CN108034698A - 一种恒温固相重组杂交方法 - Google Patents

一种恒温固相重组杂交方法 Download PDF

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李博安
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Abstract

本发明公开一种恒温固相重组杂交方法，所述重组杂交方法包括以下步骤：(1)用标记引物扩增待测靶标核酸序列，产生标记双链靶标核酸；(2)将单链DNA探针嵌入或者吸附于固相介质表面，所述探针包含与待检测的标记双链靶标核酸序列互补的核酸序列；(3)水化步骤(2)中的固相介质表面，释放探针；(4)使探针与靶标核酸发生特异性重组杂交；(5)去除未杂交的或者非特异性杂交的扩增核酸产物；(6)加入针对靶标核酸标记物的结合物‑呈色剂复合体，结合相应的标记靶标核酸并呈色；(7)根据呈色情况检测样品中是否含有靶标核酸。本发明的重组杂交方法大幅减少了操作时间、步骤和复杂度。

Description

一种恒温固相重组杂交方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种恒温固相重组杂交方法。
背景技术
杂交技术被广泛应用于实验室研究和医疗诊断中，成功的杂交程序至少部分依赖于所使用的探针处于适当的、精确测量的浓度。当杂交反应处于一种不适当的条件下，不准确的结果包括假阳性或者假阴性会频繁发生。
标准的杂交程序通常包括以下几个步骤：(a)95℃高温使核苷酸探针变性。(b)在冰上激冷以防止探针退火。(c)在温度范围55-62℃过夜杂交(Sambrook and Russell,supra；Ausubel et al.,supra.See also Tijssen,Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology,Vol.24:Hybridization with Nucleic AcidProbes(Elsevier,NY 1993))。典型的杂交反应需要消耗时间以及大量的人工。并且，根据探针序列的不同杂交温度必须优化，前者往往依赖于存在于靶标基因序列的胞嘧啶和鸟嘌呤的百分比。这种温度的优化发生于每种分析用的探针，需要大量的尝试和误差测试。对于实施多重靶点同时杂交检测，这种方法就非常困难。
有鉴于此，发展一种简单可靠、不需要消耗时间和复杂步骤的杂交方法成为必须，这里我们发明了一种新的重组杂交方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足而提供一种恒温固相重组杂交方法，大幅减少了操作时间、步骤和复杂度，可以在固相表面方便快速地决定靶点核酸是否存在于检测样品中。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种恒温固相重组杂交方法，包括以下步骤：
(1)用标记引物扩增待测靶标核酸序列，产生标记双链靶标核酸；
(2)将单链DNA探针嵌入或者吸附于固相介质表面，所述探针包含与待检测的标记双链靶标核酸序列互补的核酸序列；
(3)水化步骤(2)中的固相介质表面，释放探针；
(4)将步骤(1)中扩增的标记双链靶标核酸与含有重组酶的恒温杂交缓冲液在固相介质表面共孵育，使探针与靶标核酸发生特异性重组杂交；
(5)去除未杂交的或者非特异性杂交的扩增核酸产物；
(6)加入针对靶标核酸标记物的结合物-呈色剂复合体，结合相应的标记靶标核酸并呈色；
(7)根据呈色情况检测样品中是否含有靶标核酸。
上述技术方案提供的恒温杂交方法可以在固相表面方便快速地决定靶点核酸是否存在于检测样品中。目前常规应用的温度依赖型杂交方法中，需要升温变性、降温退火、配对杂交等复杂过程，通常需要耗时3个小时以上。在进行多重或者大量目标同时检测时，每一个探针的长度需要进行反复测试以保证杂交温度一致，最终的杂交效果难以保证。该发明的重组杂交方法大幅减少了操作时间、步骤和复杂度，其要点在于，该发明中使用的重组酶能够迅速解开双链DNA，并且在基于同源重组的原理上特异性地将探针与靶标DNA序列配对，这样就允许核酸杂交反应在宽恒温条件(40±2℃)下发生于每一个序列形态的探针，这可以避免为每一个检测的探针优化杂交温度，从而可以非常容易地同时进行大量靶标的杂交检测，整个反应时间可以在20-25分钟内完成。
作为本发明所述的恒温固相重组杂交方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，采用多聚酶链式反应或恒温核酸扩增法扩增待测靶标核酸序列。
作为本发明所述的恒温固相重组杂交方法的优选实施方式，所述固相介质包括塑料板、玻璃片或硝酸纤维素膜。
作为本发明所述的恒温固相重组杂交方法的优选实施方式，所述固相介质表面包括鲑鱼精子DNA、封闭剂和抗菌剂中的至少一种。
作为本发明所述的恒温固相重组杂交方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，采用水化溶液水化步骤(2)中的固相介质表面，所述水化溶液由下述浓度的组分构成：硫酸葡聚糖10～20wt％和PBS缓冲液10mM。
作为本发明所述的恒温固相重组杂交方法的优选实施方式，所述探针为DNA寡核苷酸探针。
作为本发明所述的恒温固相重组杂交方法的优选实施方式，所述DNA寡核苷酸探针的长度为20～50nt且在5’端带有60个多聚T核苷酸；所述DNA寡核苷酸探针经254nm紫外线辐照10min，辐照强度为0.3J/cm2，固化在固相介质表面。
作为本发明所述的恒温固相重组杂交方法的优选实施方式，所述标记物包括生物素、地高辛或荧光染料。
作为本发明所述的恒温固相重组杂交方法的优选实施方式，所述杂交缓冲液包括重组酶和PBS缓冲液，所述杂交缓冲液pH值为7.5，温度为40±2℃。
作为本发明所述的恒温固相重组杂交方法的优选实施方式，所述结合物包括链霉亲和素、抗地高辛或荧光染料的抗体；呈色剂包括胶乳或胶体金。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明的重组杂交方法大幅减少了操作时间、步骤和复杂度。本发明通过使用重组酶能够迅速解开双链DNA，并且在基于同源重组的原理上特异性地将探针与靶标DNA序列配对，这样就允许核酸杂交反应在宽恒温条件(40±2℃)下发生于每一个序列形态的探针，这可以避免为每一个检测的探针优化杂交温度，从而可以非常容易地同时进行大量靶标的杂交检测，整个反应时间可以在20-25分钟内完成。
附图说明
图1为本发明重组酶恒温杂交反应流程原理示意图。这里重组酶与单链DNA探针相互作用形成单链DNA探针-重组酶复合体，然后扫描标记双链靶标核酸序列并帮助探针结合靶标序列，同时也以同源重组方式替换掉非模板链。
图2为本发明一个实施案例示意图:(a)整个芯片布局了3个靶标基因(ERBB2,EGFRand AKT2)的检测。(b)靶标基因(ERBB2,EGFR and AKT2)被恒温杂交检测显示阳性结果的案例。(c)特异性单链DNA探针被固定在固相介质上的案例。
图3为本发明一个实施方案流程图:(a)单链DNA探针被嵌入或者吸附于固相介质表面；(b)用单侧标记引物扩增待检测靶标核酸序列；(c,d)水化并加入含有重组酶的恒温杂交缓冲液，进行恒温杂交；(e,f)漂洗介质表面以去除未杂交的或者非特异性杂交的扩增DNA产物，并将针对靶标核酸产物标记物的结合(抗体)-呈色剂复合体加到固相表面以结合相应的标记靶标核酸并呈色。
图4为本发明的一个实施案例结果图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
图1为本发明重组酶恒温杂交反应流程原理示意图。
本发明提供一种恒温固相重组杂交方法，包括以下步骤：
(1)用标记引物扩增待测靶标核酸序列，产生标记双链靶标核酸；
(2)将单链DNA探针嵌入或者吸附于固相介质表面，所述探针包含与待检测的标记双链靶标核酸序列互补的核酸序列；
(3)水化步骤(2)中的固相介质表面，释放探针；
(4)将步骤(1)中扩增的标记双链靶标核酸与含有重组酶的恒温杂交缓冲液在固相介质表面共孵育，使探针与靶标核酸发生特异性重组杂交；
(5)去除未杂交的或者非特异性杂交的扩增核酸产物；
(6)加入针对靶标核酸标记物的结合物-呈色剂复合体，结合相应的标记靶标核酸并呈色；
(7)根据呈色情况检测样品中是否含有靶标核酸。
在将非结合的物质洗去之后，结合于扩增双链DNA产物-互补杂交靶标核酸探针的呈色剂可以由肉眼以及光学设备探测到。
该发明中，适合的DNA扩增技术包括但不限于多聚酶链式反应(PCR)，或者恒温DNA扩增技术(例如重组酶多聚酶扩增技术RPA)。该发明中，标记在引物上的适合的标记物可以是但不限于生物素，地高辛或者荧光染料(如FAM，TAMRA)。该发明中，恒温杂交在固相进行。适合的固相表面可以是但不限于显微镜载片(玻璃载片、塑料载片、石英载片)、盖玻片、纤维素基材料(如纤维素、硝酸纤维素、羧甲基纤维素、人造纤维丝、纤维胶)以及多壁板(如微孔板)，最佳选择为探针粘贴或者吸附于微孔板。该发明方法适合的检测样品包括比如扩增的DNA产物以及染色体样品。该发明在一个实施方案中的检测样品可以包括一个单一靶标核酸，或者多个靶标核酸(例如二个或者多个以及大量不同的靶标核酸)。靶标核酸可以是DNA或者RNA，也可以是基因内、基因间和/或转基因核酸序列。因此，靶标核酸可以是内源基因核酸序列，也可以是人工或者外源(如转基因)核酸序列。
探针可以被选择性预先处理，以使检测样品中的靶标核酸易于接近探针或者易于接近固相基质。这样的预处理可以包括比如将30-50胸腺嘧啶核苷酸或者隔离子(氨基酸)加到探针的末端。该发明方法中有用的探针部分由核苷酸序列组成，也被称为靶标结合区域，其在本质上互补于样品中一个靶标核酸中的一段核苷酸序列。在一个特定的实施方案中，该发明方法中使用的探针是寡聚核苷酸探针(例如单链DNA寡聚核苷酸探针)。典型的寡聚核苷酸探针为线性的长度为20-100个核苷酸，30-50核苷酸最佳。在某个特定的实施方案中，我们使用的寡聚核苷酸探针长度为40个。该发明方法中使用的探针包括但不限于DNA探针、RNA探针、肽核酸(PNA)探针、锁核酸(LNA)探针、吗啉代核酸探针、乙二醇核酸(GNA)探针、苏糖核酸(TNA)探针。这些探针能够经由化学性或者生化性修饰，和/或可以含有非天然的或衍生的核苷酸碱基。例如，一个探针含有的修饰核苷酸可以已经被修饰过碱基(比如5’-甲基化胞嘧啶)、和/或修饰过糖基(2’-甲氧基核糖、2’-甲氧乙基核糖、2’-氟核糖、2’-氨基核糖)。尽管线性化探针最佳，有用的探针可以是环状、分支状、和/或包括能形成结构域的稳定二级结构(比如茎-环结构以及环-茎-环结构)。该发明方法中产生有用探针的方法在行业中是众所周知的，包括像生化、重组、合成(如化学合成)以及半合成方法。在一个实施方案中，本发明方法中应用的寡核苷酸探针由化学合成产生。合成的寡核苷酸探针可以由已知的核酸合成方法产生(详见Glick and Pasternak,Molecular Biotechnology:Principles and Applications of Recombinant DNA(ASM Press 1998))。比如，可以应用液相或固相技术，合成程序通常可以自动进行，并包含亚磷酰胺、亚磷酸三酯、六氟磷酸盐以及磷酸三酯等方法。
适合附着于引物的可检测标记可以是直接标记也可以是间接标记。典型的间接标记包括像半抗原、生物素、或者其它可特异性结合的配体。对于间接标记来说，配体结合的伴随物通常含有直接标记，或者也可以是间接标记。间接标记为半抗原的例子中包括二硝基酚(DNP)、地高辛、生物素、以及各种荧光染料(如fluorescein,DY490,DY590,Alexa 405/Cascade blue,Alexa 488,Bodiby FL,Dansyl,Oregon Green,Lucifer Yellow,Tetramethylrhodamine/Rhodamine Red,and Texas Red)。作为间接标记，半抗原通常以抗半抗原抗体作为配体结合伴随物来检测。然而，半抗原也可以用其它配体结合伴随物来检测(比如，在使用生物素时，抗生物素抗体或者链霉亲和素可被当作配体结合伴随物来使用。进一步，在一些实施方案中，半抗原也可被直接检测(比如，在使用荧光素时，抗荧光素抗体或直接检测荧光可以被使用)。
在其它实施方案中，固相基质中还包含有一种或者更多的试剂嵌入或者吸附于基质中。这些试剂包括，比如鲑鱼精子DNA、封闭剂(如脱脂牛奶、白蛋白、酪蛋白)以及抗菌剂(如叠氮化钠、硫汞撒)，或者这些试剂的组合。
根据本发明，固相基质要被水化，以使探针在与可能存在于样品中的靶标核酸杂交之前，从基质中暴露出来。在一个实施方案中，固相基质可在其接触杂交缓冲液后立即被水化。最佳情形下杂交缓冲液组份含有33mM NaCl,50mM Tris-HCl,10mM MgCl2,pH 7～8。在一个特定的实施方案中，用于固相基质水化的水化缓冲液也被用做杂交缓冲液。本发明方法进一步的组成步骤是，在恒温条件下将检测样品与探针孵育，在靶标核酸存在于样品中时，可使探针与之发生特异性杂交。总体来讲，杂交在恒温条件下进行，温度范围为38℃～42℃。
对于一个给定靶标序列及其互补探针来说，最佳杂交条件依赖于多种因素，比如盐浓度、孵育时间，以及探针的浓度、组份、长度，这可以被行业中使用的普通技术所鉴定。基于这些以及其它已知因素，适宜的结合条件可以很容易的被行业中使用的一种普通技术所确定。如果需要，可以根据目前的方法将其优化使用。通常，杂交在恒温条件下进行(比如40±2℃)，体系中也含有重组酶以使探针与潜在的互补序列结合。杂交的严格性可以根据情况增加或者减少，以特异性的检测100％互补的靶标核酸或者检测小于100％互补的相关靶标核酸(比如70％、80％、90％互补性)。众多因素可以改变以产生低、中、高杂交严格性，这些因素包括探针序列长度、性质(DNA,RNA,碱基组成)、靶标核苷酸序列性质(DNA,RNA,碱基组成，以溶解或者固相存在)、盐浓度以及杂交缓冲液中其它组份(比如硫酸葡聚糖、聚乙二醇和/或盐的浓度)。这些条件可以根据核苷酸碱基组成、长度、以及使用环境而改变，改变时即可根据经验也可根据决定这些变量的公式进行。最佳的杂交条件包括在组成为33mMNaCl,50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，以及pH 7.5±0.5的杂交缓冲液中40±2℃，恒温杂交10～15分钟。
根据本发明，样品在杂交步骤后要进行洗脱以去除未杂交的扩增的标记物标记的DNA产物。洗脱是在有适合严格性的溶液中进行的，以去除未结合的和/或非特异性结合的标记物标记的DNA产物。一个适宜的严格性可以根据用依次增高严格性的溶液洗脱样品，并在每次洗脱间读取信号强度来决定。在固相恒温杂交方法中适合的洗脱缓冲液在行业中通常时已知的。例如，洗脱缓冲液通常包括一种或者多种盐(如钠盐、锂盐、钾盐)以及一种或者多种去污剂(如离子去污剂、非离子去污剂)。洗脱缓冲液中适合的去污剂包括但不限于SDS,Triton X-100,Tween 20,NP-40,或Igepal CA-630.最佳情形是，洗脱缓冲液含有一种或多种盐(如柠檬酸钠)，其总浓度为0.03～0.09M，以及0.1wt％SDS。在一个特定实施方案中，洗脱缓冲液含有2×SSC。洗脱的次数和每次洗脱时间可很容易的由行业中一种常规技术来确定。本发明方法中典型的洗脱条件包括，例如，用2×SSC进行杂交后的室温(约25℃)初次洗脱5分钟，然后进行一次或多次室温下0.03M到0.09M单价盐(如SSC)加0.1wt％SDS洗脱至少2分钟，最好每次洗脱2到5分钟。
实施例1
一个固相恒温重组酶依赖的杂交方法检测人细胞中erb-b2受体酪氨酸激酶(ERBB2)、表皮生长因子(EGFR)、丝/苏氨酸激酶(AKT2)的基因。
本实施例涉及到一个方法以检测人细胞中erb-b2受体酪氨酸激酶(ERBB2)、表皮生长因子(EGFR)、丝/苏氨酸激酶(AKT2)的基因。最佳的情形是，细胞为表皮细胞(如尿道上皮细胞)或者外周血细胞。在一个实施方案中，基因组DNA由行业中的常规技术酚－氯仿－异丙醇法提取。该方法步骤包含将特异性探针包被在微量滴定板小孔中，这样，为探测样品中一种或多种靶基因序列的合成DNA寡核苷酸探针就被嵌入或吸附于基质中。寡核苷酸探针包含有能与靶基因序列互补的核苷酸序列。最佳情形是，寡核苷酸探针为ERBB2，EGFR，AKT2基因特异性探针。在一个实施方案中，寡核苷酸探针长度在20到40个核苷酸，在其5’端带有60个胸腺嘧啶核苷酸。
该方法进一步包含将基质用杂交缓冲液水化，以使探针暴露到表面。在一个特定实施方案中，杂交缓冲液含有硫酸葡聚糖和盐(如柠檬酸钠盐(SSC)，PBS)。最佳情形是，杂交缓冲液含有10wt％到20wt％硫酸葡聚糖，1×PBS，pH 7到8。
该方法进一步包含将扩增并标记的基因组DNA和探针在恒温条件下进行孵育，使得在靶基因序列存在于样品中的情况下，探针能与之特异性杂交。在一个实施方案中，杂交在40±2℃温度下进行，杂交缓冲液含有1×PBS,1IU重组酶以及20wt％硫酸葡聚糖，时间5-10分钟。
该检测ERBB2,EGFR,AKT2基因的方法进一步包含如下几个步骤：洗脱样品以去除未杂交的标记的扩增DNA片段、检测沉积在微量滴定板小孔中特定位置的乳胶以探测样品中的ERBB2，EGFR，AKT2基因。洗脱以及检测可以根据上述的确定靶标核酸是否存在于一个生物样品中的方法进行。
1、在微量滴定板上制备探针
该方法使用96孔微量滴定板(Nunc)。ERBB2,EGFR,以及AKT2基因特异性寡核苷酸探针分别被置于5-10μL体积中并沉积于微孔的特定位置，寡核苷酸探针经254nm，200mJ的UV照射10min交联，辐照强度为0.3J/cm2。
2、用固相恒温重组酶依赖的杂交方法检测生物样品中的靶标核酸
嵌入探针的微孔板采用上述的方法制备，用杂交缓冲液重新水化。用恒温温度40±2℃，在含有10wt％硫酸葡聚糖，1IU重组酶，1×PBS的杂交缓冲液中杂交15～25分钟。杂交之后，微孔板用1×PBS在室温下摇动洗脱5分钟，以去除未杂交的和非特异性杂交的标记的扩增DNA片段。链霉亲和素螯合的胶乳被加入微孔以结合标记在引物上的生物素。在洗脱未结合的胶乳后，如果特异性基因片段互补杂交于相应探针，则沉积在特定位置的胶乳会被检测出信号。应用上述检测手段，一组嵌入微量滴定板微孔中的ERBB2,EGFR,以及AKT2基因特异性探针能够被成功的应用于恒温固相杂交，以检测人上皮细胞中的ERBB2,EGFR,以及AKT2基因特异性靶核酸(图2、图3、图4)。
本实施例中应用的引物与探针序列如表1所述
表1
综上所述，本发明通过使用重组酶能够迅速解开双链DNA，并且在基于同源重组的原理上特异性地将探针与靶标DNA序列配对，这样就允许核酸杂交反应在宽恒温条件(40±2℃)下发生于每一个序列形态的探针，这可以避免为每一个检测的探针优化杂交温度，从而可以非常容易地同时进行大量靶标的杂交检测，整个反应时间可以在20～25分钟内完成，大幅减少了操作时间、步骤和复杂度。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种恒温固相重组杂交方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用标记引物扩增待测靶标核酸序列，产生标记双链靶标核酸；
(2)将单链DNA探针嵌入或者吸附于固相介质表面，所述探针包含与待检测的标记双链靶标核酸序列互补的核酸序列；
(3)水化步骤(2)中的固相介质表面，释放探针；
(4)将步骤(1)中扩增的标记双链靶标核酸与含有重组酶的恒温杂交缓冲液在固相介质表面共孵育，使探针与靶标核酸发生特异性重组杂交；
(5)去除未杂交的或者非特异性杂交的扩增核酸产物；
(6)加入针对靶标核酸标记物的结合物-呈色剂复合体，结合相应的标记靶标核酸并呈色；
(7)根据呈色情况检测样品中是否含有靶标核酸。
2.根据权利要求1所述的恒温固相重组杂交方法，其特征在于，所述步骤(1)中，采用多聚酶链式反应或恒温核酸扩增法扩增待测靶标核酸序列。
3.根据权利要求1所述的恒温固相重组杂交方法，其特征在于，所述固相介质包括塑料板、玻璃片或硝酸纤维素膜。
4.根据权利要求1所述的恒温固相重组杂交方法，其特征在于，所述固相介质表面包括鲑鱼精子DNA、封闭剂和抗菌剂中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的恒温固相重组杂交方法，其特征在于，所述步骤(2)中，采用水化溶液水化步骤(2)中的固相介质表面，所述水化溶液由下述浓度的组分构成：硫酸葡聚糖10～20wt％和PBS缓冲液10mM。
6.根据权利要求1所述的恒温固相重组杂交方法，其特征在于，所述探针为DNA寡核苷酸探针。
7.根据权利要求6所述的恒温固相重组杂交方法，其特征在于，所述DNA寡核苷酸探针的长度为20～50nt且在5’端带有60个多聚T核苷酸；所述DNA寡核苷酸探针经254nm紫外线辐照10min，辐照强度为0.3J/cm2，固化在固相介质表面。
8.根据权利要求1所述的恒温固相重组杂交方法，其特征在于，所述标记物包括生物素、地高辛或荧光染料。
9.根据权利要求1所述的恒温固相重组杂交方法，其特征在于，所述杂交缓冲液包括重组酶和PBS缓冲液，所述杂交缓冲液pH值为7.5，温度为40±2℃。
10.根据权利要求1所述的恒温固相重组杂交方法，其特征在于，所述结合物包括链霉亲和素、抗地高辛或荧光染料的抗体；呈色剂包括胶乳或胶体金。
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