TWI686481B - 複數個標的核酸之檢測套組及使用其之檢測方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種複數個標的核酸之檢測套組，其可使用置入有1種反應液的1個反應容器以及單一標記，來同時放大、檢測複數個基因。疑似含有會在變性溫度T0下進行解離之第1標的核酸及第2標的核酸之溶液是含有下述組分而成：DNA聚合酶；第1標的用引子，其在黏著(annealing)溫度T1下，結合到源自第1標的核酸之單股；第2標的用引子，其在黏著溫度T1下，結合到源自第2標的核酸之單股；第1標的用探針，其在黏著溫度T1下，結合到源自第1標的核酸之單股；第2標的用探針，其在低於黏著溫度T1及延長溫度T2之第2標的檢測溫度T3下，結合到源自第2標的核酸之單股；且滿足T0>T2≧T1>T3。

Description

複數個標的核酸之檢測套組及使用其之檢測方法 發明領域
本發明有關於改善PCR法，來測定複數個標的核酸之檢測套組及其關聯技術。
發明背景
在基因檢查中，有許多需要測定複數個標的基因。例如，流行性感冒之A型與B型、流行性感冒與RSV、更甚者人類間質肺炎病毒(human metapneumovirus)、性感染症之披衣菌(chlamydia)與淋病球菌(gonococcus)、黴漿菌(mycoplasma)及其抗性因子(resistance factor)等。
在病徵相似之下且在同時期同時擴大感染情況等之下，亦要鑑別並診斷該等，並確立治療方針。又，抗性因子之存在亦可用於投藥之選定判斷等。
另一方面，在單獨之測定項目當中，作為確認該測定是否真的順利進行之手段，設定內部控制(internal control)亦是有用的。此是預先準備用以放大之與檢測目標之標的基因無關係之核酸序列，且不論標的基因之有無，是可確認反應是否順利進行。藉此，可在測定之中確認測 定試劑或裝置是否有效作用。
如此，在檢測複數個標的核酸時，可認為是有實施各別的測定，或者，對檢測之各個標的核酸使用不同的標記色素等來識別之手段。
或者，亦可在同時進行放大反應後，緩慢的使溫度上昇(或下降)，並從顯示出螢光訊號之變化率之波鋒的溫度與標的核酸的熔解溫度來識別判斷(熱熔解曲線分析法)。
然而，各別測定會花費時間或成本，識別不同之標記物亦不僅要準備複數個標記試劑，分析裝置之波長設定等亦會花費成本。
使用熱熔解曲線分析法時，成本雖低，然需要緩慢的使溫度變化，因此為了進行正確的分析，不得不花費5~10分鐘左右的時間來進行溫度變化。
在專利文獻1(日本特開2002-136300號公報)，是準備置入有不同反應液的複數個反應容器，並分別進行放大檢測。具有在每一項目要調製試劑、分注作業而麻煩的問題點。
在專利文獻2(日本特開2004-203號公報)，是在置入有1種反應液的1個反應容器中同時放大複數個基因。其是透過先改變標記色素來識別每個基因。由於光是使用之標記色素的數量，檢測裝置之光學系統便需要複數個，因此具有裝置成本變高的問題點。
在專利文獻3(日本特開2008-173127號公報)，是 在置入有1種反應液的1個反應容器中同時放大複數個基因。在每一項目改變PCR產物或標記探針之解離溫度，且在放大後，使溫度從低溫側慢慢上昇至高溫側並監測螢光值以進行解離曲線分析(與「熱熔解曲線分析」同義。)，再透過監測在取決於鹼基序列之各個解離溫度下是否有波鋒來識別。
若提升熔解曲線分析時溫度變化的速度，則識別各項目之熔解溫度會變困難，因此會有在PCR反應後還要額外花費5~10分鐘左右之時間的問題點。
在專利文獻4(日本特表2012-513215號公報)，是在1個反應液容器中同時放大複數個基因。針對每一個基因改變PCR產物之解離溫度與引子之熔解溫度，並在各自的熔解溫度下監測螢光並識別。
通常之PCR程序(PCR profile)在1循環中，設置有變性、黏著、延長步驟，然在專利文獻4是在每一項目改變PCR產物之熔解溫度，因此需要考慮之條件多，程序之設計困難，且測定時間亦變長。由於溫度變化激烈，有裝置之負擔亦大的問題點。
專利文獻1：日本特開2002-136300號公報
專利文獻2：日本特開2004-203號公報
專利文獻3：日本特開2008-173127號公報
專利文獻4：日本特表2012-513215號公報
專利文獻5：日本特許第4724380號公報
就此，本發明之目的在於提供一種複數個標的核酸之檢測套組，其可使用置入有1種反應液的1個反應容器以及單一標記，來同時放大、檢測複數個基因。
第1發明之複數個標的核酸之檢測套組，是令變性溫度為T0、黏著溫度為T1、延長溫度為T2、第2標的檢測溫度為T3時，設定溫度滿足T0>T2≧T1>T3，並且於可含有在變性溫度T0下，雙股之氫鍵被切斷而分別解離成2條單股之第1標的核酸及第2標的核酸的溶液中，含有下述組分：
第1標的用引子，其在黏著溫度T1下，對第1標的核酸解離成的2條單股之任一者專一結合；第2標的用引子，其在黏著溫度T1下，對第2標的核酸解離成的2條單股之任一者專一結合；第1標的用探針，其在黏著溫度T1下，對第1標的核酸解離成的2條單股之任一者專一結合，且具有螢光訊號因結合而變化之第1標記物；DNA聚合酶；去氧核糖核苷三磷酸，其在延長溫度T2下，透過DNA聚合酶之作用，結合至第1標的核酸解離成的2條單股及第2標的核酸解離成的2條單股；第2標的用探針，其在黏著溫度T1下，不結合至第1標的核酸解離成的2條單股及第2標的核酸解離成的2條單股之任一者，且在第2標的檢測溫度T3下，對第2標的核酸解離成的2條單股之任一者專一結合，並且具有螢光訊號因結合而變化之第2標記物。
第1、第2標記物宜選自於由QProbe(註冊商標)探針、Eprobe(註冊商標)探針及TaqMan(註冊商標)探針所構成之群組。
螢光訊號可為黏著即消光，亦可為黏著即發光之任一者。
第1標的核酸及第2標的核酸宜為黴漿菌P1基因與內部控制，或者披衣菌內生性質體基因與淋病球菌CMT基因。
如上所述，若藉由本發明，將可使用1種標記物並以1種混合液來檢測複數個標的核酸。由於不需熱熔解曲線分析而可識別複數個標的核酸，故可大幅縮短測定時間，而實用效果高。
1‧‧‧容器
2‧‧‧溶液
10‧‧‧第1標的核酸
13‧‧‧第1標的用F引子
14‧‧‧第1標的用R引子
15‧‧‧第1標的用探針
16‧‧‧第1標記物
20‧‧‧第2標的核酸
23‧‧‧第2標的用F引子
24‧‧‧第2標的用R引子
25‧‧‧第2標的用探針
26‧‧‧第2標記物
30‧‧‧DNA聚合酶
31‧‧‧去氧核糖核苷三磷酸
T0‧‧‧變性溫度
T1‧‧‧黏著溫度
T2‧‧‧延長溫度
T3‧‧‧第2標的檢測溫度
圖1是顯示本發明實施形態1中混合液之溫度變化的圖表。
圖2是本發明實施形態1中螢光測定之時間說明圖。
圖3是顯示本發明實施形態1中判定方法的流程圖。
圖4是顯示本發明實施形態1中陰性對照之螢光強度變化的圖表。
圖5是顯示本發明實施形態1中第1標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖6是顯示本發明實施形態1中第2標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖7是顯示本發明實施形態1中第1、第2標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖8是本發明實施形態2中螢光測定的時間說明圖。
圖9是顯示本發明實施形態2中陰性對照之螢光強度變化的圖表。
圖10是顯示本發明實施形態2中第1標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖11是顯示本發明實施形態2中第2標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖12是顯示本發明實施形態2中第1、第2標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖13是顯示本發明實施形態3中判定方法的流程圖。
圖14是顯示本發明實施形態3中陰性對照之螢光強度變化的圖表。
圖15是顯示本發明實施形態3中第1標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖16是顯示本發明實施形態3中第2標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖17是顯示本發明實施形態3中第1、第2標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖18是顯示本發明實施形態4中陰性對照之螢光強度變化的圖表。
圖19是顯示本發明實施形態4中第1標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖20是顯示本發明實施形態4中第2標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖21是顯示本發明實施形態4中第1、第2標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖22是顯示本發明實施形態5中陰性對照之螢光強度變化的圖表。
圖23是顯示本發明實施形態5中第1標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖24是顯示本發明實施形態5中第2標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖25是顯示本發明實施形態5中第1、第2標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖26是顯示本發明實施形態6中陰性對照之螢光強度變化的圖表。
圖27是顯示本發明實施形態6中第1標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖28是顯示本發明實施形態6中第2標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖29是顯示本發明實施形態6中第1、第2標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖30是顯示本發明實施形態7中混合液之溫度變化的圖表。
圖31是顯示本發明實施形態7中陰性對照之螢光強度變化的圖表。
圖32是顯示本發明實施形態7中第1標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖33是顯示本發明實施形態7中第2標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖34是顯示本發明實施形態7中第1、第2標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖35是本發明實施形態1中溫度變化的擴大圖。
圖36是顯示本發明實施形態1中混合液成分的說明圖。
圖37(a)是本發明實施形態1中變性步驟的說明圖，圖37(b)是本發明實施形態1中黏著步驟的說明圖，圖37(c)是本發明實施形態1中延長步驟的說明圖，圖37(d)是本發明實施形態1中延長結束步驟的說明圖。
圖38(a)是本發明實施形態1中變性步驟的說明圖，圖38(b)是本發明實施形態1中黏著步驟的說明圖。
用以實施發明之最佳形態
本案發明人開發出一種檢測複數核酸之套組，其是在PCR法中，組合了探針黏著溫度之條件設定與溫度變化程序，且在置入有1種反應液的1個反應容器中使用了單一螢光標記。
在本套組，如圖35所示，使用4個溫度，亦即，變性溫度T0(95℃)、黏著溫度T1(70℃)、延長溫度T2(72℃)及第2標的檢測溫度T3(55℃)。該等溫度是將溫度設定成滿 足T0>T2≧T1>T3。當然，該等溫度數值僅不過是例示，如後述，可進行種種變更。
所謂複數個標的核酸是指第1標的核酸及第2標的核酸，然若需要，亦可藉由增加第3標的檢測溫度T4(T3>T4)等的設定溫度來追加第3標的核酸等其他標的核酸。
邊參照圖36，邊針對本套組之內容進行說明。首先，在本套組是令第1標的核酸10與第2標的核酸20為檢測對象。為便於以下之說明，僅說明在容器1內之溶液2(詳如後述。)含有第1標的核酸10與第2標的核酸20兩者之情況(亦即，陽性與陽性之情況)。
當然，在一者或兩者為陰性之情況時，會變成溶液2不含有第1標的核酸10與第2標的核酸20之至少一者或兩者，在以下之說明中，關於不含有之標的核酸，將不會進行螢光訊號及放大。
如圖37(a)所示，若使溶液2之溫度上昇成為變性溫度T0，則第1標的核酸10及第2標的核酸20其雙股之氫鍵皆會被切斷，分別解離成2條單股(第1標的核酸10解離成第1單股11與第2單股12，第2標的核酸20解離成第1單股21與第2單股22)。
如圖37(b)所示，若從變性溫度T0降溫變成黏著溫度T1，則就第1標的核酸10而言，第1標的用F引子13會專一結合到互補之第1單股11序列上，第1標的用R引子14會專一結合到互補之第2單股12序列上。同樣的，就第2標的核 酸20而言，第2標的用F引子23會專一結合到互補之第1單股21序列上，第2標的用R引子24會專一結合到互補之第2單股22序列上。
又，經第1標記物16標記之第1標的用探針15，在圖37(b)所示之黏著溫度T1下，專一結合至源自第1標的核酸10之第1單股11的特定部位，而第1標記物16產生螢光信號。然而，經第2標記物26標記之第2標的用探針25，由於黏著溫度T1較第2標的檢測溫度T3還要高溫，因此不會結合至源自第2標的核酸20之第1單股21，第2標記物26不會產生螢光信號。
如圖37(c)所示，若將溫度從黏著溫度T1提升至延長溫度T2，則在溶液2，由於含有用以反覆PCR循環之充分量的DNA聚合酶30與去氧核糖核苷三磷酸31，而會如下進行放大反應。
亦即，就第1標的核酸10而言，會從結合至第1單股11之第1標的用F引子13，又，從結合至第2單股12之第1標的用R引子14，分別結合去氧核糖核苷三磷酸31並漸漸延長。
又，就第2標的核酸20而言，會從結合至第1單股21之第2標的用F引子23，又，從結合至第2單股22之第2標的用R引子24，分別結合去氧核糖核苷三磷酸31並漸漸延長。
然後，一但放大反應結束，則如將圖37(d)與圖36進行比較所知，第1標的核酸10及第2標的核酸20兩者會 增加變成2倍。
再一次，返回圖37(a)所示之步驟，若反覆以上之步驟(圖37(a)~圖37(d))，則可反覆第1標的物16所致之螢光訊號的變化與放大反應。
接著，邊參照圖38，邊針對從變性溫度T0降溫至第2標的溫度檢測溫度T3之情況進行說明。
在變性溫度T0，如圖38(a)所示，會成為與圖37(a)同樣的狀態。然而，若將溫度降至第2標的溫度檢測溫度T3，則與圖37(b)相異，會變成如圖38(b)所示之狀態。
亦即，如圖38(b)所示，針對經第1標記物16標記之第1標的用探針15會專一結合至源自第1標的核酸10之第1單股11的特定部位，而第1標記物16之螢光訊號會變化這一點而言，與圖37(b)相同，然而，經第2標記物26標記之第2標的用探針25，由於是在第2標的檢測溫度T3，故會結合至源自第2標的核酸20之第1單股21，而第2標記物26之螢光訊號會變化。再者，第1標記物16與第2標記物26宜相同。
結果便是，若掌握起因於第2標記物26所致螢光訊號變化的差異，則可判定第2標記物20之有無(陽性/陰性)。
而且，如自以上說明所闡明，當可理解為使用置入有1種反應液的1個反應容器且在連貫不間斷之步驟中，可檢測複數個標的核酸。
以下將更具體顯示透過QProbe(註冊商標)法、Eprobe(註冊商標)法、TaqMan(註冊商標)法之使用了3種探 針之檢測複數核酸的實施形態。於實施所需之引子序列及各探針之鹼基序列、核酸試料之情報亦一併顯示。
(實施形態1)
<於QProbe法檢測黴漿菌P1基因與內部控制>
進行於QProbe法之黴漿菌P1基因與內部控制的檢測。
<材料及方法>
(引子)
在實施形態1之PCR法所使用之引子對是如(表1)所 示。
Figure 105115749-A0202-12-0012-1
序列編號1、序列編號2是使用記載於Ieven等人之報告(The Journal Of Infectious Diseases,1996；173；1445-52)的(針對P1黏附蛋白(P1 adhesin)基因之引子對)序列。
(核酸試料)
將在實施形態1中PCR法所使用之核酸試料顯示於下。
(pMYC)
是將編碼源自黴漿菌肺炎病原體之肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)之膜蛋白質，即P1蛋白質，的基 因片段(可以序列編號1與2之引子對放大之序列)人工合成後，插入至pMD20T載體的質體DNA。此質體DNA是委託Takara Bio股份有限公司製作合成。
(pICM5)
是一為了可將序列編號1與2之引子對做成共通引子放大，而將含有與引子對互補之鹼基序列的序列人工合成後，插入至pMD20T載體而成的質體DNA。此質體DNA是委託Takara Bio股份有限公司製作合成。
(調製核酸試料)
上述質體之長度，pMYC是2942bp、pICM5是2886bp。
從各質體之長度與質體溶液之濃度(μg/μl)計算每1μL之複製數後，使用TE緩衝溶液(10mM Tris-HCl、1.0mM EDTA pH8.0)，將pMYC稀釋成1×10^5copies/μl、將pICM5稀釋成1×10^3copies/μl。
(探針)
於實施形態1之PCR法所使用之探針情報是如(表2)所示。
Figure 105115749-A0202-12-0013-2
序列編號3及序列編號4，是從可藉(表1)之引子對放大之PCR產物的鹼基序列，並參考使用了J-Bio21中心之首頁上的QProbe設計支援工具計算的Tm值，選擇出特定 區域。
專一黏著pMYC之QProbe，亦即MYC QP，與專一黏著pICM5之QProbe，亦即IC QP，的螢光色素是使用BODIPY(註冊商標)FL，並將各個3’末端之C進行標記。QProbe是委託日鐵住金環境股份有限公司製作合成。
(PCR、螢光測定條件)
在實施形態1，針對在置入有1種反應液之1個反應容器中放大的2個標的核酸而言，是將專一黏著第1標的之pMYC之QProbe(MYC QP)的Tm值設定成較引子的Tm值還要高溫，並在放大反應中檢測。
接著，將專一黏著第2標的之pICM5之QProbe(IC QP)的Tm值設定成較放大反應中的變化溫度(70℃-95℃)還要低溫，並在放大反應後檢測。
將PCR反應液組成、反應條件顯示於(表3)與(表4)，又，將混合液之溫度變化圖表化顯示於圖1。
Figure 105115749-A0202-12-0014-3
Figure 105115749-A0202-12-0015-4
PCR及螢光測定是使用LightCycler(註冊商標)nano(Roche Diagnostics股份有限公司)。
螢光測定時之激發波長與螢光波長的組合是選擇510-528nm。在各循環之變性步驟(95℃)與延長步驟(72℃)測定螢光值，進一步，在放大反應後，在用以檢測第2標的之步驟(95℃與55℃)中進行螢光測定。
將放大反應之最終循環，與在第2標的檢測步驟中的螢光測定條件顯示於圖2。
(數據之處理方法)
隨LightCycler nano所附之分析軟體並不支援使用QProbe時之分析方法，因此是參考專利文獻5(日本國特許第4724380號公報)所記載之方法，並對所得原始數據進行修正演算處理。
在全部每一個循環之放大反應與第2標的檢測步驟進行根據以下數學式之演算。
fn=fhyb.n/fden.n (數1)
fe=fhyb.e/fden.e (數1’)
fn：根據(數1)算出之在n循環中的螢光強度值
fhyb.n：第n循環之延長步驟的螢光強度值
fden.n：第n循環之變性步驟的螢光強度值
fe：根據(數1’)算出之在第2標的檢測步驟中的螢光強度值
fhyb.e：第2標的檢測步驟55℃之螢光強度值
fden.e：第2標的檢測步驟95℃之螢光強度值
接著，針對全部循環之放大反應，與第2標的檢測步驟，透過以下之數學式進行演算。
Fn=fn/f10 (數2)
Fe=fe/f10 (數2’)
Fn：將第10循環之根據(數1)所得螢光強度值設定成1時之第n循環的相對值
Fe：將第10循環之根據(數1’)所得螢光強度值設定成1
時之第2標的檢測步驟的相對值
將放大反應最終循環之Fn值，即F44，用於判定第1標的核酸之有無。
進一步，根據以下之數學式進行演算。
Fs=Fe-F44 (數3)
Fs：第2標的之測定值
將Fs之值用於判定第2標的核酸之有無。
於QProbe法之判定是以下述所示方法進行。
第1標的核酸之有無是將測定試料之F44值與閾值1進行比較，並將[測定試料之F44<閾值1]判定為陽性。
閾值1是使用將陰性對照(添加了TE取代DNA之試劑)之F44之平均值-標準差之3倍(以下mean-3SD)的值。
不論第1標的核酸為陽性、陰性，第2標的核酸之有無是將Fs之值與閾值2進行比較，將[Fs<閾值2]判定為陽性。
閾值2是使用僅添加了pMYC之試料的Fs之mean-3SD的值。判定方法之流程圖是如圖3所示。
在核酸試料中黴漿菌P1基因是使用pMYC、內部控制是使用pICM5，並實施PCR。
MYC QP之序列是將Tm值設定成72.5℃、IC QP之序列是將Tm值設定成57.5℃。因此，可推測在PCR中之溫度範圍(從70℃至95℃)，探針是僅有MYC QP會黏著。
由於第2標的檢測步驟之螢光測定是在95℃與較IC QP之Tm值還要低之55℃下進行，因此可推測第2標的檢測步驟之測定值是會同時檢測到MYC QP與IC QP之消光。
陰性對照之放大曲線是直到PCR結束之第44循環都未見消光(因F44之值0.998並不低於閾值1之值0.997)，此時之mean-3SD會是0.997，並設為用以檢測實施形態1之第1標的之閾值1，且顯示於(表5)。將放大曲線顯示於圖4。
第1標的核酸之pMYC的放大曲線是從28循環附近有觀察到伴隨MYC QP之黏著的消光。
F44之值0.913是較閾值1還要低，顯示出pMYC之目的區域有放大。此時之Fs的mean-3SD是-0.056，並設為用以檢測第2標的之閾值2，且顯示於(表5)。將放大曲線 顯示於圖5。
第2標的核酸之pICM5的放大曲線是在放大反應中完全未見消光(因F44之值0.997並不低於閾值1之值0.997)，Fs之值-0.118是較閾值2還要低。
根據此結果顯示出，pMYC之目的區域沒有放大，與pICM5之目的區域有放大。
將Fs之值顯示於(表5)。將放大曲線顯示於圖6。
Figure 105115749-A0202-12-0018-5
添加有第1標的核酸之pMYC與第2標的核酸之pICM5兩者時之放大曲線，與pMYC之放大曲線相同，從28循環附近可觀察到伴隨MYC QP之黏著的消光，且F44之值0.912是較閾值1還要低，顯示出pMYC之目的區域有放大。
Fs之值-0.116是較閾值2還要低，顯示出pICM5之目的區域有放大。Fs之值顯示於(表5)。放大曲線顯示於圖7。
該等PCR產物在PCR結束後進行瓊脂糖電泳，添加有pMYC之試料在206bp附近、添加有pICM5之試料在150bp附近可確認到目的PCR產物。
根據以上結果顯示出，於QProbe法，組合探針之 設計方法與溫度變化程序，且在置入有1種反應液的1個反應容器使用單一螢光標記，可檢測黴漿菌P1基因與內部控制。
(實施形態2)
<於變更了第2檢測步驟之程序的QProbe法檢測黴漿菌P1基因與內部控制>
以變更實施形態1之第2標的檢測步驟之程序的方法來進行於QProbe法之黴漿菌P1基因與內部控制的檢測。
於PCR使用之引子、探針、反應液組成與核酸試料是使用與實施形態1相同者。本形態之反應條件是如(表6)所示。
Figure 105115749-A0202-12-0019-6
在實施形態2，是在第2標的檢測步驟且於55℃下進行螢光測定。將在放大反應之最終循環，與在第2標的檢測步驟時之螢光測定條件顯示於圖8。
在實施形態2中，fe是使用以下之演算，其他是進行與實施形態1相同之演算處理。
fe=fhyb.e/fden.44
fe：第2標的檢測步驟中之螢光強度值
fhyb.e：第2標的檢測步驟55℃之螢光強度值
fden.44：最終循環之放大反應之95℃的螢光強度值
以下顯示實施形態2之判定方法。第1標的核酸之有無是將測定試料之F44的值與閾值3進行比較，將[測定試料之F44<閾值3]判定為陽性。
閾值3是使用將陰性對照之F44之平均值-標準差之3倍(以下mean-3SD)的值。
不論第1標的核酸為陽性、陰性，第2標的核酸之有無是將Fs之值與閾值4進行比較，將[Fs<閾值4]判定為陽性。
閾值4是使用僅添加了pMYC之試料的Fs之mean-3SD的值。
陰性對照之放大曲線是直到放大反應結束之第44循環都未見消光(因F44之值0.998並不低於閾值3之值0.997)，此時之mean-3SD會是0.997，並設為用以檢測本例之第1標的之閾值3，且顯示於(表7)。放大曲線是如圖9所示。
第1標的核酸之pMYC的放大曲線是從28循環附近可觀察到伴隨MYC QP之黏著的消光，且F44之值0.912是較閾值3還要低，顯示出pMYC之目的區域有放大。
又，此時之Fs之mean-3SD為-0.052，並設為用以檢測第2標的之閾值4，且顯示於(表7)。放大曲線是如圖10 所示。
第2標的核酸之pICM5的放大曲線是在放大反應中完全未見消光(因F44之值0.997並不低於閾值3之值0.997)，Fs之值-0.170是較閾值4還要低。
根據此結果顯示出，pMYC之目的區域沒有放大，與pICM5之目的區域有放大。將Fs之值顯示於(表7)。將放大曲線顯示於圖11。
Figure 105115749-A0202-12-0021-7
添加有第1標的核酸之pMYC與第2標的核酸之pICM5兩者時之放大曲線，與pMYC之放大曲線相同，從28循環附近可觀察到伴隨MYC QP之黏著的消光，且F44之值0.911是較閾值3還要低，顯示出pMYC之目的區域有放大。
Fs之值-0.114是較閾值4還要低，顯示出pICM5之目的區域有放大。將Fs之值顯示於(表7)。將放大曲線顯示於圖12。
根據以上結果顯示出，即便在fe之算出使用最終循環之放大反應之95℃的螢光強度值(fden.44)，仍可檢測第2標的。
(實施形態3)
<於Eprobe法檢測黴漿菌P1基因與內部控制>
進行於Eprobe法之黴漿菌P1基因與內部控制的檢測。
於PCR使用之引子與核酸試料是使用與實施形態1相同者。於實施形態3之PCR法使用之探針情報是如(表8)所示。
Figure 105115749-A0202-12-0022-8
Eprobe是參考使用了股份有限公司DNAFORM製作之軟體「Edesign」計算的Tm值，選擇出特定區域。
專一黏著pMYC之Eprobe，即MYC EP，與專一黏著pICM5之Eprobe，即IC EP，的螢光色素是使用D514，且MYC EP是將5’末端起第19個的T進行標記，IC EP是將5’末端起第9個的T進行標記。
Eprobe是委託Eurofins Genomics股份有限公司製作合成。將PCR反應液組成、反應條件顯示於(表9)與(表10)。
[表9]
Figure 105115749-A0202-12-0023-10
Figure 105115749-A0202-12-0023-11
螢光測定時之激發波長與螢光波長的組合是選擇530-548nm。
於實施形態3之Fs是使用以下之演算，其他是進行與實施形態1相同之演算處理。
Fs=Fe-F40
於實施形態3之判定是依以下所示方法進行。第1 標的核酸之有無是將測定試料之F40的值與閾值5進行比較，將[測定試料之F40>閾值5]判定為陽性。
閾值5是使用將陰性對照之F40之平均值+標準差之3倍(以下mean+3SD)的值。
不論第1標的核酸為陽性、陰性，第2標的核酸之有無是將Fs之值與閾值6進行比較，將[Fs>閾值6]判定為陽性。
閾值6是使用僅添加了pMYC之試料的Fs之mean+3SD的值。判定方法之流程圖是如圖13所示。
MYC EP之序列是將Tm值設定成76.4℃，IC EP之序列是將Tm值設定成59.8℃。因此，可推測在PCR中之溫度範圍(從70℃至95℃)，探針是僅有MYC EP會黏著。
又，由於第2標的檢測步驟之螢光測定是在95℃與較IC EP之Tm值還要低之55℃下進行，因此可推測第2標的檢測步驟之測定值是會同時檢測到MYC EP與IC EP之發光。
陰性對照之放大曲線是直到PCR結束之第40循環都未見發光(因F40之值1.007並不高於閾值5之值1.013)，此時之mean+3SD會是1.013，並設為用以檢測第1標的核酸之閾值5，且顯示於(表11)。將放大曲線顯示於圖14。
第1標的核酸之pMYC的放大曲線是從29循環附近可觀察到伴隨MYC EP之黏著的發光，且F40之值2.314是較閾值5還要高，顯示出pMYC之目的區域有放大。
又，此時之Fs的mean+3SD為3.695，並設為用 以檢測第2標的之閾值6，且顯示於(表11)。將放大曲線顯示於圖15。
第2標的核酸之pICM5的放大曲線是在放大反應中完全未見發光(因F40之值1.012並不高於閾值5之值1.013)，Fs之值4.012是較閾值6還要高。
根據此結果顯示出，pMYC之目的區域沒有放大，與pICM5之目的區域有放大。將Fs之值顯示於(表11)。將放大曲線顯示於圖16。
Figure 105115749-A0202-12-0025-12
添加有第1標的核酸之pMYC與第2標的核酸之pICM5兩者時之放大曲線，與pMYC之放大曲線相同，從29循環附近可觀察到伴隨MYC EP之黏著的發光，且F40之值2.355是較閾值5還要高，顯示出pMYC之目的區域有放大。
Fs之值4.254是較閾值6還要高，顯示出pICM5之目的區域有放大。將Fs之值顯示於(表11)。將放大曲線顯示於圖17。
根據以上結果顯示出，於Eprobe法組合探針之設計方法與溫度變化程序，並在置入有1種反應液的1個反應容器使用單一螢光標記，亦可檢測黴漿菌P1基因與內部控 制。
(實施形態4)
<於TaqMan探針法檢測黴漿菌P1基因與內部控制>
進行於TaqMan探針法之黴漿菌P1基因與內部控制的檢測。用於PCR之引子與核酸試料是使用與實施形態1相同者。
於實施形態4之PCR法所使用之探針情報是如(表12)所示。
Figure 105115749-A0202-12-0026-13
TaqMan探針是參考使用了nearest neighbor法計算之Tm值，並選擇出特定區域。
在專一黏著pMYC之TaqMan探針，即MYC Taq，與專一黏著pICM5之TaqMan探針，即IC Taq，的螢光色素，是分別在5’末端標記FAM(註冊商標)、在3’末端標記TAMRA(註冊商標)。
TaqMan探針是委託Takara Bio股份有限公司製作合成。將PCR反應液組成、反應條件顯示於(表13)與(表14)。
[表13]
Figure 105115749-A0202-12-0027-14
Figure 105115749-A0202-12-0027-15
螢光測定時之激發波長與螢光波長的組合是選擇530-548nm。
在放大反應後之用以檢測第2標的之步驟，是在95℃與50℃下進行螢光測定。
在實施形態4，設fhyb.e：第2標的檢測步驟50℃之螢光強度值，其他是進行與實施形態1相同的演算步驟。
實施形態4中的判定方法是進行如下所示方法。第1標的核酸之有無是將測定試料之F44的值與閾值7進行比較，將[測定試料之F44>閾值7]判定為陽性。
閾值7是使用將陰性對照之F44之平均值+標準差之3倍(以下mean+3SD)的值。
不論第1標的核酸為陽性、陰性，第2標的核酸之有無是將Fs之值與閾值8進行比較，將[Fs>閾值8]判定為陽性。
閾值8是使用僅添加了pMYC之試料的Fs之mean+3SD值。
MYC Taq之序列是將Tm值設定成75.8℃，IC Taq之序列是將Tm值設定成53.7℃。因此，可推測在PCR中之溫度範圍(從70℃至95℃)，探針是僅有MYC Taq會黏著。
又，由於第2標的檢測步驟之螢光測定是在95℃與較IC Taq之Tm值還要低之50℃下進行，因此可推測第2標的檢測步驟之測定值是會同時檢測到MYC Taq與IC Taq之發光。
陰性對照之放大曲線是直到PCR結束之第44循環都未見發光(因F44之值1.028並不高於閾值7之值1.028)，此時之mean+3SD會是1.028，並設為用以檢測第1標的核酸之閾值7，且顯示於(表15)。將放大曲線顯示於圖18。
第1標的核酸之pMYC的放大曲線是從28循環附近可觀察到伴隨MYC Taq之黏著的發光，且F44之值1.427較是閾值7還要高，顯示出pMYC之目的區域有放大。
又，此時之Fs的mean+3SD為0.110，並設為用以檢測第2標的之閾值8，且顯示於(表15)。將放大曲線顯示於圖19。
Figure 105115749-A0202-12-0029-16
第2標的核酸之pICM5的放大曲線是在放大反應中完全未見發光(因F44之值1.028並不高於閾值7之值1.028)，Fs之值0.130是較閾值8還要高。
根據此結果顯示出，pMYC之目的區域沒有放大，與pICM5之目的區域有放大。
將Fs之值顯示於(表15)。將放大曲線顯示於圖20。
添加有第1標的核酸之pMYC與第2標的核酸之pICM5兩者時的放大曲線，與pMYC之放大曲線相同，從29循環附近可觀察到伴隨MYC EP之黏著的發光，且F40之值1.348是較閾值7還要高，顯示出pMYC之目的區域有放大。
Fs之值0.177是較閾值8還要高，顯示出pICM5之目的區域有放大。將Fs之值顯示於(表15)。將放大曲線顯示於圖21。
根據以上結果顯示出，於TaqMan探針法組合探 針之設計方法與溫度變化程序，並在置入有1種反應液的1個反應容器使用單一螢光標記，亦可檢測黴漿菌P1基因與內部控制。
(實施形態5)
<於使用了實際檢體之QProbe法檢測黴漿菌P1基因與內部控制>
進行使用了實際檢體之於QProbe法之黴漿菌P1基因與內部控制的檢測。
黴漿菌P1基因是使用了來自利用LAMP法(日本國特許第3313358號)而肺炎支原體被判定為陽性之(檢查是委託股份有限公司BML)咽喉擦拭液，並使用QIAamp(註冊商標)DNA mini Kit(QIAGEN公司)萃取的總DNA。
又，陰性試料方面，是使用了來自利用LAMP法而肺炎支原體被判定為陰性之咽喉擦拭液，並使用QIAamp DNA mini Kit萃取的總DNA。其他條件是與實施形態1相同來實施PCR。
對獲得之原始數據進行與實施形態1相同的演算處理。
以下顯示實施形態5之判定方法。第1標的核酸之有無是將測定試料之F44的值與閾值9進行比較，將[測定試料之F44<閾值9]判定為陽性。
閾值9是使用將陰性試料之F44之平均值-標準差之3倍(以下mean-3SD)的值。
不論第1標的核酸為陽性、陰性，第2標的核酸之 有無是將Fs之值與閾值10進行比較，將[Fs<閾值10]判定為陽性。閾值10是使用陽性試料的Fs之mean-3SD值。
陰性試料之放大曲線是直到PCR結束之第44循環都未見消光(因F44之值0.997並不低於閾值9之值0.997)，此時之mean-3SD會是0.997，並設為用以檢測本例之第1標的之閾值9，且顯示於(表16)。將放大曲線顯示於圖22。
第1標的核酸之陽性試料的放大曲線是從35循環附近可觀察到伴隨MYC QP之黏著的消光，且F44之值0.951是較閾值9還要低，顯示出pMYC之目的區域有放大。
又，此時之Fs的mean-3SD為-0.132，並設為用以檢測第2標的之閾值10，且顯示於(表16)。將放大曲線顯示於圖23。
第2標的核酸之pICM5的放大曲線是在放大反應中完全未見消光(因F44之值0.998並不低於閾值9之值0.997)，Fs之值-0.227是較閾值10還要低。
根據此結果顯示出，pMYC之目的區域沒有放大，而pICM5之目的區域有放大。將Fs之值顯示於(表16)。將放大曲線顯示於圖24。
於第1標的核酸之陽性試料添加有第2標的核酸之pICM5時的放大曲線，與陽性試料之放大曲線相同，從35循環附近可觀察到伴隨MYC QP之黏著的消光，且F44之值0.953是較閾值9還要低，顯示出pMYC之目的區域有放大。
Fs之值-0.235是較閾值10還要低，顯示出pICM5 之目的區域有放大。將Fs之值顯示於(表16)。將放大曲線顯示於圖25。
Figure 105115749-A0202-12-0032-17
根據以上結果顯示出，即便在實際之臨床檢體，組合探針之設計方法與溫度變化程序，並在置入有1種反應液的1個反應容器使用單一螢光色素，亦可檢測黴漿菌P1基因與內部控制。
本發明亦可應用在識別感染症之病原體的亞型或識別單鹼基多型。
(實施形態6)
<於QProbe法檢測披衣菌內生性質體基因與淋病球菌CMT基因>
進行於QProbe法之披衣菌內生性質體基因與淋病球菌CMT基因的檢測。
(pCT)
將披衣菌感染症病原體之砂眼衣原體(Chlamydia trachomatis)共通的內生性質體(pLGV440)基因片段人工合成後，插入至pUC57載體的質體DNA，是委託北海道System Science股份有限公司製作合成。
(pNG)
將淋病病原體之奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)之胞嘧啶DNA甲基轉移酶(cytosine DNA methyltransferase,CMT)基因片段人工合成後，插入至pUC57載體的質體DNA，是委託北海道System Science股份有限公司製作合成。
上述質體之長度，pCT是3064bp、pNG是3059bp。
從各質體之長度與質體溶液之濃度(μg/μl)計算每1μL之複製數後，使用TE緩衝溶液(10mM Tris-HCl、1.0mM EDTA pH8.0)，將pCT、pNG皆稀釋成1×10^5copies/μl。
於實施形態6之PCR法所使用之引子對是如(表17)所示。
Figure 105115749-A0202-12-0033-18
於實施形態6之PCR法所使用之探針情報是如(表18)所示。
Figure 105115749-A0202-12-0033-19
CT QP是從可藉序列編號6與序列編號7之引子對放大之PCR產物的鹼基序列，並參考使用日鐵住金環境股份有限公司J-Bio21中心之首頁上的QProbe設計支援工具計算的Tm值，選擇出特定區域。
NG QP是從可藉序列編號8與序列編號9之引子對放之PCR產物的鹼基序列，並參考使用J-Bio21中心之首頁上的QProbe設計支援工具計算的Tm值，選擇出特定區域。
專一黏著pCT之QProbe，即CT QP，與專一黏著pNG之QProbe，即NG QP，的螢光色素是分別使用BODIPY(註冊商標)FL，並分別將3’末端之C進行標記。
QProbe是委託日鐵住金環境股份有限公司製作合成。將PCR反應液組成、反應條件顯示於(表19)與(表20)。
Figure 105115749-A0202-12-0034-20
[表20]
Figure 105115749-A0202-12-0035-21
螢光測定時之激發波長與螢光波長的組合是選擇510-528nm。
在各循環之變性步驟(95℃)與延長步驟(68℃)測定螢光值，進一步，在放大反應後，在用以檢測第2標的之步驟(95℃與55℃)中進行螢光測定。
對獲得之原始數據進行與實施形態1相同的演算處理。
以下將顯示本實施形態之判定方法。第1標的核酸之有無是將測定試料之F44值與閾值11進行比較，並將[測定試料之F44<閾值11]判定為陽性。
閾值11是使用將陰性對照之F44之平均值-標準差之3倍(以下mean-3SD)的值。
不論第1標的核酸為陽性、陰性，第2標的核酸之有無是將Fs之值與閾值12進行比較，並將[Fs<閾值12]判定為陽性。
閾值12是使用僅添加了pNG之試料的Fs之mean-3SD的值。
CT QP之序列是將Tm值設定成73.4℃，NG QP之 序列是將Tm值設定成62.5℃。因此，可推測在PCR中之溫度範圍(從68℃至95℃)，探針是僅有CT QP會黏著。
又，由於第2標的檢測步驟之螢光測定是在95℃與較NG QP之Tm值還要低之55℃下進行，因此可推測第2標的檢測步驟之測定值是會同時檢測到CT QP與NG QP之發光。
陰性對照之放大曲線是直到PCR結束之第44循環都未見消光(因F44之值0.998並不低於閾值11之值0.996)，此時之mean-3SD會是0.996，並設為用以檢測本例之第1標的之閾值11，且顯示於(表21)。將放大曲線顯示於圖26。
第1標的核酸之pCT的放大曲線是從28循環附近可觀察到伴隨CT QP之黏著的消光，且F44之值0.720是較閾值11還要低，顯示出pCT之目的區域有放大。
又，此時之Fs的mean-3SD為-0.039，並設為用以檢測第2標的之閾值12，且顯示於(表21)。將放大曲線顯示於圖27。
第2標的核酸之pNG的放大曲線是在放大反應中完全未見消光(因F44之值0.998並不低於閾值11之值0.996)，Fs之值-0.065是較閾值12還要低。
根據此結果顯示出，pCT之目的區域沒有放大，與pNG之目的區域有放大。將Fs之值顯於(表21)。將放大曲線顯示於圖28。
[表21]
Figure 105115749-A0202-12-0037-22
添加有第1標的核酸之pCT與第2標的核酸之pNG兩者時之放大曲線，與pCT之放大曲線相同，從28循環附近可觀察到伴隨CT QP之黏著的消光，且F44之值0.729是較閾值11還要低，顯示出pCT之目的區域有放大。
Fs之值-0.111是較閾值12還要低，顯示出pNG之目的區域有放大。將Fs之值顯示於(表21)。將放大曲線顯示於圖29。
根據以上結果顯示出，即便於2項目之基因中，組合探針之設計方法與溫度變化程序，並在置入有1種反應液的1個反應容器使用單一螢光色素，亦可檢測黴漿菌P1基因與內部控制。
(實施形態7)
<在放大反應中檢測複數次第2標的之於QProbe法檢測黴漿菌P1基因與內部控制>
不僅將第2標的檢測步驟在最終循環之後進行，亦以插入於放大反應中之方法進行於QProbe法之黴漿菌P1基因與內部控制的檢測。
於PCR使用之引子、探針、反應液組成與核酸試 料是使用與實施形態1相同者。反應條件是如(表22)所示。
Figure 105115749-A0202-12-0038-23
又，將放大反應之溫度變化圖表化顯示於圖30。
在實施形態7之分析中是進行以下之演算，其他則進行與實施形態1相同之步驟。
fen=fhyb.en/fden.en (數4)
fen：根據(數4)算出之在第n次第2標的檢測步驟中的螢光強度值
fhyb.en：第n次第2標的檢測步驟55℃之螢光強度值
fden.en：第n回次第2標的檢測步驟95℃之螢光強度值
Fen=fen/f10 (數5)
Fen：將第10循環之根據(數4)所得螢光強度值設定成1時之第n次第2標的檢測步驟之相對值
Fs1=Fe1-F20 (數6)
Fs2=Fe2-F27 (數6’)
Fs3=Fe3-F34 (數6”)
Fs4=Fe4-F41 (數6''')
Fs1：第1次第2標的檢測步驟之測定值
Fs2：第2次第2標的檢測步驟之測定值
Fs3：第3次第2標的檢測步驟之測定值
Fs4：第4次第2標的檢測步驟之測定值
判定是以下述所示方法進行。第1標的核酸之有無是將測定試料之F41值與閾值13進行比較，並將[測定試料之F41<閾值13]判定為陽性。
閾值13是使用將陰性對照之F41之平均值-標準差之3倍(以下mean-3SD)的值。
第2標的核酸之有無，在第1次第2標的檢測步驟是將[Fs1<閾值14]判定為陽性。
閾值14是使用僅添加有pMYC之試料的Fs1之 mean-3SD值。
在第2次第2標的檢測步驟是將[Fs2<閾值15]判定為陽性。
閾值15是使用僅添加有pMYC之試料的Fs2之mean-3SD值。
在第3次第2標的檢測步驟是將[Fs3<閾值16]判的為陽性。
閾值16是使用僅添加有pMYC之試料的Fs3之mean-3SD值。
在第4次第2標的檢測步驟是將[Fs4<閾值17]判定為陽性。
閾值17是使用僅添加有pMYC之試料的Fs4之mean-3SD值。
陰性對照之放大曲線，在各第2標的檢測步驟之外，是直到PCR結束之第41循環都未見消光(因F41之值0.999並不低於閾值13之值0.998)，此時之mean-3SD會是0.998，並設為用以檢測本例之第1標的檢測之閾值13，且顯示於(表23)。將放大曲線顯示於圖31。
第1標的核酸之pMYC的放大曲線是從30循環附近可觀察到伴隨MYC QP之黏著的消光，且F41之值0.892是較閾值13還要低，顯示出pMYC之目的區域有放大。
又，此時之Fs1的mean-3SD為-0.058、Fs2的mean-3SD為-0.070、Fs3的mean-3SD為-0.080、Fs4的mean-3SD為-0.087，且分別設為用以檢測第2標的之閾值14、 15、16、17，並顯示於(表23)。將放大曲線顯示於圖32。
Figure 105115749-A0202-12-0041-24
第2標的核酸之pICM5的放大曲線，在各第2標的檢測步驟之外，在放大反應中是完全未見消光(因F41之值0.999並不低於閾值13之值0.998)，Fs1之值-0.058是較閾值14還要高，顯示出pICM5之目的區域直到第1次第2標的檢測步驟並未放大到檢測界限以上。
Fs2之值-0.057亦較閾值15還要高，顯示出pICM5之目的區域直到第2次第2標的檢測步驟並未放大到檢測界 限以上。
Fs3之值-0.084是較閾值16還要低，顯示出pICM5之目的區域直到第3次第2標的檢測步驟放大到檢測界限以上。
Fs4之值-0.192亦較閾值17還要低。將Fs1、Fs2、Fs3、Fs4之值顯示於(表23)。將放大曲線顯示於圖33。
添加有第1標的核酸之pMYC與第2標的核酸之pICM5兩者時之放大曲線，與pMYC之放大曲線相同，從30循環附近可觀察到伴隨MYC QP之黏著的消光，且F41之值0.897是較閾值13還要低，顯示出pMYC之目的區域有放大。
Fs1之值-0.058是較閾值14還要高，顯示出pICM5之目的區域直到第1次第2標的檢測步驟並未放大到檢測界限以上。
Fs2之值-0.068亦較閾值15還要高，顯示出pICM5之目的區域直到第2次第2標的檢測步驟並未放大到檢測界限以上。
Fs3之值-0.109是較閾值16還要低，顯示出pICM5之目的區域直到第3次第2標的檢測步驟放大到檢測界限以上。
Fs4之值-0.154亦較閾值17還要低。Fs1、Fs2、Fs3、Fs4之值是如(表23)所示。將放大曲線顯示於圖34。
根據以上結果顯示出，不僅將第2標的檢測步驟在最終循環之後，於插入至放大反應中之方法亦可檢測黴 漿菌P1基因與內部控制。
圖式簡單說明
圖1是顯示本發明實施形態1中混合液之溫度變化的圖表。
圖2是本發明實施形態1中螢光測定之時間說明圖。
圖3是顯示本發明實施形態1中判定方法的流程圖。
圖4是顯示本發明實施形態1中陰性對照之螢光強度變化的圖表。
圖5是顯示本發明實施形態1中第1標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖6是顯示本發明實施形態1中第2標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖7是顯示本發明實施形態1中第1、第2標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖8是本發明實施形態2中螢光測定的時間說明圖。
圖9是顯示本發明實施形態2中陰性對照之螢光強度變化的圖表。
圖10是顯示本發明實施形態2中第1標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖11是顯示本發明實施形態2中第2標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖12是顯示本發明實施形態2中第1、第2標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖13是顯示本發明實施形態3中判定方法的流程圖。
圖14是顯示本發明實施形態3中陰性對照之螢光強度變化的圖表。
圖15是顯示本發明實施形態3中第1標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖16是顯示本發明實施形態3中第2標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖17是顯示本發明實施形態3中第1、第2標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖18是顯示本發明實施形態4中陰性對照之螢光強度變化的圖表。
圖19是顯示本發明實施形態4中第1標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖20是顯示本發明實施形態4中第2標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖21是顯示本發明實施形態4中第1、第2標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖22是顯示本發明實施形態5中陰性對照之螢光強度變化的圖表。
圖23是顯示本發明實施形態5中第1標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖24是顯示本發明實施形態5中第2標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖25是顯示本發明實施形態5中第1、第2標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖26是顯示本發明實施形態6中陰性對照之螢光強度變化的圖表。
圖27是顯示本發明實施形態6中第1標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖28是顯示本發明實施形態6中第2標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖29是顯示本發明實施形態6中第1、第2標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖30是顯示本發明實施形態7中混合液之溫度變化的圖表。
圖31是顯示本發明實施形態7中陰性對照之螢光強度變化的圖表。
圖32是顯示本發明實施形態7中第1標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖33是顯示本發明實施形態7中第2標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖34是顯示本發明實施形態7中第1、第2標的核酸之螢光強度變化的圖表。
圖35是本發明實施形態1中溫度變化的擴大圖。
圖36是顯示本發明實施形態1中混合液成分的說明圖。
圖37(a)本發明實施形態1中變性步驟的說明圖，圖37(b)是本發明實施形態1中黏著步驟的說明圖，圖37(c)是本發明實施形態1中延長步驟的說明圖，圖37(d)是本發明實施形態 1中延長結束步驟的說明圖。
圖38(a)是本發明實施形態1中變性步驟的說明圖，圖38(b)是本發明實施形態1中黏著步驟的說明圖。
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<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 肺炎支原體
<400> 1
Figure 105115749-A0202-12-0047-25
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 肺炎支原體
<400> 2
Figure 105115749-A0202-12-0048-26
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 肺炎支原體
<400> 3
Figure 105115749-A0202-12-0048-27
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 隨機序列
<400> 4
Figure 105115749-A0202-12-0049-28
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 隨機序列
<400> 5
Figure 105115749-A0202-12-0049-29
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 砂眼衣原體
<400> 6
Figure 105115749-A0202-12-0049-30
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> 砂眼衣原體
<400> 7
Figure 105115749-A0202-12-0050-31
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 奈瑟氏球菌
<400> 8
Figure 105115749-A0202-12-0050-32
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 奈瑟氏球菌
<400> 9
Figure 105115749-A0202-12-0051-33
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 砂眼衣原體
<400> 10
Figure 105115749-A0202-12-0051-34
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 奈瑟氏球菌
<400> 11
Figure 105115749-A0202-12-0051-35
1‧‧‧容器
2‧‧‧溶液
10‧‧‧第1標的核酸
11‧‧‧第1標的核酸之第1單股
12‧‧‧第1標的核酸之第2單股
13‧‧‧第1標的用F引子
14‧‧‧第1標的用R引子
15‧‧‧第1標的用探針
16‧‧‧第1標記物
20‧‧‧第2標的核酸
21‧‧‧第2標的核酸之第1單股
22‧‧‧第2標的核酸之第2單股
23‧‧‧第2標的用F引子
24‧‧‧第2標的用R引子
25‧‧‧第2標的用探針
26‧‧‧第2標記物
30‧‧‧DNA聚合酶
31‧‧‧去氧核糖核苷三磷酸

Claims (6)

  1. 一種複數個標的核酸之檢測套組，其特徵在於，令變性溫度為T0、黏著溫度為T1、延長溫度為T2、第2標的檢測溫度為T3時，設定溫度滿足T0>T2≧T1>T3，於可含有在前述變性溫度T0下，雙股之氫鍵被切斷而分別解離成2條單股之第1標的核酸及第2標的核酸的溶液中，含有下述組分：第1標的用引子，其在前述黏著溫度T1下，對前述第1標的核酸解離成的2條單股之任一者專一結合；第2標的用引子，其在前述黏著溫度T1下，對前述第2標的核酸解離成的2條單股之任一者專一結合；第1標的用探針，其在前述黏著溫度T1下，對前述第1標的核酸解離成的2條單股之任一者專一結合，且具有螢光訊號因結合而變化之第1標記物；DNA聚合酶；去氧核糖核苷三磷酸，其在前述延長溫度T2下，透過前述DNA聚合酶之作用，結合至前述第1標的核酸解離成的2條單股及前述第2標的核酸解離成的2條單股；第2標的用探針，其在前述黏著溫度T1下，不結合至前述第1標的核酸解離成的2條單股及前述第2標的核酸解離成的2條單股之任一者，且在前述第2標的檢測溫度T3下，對前述第2標的核酸解離成的2條單股之任一者專一結合，並且具有螢光訊號因結合而變化之第2標記 物；前述第1標的與前述第2標的互異，且前述第2標的用引子與前述第2標的用探針具有不同序列。
  2. 如請求項1之複數個標的核酸之檢測套組，其中前述螢光訊號是黏著即消光者。
  3. 如請求項1之複數個標的核酸之檢測套組，其中前述螢光訊號是黏著即發光者。
  4. 如請求項1至3中任一項之複數個標的核酸之檢測套組，其中前述第1標的核酸為黴漿菌P1基因，前述第2標的核酸為內部控制。
  5. 如請求項1至3中任一項之複數個標的核酸之檢測套組，其中前述第1標的核酸為披衣菌內生性質體基因，前述第2標的核酸為淋病球菌CMT基因。
  6. 一種使用如請求項1至5中任一項之測定複數個標的核酸之檢測套組的檢測方法，其含有下述步驟：解離步驟，其是將前述溶液之溫度提升至前述變性溫度T0，使疑似含有之前述第1標的核酸及前述第2標的核酸分別解離成2條單股；第1標的核酸檢測步驟，其是將前述溶液之溫度降至前述黏著溫度T1，並基於源自前述第1標的用探針之螢光訊號，檢測第1標的核酸之存在與否；放大步驟，其是將前述溶液之溫度調整成前述延長溫度T2後，將疑似含有之前述第1標的核酸及前述第2標的核酸解離，並將各個2條單股放大成雙股之第1標的 核酸及第2標的核酸；第2標的核酸檢測步驟，其是將前述溶液之溫度降至前述第2標的檢測溫度T3，並基於源自前述第2標的用探針之螢光訊號，檢測第2標的核酸之存在與否；前述第1標的與前述第2標的互異，且前述第2標的用引子與前述第2標的用探針具有不同序列。
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