CN112980926A - 一种去除核酸检测背景的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种去除核酸检测背景的方法及其应用，所述去除核酸检测背景的方法包括：在扩增引物上连接标记物，扩增目标片段，再将所得扩增产物进行解链；将所得解链后的扩增产物和连接标记物的扩增引物转移至表面连接探针的基底上，孵育，所述解链后的扩增产物与所述基底表面的探针结合；而后，记录所述标记物的运动轨迹，根据所述运动轨迹判定检测信号的种类。本发明通过观察标记物在加热条件下的运动轨迹，可以将非特异性吸附、非特异性结合引起的背景信号与特异性结合产生的真实信号加以区分，提高了检测的准确性，检测方法简单高效，用时极短，还可以实现同一位点的多重杂交检测、基因分型及SNP的检测，应用价值极高。
Description
技术领域
本发明属于核酸杂交检测技术领域，尤其涉及一种去除核酸检测背景的方法及其应用。
背景技术
核酸检测已广泛应用于遗传病筛查、单核苷酸多态性分析及感染性病原体诊断等方面。根据检测原理不同，现有核酸检测方法可主要分成三大类：
(1)基于荧光定量PCR(quantitative PCR，qPCR)的核酸诊断技术。该方法通过在聚合酶链式反应中添加特异性探针对扩增产物进行标记，并在引物延伸时切割探针以产生荧光，通过荧光信号的积累，可对特异性产物进行定量分析。qPCR常用于病毒性肝炎、艾滋病等感染性疾病的检测中，可以在区分病原体亚型的同时，根据定量结果反映出体内病毒的载量、传染性及活跃程度。qPCR具有特异性强、灵敏度高等优点，因此还可用于单核苷酸多态性(SNP)的准确分型；
(2)基于反向斑点杂交(reverse dot hybridization，RDB)的核酸诊断技术。其检测原理是将多个寡核苷酸探针固定于尼龙膜或硝酸纤维素膜上的不同位置，使带有生物素标记的扩增产物与探针杂交，经洗涤去除多余样本后，再利用酶催化底物显色反应来显示杂交结果。相较于先固定产物的普通斑点杂交，RDB具备同时检测多个靶点突变的能力，适用于已知突变类型的疾病诊断，如α-地中海贫血与β-地中海贫血；
(3)基于抗原抗体亲和反应的核酸诊断技术。亲和法的代表为第二代杂交捕获技术(hybrid capture 2，HC2)，可作为临床上宫颈癌及其癌前病变的初筛手段。该方法利用RNA探针结合HPV病毒的DNA，再基于分子ELISA技术进行信号放大，利用第一抗体将RNA:DNA复合物固定于微孔板，并标记上偶联有碱性磷酸酶的第二抗体，随后加入底物，通过化学发光技术检测病毒DNA，可以同时检测13种高危型-HPV病毒DNA。
在杂交检测的过程中，响应信号按来源可以分为三类：(1)报告分子非特异地吸附于基底，由分子之间的非特异性吸附形成的背景信号；(2)由于报告分子与扩增产物或固定于基底的探针发生碱基错配，由非特异性结合形成的背景信号；(3)由报告分子和扩增产物之间的特异性结合形成的真实的检测信号。区分这三种信号是降低检测下限、提高检测准确率及缩短检测时间的关键。
目前，已有很多关于降低核酸杂交背景信号的方法。CN1424405A公开了一种基因芯片分子探针及相关技术，提供了一种用于高效屏蔽背景光或激发光噪音的表面等离子体共振激发技术，通过将光学微粒通过共价键连接特异性地标记到基因芯片表面已杂交的双链核酸分子上，或通过将样品中待分析的核酸连接到光学微粒上，用携带目标基因的光学微粒直接与基因芯片上的探针进行杂交，最后通过洗脱等过程进行光学激发和信号检测，同时采用了表面等离子体共振(SPR)信号激发技术实现对背景光的完全屏蔽，提高了信噪比，改进了信号检测的效果。改法运行成本较低，操作简单，联合处理速度较快，但需要借助于专用仪器，且对操作人员的技术水平要求较高，限制了其应用范围。
大多数核酸诊断技术中，需要将核酸的生物信号转换为其他可检测的光信号、电信号才能实现靶标检出，但是无法保证检测到的信号都是由于靶标存在而产生的，非靶标存在也可能会产生信号引入干扰。因此，如何提供一种可以有效区分响应信号中的背景干扰与特异性信号的方法，能够提升检测的准确性，缩短检测时间，已成为亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种去除核酸检测背景的方法及其应用，通过观察标记物在升温过程中的运动轨迹，将报告分子和基底之间的非特异性吸附以及因碱基错配而非特异性结合产生的背景信号，与探针和目标片段之间特异性结合产生的真实信号进行区分，去除了检测中的背景信号，且检测所需时间短，操作简单，应用价值极高。
为达此目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种去除核酸检测背景的方法，所述去除核酸检测背景的方法包括：
在扩增引物上连接标记物，扩增目标片段，再将所得扩增产物进行解链；
将所得解链后的扩增产物和连接标记物的扩增引物转移至表面连接探针的基底上，孵育，所述连接标记物的扩增引物与所述解链后的扩增产物结合，所述解链后的扩增产物与所述基底表面的探针结合；
而后，记录所述标记物的运动轨迹，根据所述运动轨迹判定检测信号的种类。
本发明中，将标记物连接在扩增引物上，扩增产物与探针孵育结合后，再通过观察与扩增产物结合的扩增引物上的标记物在加热条件下的运动轨迹，可以提升检测中的准确性：未结合的标记物在溶液中进行随机的布朗运动，均方位移较大；当标记物与基底发生非特异性吸附时，其布朗运动受到影响，运动轨迹为一个点，均方位移近似为定值；当标记物与探针结合后，运动轨迹会局限在一定的距离内，均方位移在一定的数值范围内；由于非特异性结合不够紧密，在逐渐升温的过程中，杂交链解开，非特异性结合的标记物重新恢复随机的布朗运动，即均方位移先在一定的范围内后增大；而特异性结合的标记物仍旧在一定的范围内运动，据此即可将标记物与基底之间非特异性吸附及引物与探针之间因碱基错配造成的非特异性结合引起的背景信号与真实信号区分开来。
优选地，所述标记物包括表面带有羧基的微球。
优选地，所述微球的直径为0.8～1.2μm，例如可以是0.8μm、0.9μm、1μm、1.1μm或1.2μm，优选为1μm。
优选地，所述标记物与扩增引物中的正向扩增引物相连。
优选地，所述正向扩增引物的5’端携带氨基。
优选地，所述标记物与正向扩增引物共价连接。
优选地，所述所述共价连接包括EDC-NHS反应和/或叠氮-炔基反应。
本发明中，虽然物理吸附、生物素-链霉亲和素、抗原抗体这些方式也具有可行性，但是，所述共价连接具有明显的优点，物理吸附等方式有可能在温度升高以后由于蛋白构象改变或者其它原因让小球和引物解开连接，造成检测失败。
本发明中，EDC为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺，NHS为N-羟基琥珀酰亚胺，作为交联剂，二者可以帮助微球表面的羧基与引物表面修饰的氨基之间形成酰胺键，交联后，产物的热稳定性、形态稳定性及抗酶解能力显著增加。
优选地，所述扩增使用的扩增引物包括未标记的扩增引物和/或所述连接标记物的扩增引物。
本发明中，可以在扩增时使用连接标记物的正向扩增引物，再将结合有扩增引物的解链后的扩增产物与基底表面的探针杂交；或在扩增时使用未标记的正向扩增引物，再将连接标记物的正向扩增引物和解链后的扩增产物一同与基底表面的探针孵育杂交，所述连接标记物的正向扩增引物与所述解链后的扩增产物结合，所述解链后的扩增产物与所述基底表面的探针结合。
优选地，所述基底包括玻璃基底和/或高分子基底。
本发明中，所述基底可以是玻璃或者是透明的高分子基底材料(例如COC、COP和PMMA等)，只需要能观察到颗粒的运动状态即可。
优选地，所述探针通过与所述基底共价连接。
优选地，所述共价连接包括EDC-NHS反应和/或叠氮-炔基反应。
优选地，所述探针与所述基底连接前还包括合成探针的步骤。
优选地，所述解链的温度为93～97℃，例如可以是93℃、93.5℃、94℃、94.5℃、95℃、95.5℃、96℃、96.5℃或97℃，优选为95℃。
优选地，所述解链的时间为3～7min，例如可以是3min、3.5min、4min、4.5min、5min、5.5min、6min、6.5min或7min，优选为5min。
优选地，所述记录标记物的运动轨迹前还包括清洗未结合的扩增产物的步骤。
优选地，所述记录标记物的运动轨迹的具体步骤为：
将基底置于显微镜下，对基底进行加热，同时通过摄像装置记录标记物的运动轨迹，根据所述运动轨迹进行判定。
优选地，所述加热的温度为30～80℃，例如可以是30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃。
本发明中，将加热的温度控制在30～80℃的范围内，覆盖了绝大部分探针的Tm值。当外界温度升高至DNA分子的Tm值时，DNA双链会解开，由于碱基错配形成的杂合链结构不稳定，在温度未达到探针的Tm值就会解开，解链较早，而特异性结合形成的双链结构在接近探针的Tm值时才会发生解链，因此可通过升高温度将碱基错配造成的背景信号与真实信号区分开。
优选地，所述摄像装置包括高速摄像机。
优选地，所述高速摄像机的速率为500～5500fps，例如可以是500fps、1000fps、1500fps、2000fps、2500fps、3000fps、3500fps、4000fps、4500fps、5000fps或5500fps，优选为5000fps。
优选地，所述记录标记物的运动轨迹的时间为1～5s，例如可以是1s、1.5s、2s、2.5s、3s、3.5s、4s、4.5s或5s。
优选地，所述判定的依据为所述标记物在规定时间内的均方位移。
本发明中，均方位移是粒子随时间移动后的位置相对于参考位置的偏差的量度。当标记物做无规则布朗运动时，其均方位移随时间的推移而增大，当标记物与基底上的探针发生非特异性吸附或结合时，其均方位移保持不变或稳定在一定的数值范围内，因此，可将均方位移作为标记物与探针之间相互作用关系的判定依据。
优选地，所述规定时间为0.02～0.05s，例如可以是0.02s、0.03s、0.04s或0.05s。
优选地，所述判定的依据为：
在0.02～0.05s内，所述均方位移大于0.02μm2，判定检测信号为未结合分子的背景信号；
在0.02～0.05s内，所述均方位移在0.005～0.015μm2之间，且均方位移不随温度升高而增大，判定检测信号为扩增产物与探针之间特异性结合的真实信号；
在0.02～0.05s内，所述均方位移在0.005～0.015μm2之间，且均方位移随温度升高至大于0.02μm2，判定检测信号为因碱基错配而非特异性结合的背景信号；
在0.02～0.05s内，所述均方位移小于0.005μm2，且均方位移不随温度升高而增大，判定检测信号为标记物与探针之间非特异性吸附的背景信号。
作为优选技术方案，本发明所述去除核酸检测背景的方法，具体包括以下步骤：
(1)将表面带有羧基、直径为0.8～1.2μm的微球与携带氨基的正向扩增引物共价连接；
(2)合成探针，将所述探针与基底共价连接；
(3)将正向扩增引物、反向扩增引物和待检测核酸样本加入反应液中，进行目标片段的扩增，所述扩增使用的扩增引物包括未标记的扩增引物和/或所述连接标记物的扩增引物；
(4)将扩增产物在93～97℃下解链3～7min；
(5)将解链后的扩增产物和连接标记物的扩增引物转移至表面连接探针的基底上，孵育，所述连接标记物的扩增引物与所述解链后的扩增产物结合，所述解链后的扩增产物与所述基底表面的探针结合；
(6)清洗未结合的扩增产物，将基底置于显微镜下，加热至30～80℃，通过速率为500～5500fps的高速摄像机记录微球的运动轨迹1～5s，根据微球在0.02～0.05s内的均方位移判定检测信号的种类；
判定的依据为：
在0.02～0.05s内，所述均方位移大于0.02μm2，判定检测信号为未结合微球的背景信号；
在0.02～0.05s内，所述均方位移在0.005～0.015μm2之间，且均方位移不随温度升高而增大，判定检测信号为扩增产物与探针之间特异性结合的真实信号；
在0.02～0.05s内，所述均方位移在0.005～0.015μm2之间，且均方位移随温度升高至大于0.02μm2，判定检测信号为因碱基错配而非特异性结合的背景信号；
在0.02～0.05s内，所述均方位移小于0.005μm2，且均方位移不随温度升高而增大，判定检测信号为微球与探针之间非特异性吸附的背景信号。
第二方面，本发明提供了一种第一方面所述的去除核酸检测背景的方法在多重杂交检测、基因分型或SNP的检测中的应用。
本发明中，由于探针固定在基底上，因此可以实现同一位点的多重杂交，可根据探针之间的Tm值得不同进行区分，与单独进行单一的杂交相比，所需时间明显缩短；当探针与扩增产物发生碱基错配时，标记物的均方位移具有先稳定在0.005～0.015μm2之间，而当温度达到一个特定值时均方位移随时间的推移而大于0.02μm2，而此时特异性结合的扩增产物的均方位移则无变化，因此可以利用这一特性将特异性结合的扩增产物与非特异性结合的扩增产物区分开，因此可用于基因分型及SNP的检测中。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过观察标记物在加热条件下的布朗运动，将标记物与基底之间非特异性吸附及碱基错配而非特异性结合产生的背景信号与真实信号进行区分，提升了检测结果的准确性；
(2)本发明的检测方法简单高效，通过观察标记物的运动轨迹即可进行判断，克服了常规检测中需要一定量的真实信号才能被仪器识别，因而需要较长的杂交时间的弊端，本发明在1～5s内即可完成检测，极大地缩短了检测所需的时间；
(3)本发明将探针固定在基底上，因此可在同一位点实现多重核酸杂交检测，可以通过对核酸双链的变性过程进行实时观察，根据探针Tm值的差异即可进行区分，进一步缩短了检测时间，节约了检测成本；
(4)由于碱基错配引起探针与带有标记物的扩增引物发生非特异性结合，上述标记物的均方位移呈现出先稳定在一定的范围内，后在温度达到某一个特定值后随时间的推移而增大的特性，本发明所述的检测方法可用于基因分型、SNP的检测中，相比于测序技术，更为方便快捷，检测成本也更低。
附图说明
图1为本发明实施例1中加热条件下的微球的均方位移与时间的关系图；
图2是本发明对比例1中未加热条件下的微球的均方位移与时间的关系图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
原料：
EDC购自SIGMA；
NHS购自SIGMA；
微球购自Bangslabs，微球的直径为1μm；
玻璃基底购自Thermo fisher；
模板来自外周血提取的核酸；
缓冲液和PCR酶的混合物购自NEB，商品名为NEB
High-Fidelity 2X MasterMix。
实施例1
本实施例中提供一种MTHFR基因的检测方法，具体包括如下步骤：
1、合成MTHFR基因(NG_013351.1)的5’端修饰有羧基的正向扩增引物SEQ IDNo.1、反向扩增引物SEQ ID No.2。
SEQ ID No.1：
TGACCTGAAGCACTTGAAGGAGAA
SEQ ID No.2：
GGAAGAATGTGTCAGCCTCAAAGA
本实施例中，还通过EDC-NHS反应，将表面带有羧基、直径为1μm的微球与5’端修饰有氨基的正向扩增产物共价连接，得到带有标记物的正向扩增引物。
2、合成了5’端修饰有羧基的MTHFR基因的检测探针SEQ ID No.3。
SEQ ID No.3：
AATCGGCTCCCGCAG
本实施例中，还通过EDC-NHS反应，将检测探针与玻璃基底共价连接，得到了表面连接有探针的玻璃基底。
3、使用步骤1合成的带有标记物的正向扩增引物与反向扩增引物进行目标片段的扩增，扩增体系如表1所示。
表1
| 组分 | 体积(μL) |
| 正向扩增引物(10μM) | 1.25 |
| 反向扩增引物(10μM) | 1.25 |
| 模板(人基因组DNA) | 总量为100ng |
| 缓冲液和PCR酶的混合物 | 10 |
| 水 | 补足至25μL |
扩增的程序为：
预变性：98℃孵育30s；
循环扩增：(98℃孵育5s；60℃孵育10s；72℃孵育10s；
循环的次数为40次。
延伸：72℃孵育2min。
经过上述反应，得到了扩增产物。
4、使用表面连接有探针的玻璃基底对扩增产物进行检测。具体步骤如下：
(1)将步骤3得到的扩增产物在95℃下解链5min；
(2)将解链后的扩增产物转移至步骤2制备的表面连接有探针的玻璃基底上，孵育，所述解链后的扩增产物与所述玻璃基底表面的探针结合；
(3)清洗未结合的扩增产物，将玻璃基底置于暗场显微镜下，加热至65℃，通过速率为5000fps的高速摄像机记录微球的运动轨迹4s，根据微球在0.05s内的均方位移判定检测信号的种类。
实施例1所得的加热条件下微球的均方位移如图1所示，由图可知：
(1)在0.04s内，情况一所代表的微球的均方位移大于0.02μm2，因此该检测信号为未结合微球的背景信号；
(2)在0.04s内，情况二所代表的微球的均方位移在0.005～0.015μm2之间，且情况二的微球的均方位移不随温度升高而增大，因此该检测信号为扩增产物与探针之间特异性结合的真实信号；
(3)在0.04s内，情况四所代表的微球的均方位移在0.005～0.015μm2之间，且当温度高于60℃时，微球的均方位移随温度升高而大于0.02μm2，因此该检测信号为因碱基错配而非特异性结合的背景信号；
(4)在0.04s内，情况三所代表的微球的均方位移小于0.005μm2，且均方位移不随温度升高而增大，因此该检测信号为微球与探针之间非特异性吸附的背景信号。
因此，通过观察微球在加热条件下的均方位移，可以将微球与基底的非特异性吸附、带有微球的正向扩增引物与探针之间的非特异性结合引起的背景信号与扩增产物与探针之间的特异性结合产生的真实信号区分开，提高了检测结果的准确性。
对比例1
与实施例1的区别在于，在观察微球的均方位移时不进行加热。
对比例1所得的不加热的玻璃基底上的微球的位移如图2所示，由图可知：
(1)在0.04s内，情况一所代表的微球的均方位移大于0.02μm2，因此该检测信号为未结合微球的背景信号；
(2)在0.04s内，情况五所代表的微球的均方位移在0.005～0.015μm2之间，由于未对玻璃基底进行加热，与探针非特异性结合的带有微球的正向扩增引物未发生解链，因此无法与真实信号区分开，因此该检测信号为扩增产物与探针之间特异性结合的真实信号与因碱基错配而非特异性结合的背景信号的混合信号；
(3)在0.04s内，情况三所代表的微球的均方位移小于0.005μm2，且均方位移不随温度升高而增大，因此该检测信号为微球与探针之间非特异性吸附的背景信号。
因此，若观察过程中未对玻璃基底进行加热，则可以将微球与基底的非特异性吸附引起的背景信号区分开，但不能将带有微球的正向扩增引物与探针之间的非特异性结合引起的背景信号加以排除，因此，检测结果中仍存在一定的背景信号，有可能产生假阳性的检测结果。
综上所述，本发明通过将标记物连接在正向扩增引物上，并在加热条件下观察标记物的运动轨迹，可以将标记物与基底的非特异性吸附、带有标记物的正向扩增引物与探针之间的非特异性结合引起的背景信号与扩增产物与探针之间的特异性结合产生的真实信号加以区分，提高了检测的准确性，且检测方法高效简单，用时极短，还可以通过探针Tm值的差异实现同一位点进行多重核酸的杂交检测，也可以用于基因分型、SNP的检测中，应用前景十分广阔。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 华中科技大学协和深圳医院
<120> 一种去除核酸检测背景的方法及其应用
<130> 2021
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgacctgaag cacttgaagg agaa 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggaagaatgt gtcagcctca aaga 24
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aatcggctcc cgcag 15
Claims (10)
1.一种去除核酸检测背景的方法，其特征在于，所述去除核酸检测背景的方法包括：
在扩增引物上连接标记物，扩增目标片段，再将所得扩增产物进行解链；
将所得解链后的扩增产物和连接标记物的扩增引物转移至表面连接探针的基底上，孵育，所述连接标记物的扩增引物与所述解链后的扩增产物结合，所述解链后的扩增产物与所述基底表面的探针结合；
而后，记录所述标记物的运动轨迹，根据所述运动轨迹判定检测信号的种类。
2.根据权利要求1所述的去除核酸检测背景的方法，其特征在于，所述标记物包括表面带有羧基的微球；
优选地，所述微球的直径为0.8～1.2μm，优选为1μm。
3.根据权利要求1或2所述的去除核酸检测背景的方法，其特征在于，所述标记物与扩增引物中的正向扩增引物相连；
优选地，所述正向扩增引物的5’端携带氨基；
优选地，所述标记物与正向扩增引物共价连接；
优选地，所述共价连接包括EDC-NHS反应和/或叠氮-炔基反应；
优选地，所述扩增使用的扩增引物包括未标记的扩增引物和/或所述连接标记物的扩增引物。
4.根据权利要求1～3任一项所述的去除核酸检测背景的方法，其特征在于，所述基底包括玻璃基底和/高分子基底；
优选地，所述探针与所述基底共价连接；
优选地，所述共价连接包括EDC-NHS反应和/或叠氮-炔基反应；
优选地，所述探针与所述基底连接前还包括合成探针的步骤。
5.根据权利要求1～4任一项所述的去除核酸检测背景的方法，其特征在于，所述解链的温度为93～97℃，优选为95℃；
优选地，所述解链的时间为3～7min，优选为5min。
6.根据权利要求1～5任一项所述的去除核酸检测背景的方法，其特征在于，所述记录标记物的运动轨迹前还包括清洗未结合的扩增产物的步骤。
7.根据权利要求1～6任一项所述的去除核酸检测背景的方法，其特征在于，所述记录标记物的运动轨迹的具体步骤为：
将基底置于显微镜下，对基底进行加热，同时通过摄像装置记录标记物的运动轨迹，根据所述运动轨迹进行判定；
优选地，所述加热的温度为30～80℃；
优选地，所述摄像装置包括高速摄像机；
优选地，所述高速摄像机的速率为500～5500fps，优选为5000fps；
优选地，所述记录标记物的运动轨迹的时间为1～5s。
8.根据权利要求7所述的去除核酸检测背景的方法，其特征在于，所述判定的依据为所述标记物在规定时间内的均方位移；
优选地，所述规定时间为0.02～0.05s；
优选地，所述判定的依据为：
在0.02～0.05s内，所述均方位移大于0.02μm2，判定检测信号为未结合分子的背景信号；
在0.02～0.05s内，所述均方位移在0.005～0.015μm2之间，且均方位移不随温度升高而增大，判定检测信号为扩增产物与探针之间特异性结合的真实信号；
在0.02～0.05s内，所述均方位移在0.005～0.015μm2之间，且均方位移随温度升高至大于0.02μm2，判定检测信号为因碱基错配而非特异性结合的背景信号；
在0.02～0.05s内，所述均方位移小于0.005μm2，且均方位移不随温度升高而增大，判定检测信号为标记物与探针之间非特异性吸附的背景信号。
9.根据权利要求1～8任一项所述的去除核酸检测背景的方法，其特征在于，所述去除核酸检测背景的方法包括：
(1)将表面带有羧基、直径为0.8～1.2μm的微球与携带氨基的正向扩增引物共价连接；
(2)合成探针，将所述探针与基底共价连接；
(3)将正向扩增引物、反向扩增引物和待检测核酸样本加入反应液中，进行目标片段的扩增，所述扩增使用的扩增引物包括未标记的扩增引物和/或所述连接标记物的扩增引物；
(4)将扩增产物在93～97℃下解链3～7min；
(5)将解链后的扩增产物和连接标记物的扩增引物转移至表面连接探针的基底上，孵育，所述连接标记物的扩增引物与所述解链后的扩增产物结合，所述解链后的扩增产物与所述基底表面的探针结合；
(6)清洗未结合的扩增产物，将基底置于显微镜下，加热至30～80℃，通过速率为500～5500fps的高速摄像机记录微球的运动轨迹1～5s，根据微球在0.02～0.05s内的均方位移判定检测信号的种类；
判定的依据为：
在0.02～0.05s内，所述均方位移大于0.02μm2，判定检测信号为未结合微球的背景信号；
在0.02～0.05s内，所述均方位移在0.005～0.015μm2之间，且均方位移不随温度升高而增大，判定检测信号为扩增产物与探针之间特异性结合的真实信号；
在0.02～0.05s内，所述均方位移在0.005～0.015μm2之间，且均方位移随温度升高至大于0.02μm2，判定检测信号为因碱基错配而非特异性结合的背景信号；
在0.02～0.05s内，所述均方位移小于0.005μm2，且均方位移不随温度升高而增大，判定检测信号为微球与探针之间非特异性吸附的背景信号。
10.如权利要求1～9任一项所述的去除核酸检测背景的方法在多重杂交检测、基因分型或SNP的检测中的应用。
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2021
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| 匡茜: "基于功能纳米材料和信号放大技术的荧光生物传感研究", 中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）工程科技I辑, pages 014 - 204 * |
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