JP2012024039A - コロナウイルスのためのlamp増幅用核酸プライマーセット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】コロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅するためのLAMP増幅用核酸プライマーセットであって;当該FIPプライマー、BIPプライマー、F3プライマー、B3プライマーが特定な配列からなるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含む、少なくとも1種類のプライマーである;プライマーセット。
【選択図】なし
Description
(1)コロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅するためのLAMP増幅用核酸プライマーセットであって、前記LAMP増幅用核酸プライマーセットは、FIPプライマー、BIPプライマー、F3プライマー、B3プライマーを含み、
当該FIPプライマーは配列番号1、配列番号5、配列番号9、配列番号13若しくは配列番号17若しくは配列番号44またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドを含み、
当該BIPプライマーは配列番号2、配列番号6、配列番号10、配列番号15、配列番号18、配列番号21若しくは配列番号45またはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも1選択されるポリヌクレオチドを含み、
当該F3プライマーは配列番号3、配列番号7、配列番号11、配列番号14若しくは配列番号19、配列番号34、配列番号35若しくは配列番号46またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドを含み、および
当該B3プライマーは配列番号4、配列番号8、配列番号12、配列番号16、配列番号20若しくは配列番号22またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドを含む
プライマーセット
である。
本発明の1態様により、コロナウイルス由来の核酸を特異的且つ迅速に増幅するためのLAMP増幅用核酸プライマーセットが提供される。
当該BIPプライマーが配列番号2、配列番号6、配列番号10、配列番号15、配列番号18、配列番号21若しくは配列番号45またはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも1選択されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含む、少なくとも1種類のBIPプライマーであり、
当該F3プライマーが配列番号3、配列番号7、配列番号11、配列番号14、配列番号19、配列番号34、配列番号35若しくは配列番号48またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含む、少なくとも1種類のF3プライマーであり、および
当該B3プライマーが配列番号4、配列番号8、配列番号12、配列番号16、配列番号20、配列番号22、配列番号36若しくは配列番号47またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含む、少なくとも1種類のB3プライマーである
FIPプライマー、BIPプライマー、F3プライマーおよびB3プライマーを含むプライマーセットである。
(1) 配列番号1、配列番号2、配列番号3および配列番号4によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ;
(2) 配列番号5、配列番号6、配列番号7および配列番号8によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ;
(3) 配列番号9、配列番号10、配列番号11および配列番号12によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ;
(4) 配列番号13、配列番号10、配列番号14および配列番号12によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ;
(5) 配列番号13、配列番号15、配列番号14および配列番号16によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ;
(6) 配列番号17、配列番号18、配列番号19および配列番号20によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ;
(7) 配列番号17、配列番号21、配列番号19および配列番号22によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ;
ここで、(1)〜(7)の組み合わせは、コロナウイルスを検出することが可能なプライマーの組み合わせである。更に、そこにおいて、少なくとも1つのプライマーの一部にコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含んでもよい。そのような範囲とは、分類学的にコロナウイルスと同定されるために必ずしも必要ではない範囲であればよい;
(8) 配列番号44、配列番号45、配列番号46および配列番号47によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ;
ここで、(8)の組み合わせにおいては、各配列中に複数の塩基を示す1塩基表示による記号を含む。それらの記号の示す塩基の意味は通常当該技術分野において一般的に使用される意味である。即ち、「r」はグアニンまたはアデニン、「y」はチミンまたはシトシン、「m」はアデニンまたはシトシン、「k」はグアニンまたはチミン、「s」はグアニンまたはシトシン、「w」はアデニンまたはチミン、「b」はグアニンまたはシトシンまたはチミン、「d」はアデニンまたはグアニンまたはチミン、「h」はアデニンまたはシトシンまたはチミン、「v」はアデニンまたはグアニンまたはシトシン、「n」はアデニンまたはグアニンまたはシトシンまたはチミンである。本明細書においてもこの通りに意味する。(8)の組み合わせでプライマーセットを使用する場合には、ミックス塩基で使用することは、ユニバーサルにウイルスを増幅するためにより効果的である。また、そこにおいて、少なくとも1つのプライマーの一部にコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含んでもよい。そのような範囲とは、分類学的にコロナウイルスと同定されるために必ずしも必要ではない範囲であればよい;
(9) 配列番号59、配列番号60、配列番号58および配列番号61によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー;
(a)配列番号68、配列番号69、配列番号67および配列番号70によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー;
(b)配列番号77、配列番号78、配列番号76および配列番号79によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー;
(c)配列番号86、配列番号87、配列番号85および配列番号89によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー;
(d)配列番号104、配列番号105、配列番号103および配列番号106によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー;
(d)配列番号113、配列番号114、配列番号112および配列番号115によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー;
(f)配列番号122、配列番号123、配列番号121および配列番号124によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー;並びに
(g)配列番号131、配列番号132、配列番号130および配列番号133によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー;を含むプライマーの組み合わせ;
ここにおいて、(9)の組み合わせに含まれるプライマーセットは、コロナウイルスの種を同定する、または判定するために使用することも可能なプライマーセットである。これらのプライマーセットによりユニバーサルにウイルスを増幅する場合には、全てのプライマーセットを使用する方が好ましい。特定の種のコロナウイルスを増幅したい場合には、種に応じて使用するプライマーセットを選択してよい。組み合わせ(a)および(f)はウシコロナウイルス(Bovine coronavirus)、(b)、(c)、(g)および(h)はヒトコロナウイルス(Human coronavirus)、(d)および(i)はブタ血球凝集脳脊髄炎ウイルス(Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus)にそれぞれ好ましい。また、そこにおいて、少なくとも1つのプライマーの一部にコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含んでもよい。
(10) 配列番号59、配列番号60、配列番号58および配列番号61によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ;
(11) 配列番号68、配列番号69、配列番号67および配列番号70によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ;
(12) 配列番号77、配列番号78、配列番号76および配列番号79によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ;
(13) 配列番号86、配列番号87、配列番号85および配列番号89によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ;
(14) 配列番号104、配列番号105、配列番号103および配列番号106によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ;
(15) 配列番号113、配列番号114、配列番号112および配列番号115によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ;
(16) 配列番号122、配列番号123、配列番号121および配列番号124によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ;並びに
(17) 配列番号131、配列番号132、配列番号130および配列番号133によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ:
また、そこにおいて、少なくとも1つのプライマーの一部にコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含んでもよい。
RT−LAMP法の反応液組成
20mM Tris−HCL(pH8.8)
10mM KCL
8mM MgSO4
10mM (NH4)2SO4
0.1% Tween20
0.8M Betaine
1.4mM dNTPs
16 U Bst DNA polymerase
0.625U AMV Reverse transcriptase
このような組成の反応液で、総量25μLで反応を行う際には、下記の濃度でそれぞれのプライマーを持ち込んでもよい;
プライマー添加量
FIPプライマー 40pmoL
BIPプライマー 40pmoL
F3プライマー 5pmoL
B3プライマー 5pmoL。
本発明は更に、上述のポリペプチドプライマーにより増幅されたコロナウイルスに由来する核酸を検出および/または分類するためのプローブおよびプローブセットもまた提供する。
本発明に従うと、コロナウイルスの検出および/または分類するためのアッセイキットが提供されてもよい。そのようなアッセイキットは、上述のプライマーまたはプライマーセットとプローブまたはプローブセットとを含めばよい。当該アッセイキットは、当該プライマーまたはプライマーセットおよびプローブまたはプローブセットに加えて、LAMP増幅に必要なバッファーを含んでもよく、ハイブリダイゼーションに必要なバッファー、並びにそこにおいて当該増幅および/またはハイブリダイゼーションを行うための容器を具備してもよい。また、アッセイキットに含まれるプローブは基体に固定化されていてもよい。その場合の基体は上述した何れかの基体であればよい。
本発明に従うと、更に、コロナウイルスを検出する方法が提供される。当該検出方法は、上記したプライマー、プローブおよび増幅方法を利用することによって、更に、コロナウイルス属に分類される微生物の検出および属レベルまたは種レベルで遺伝子型分類を行う方法である。
本発明に従うプライマーから任意に選択される少なくとも1つのプライマーを含む複数のプライマーを使用して、LAMP反応またはRT−LAMP反応により試料について核酸鎖増幅反応を行う工程と、
前記増幅反応後に増幅産物の有無を検出する工程と、
を具備すればよい。当該試料は、予め核酸を抽出する工程に供されてもよい。
以下に、本発明による核酸検知方法について例を用いて具体的に説明する。
<プライマーセットの選択>
MHV(Murine hepatitis virus、アクセション番号NC_001846, NC_006852, AF208067, AF190408, AF190408, AF201929, AF700211, AY910861, M35253, M35254, M35255, M35256, M80644))からアライメントを作成し、変異のない、または変異頻度の少ない領域を選んでプライマーを設計した。MHVの一部をクローニングしたプラスミド(103copies/reaction)をテンプレートにして、以下の組成にて63℃90分Realoop-30(モリテックス社製)を用いてLAMP増幅を行った。プライマーの組み合わせと増幅結果(濁度立上がり時間)を合わせて表1に示す。濁度立上がり時間80分未満が3種、80分以上が4種得られた。このうち、上位4種を候補として選択し、ループプライマーの設計を行った。結果を表6に示す。
FIP 40 pmol
BIP 40 pmol
F3 5 pmol
B3 5 pmol
(Lfc/Lb 20 pmol)
2×Reaction Mixture 12.5 μl
8 U/μl Bst DNA polymerase 1μl
Template 1μl
Distilled Water Up to 25μl。
Tris-HCl (pH8.8) 20 mM
KCL 10 mM
MgSO4 8 mM
(NH4)SO4 10 mM
Tween-20 0.1 %
Betaine 0.8 M
dNTPs 1.4 mM each。
上記で候補となったプライマーセットに対し、定法に従ってループプライマーを設計して合成した。上述の反応組成に20pmolのループプライマーを追加して同様にLAMP増幅を行った。テンプレートは添加前に95℃5分処理したものを使用した。プライマーの組合せと増幅結果を合わせて表7に示す。この実験から各プライマーセットに対する良好なループプライマーを選択した。
プライマー中に変異塩基があると増幅特性を悪化させるため、変異に富む実際の検体を網羅的に検出するには、変異が存在しない箇所をプライマーにすることが望ましい。したがって、絞り込まれた4種のプライマーセットのうち、最も変異確率の少ない、セット1−1が最良であると判断した。調査した配列中に存在する変異数は、以下の表で表される。
<SDAV(Rat sialodacryoadenitis coronavirus)用プライマーの設計>
SDAV(Rat sialodacryoadenitis coronavirus、アクセション番号 AF207551)は、ラットに感染するコロナウイルスであるが、MHVと配列が類似していることから、共通のプライマーで増幅できる可能性が高い。そこで、SDAVも対応可能なプライマーとするため、プライマーセット1−1,17−1それぞれに対応する領域の配列を調べ、表9に示すプライマーの組み合わせで増幅を行った。
<変異株用プライマーの設計>
プライマーセット1-1について、プライマー領域にある変異箇所を調べたところ、F2領域、F3領域、B3領域およびLPb領域に頻度の高い変異があることがわかった。そこで、これら変異株も良好に増幅できるよう、表10のプライマーを新たに追加して増幅を行った。
<RT-LAMP>
プライマーセット1-1および変異対応追加プライマーを混合したLAMP増幅液(上述の例1の記載の組成と同様)に、0.625UのAMV transcriptaseを添加し、実際のMHVウイルス(譲渡された2つの基準株A59, JHM )およびSDAVウイルスのRT-LAMP(63℃60分)を行った。その結果、抽出検体の段階希釈液において良好な増幅であった。
Probe配列設計
前記プライマーセットにて増幅されたLAMP産物検出用プローブを選定するため、LAMP産物の1本鎖核酸領域にハイブリダイゼーションが可能な設計にて複数の候補配列を選定した。3’末端チオール修飾を持つ合成核酸として表11に示すプローブ候補を準備した。
<プローブの選定>
図6に模式的に示すような構成の核酸プローブ固定化電極を作製した。基板12に配置された金電極13に対して、プローブ候補となる配列の合成核酸(3’末端がチオール修飾されている)7〜10をスポットすることにより配列毎に固定化した。
検出対象である、MHV及びSDAVはRNAウイルスである事から、ゲノム配列には多様な変異(バリエーション)が存在する。そこで、公表されている全てのMHV及びSDAVゲノム配列情報を基に、例1−6にて選定されてきた最適プライマーおよびプローブ領域の変異発生状況を確認した(表11を参照されたい)。
他のCoronavirus group 2a(Bovine coronavirus NC_003045、Human coronavirus HKU1 NC_005147、Human coronavirus OC43 NC_006577、Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus NC_007732)、 2b(SARScoronavirus NC_004718)についても、上述の例1−7で示されたMHVおよびSDAVを代表として選定した最適なプライマーおよびプローブの設計に対応する遺伝子領域を特定した。それぞれのウイルス種に対応したプライマーおよびプローブを構築した(表12を参照されたい)。
(表13を参照されたい)。
検出対象である、Coronavirus group 2a、2bはRNAウイルスである事から、ゲノム配列には多様な変異(バリエーション)が存在する。そこで、上述の例7同様、公表されている全てのBovine coronavirus、Human coronavirus HKU1、Human coronavirus OC43、Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus、SARScoronavirusのゲノム配列情報を元に、前述の例において選定されてきた最適なプライマーおよびプローブの領域の変異発生状況を確認。それぞれの変異に対応する鋳型配列を合成遺伝子により作成したと伴に、全パターンについて変異対応プライマーおよびプローブを準備した。それらを用いて配列変異を含むウイルス配列検出を試みた。その結果、何れの組み合わせにおいてもプライマーおよびプローブ配列と検体がフルマッチであれば、30nA以上の電流増加量にて検出が可能であることを確認した。検出結果の例を図10〜図12に示す。図10はorcine hemagglutinating encephalomyelitis virus 陽性検体を用いて得た結果の例である。図11は、Bovine corona virus 陽性検体を当てた結果である。図12は、陰性検体を当てた結果を示す。
以上の事から、本発明にて選定されたプライマーおよびプローブ領域を用いることで、コロナウイルス グループ2aおよび2bの検出ならびに種判別および/またはタイピングを、望ましい検出特性(即ち、検出信号量および検出特異性)にて行な得ることが示された。また必要に応じてプライマーおよびプローブの配列を一部改変する事で、コロナウイルス グループ2aおよび2bを構成するウイルス種およびウイルス配列変異に対して、検出特性を損なうことなく対応可能であることが確認できた。
Claims (9)
- コロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅するためのLAMP増幅用核酸プライマーセットであって、前記LAMP増幅用核酸プライマーセットは、FIPプライマー、BIPプライマー、F3プライマー、B3プライマーを含み、
当該FIPプライマーが配列番号1、配列番号5、配列番号9、配列番号13、配列番号17若しくは配列番号44またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含む、少なくとも1種類のFIPプライマーであり、
当該BIPプライマーが配列番号2、配列番号6、配列番号10、配列番号15、配列番号18、配列番号21若しくは配列番号45またはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも1選択されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含む、少なくとも1種類のBIPプライマーであり、
当該F3プライマーが配列番号3、配列番号7、配列番号11、配列番号14、配列番号19、配列番号34、配列番号35若しくは配列番号46またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含む、少なくとも1種類のF3プライマーであり、および
当該B3プライマーが配列番号4、配列番号8、配列番号12、配列番号16、配列番号20、配列番号22、配列番号36若しくは配列番号47またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含む、少なくとも1種類のB3プライマーである
プライマーセット。 - 請求項1に記載のプライマーセットであって、前記FIPプライマー、前記BIPプライマー、前記F3プライマーおよび前記B3プライマーの組み合わせが以下からなる群より少なくとも1選択され、前記増幅がコロナウイルス由来の核酸の増幅であるプライマーセット;
(1) 配列番号1、配列番号2、配列番号3および配列番号4によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー;
(2) 配列番号5、配列番号6、配列番号7および配列番号8によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー;
(3) 配列番号9、配列番号10、配列番号11および配列番号12によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー;
(4) 配列番号13、配列番号10、配列番号14および配列番号12によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー;
(5) 配列番号13、配列番号15、配列番号14および配列番号16によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー;
(6) 配列番号17、配列番号18、配列番号19および配列番号20によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー;
(7) 配列番号17、配列番号21、配列番号19および配列番号22によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー;
(8) 配列番号44、配列番号45、配列番号46および配列番号47によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー、ここで、各配列により示されるポリヌクレオチドがミックス塩基であるプライマー;ならびに
(9) 配列番号59、配列番号60、配列番号58および配列番号61によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー;
配列番号68、配列番号69、配列番号67および配列番号70によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー;
配列番号77、配列番号78、配列番号76および配列番号79によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー;
配列番号86、配列番号87、配列番号85および配列番号89によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー;
配列番号104、配列番号105、配列番号103および配列番号106によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー;
配列番号113、配列番号114、配列番号112および配列番号115によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー;
配列番号122、配列番号123、配列番号121および配列番号124によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー;並びに
配列番号131、配列番号132、配列番号130および配列番号133によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー;からなるプライマー。 - 請求項1または2に記載のプライマーセットであって、前記FIPプライマー、前記BIPプライマー、前記F3プライマーおよび前記B3プライマーの組み合わせが以下からなる群より少なくとも1選択されるプライマーセット;
(10) 配列番号59、配列番号60、配列番号58および配列番号61によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー;
(11) 配列番号68、配列番号69、配列番号67および配列番号70によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー;
(12) 配列番号77、配列番号78、配列番号76および配列番号79によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー;
(13) 配列番号86、配列番号87、配列番号85および配列番号89によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー;
(14) 配列番号104、配列番号105、配列番号103および配列番号106によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー;
(15) 配列番号113、配列番号114、配列番号112および配列番号115によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー;
(16) 配列番号122、配列番号123、配列番号121および配列番号124によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー;並びに
(17) 配列番号131、配列番号132、配列番号130および配列番号133によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー。 - 前記LAPM増幅用核酸プライマーセットが、更に、ループプライマーLPfおよびLPbを含み、前記LPfが、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号37、配列番号48、配列番号62、配列番号71、配列番号80、配列番号89、配列番号107、配列番号116、配列番号125若しくは配列番号134またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含み、前記LPbが配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号49、配列番号63、配列番号72、配列番号81、配列番号90、配列番号108、配列番号117、配列番号126若しくは配列番号135またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含む請求項1〜3の何れか1項に記載のプライマーセット。
- コロナウイルスに由来する核酸を特異的に増幅する方法であって、試料を請求項1〜4の何れか1項に記載のプライマーセットを用いてLAMP増幅することを具備する方法。
- コロナウイルスを検出および/または分類する方法であって、
試料に含まれる核酸を請求項1〜4の何れか1項に記載のプライマーセットを用いてLAMP増幅することと、
前記LAMP増幅により生じた反応産物と、
配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42および配列番号43、並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に検出可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含むプローブ群;および/または
配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号145、配列番号146および配列番号147並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に検出可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含むプローブ群;
より形成されるプローブ群から選択される少なくとも1種類のプローブから選択される少なくとも1種類のプローブと、
を反応することと、
前記反応の結果から、試料に存在するコロナウイルスを検出および/または分類することと
を具備する方法。 - 請求項6に記載の方法であって、前記プローブ群が基体に固定化されている方法。
- コロナウイルスの検出および/または分類するためのアッセイキットであって、
請求項1〜3の何れか1項に記載のプライマーセットと、
前記プライマーセットを用いて得られた増幅産物からコロナウイルスを特異的に検出および/または分類するためのプローブであり、
配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42および配列番号43、並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に検出可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含むプローブ群;および/または
配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号145、配列番号146および配列番号147、並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に検出可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含むプローブ群;
より形成されるプローブ群から選択される少なくとも1種類のプローブと、
を含むことを特徴とするアッセイキット。 - 請求項8に記載のアッセイキットであって、前記プローブ群が基体に固定化されているアッセイキット。
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