲα及びＡＭＬ
１／ＭＴＧ８の白血病キメラ遺伝子、更にＴＥＬ／ＡＭ
Ｌ１、Ｅ２Ａ／ＰＢＸ１及びＣＢＦβ／ＭＹＨ１１の白
血病キメラ遺伝子の検出が有用である。

【００１９】なお、本明細書において使用する、アミノ
酸、ペプチド、塩基配列、核酸、制限酵素、その他に関
する略号による表示は、ＩＵＰＡＣ及びＩＵＰＡＣ−Ｉ
ＵＢによる命名法又はその規定、及び「塩基配列又はア
ミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライ
ン」（平成９年３月、特許庁調整課審査基準室）に従う
ものとする。

【００２０】

【発明の実施の形態】本発明の白血病キメラ遺伝子の検
出方法は、特定のプライマーセット及びプローブの利用
を必要とするものであり、これらを利用する限りにおい
て、核酸の増幅方法や核酸の検出方法として、リアルタ
イムＰＣＲ法に拘泥されることなく、公知もしくは将来
得られ得る各種の方法を広く採用することができる。

【００２１】ここで、リアルタイムＰＣＲ法としては、
蛍光標識したプローブを利用することによって、蛍光共
鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づいて目的のＰＣＲ
増幅産物をリアルタイムに検出することを可能とする各
種の方法を制限なく挙げることができる。より具体的に
は、いわゆるリアルタイムＰＣＲ法（Proc. Natl. Aca
d. Sci., 88, 7276-7280 (1991); 特表平6-500021号公
報等）として知られている方法（以下、本明細書におい
て「汎用リアルタイムＰＣＲ法」という。）或いはライ
トサイクラー（LightCycler）ハイブリダイゼーション
フォーマット（Biotechniques, 22, 176-181 (1997)）
として知られている方法（以下、本明細書において「ラ
イトサイクラーハイブリダイゼーションフォーマット
法」という。）等を挙げることができる。

【００２２】前者の汎用リアルタイムＰＣＲ法は、プロ
ーブとしてレポーター蛍光色素とクエンチャー蛍光色素
を同一のプローブ内に結合させてなる蛍光標識プローブ
を利用するものであって、プローブの分解に伴い抑制さ
れていたレポーター蛍光色素の蛍光強度が増加すること
により増幅産物の検出が可能となるものである。後者の
ライトサイクラーハイブリダイゼーションフォーマット
法は、検出対象である増幅産物に隣接して結合するよう
に設計された２つのプローブを利用するものである。こ
れら２つのプローブは一方にドナー蛍光色素を、他方に
アクセプター蛍光色素を結合した蛍光標識プローブであ
って、２つのプローブが近接して増幅産物に結合した際
に起こる蛍光共鳴エネルギー移動により増幅産物の検出
が可能となるものである。

【００２３】本発明で用いるプライマーセットは、前述
した１０種の白血病キメラ遺伝子のうち少なくともＭ−
ｂｃｒ／ａｂｌ、ｍ−ｂｃｒ／ａｂｌ、ＰＭＬ／ＲＡＲ
α及びＡＭＬ１／ＭＴＧ８の白血病キメラ遺伝子の検出
を可能とする領域を含むＰＣＲ増幅産物が得られるよう
に設定されている。なお、本発明のプライマーセット
は、更に必要に応じてその他の白血病キメラ遺伝子であ
るＴＥＬ／ＡＭＬ１、Ｅ２Ａ／ＰＢＸ１、ＣＢＦβ／Ｍ
ＹＨ１１、ＭＬＬ／ＡＦ４及びＭＬＬ／ＡＦ９、並びに
白血病関連遺伝子であるＷＴ１遺伝子や内在性コントロ
ール遺伝子であるＧＡＰＤＨ、からなる群から選ばれる
少なくとも１種の遺伝子の検出を可能とする領域を含む
ＰＣＲ増幅産物が得られるように設定されてなるプライ
マーセットを含んでいてもよい。上記において「遺伝子
の検出を可能とする領域」は、当該検出対象の遺伝子に
固有の配列を含むように任意に設定できる。キメラ遺伝
子の検出には、かかる領域としてキメラを構成する異遺
伝子の接合領域を用いることができる。すなわちキメラ
遺伝子の検出に用いられるプライマーセットとしては、
上記接合領域を含むＰＣＲ増幅産物が得られるように、
当該接合領域を挟むようにして設定した、キメラの片方
の遺伝子に特異的なフォワードプライマーとキメラの他
方の遺伝子に特異的なリバースプライマーからなるもの
を用いることができる。

【００２４】これらのプライマーセットは、通常６０〜
５００程度の塩基長からなるＰＣＲ増幅産物を与えるよ
うに設定できる。フォワードプライマーとリバースプラ
イマーからなる各プライマーセットは、標的遺伝子に特
異的であるように設定され、通常１８〜３０程度の塩基
数を有する塩基配列からなることができる。

【００２５】尚、白血病キメラ遺伝子には、融合する遺
伝子が同じである同一キメラであっても各遺伝子の接合
位置が異なる複数のタイプが存在し、例えばＰＭＬ／Ｒ
ＡＲαには、大きく分けて３種類のタイプが存在するこ
とが知られている（直江知樹, 日常診療と血液, 8(2),
167-171 (1998)）。このような場合、１つのプライマー
セットの使用では、接合位置の違いに応じて増幅される
遺伝子の大きさに違いが生じ、それがＰＣＲ効率に影響
を及ぼすため、全タイプのキメラ遺伝子が検出できない
という場合が生じる。このようなキメラ遺伝子を検出す
るためには、個々のいずれのタイプのキメラ遺伝子に対
しても所望の大きさの増幅産物が得られるように、複数
のフォワード乃至リバースプライマーからなる混合プラ
イマーセットを用いることが好ましい。

【００２６】本発明で用いられるプローブは、標的遺伝
子としての上記ＰＣＲ増幅産物と特異的にハイブリダイ
ズし当該増幅産物の特異的検出を可能とするように設定
される。当該プローブは、通常２０〜３０程度の塩基か
らなることができる。尚、ライトサイクラーハイブリダ
イゼーションフォーマット法を採用する場合に用いる２
つのプローブは、標的遺伝子であるＰＣＲ増幅産物の塩
基配列に、両者が通常１〜５塩基程度の間を隔てて隣接
してハイブリダイズするように設定される。

【００２７】プローブは、リアルタイムＰＣＲ法に従う
検出に利用されるために、任意の蛍光色素で標識されて
いることが好ましい。例えば、前述する汎用リアルタイ
ムＰＣＲ法において用いられるレポーター蛍光色素とし
ては、６−カルボキシ−フルオレッセン（ＦＡＭ）等の
フルオレッセン系蛍光色素を、クエンチャー蛍光色素と
しては、６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン
（ＴＡＭＲＡ）等のローダミン系蛍光色素を制限なく利
用できる。これらの色素は公知であり商業的に入手する
ことができる。また、かかる色素はプローブ導入用キッ
トとしても市販されており、これを使用すれば常法に従
って簡単にプローブに導入することができる。これら蛍
光色素のプローブへの結合位置は特に制限はないが、通
常、プローブの両端にこれらの蛍光色素を結合すること
ができる。尚、ライトサイクラーハイブリダイゼーショ
ンフォーマット法の蛍光標識プローブに用いられる蛍光
色素も同様に特に制限はなく、簡便には、ドナー蛍光色
素としてはフルオレッセンが、またアクセプター蛍光色
素としては「ＬＣＲｅｄ６４０」（LightCycler; ベー
リンガーマンハイム社）が好適に利用できる。

【００２８】本発明においては、上記のプライマーセッ
トとプローブは、リアルタイムＰＣＲ法において任意の
ひとつのＰＣＲ条件下において同時に作動可能であるよ
うに設定されていることが重要である。かかる所望のプ
ライマーセットとプローブを設定するにあたっては、プ
ライマー及びプローブの結合位置（乃至配列中に含まれ
るＧＣ含量）、塩基長、融解温度（Ｔｍ）及び増幅産物
の大きさなどを指針とすることができる。指針として特
に好ましくは融解温度（Ｔｍ）であり、具体的にはプラ
イマーとしては融解温度（Ｔｍ）が５０〜６５℃程度の
範囲にあるものを、またプローブとしては上記プライマ
ーの融解温度よりも約１０℃程度高い範囲にあるものを
選択設定することができる。

【００２９】尚、リアルタイムＰＣＲ法において、デナ
チュレーション条件として９５℃−１５秒、アニーリン
グ及びＤＮＡ伸長反応条件として６０℃−６０秒を採用
することが好ましい。この条件下で上記１０種の白血病
キメラ遺伝子並びにＷＴ１遺伝子及びＧＡＰＤＨの全て
について効率的検出を可能とする所望のプライマーセッ
ト及びプローブの具体例は、図１に示すとおりである。
尚、図１中、「Forward」とはフォワードプライマー、
「Reverse」とはリバースプライマー、「TaqMan」とは
プローブを意味する。またプローブの配列中、「FAM」
はレポーター蛍光色素として用いる６−カルボキシ−フ
ルオレッセン、「TAMRA」はクエンチャー蛍光色素とし
て用いる６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミンで
ある。

【００３０】尚、本発明において「ひとつのＰＣＲ条件
下において同時に作動可能である」とは、ひとつのＰＣ
Ｒ条件の下で各測定系が良好な測定感度を与えることを
意味する。当該分野で所望の測定感度を与えるコピー数
としては１チューブあたり数十コピーを挙げることがで
きる。例えば、図１に示すプライマーセット及びプロー
ブによれば、１チューブあたり２０コピーまでの測定感
度を少なくとも有することが確認されている。

【００３１】本発明の白血病キメラ遺伝子の検出法は、
上記特定のプライマーセット及びプローブを利用する点
を除けば、通常のリアルタイムＰＣＲ法（広義）に従っ
て常法により実施することができる。かかるリアルタイ
ムＰＣＲ法（上記汎用リアルタイムＰＣＲ法及びライト
サイクラーハイブリダイゼーションフォーマットを含
む）を実施するための装置や機器及びキットはいずれも
市販されており、本発明においてもかかる市販品を好適
に利用することができる。尚、当該リアルタイムＰＣＲ
法において、デナチュレーション、アニーリング及びＤ
ＮＡ伸長反応の各反応条件は、上記プライマーセット及
びプローブの設定条件に一致していることが必要であ
り、前述の条件を好適に使用することができる。その他
の操作及び手法は常法に従うことができる。

【００３２】尚、本発明において採用され得る各種の操
作、例えば、ＲＮＡの抽出、ＤＮＡ又はＤＮＡ断片の合
成、切断、削除、付加又は結合を目的とする酵素処理、
ＲＮＡ又はＤＮＡの単離、精製、複製、選択、増幅など
はいずれも常法に従うことができる（分子遺伝学実験
法、共立出版（株）１９８３年発行；ＰＣＲテクノロジ
ー、宝酒造（株）１９９０年発行等参照）。またこれら
は必要に応じて適宜常法に従って修飾して用いることも
できる。更に、増幅産物等の塩基配列を決定する場合に
も、公知もしくは将来得られ得る各種の方法を広く採用
することができる（例えばサイクルシークエンシング
法：服部正平、「ＰＣＲを用いた直接塩基配列決定法」
実験医学（増刊）新ＰＣＲとその応用、２９−３５頁
（１９９７）、羊土社等）。

【００３３】本発明の白血病キメラ遺伝子の検出方法を
実施するにあたっては、上記特定のプライマーセット及
びプローブを有効成分として含む白血病キメラ遺伝子検
出用キットを利用するのが好ましい。当該キットは、１
０種の白血病キメラ遺伝子、具体的にはＭ−ｂｃｒ／ａ
ｂｌ、ｍ−ｂｃｒ／ａｂｌ、μ−ｂｃｒ／ａｂｌ、ＰＭ
Ｌ／ＲＡＲα、ＡＭＬ１／ＭＴＧ８、ＴＥＬ／ＡＭＬ
１、Ｅ２Ａ／ＰＢＸ１、ＣＢＦβ／ＭＹＨ１１、ＭＬＬ
／ＡＦ４及びＭＬＬ／ＡＦ９の白血病キメラ遺伝子の中
でも、少なくともＭ−ｂｃｒ／ａｂｌ、ｍ−ｂｃｒ／ａ
ｂｌ、ＰＭＬ／ＲＡＲα及びＡＭＬ１／ＭＴＧ８の白血
病キメラ遺伝子が検出できるように設計されたプライマ
ーセット及びプローブを含むことが好ましい。さらに当
該検出用キットには、所望に応じてＴＥＬ／ＡＭＬ１、
Ｅ２Ａ／ＰＢＸ１、ＣＢＦβ／ＭＹＨ１１、ＭＬＬ／Ａ
Ｆ４及びＭＬＬ／ＡＦ９からなる群から選択される白血
病キメラ遺伝子、またはＷＴ１遺伝子及びＧＡＰＤＨの
少なくとも１種の遺伝子についての検出用プライマーセ
ット及びプローブを含ませることができる。尚、これら
のプライマーセット及びプローブは、上記白血病キメラ
遺伝子の検出と同一条件下で作動可能なように設定され
ることが好ましい。当該キットには、さらにリアルタイ
ムＰＣＲ法を実施する際に必要とされる他の任意成分を
包含させることができる。

【００３４】本発明の検出方法によれば、白血病キメラ
遺伝子の存在が想定される生体成分を検体として、それ
に含まれ得る白血病キメラ遺伝子を１度に非常に簡便に
かつ迅速に定性乃至定量分析することができ、白血病罹
患の有無の診断のみならず、白血病の分類やＭＲＤ解析
等に関して有用な情報を取得することができる。

【００３５】

【実施例】以下、本発明の内容を実施例を用いて具体的
に説明する。但し、本発明はこれらに何ら限定されるも
のではない。実施例１ （１）プライマーとプローブの設計 検出対象として選択した１０種のキメラ遺伝子（M-bcr/
abl, m-bcr/abl, μ-bcr/abl, PML/RARα, AML1/MTG8,
TEL/AML1, E2A/PBX1, CBFβ/MYH11, MLL/AF4,MLL/AF9）
及びＷＴ１遺伝子並びに内在性コントロール遺伝子とし
てのＧＡＰＤＨ遺伝子の特異的増幅と検出を可能とする
プライマーセット及びプローブについて、複数の候補物
を設計し、合成した。

【００３６】リアルタイムＰＣＲ法の反応条件として、
デナチュレーション条件：９５℃−１５秒及びアニーリ
ング及びＤＮＡ伸長反応条件：６０℃−６０秒を採用
し、この条件下で、上記全ての遺伝子が１度に効率的に
検出できるような所望のプライマーセット及びプローブ
をそれぞれ選択した。

【００３７】各遺伝子に対応して上記で選択されたプラ
イマーセット及びプローブの配列を図１に示す。なお、
CBFβ/MYH11遺伝子のプライマーセット及びプローブと
しては、図１に記載するNo.1とNo.2のうち、No.1のセッ
トを選択した。

【００３８】図１中「Forward」とはフォワードプライ
マー、「Reverse」とはリバースプライマー、「TaqMa
n」とはプローブを意味する。また各プローブは、リア
ルタイムＰＣＲ法に適用するために、常法に従ってレポ
ーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素で両端が蛍光
標識（FAM：６−カルボキシ−フルオレッセン、TAMRA：
６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン）されてい
る。

【００３９】また併せて図１に、各遺伝子におけるプラ
イマー及びプローブの位置（各GeneBank番号で特定され
る既知配列上の位置）（図１中、「position」として示
す）、並びに融解温度（Tm）を示す。なお、ＰＭＬ／Ｒ
ＡＲα、ＣＢＦβ／ＭＹＨ１１及びＭＬＬ／ＡＦ９とい
った白血病キメラ遺伝子については、キメラを構成する
異遺伝子の接合位置が異なる複数のタイプが存在するた
め、それを考慮して、複数のフォワード若しくはリバー
スプライマーからなる混合プライマーセットを用いた。

【００４０】（２）リアルタイムＰＣＲの実施 (i) リアルタイムＰＣＲの実施にあたり、まずＲＮＡ及
びｃＤＮＡを常法に従って下記の方法により調製した。 ＲＮＡの調製：白血病細胞株から抽出したトータル
ＲＮＡをカラム（QIAampRNA Blood Mini Kit; QIAGEN
社）に吸着させ、カラムを洗浄後、吸着したＲＮＡをＤ
ＥＰＣ水（diethylpyrocarbonate treated distilled a
nd deionized water）で溶出した。ＲＮＡの濃度と純度
は、吸光度Ａ２６０nm／Ａ２８０nmの比で確認した。 ｃＤＮＡの調製：上記で得られたトータルＲＮＡ２
μｇを、５００ｎｇのランダムプライマー、２００ユニ
ットの逆転写酵素（SuperScript II; GIBCO社）、４０
ユニットのＲＮａｓｅ阻害剤（GIBCO社）及び１ｍＭ
ｄＮＴＰを含む４５μｌの反応液中で逆転写して調製し
た。

【００４１】(ii) リアルタイムＰＣＲ 上記で調製したｃＤＮＡ２.２５μｌ、フォワードプラ
イマーとリバースプライマー各７.５ｐＭ、プローブ（T
aqMAN probe）５ｐＭ及びユニバーサル・マスターミッ
クス（TaqMAN Universal PCR Master Mix; PE Biosyste
ms社）１２.５μｌを、ＤＥＰＣ水に加えて全量を２５
μｌとした。ＰＣＲ反応は、最初に５０℃で２分間、９
５℃で２分間かけてＴａｑポリメラーゼを活性化し、次
いで９５℃−１５秒のデナチュレーション工程、及び６
０℃−６０秒のアニーリング及びＤＮＡ伸長反応工程を
１サイクルとして、これを計５０サイクル行うことによ
り実施した。プローブに由来して増幅産物が発する蛍光
強度を７秒毎に測定し（PRISM7700; PE Biosystems
社）、同機器付属のソフトウエアー（Seqquence Detect
ion System ver.1.63）によりデータ解析を行った。

【００４２】なお、上記リアルタイムＰＣＲは９６ウエ
ルのＰＣＲプレートを用いて行った。ＰＣＲプレートの
各ウエルには、検体として上記ｃＤＮＡの他、陰性コン
トロール（distilled adn deionized water：ddw）、陽
性コントロール（各キメラ遺伝子のスタンダード標品
（1000コピー／ウエル）、ＷＴ１遺伝子のスタンダード
標品（1000コピー／ウエル）、ＧＡＰＤＨ遺伝子のスタ
ンダード標品（10000コピー／ウエル））及び逆転写コ
ントロール（ＧＡＰＤＨｍＲＮＡ(10000コピー／ウエ
ル)を、検体を逆転写する時に同時に逆転写したｃＤＮ
Ａ）を配置し、上記と同様にしてＰＣＲ反応を行った。

【００４３】なお、上記陽性コントロールとして用いた
各遺伝子のスタンダード標品は下記のようにして調製し
た。 ＜スタンダード標品の調製＞白血病細胞株から調製した
上記ｃＤＮＡを（１）で調製したプライマーセットを用
いてＰＣＲ増幅し、ｐＣＲＩＩベクター（Invitrogen
社）に組み込んだ。各キメラ遺伝子、ＷＴ１遺伝子又は
ＧＡＰＤＨ遺伝子からなる目的遺伝子を組み込んだベク
タープラスミドを大腸菌ＪＭ１０９にトランスフェクト
してＬＢ培地で培養し、市販キット（QIAGEN Plasmid M
axi kit; QIAGEN社）により精製した。所望遺伝子を含
む各プラスミドのコピー数は、ＤＮＡ濃度（吸光度Ａ２
６０nm）とプラスミドＤＮＡの分子量から計算した。

【００４４】(iii) 結果 キメラ遺伝子転写産物（(a)〜(j)）、ＷＴ１遺伝子転写
産物(k）及びＧＡＰＤＨ遺伝子転写産物(l) のＰＣＲ増
幅プロフィールを図２〜３に示す。図２〜３の各グラフ
中、黒四角で示すプロットが白血病細胞株についての結
果である。尚、図２〜３において縦軸は蛍光強度（ΔＲ
ｎ）を、横軸はＰＣＲのサイクル数を示す。図２〜３の
各グラフ中に併記する●のプロットは後述する染色体異
常が確認されている臨床検体における結果であり、▲の
プロットは健常者検体（健常人白血球）における結果で
ある。この結果から、白血病キメラ遺伝子の発現が知ら
れている白血病細胞株（陽性対照）において蛍光強度の
上昇がみられたのに対し、健常人の白血球では上昇がみ
られず、測定対象である白血病キメラ遺伝子に特異的に
反応していることが確認された（交叉反応性は認められ
なかった。）。

【００４５】また、標準曲線と７点の希釈スタンダード
はよい相関（correlation efficiency: Ce）を示した：
M-bcr/abl Ce＝0.998, m-bcr/abl Ce＝0.998, μ-bcr/a
bl Ce＝0.999, PML/RARαCe＝0.998, AML1/MTG8 Ce＝0.
999, TEL/AML1 Ce＝0.997, E2A/PBX1 Ce＝0.999, CBFβ
/MYH11 Ce＝0.996, MLL/AF4 Ce＝0.997, MLL/AF9 Ce＝
0.994，WT1 Ce＝0.996, GAPDH Ce＝0.997。

【００４６】染色体転座が知られている各種白血病細胞
株における検出結果を表１に示す。

【００４７】

【表１】

【００４８】Ｍ−ｂｃｒ／ａｂｌ及びｍ−ｂｃｒ／ａｂ
ｌは、当該キメラ遺伝子の発現が確認されているＫ５６
２、ＭＥＧ−Ｏ１及びＫＵ−８１２の細胞株において検
出された（Blood, 87, 5213-5217 (1996)）。ＰＭＬ／
ＲＡＲαは、その発現が確認されているＮＢ−４で検出
された。ＡＭＬ１／ＭＴＧ８は、当該キメラ遺伝子の発
現が確認されているＫａｓｕｍｉ−１で検出された。Ｃ
ＢＦβ／ＭＹＨ１１は、当該キメラ遺伝子の発現が確認
されているＭＥ−１で検出された。ＭＬＬ／ＡＦ９は、
当該キメラ遺伝子の発現が確認されているＴＨＰ−１で
検出された。

【００４９】尚、ＨＬ−６０、ＫＧ−１、ＣＣＲＦ−Ｃ
ＥＭ、Ｒａｊｉ、Ｕ９３７、ＭＯＬＴ−３、ＭＯＬＴ−
４及びＪｕｒｋｕｔの各細胞株においては、上記検出系
ではいかなるキメラ遺伝子も検出されなかった。これら
の細胞株においては、当該１０種のキメラ遺伝子の存在
は知られていない（Leukemia, 9, 480-500 (1995)）。
ＷＴ１転写産物は、Ｒａｊｉを除き全ての細胞株から検
出され、その範囲は、８０〜９．３×１０⁵コピー／μ
ｇＲＮＡであった。

【００５０】また、各測定系の再現性及び測定感度の試
験結果を表２に示す。

【００５１】

【表２】

【００５２】各測定系において、同時及び日差再現性と
も、低（low）、中（middle）、高（high）ドーズの対
照検体でＣＶが１３％以下であり、良好な再現性を示し
た。また、スタンダード標品を用いた感度試験におい
て、１チューブあたりＭ−ｂｃｒ／ａｂｌ、ＭＬＬ／Ａ
Ｆ４及びＧＡＰＤＨが２０コピーであるのを除いて、全
て１０コピーまでの測定感度を有することが確認され
た。以上のことより、これら１０種の白血病キメラ遺伝
子、ＷＴ１遺伝子及びＧＡＰＤＨの検出のために設計し
た上記本発明のプライマーセット及びプローブは、上記
設定したＰＣＲ条件で、全て同時に作動可能であり、本
発明によって白血病キメラ遺伝子の検出並びに白血病の
診断において所望の測定系が提供できることが確認でき
た。

【００５３】尚、上記実施例で使用した白血病細胞株
は、所望遺伝子の発現・存在が確認されている任意の各
種細胞株である。ここでは、白血病細胞株として以下の
細胞株が使用されているが、これらに何ら制限されるこ
とはない。 ＭＥＧ−Ｏ１（Ph＋）：Blood, 72, 46-60 (1988) ＮＢ４：Blood, 77, 1080-1086 (1991) Ｋａｓｕｍｉ−１：Blood, 77, 2031-2036 (1991) ＭＥ−１：Blood, 78, 451-457 (1998) ＫＵ８１２、ＨＬ-６０Ｕ９３７及びＴＨＰ−１：いず
れもＪＣＲＢ Ｋ５６２、ＫＧ-１、Ｒａｊｉ及びＣＣＲＦ−ＣＥＭ：
いずれもＡＴＣＣ 尚、全ての細胞は、１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ−
１６４０培地で培養が行われた。各細胞株から抽出され
たｍＲＮＡを名古屋大学 直江知樹先生よりご供与戴
き、上記実施例に供した。

【００５４】実施例２ 上記白血病キメラ遺伝子の検出方法について、白血病の
スクリーニング系としての有用性を名古屋大学 直江智
樹先生に評価戴いた。その結果は次のとおりである。

【００５５】検体として名古屋大学医学部の保存白血病
細胞６２検体が使用された（これら骨髄細胞は、名古屋
大学医学部、名古屋第一赤十字病院及び小牧市民病院の
造血器腫瘍の患者よりインフォームドコンセント了承の
もとに採取された）。５０名（男女各２５名）の健常者
末梢血はインフォームドコンセント了承のもとに採取さ
れた。

【００５６】骨髄液及び末梢血からのＲＮＡの調製は、
前記市販キット（QIAamp RNA BloodMini Kit; QIAGEN
社）のマニュアルに従い、赤血球を溶血バッファーで溶
血後、残りの白血球から抽出したトータルＲＮＡより前
記同様にして行われた。ｃＤＮＡの調製も同様である。

【００５７】前記したリアルタイムＰＣＲに従って測定
された結果、健常者５０名の末梢血全有核細胞中には、
いずれのキメラ遺伝子転写産物も検出されなかった。Ｗ
Ｔ１遺伝子転写産物は、この５０名中４名に検出され、
それぞれ５３、６８、７１、８８コピー／μｇＲＮＡで
あった。尚、染色体異常が確認されている臨床検体
（●）と健常人白血球（▲）におけるＰＣＲ増幅プロフ
ィールは、白血病細胞株におけるＰＣＲ増幅プロフィー
ル（黒四角）と共に図１に示されている。

【００５８】保存白血病細胞６２検体中、２３検体（３
７．１％）においてキメラ遺伝子転写産物が検出され、
５５検体（８８．７％）においてＷＴ１遺伝子転写産物
が検出された。キメラ遺伝子転写産物が検出された検体
は、１例を除き、全てＷＴ１遺伝子転写産物が検出され
た。

【００５９】上記キメラ遺伝子転写産物が検出された２
３検体において、Ｍ−ｂｃｒ／ａｂｌは３検体、ｍ−ｂ
ｃｒ／ａｂｌは５検体、ＰＭＬ／ＲＡＲαは６検体、Ａ
ＭＬ１／ＭＴＧ８は４検体、ＴＥＬ／ＡＭＬ１は１検
体、Ｅ２Ａ／ＰＢＸ１は１検体、ＭＬＬ／ＡＦ４は１検
体及びＭＬＬ／ＡＦ９は２検体で各々検出された。

【００６０】この２３検体は、１例を除きＦＡＢ分類の
結果と一致しており、その１９例のＰＣＲデータは、染
色体解析結果と一致していた。

【００６１】ＦＡＢ分類及び染色体解析結果と不一致の
１検体（＃２６）は、出血傾向が認められなかった患者
であり、白血病細胞はＨＬＡ−ＤＲ陽性で正常の核型を
示していた。これらの臨床データはＭ３／ＡＰＬとは相
違するが、リアルタイムＰＣＲ増幅物の配列解析結果は
ＰＭＬ／ＲＡＲα転写産物のそれに一致しており、確か
にこの転写産物が存在していることに間違いはない。

【００６２】ＰＣＲデータと染色体解析結果は４例（＃
１４、＃２６、＃２７及び＃３５）において一致しなか
った。＃１４検体は、ｍ−ｂｃｒ／ａｂｌ転写産物を発
現していた。この患者のＦＡＢ分類はＬ２であり、核型
は−９及び−２２で３つのマーカー染色体が存在した。
これらを考慮すると、この検体は、マスクドタイプのｂ
ｃｒ／ａｂｌキメラ遺伝子を有しているものと思われ
た。尚、この本発明に係る検出系によって、マスクドタ
イプのｂｃｒ／ａｂｌ転写産物を検出できることを確認
している。

【００６３】＃２７検体は、ＭＬＬ／ＡＦ９転写産物を
弱く発現していた（４２０コピー／μｇＲＮＡ）。これ
は１０⁵細胞あたり約４２０コピーに相当し、染色体解
析の検出限界以下であったと考えられる。

【００６４】＃３５検体の核型はｔ（１；２２）、−
７、−１６であったが、ＰＣＲデータではｔ（９；２
２）ｍ−ｂｃｒ／ａｂｌを示した。この患者は、化学療
法抵抗性でありＰｈ（＋）の症状に一致していた。ＰＣ
Ｒ増幅物の配列解析結果は、ｂｃｒ／ａｂｌ転写産物の
それに一致していた。Ｐｈ（−）核型でｂｃｒ／ａｂｌ
キメラ遺伝子（＋）の患者の存在は報告されている。

【００６５】ＷＴ１転写産物は、４５例のＡＭＬ中４１
例（９１．１％）及び１７例のＡＬＬ中１４例（８２．
４％）で検出された。ＷＴ１転写物とキメラ遺伝子転写
物とを合わせると、約９２％のＡＭＬ及びＡＬＬの患者
においてＭＲＤの追跡が可能であった。

【００６６】このリアルタイムＰＣＲによる白血病キメ
ラ遺伝子の迅速測定系は、ＤＮＡ増幅と検出が同時に実
施できるという簡便さと併せて、ＰＣＲ増幅物の人為的
汚染が回避できることから、臨床上極めて有用な測定系
であると考えられる。また、この検出系によれば目的遺
伝子の定量が可能であり、このため白血病キメラ遺伝子
の転写産物のスクリーニングと定量が同時に為し得ると
いう利点を有する。これらのことから本発明の白血病キ
メラ遺伝子の検出方法は、的確な白血病診断、更にＭＲ
Ｄ解析のための手段として有用であると考える。

【００６７】実施例３ 前記実施例１に従って、CBFβ/MYH11遺伝子の増幅・検
出用のプライマーセット及びプローブとして、図１に記
載するNo.1とNo.2のうち、No.2のセットを準備した。

【００６８】実施例２と同様にして、染色体異常が確認
されている臨床検体及び健常人の白血球からＲＮＡを調
製した。トータルＲＮＡを１.５μｇサンプリングし、
ランダムヘキサマーを５００ｎｇ添加し、ＤＥＰＣ水を
加えて、１１.５μｌにした後、６５℃で５分間加熱
し、氷中に５分間放置した。その後、緩衝液（５×firs
t strand buffer: GIBCO社製）を４.５μｌ、０.１Ｍ
ＤＴＴを１.５μｌ、２ｍＭ ｄＮＴＰを３μｌ、ＲＮ
ａｓｅ阻害剤（GIBCO社製）を１μｌ（40ユニット）及
び逆転写酵素（SuperScriptII: GIBCO社製）を１μｌ
（200ユニット）加え、合計２２.５μｌにして、４２℃
で６０分間反応してｃＤＮＡを合成した。

【００６９】そのｃＤＮＡ７.５μｌに、ユニバーサル
・マスターミックス（２×：TagManUniversal PCR Mast
er Mix；PE Biosystems社製）を２５μｌ、フォワード
／リバース各プライマー(CBFβ/MYH11検出用（No.2）、
１５pmol／μｌ)を１μｌ、プローブ（TagMan Probe、C
BFβ/MYH11検出用（No.2）；１０pmol／μｌ）を１μｌ
及びＤＥＰＣ水を１４.５μｌ加え、実施例１に記載す
る条件に準じてリアルタイムＰＣＲを行った。得られた
増幅プロフィールを図２及び図３に準じて、図４に示
す。これらの結果からわかるように、このCBFβ/MYH11
検出用の混合プライマー及びプローブのセット（No.2）
は、非特異反応を生じない点でより好ましいものであ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】標的遺伝子に対応して、本発明で用いるプライ
マーセット及びプローブの塩基配列を示す図である。併
せて、標的遺伝子に対する各プライマー及びプローブの
存在位置（Gene Bank番号で特定される既知配列上の位
置）、融解温度（Tm）を示す。

【図２】キメラ遺伝子転写産物（(a)Major-bcr/abl,
(b)minor-bcr/abl, (c)Micro-bcr/abl, (d)PML/RARα,
(e)AML1/MTG8, (f)TEL/AML1）の増幅プロフィールを示
す。尚、各グラフ中、縦軸は蛍光強度（ΔＲｎ）を、横
軸はＰＣＲのサイクル数を示す。各グラフ中、黒四角で
示すプロットが白血病細胞株についての結果、●のプロ
ットは染色体異常が確認されている臨床検体における結
果、▲のプロットは健常人白血球における結果である。

【図３】キメラ遺伝子転写産物（(g)E2A/PBX1, (h)CBF
β/MYH11, (i)MLL/AF4, (j)MLL/AF9）、ＷＴ１遺伝子転
写産物(k）及びＧＡＰＤＨ遺伝子転写産物(l) の増幅プ
ロフィールを示す。尚、(h)CBFβ/MYH11は、図１に記載
するCBFβ/MYH11遺伝子検出用（No.1）のプライマー及
びプローブセットを用いて増幅した結果である。各グラ
フ中、縦軸は蛍光強度（ΔＲｎ）を、横軸はＰＣＲのサ
イクル数を示す。各グラフ中、黒四角で示すプロットが
白血病細胞株についての結果、●のプロットは染色体異
常が確認されている臨床検体における結果、▲のプロッ
トは健常人白血球における結果である。

【図４】図１に記載するCBFβ/MYH11遺伝子検出用（No.
2）のプライマー及びプローブセットを用いて増幅し
た、キメラ遺伝子転写産物（CBFβ/MYH11）の増幅プロ
フィールを示す。グラフ中、縦軸は蛍光強度（ΔＲｎ）
を、横軸はＰＣＲのサイクル数を示す。また、●のプロ
ットは染色体異常が確認されている臨床検体における結
果、▲のプロットは健常人白血球における結果である。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd. <120> Detection of Chimeric Fusion Genes in Leukemia <130> 40F00JP <150> JP 2000-255570 <151> 2000-8-25 <160> 45 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for detecting of Major bcr/abl <400> 1 gatgctgacc aactcgtgtg tg 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detecting of Major bcr/abl <400> 2 tggccacaaa atcatacagt gc 22 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prove (TaqMan) for detecting of Major bcr/abl <400> 3 ccttcagcgg ccagtagcat ctgacttt 28 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for detecting of minor bcr/abl <400> 4 atcgtgggcg tccgcaagac 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detecting of minor bcr/abl <400> 5 gctcaaagtc agatgctact g 21 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prove (TaqMan) for detecting of minor bcr/abl <400> 6 cgccctcgtc atcgttgggc cagatct 27 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for detecting of Micro bcr/abl <400> 7 atggaggagg tgggcatcta c 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detecting of Micro bcr/abl <400> 8 gctcaaagtc agatgctact g 21 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prove (TaqMan) for detecting of Micro bcr/abl <400> 9 acatccaggc actgaaggca gccttcga 28 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for detecting of PML/RARα <400> 10 ttgcatcacc caggggaaag 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for detecting of PML/RARα <400> 11 accctattga cgttgacctg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for detecting of PML/RARα <400> 12 aaggcccttc ctatggagag 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for detecting of PML/RARα <400> 13 gaaggtcatc aagatggagt c 21 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detecting of PML/RARα <400> 14 agggagggct gggcactatc 20 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prove (TaqMan) for detecting of PML/RARα <400> 15 tcttcagaac tgctgctctg ggtctcaatg 30 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for detecting of AML1/MTG8 <400> 16 tcactgtctt cacaaaccca cc 22 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detecting of AML1/MTG8 <400> 17 gtcagcctag attgcgtctt ca 22 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prove (TaqMan) for detecting of AML1/MTG8 <400> 18 agtcgccacc taccacagag ccatcaaaat 30 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for detecting of TEL/AML1 <400> 19 tggcttacat gaaccacatc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detecting of TEL/AML1 <400> 20 cgcctcgctc atcttgcctg 20 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prove (TaqMan) for detecting of TEL/AML1 <400> 21 agcacgccat gcccattggg agaatagcag 30 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for detecting of E2A/PBX1 <400> 22 cagcaccagc ctcatgcaca 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detecting of E2A/PBX1 <400> 23 gttgtccagc cgcatcagct 20 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prove (TaqMan) for detecting of E2A/PBX1 <400> 24 ttgagtatcc gaggagccca ggaggaggaa 30 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for detecting of CBFβ/MYH11 <400> 25 aggatgcatt agcacaacag gc 22 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detecting of CBFβ/MYH11 <400> 26 tccagctgcg tcttcatctc ct 22 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detecting of CBFβ/MYH11 <400> 27 tgaggttctc gatctccttc tg 22 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detecting of CBFβ/MYH11 <400> 28 cctgtgacgc tctcaacttc at 22 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detecting of CBFβ/MYH11 <400> 29 ttcttgtcta ggttcgcctt ggc 23 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detecting of CBFβ/MYH11 <400> 30 ctggcttctg cctcagctct gt 22 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prove (TaqMan) for detecting of CBFβ/MYH11 <400> 31 acacgcgaat ttgaagatag agacaggtct 30 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for detecting of MLL/AF4 <400> 32 cagaatcagg tccagagcag ag 22 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detecting of MLL/AF4 <400> 33 cagaactgac atgctgagag tc 22 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prove (TaqMan) for detecting of MLL/AF4 <400> 34 agtggctccc cgcccaagta tccctgtaaa 30 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for detecting of MLL/AF9 <400> 35 cagaatcagg tccagagcag ag 22 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detecting of MLL/AF9 <400> 36 cagagtcatt gtcgttatcc tc 22 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detecting of MLL/AF9 <400> 37 acgatctgct gcagaatgtg tc 22 <210> 38 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prove (TaqMan) for detecting of MLL/AF9 <400> 38 agtggctccc cgcccaagta tccctgtaaa 30 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for detecting of WT1 <400> 39 gataaccaca caacgcccat c 21 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detecting of WT1 <400> 40 cacacgtcgc acatcctgaa t 21 <210> 41 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prove (TaqMan) for detecting of WT1 <400> 41 acaccgtgcg tgtgtattct gtattgg 27 <210> 42 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for detecting of GAPDH <400> 42 19 gaaggtgaag gtcggagtc <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detecting of GAPDH <400> 43 gaagatggtg atgggatttc 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prove (TaqMan) for detecting of GAPDH <400> 44 caagcttccc gttctcagcc 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detecting of CBFβ/MYH11 <400> 45 tggccagctt aatggccttc 20

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】Ｍａｊｏｒ−ｂｃｒ／ａｂｌ、ｍｉｎｏｒ
   −ｂｃｒ／ａｂｌ、ＰＭＬ／ＲＡＲα及びＡＭＬ１／Ｍ
   ＴＧ８の白血病キメラ遺伝子を検出する方法であって、
   当該検出を可能とする領域を含むＰＣＲ増幅産物を与え
   るように設定した上記各白血病キメラ遺伝子に特異的な
   各プライマーセット及び上記ＰＣＲ増幅産物の検出を可
   能とする上記各白血病キメラ遺伝子に特異的な各プロー
   ブを利用してリアルタイムＰＣＲ法に従い検出すること
   からなり、上記各プライマーセット及び各プローブはい
   ずれもひとつのＰＣＲ条件下において同時に作動可能で
   あるように設定されていることを特徴とする白血病キメ
   ラ遺伝子の検出方法。