JP2008237140A - N−アセチルトランスフェラーゼ2(nat2)の遺伝子型を検出するための核酸プライマーセット及び核酸プローブ - Google Patents
N−アセチルトランスフェラーゼ2(nat2)の遺伝子型を検出するための核酸プライマーセット及び核酸プローブ Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】NAT2遺伝子の一塩基多型G590A、G857A及びT341Cにおける遺伝子型を検出するための、LAMP増幅用核酸プライマーセットを提供する。また、本発明に従ったプライマーセットによって増幅された増幅産物を検出するための核酸プローブを提供する。また、本発明に従ったプライマーセットを用いたNAT2遺伝子の一塩基多型G590A、G857A及びT341Cにおける遺伝子型の検出方法を提供する。
【選択図】 図8
Description
Jain K.K., Application of Amplicip CYP450, Mol Diagn 9,119-27 (2005)
プライマーセット1:配列番号1のFIPプライマー及び配列番号7のBIPプライマー、
プライマーセット2:配列番号2のFIPプライマー及び配列番号7のBIPプライマー、
プライマーセット3:配列番号5のFIPプライマー及び配列番号7のBIPプライマー、
プライマーセット4:配列番号6のFIPプライマー及び配列番号7のBIPプライマー、
プライマーセット5:配列番号10のFIPプライマー及び配列番号13のBIPプライマー、
プライマーセット6:配列番号10のFIPプライマー及び配列番号14のBIPプライマー、
プライマーセット7:配列番号15のFIPプライマー及び配列番号11のBIPプライマー、
プライマーセット8:配列番号15のFIPプライマー及び配列番号12のBIPプライマー、
プライマーセット9:配列番号15のFIPプライマー及び配列番号13のBIPプライマー、
プライマーセット10:配列番号15のFIPプライマー及び配列番号14のBIPプライマー、
プライマーセット11:配列番号16のFIPプライマー及び配列番号11のBIPプライマー、
プライマーセット12:配列番号16のFIPプライマー及び配列番号12のBIPプライマー、
プライマーセット13:配列番号16のFIPプライマー及び配列番号13のBIPプライマー、
プライマーセット14:配列番号16のFIPプライマー及び配列番号14のBIPプライマー、
プライマーセット15:配列番号17のFIPプライマー及び配列番号13のBIPプライマー、
プライマーセット16:配列番号17のFIPプライマー及び配列番号14のBIPプライマー。
プライマーセット1:配列番号20のFIPプライマー及び配列番号21のBIPプライマー、
プライマーセット2:配列番号20のFIPプライマー及び配列番号22のBIPプライマー、
プライマーセット3:配列番号20のFIPプライマー及び配列番号23のBIPプライマー、
プライマーセット4:配列番号20のFIPプライマー及び配列番号25のBIPプライマー、
プライマーセット5:配列番号20のFIPプライマー及び配列番号26のBIPプライマー。
プライマーセット1:配列番号33のFIPプライマー及び配列番号30のBIPプライマー、
プライマーセット2:配列番号33のFIPプライマー及び配列番号31のBIPプライマー、
プライマーセット3:配列番号33のFIPプライマー及び配列番号32のBIPプライマー、
プライマーセット4:配列番号34のFIPプライマー及び配列番号30のBIPプライマー、
プライマーセット5:配列番号34のFIPプライマー及び配列番号31のBIPプライマー、
プライマーセット6:配列番号34のFIPプライマー及び配列番号32のBIPプライマー、
プライマーセット7:配列番号35のFIPプライマー及び配列番号32のBIPプライマー、
プライマーセット8:配列番号36のFIPプライマー及び配列番号32のBIPプライマー、
プライマーセット9:配列番号37のFIPプライマー及び配列番号32のBIPプライマー、
プライマーセット10:配列番号38のFIPプライマー及び配列番号32のBIPプライマー。
プライマーセット1:配列番号42のFIPプライマー及び配列番号43のBIPプライマー、
プライマーセット2:配列番号42のFIPプライマー及び配列番号44のBIPプライマー、
プライマーセット3:配列番号45のFIPプライマー及び配列番号43のBIPプライマー、
プライマーセット4:配列番号45のFIPプライマー及び配列番号46のBIPプライマー、
プライマーセット5:配列番号47のFIPプライマー及び配列番号43のBIPプライマー、
プライマーセット6:配列番号48のFIPプライマー及び配列番号43のBIPプライマー、
プライマーセット7:配列番号48のFIPプライマー及び配列番号46のBIPプライマー、
プライマーセット8:配列番号48のFIPプライマー及び配列番号44のBIPプライマー。
以下にLAMP法の概要を説明する。なお、本明細書では、一塩基多型の検出に供される核酸(ゲノムDNA等を含む)を検体核酸と称する。また、LAMP法によって増幅されるNAT2遺伝子内の領域を標的核酸と称する。また、LAMP法によって得られた産物を増幅産物と称する。また、ヒトゲノムDNAを含む溶液を試料溶液と称する。
一塩基多型を検出する場合は、検出される多型部位を図5に示すFP領域又はBPc領域に位置させる。或いは、FP領域及びBPc領域のそれぞれに異なる多型を位置させてもよい。図5に記載したように、F2領域からF1領域にかけての部分は、増幅産物中で一本鎖となる部分である。同様に、B2c領域からB1c領域にかけての部分も増幅産物中で一本鎖となる部分である。一本鎖である部分に検出すべき多型部位を位置させることによって、核酸プローブによる検出を簡便にすることができる。
核酸プローブは、これに限定されないが、基体上に固定化して用いることができる。核酸プローブ固定化基体は、DNAチップ、DNAマイクロアレイと称されるそれ自身公知の装置を利用しても良い。
核酸プローブと増幅産物とのハイブリダイゼーションは適切な条件下で行う。適切な条件は、増幅産物の種類や構造、検出配列に含まれる塩基の種類、核酸プローブの種類によって異なる。例えば、イオン強度0.01〜5の範囲で、pH5〜10の範囲の緩衝液中で行う。反応溶液中には、ハイブリダーゼション促進剤である硫酸デキストラン、並びにサケ精子DNA、牛胸腺DNAやEDTAおよび界面活性剤などを添加しても良い。反応温度は、例えば10℃〜90℃の範囲で行い、攪拌や振盪などで反応効率を高めても良い。反応後の洗浄には、例えばイオン強度0.01〜5の範囲で、pH5〜10の範囲の緩衝液を用いればよい。
前記基体に固定化されたプローブと増幅産物とがハイブリダイズすると2本鎖核酸が生じる。この2本鎖核酸は、電気化学的に又は蛍光により検出することができる。
電気化学的に2本鎖核酸を検出する方法を説明する。この方法では、2本鎖核酸を特異的に認識する2本鎖認識体を用いる。2本鎖認識体の例には、例えば、ヘキスト33258、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーター、ポリインターカレーターなどが含まれるが、これらに限定されない。更に、これらの物質を電気化学的に活性な金属錯体、例えばフェロセン、ビオロゲンなどで修飾することも可能である。
蛍光によって2本鎖核酸を検出する方法を説明する。予め、プライマーを蛍光学的に活性な物質で標識しておく。又は、蛍光学的に活性な物質で標識した2次プローブを用いて検出する。或いは、複数の標識を使用してもよい。蛍光学的に活性な物質は、これらに限定されないが、FITC、Cy3、Cy5、もしくはローダミンなどの蛍光色素を含む。蛍光物質は、例えば蛍光検出器を用いて検出される。標識の種類に応じた適宜の検出装置を用い、標識された検出配列又は2次プローブを検出する。
図8に一塩基多型G590AをF2とF1の間、すなわちFP領域に位置させた場合の模式図を示した。FIPプライマーは、F2領域と同じ配列、及び、F1領域と相補的な配列を有するプライマーである。このF2領域とF1領域とが、G590Aを挟んで位置する限り、様々な種類のプライマーを設計することが可能である。
NAT2 G590Aの多型部位をFP領域に設計した6種類の核酸プライマーセットを用い、63℃で1時間及び2時間、増幅反応させた。反応は表1に記載した組成で行った。鋳型DNAにはヒトゲノムを用いた。コンタミネーションの有無、及び非特異的な増幅の有無を確認するため、全てのセットでヒトゲノムの代わりに滅菌超純水を添加したネガティブコントロールを作製した。増幅反応後、3%アガロース電気泳動により増幅産物を確認した。
表2の6種類のプライマーセットを用いて得られた増幅産物を電気泳動に供した。その結果を図10に示す。1時間増幅した場合、プライマーセット3および4で十分量の増幅産物が得られた(レーン5,6)。2時間増幅した場合、プライマーセット1、2、3及び4で十分量の増幅産物が得られた(レーン1,2,5及び6)。プライマーセット18、19(レーン3及び4)では、増幅産物が少ないか、または増幅が確認されなかった。また、全てのセットにおいて、非特異増幅は見られなかった。以上から、良好なプライマーセットは1、2、3、4であり、最良のプライマーセットは3、4であることが明らかになった。上記の結果を表2にまとめた。
NAT2 G590Aの多型部位をBP領域に設計した16種類のプライマーセットを用い、63℃で1時間及び2時間、増幅反応させた。反応は表1に記載した組成で行った。鋳型DNAにはヒトゲノムを用いた。コンタミネーションの有無、及び非特異的な増幅の有無を確認するため、全てのセットでヒトゲノムの代わりに滅菌超純水を添加したネガティブコントロールを作製した。増幅反応後、3%アガロース電気泳動により増幅産物を確認した。
表3の16種類のプライマーセットを用いて得られた増幅産物を電気泳動に供した。その結果を図11に示す。1時間増幅した場合、プライマーセット9で十分量の増幅産物が得られた(レーン7)。2時間増幅した場合、プライマーセット5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、21で十分量の増幅産物が得られた。プライマーセット22、23では、増幅が見られなかった。プライマーセット20、21においては、図12に示すような非特異増幅が見られた。以上から、良好なプライマーセットは5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15及び16であり、最良のプライマーセットは9であることが明らかになった。上記の結果を表3にまとめた。
NAT2 G857Aの多型部位をBP領域に設計した6種類のプライマーセットを用い、63℃で1時間及び2時間、増幅反応させた。反応は表1に記載した組成で行った。鋳型DNAにはヒトゲノムを用いた。コンタミネーションの有無、及び非特異的な増幅の有無を確認するため、全てのセットでヒトゲノムの代わりに滅菌超純水を添加したネガティブコントロールを作製した。増幅反応後、3%アガロース電気泳動により増幅産物を確認した。
表4の6種類のプライマーセットを用いて得られた増幅産物を電気泳動に供した。1時間増幅した場合、プライマーセット1、2、3、4及び5で十分量の増幅産物が得られた。2時間増幅した場合にも、同様にプライマーセット1、2、3、4及び5で十分量の増幅産物が得られた。プライマーセット6では、2時間増幅した場合でも増幅は見られなかった。また、全てのセットにおいて、非特異増幅は見られなかった。以上から、最良のプライマーセットは1、2、3、4、及び5であることが明らかになった。上記の結果を表4にまとめた。
NAT2 T341Cの多型部位をBP領域に設計した13種類の核酸プライマーセットを用い、63℃で1時間及び2時間、増幅反応させた。反応は表1に記載した組成で行った。鋳型DNAにはヒトゲノムを用いた。コンタミネーションの有無、及び非特異的な増幅の有無を確認するため、全てのセットでヒトゲノムの代わりに滅菌超純水を添加したネガティブコントロールを作製した。増幅反応後、3%アガロース電気泳動により増幅産物を確認した。
表5の13種類のプライマーセットを用いて得られた増幅産物を電気泳動に供した。1時間増幅した場合、プライマーセット3、6、9、10で十分量の増幅産物が得られた。2時間増幅した場合には、プライマーセット1、2、3、4、5、6、7、8、9、10及び11で十分量の増幅産物が得られた。プライマーセット12、13では、2時間増幅した場合でも増幅は見られなかった。プライマーセットセット11においては、非特異増幅が見られた。プライマーセット1、2、3、4、5、6、7、8、9、10においては、非特異増幅が見られなかった。このことから、良好なプライマーセットは1、2、3、4、5、6、7、8、9及び10であり、最良のプライマーセットは3、6、9、10であることが明らかになった。上記の結果を表5にまとめた。
多型部位は、FP領域とBP領域の各々に配置することもできる。これにより、1つの増幅産物で、2箇所以上の一塩基多型を測定することができる。例えば、G590AとG857Aの場合、G590AをFP領域に設計し、G857AをFPc領域に設計することができる。G590AとG857Aは少し離れて位置するため、ターゲット長(F2からB2までの長さ)は350bp程度となり、若干増幅効率は低下するものの、ループプライマーの導入などにより、1時間以内で増幅することができる。G590AとG857Aを同時に増幅する方法として、1つの反応チューブで各々の産物をマルチ増幅する方法もあるが、マルチ増幅は、条件設定を厳密に制御しなくてはならない。また、厳密に制御しても片方の産物のみが優先的に増幅し、もう一方の産物が増幅しない場合もありうる。よって、上述の方法により1つの増幅産物で2箇所以上の一塩基多型を測定できることは、大きな利点となる。
NAT2 G590Aの多型部位をFP領域に設計し、NAT2 G857Aの多型部位をBPc領域に設計した11種類の核酸プライマーセットを用い、63℃で1時間、1.5時間及び2時間、増幅反応させた。反応は表1に記載した組成で行った。鋳型DNAにはヒトゲノムを用いた。コンタミネーションの有無、及び非特異的な増幅の有無を確認するため、全てのセットでヒトゲノムの代わりに滅菌超純水を添加したネガティブコントロールを作製した。増幅反応後、3%アガロース電気泳動により増幅産物を確認した。
表6の11種類のプライマーセットを用いて得られた増幅産物を電気泳動に供した。1時間増幅した場合、いずれのプライマーセットにおいても増幅は見られなかった。1.5時間増幅した場合、プライマーセット1、6、7、8で十分量の増幅産物が得られた。2時間増幅した場合には、プライマーセット1、2、3、4、5、6、7、8及び10で十分量の増幅産物が得られた。プライマーセット9、11では、2時間増幅した場合でも増幅は見られなかった。プライマーセットセット10においては、非特異増幅が見られた。1、2、3、4、5、6、7、8においては、非特異増幅が見られなかった。このことから、良好なプライマーセットは1、2、3、4、5、6、7及び8であり、最良のプライマーセットは1、6、7、8であることが明らかになった。上記の結果を表6にまとめた。
核酸プローブの鎖長は、短すぎても長すぎても好ましくない。塩基の種類により結合力に差はあるが、一般的に鎖長は長くなれば長くなるほど結合力は増加する。核酸プローブの鎖長が短すぎる場合、核酸プローブと増幅産物とハイブリ効率は低くなる。一方、核酸プローブの鎖長が長すぎる場合、野生型核酸プローブと変異型核酸プローブとの1塩基の差が小さくなる。そのため、野生型増幅産物と変異型核酸プローブとの非特異的な結合、また、変異型増幅産物と野生型核酸プローブとの非特異的な結合が増加する。よって、一塩基多型を検出するためには、例えば10〜35塩基のような、適切な鎖長の核酸プローブを用いることが好ましい。
PCR-RFLP(Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism)解析によってヘテロ型であると判明したヒトゲノムを鋳型に用い、G590A検出用プライマーセット9を用いて、63℃で1時間LAMP増幅を行った。G590A検出用プライマーセット9は上記試験1−2の結果、最良のプライマーであることが判明したセットである。得られた増幅産物を、電流検出型のDNAチップで検出した。
試験した核酸プローブの塩基配列を表7に示した。核酸プローブは、プラス鎖のものを用いた。核酸プローブは、電極に固定化するために3’末端をチオール修飾した。ネガティブコントロールプローブについては、NAT2遺伝子配列とは全く無関係な配列を示すものを使用した。
DNAチップ上に金電極を作製し、これに核酸プローブを固定化した。固定化は、チオールと金との強い結合性を利用して行った。末端をチオール修飾した核酸プローブを含むプローブ溶液を金電極上にスポットし、1時間静置後、1mMメルカプトヘキサノール溶液に浸し、その後、0.2×SSC溶液で洗浄した。同一プローブは2電極ずつスポットした。洗浄後、超純水で洗浄、風乾し、核酸プローブ固定化基体とした。
1−2電極 ネガティブプローブ(配列番号51)
3−4電極 野生型核酸プローブ 17mer (配列番号52)
5−6電極 野生型核酸プローブ 21mer (配列番号53)
7−8電極 野生型核酸プローブ 26mer (配列番号54)
9−10電極 野生型核酸プローブ 29mer (配列番号55)
11−12電極 変異型核酸プローブ 19mer (配列番号56)
13−14電極 変異型核酸プローブ 21mer (配列番号57)
15−16電極 変異型核酸プローブ 23mer (配列番号58)
17−18電極 変異型核酸プローブ 27mer (配列番号59)
19−20電極 変異型核酸プローブ 30mer (配列番号60)
増幅産物と核酸プローブのハイブリダイゼーション及び検出:
上記増幅によって得られた増幅産物に終濃度2×SSCの塩を添加し、電極に固定化された核酸プローブとハイブリダイゼーション反応させた。反応温度は、35℃、45℃、50℃、55℃、60℃とし、60分間反応させた。その後、超純水で軽く洗浄した。電極を挿入剤であるヘキスト33258溶液を50μM含むリン酸緩衝液中に10分間浸漬した後、洗浄し、ヘキスト33258分子の酸化電流応答を測定した。
結果を図13に示す。反応温度が上昇すると共に、得られる信号が増加した。よって、反応温度が高い程、ハイブリダイゼーションの効率が上昇することが示された。反応温度55℃と60℃では、ほぼ同じ結果であった。
次に、反応温度を55℃とし、反応時間を10分、20分、40分、60分、120分間として、試験5−1と同様に行った。
結果を図14に示す。反応時間10分と120分により得られた結果は、ほぼ同じであった。このことから、反応時間10分でハイブリダイゼーション反応が飽和状態に達することが明らかになった。
次に、反応温度55℃、反応時間20分で、試験5−1と同様にハイブリダイゼーションを行った。その後、核酸プローブ固定化基体を40℃、45℃、50℃の0.2×SSC洗浄バッファーに20分間浸漬して洗浄した。なお、本試験で増幅に用いた検体核酸は、PCR-RFLP解析により、野生ホモ型、変異ホモ型、ヘテロ型であると判明している3種類のヒトゲノムを用いた。
結果を図15A〜Cに示す。洗浄なし(超純粋で軽く洗浄しただけのもの)の場合、野生型の増幅産物が変異型核酸プローブによって検出され、同様に変異型の増幅産物が野生型核酸プローブから検出され、非特異的なハイブリダイゼーションが確認された。洗浄温度40℃の結果は、洗浄なしとほぼ同一であった。
PCR-RFLP解析によってヘテロ型であると判明したヒトゲノムを鋳型に用い、G857A検出用プライマーセット1及び5を用いて、63℃で1時間LAMP増幅を行った。G857A検出用プライマーセット1及び5は上記試験2の結果、最良のプライマーであることが判明したセットである。得られた増幅産物を、電流検出型のDNAチップで検出した。
試験した核酸プローブの塩基配列を表8に示した。核酸プローブは、プラス鎖のものを用いた。核酸プローブは、電極に固定化するために3’末端をチオール修飾した。ネガティブコントロールプローブについては、NAT2遺伝子配列とは全く無関係な配列を示すものを使用した。
核酸プローブ固定化基体は試験5−1と同様に作製した。
1−2電極 ネガティブプローブ(配列番号51)
3−4電極 野生型核酸プローブ 20mer (配列番号61)
5−6電極 野生型核酸プローブ 23mer (配列番号62)
7−8電極 野生型核酸プローブ 24mer (配列番号63)
9−10電極 野生型核酸プローブ 25mer (配列番号64)
11−12電極 野生型核酸プローブ 30mer (配列番号65)
13−14電極 変異型核酸プローブ 24mer (配列番号66)
15−16電極 変異型核酸プローブ 26mer (配列番号67)
17−18電極 変異型核酸プローブ 28mer (配列番号68)
19−20電極 変異型核酸プローブ 29mer (配列番号69)
21−22電極 変異型核酸プローブ 31mer (配列番号70)
増幅産物と核酸プローブのハイブリダイゼーション及び検出:
上記増幅によって得られた増幅産物に終濃度2×SSCの塩を添加し、電極に固定化された核酸プローブとハイブリダイゼーション反応させた。反応温度は、35℃、45℃、50℃、55℃、60℃とし、20分間反応させた。その後、超純水で軽く洗浄した。電極を挿入剤であるヘキスト33258溶液を50μM含むリン酸緩衝液中に10分間浸漬した後、洗浄し、ヘキスト33258分子の酸化電流応答を測定した。
結果を図16に示す。図16Aはプライマーセット1の結果であり、図16Bはプライマーセット5の結果である。反応温度が上昇すると共に、得られる信号が増加した。よって、反応温度が高い程、ハイブリダイゼーションの効率が上昇することが示された。反応温度55℃と60℃では、ほぼ同じ結果であった。
G857A検出用プライマーセット1および5を用いて増幅したLAMP産物を検出した結果、G857A検出用プライマーセット1と比較して5の方がよりハイブリに伴う信号増加が高かった。プライマーセット1と5で、信号増加量が異なる理由は不明である。原因の一つとして、増幅産物中の一本鎖部分の長さや、核酸プローブと結合する位置によって、ハイブリダイゼーションの効率が変化することが考えられる。或いは、増幅産物中に挿入されるヘキスト33258の量が若干異なる可能性も考えられる。
次に、プライマーセット5を用いて増幅した産物について、反応温度55℃、反応時間20分で、試験5−3と同様にハイブリダイゼーションを行った。その後、核酸プローブ固定化基体を45℃の0.2×SSC洗浄バッファーに20分間浸漬して洗浄した。なお、本試験で増幅に用いた検体核酸は、PCR-RFLP解析により、野生ホモ型、変異ホモ型、ヘテロ型であると判明している3種類のヒトゲノムを用いた。
結果を図17に示す。野生型増幅産物では、野生型核酸プローブ(23G、24G、25G)によって高い信号値が検出され、変異型核酸プローブ(26A、28A、29A)によってはほとんど信号値が検出されなかった。同様に、変異型増幅産物では、変異型核酸プローブ(26A、28A、29A)によって高い信号値が検出され、野生型核酸プローブ(23G、24G、25G)によってはほとんど信号値が検出されなかった。また、ヘテロ型の増幅産物では、野生型核酸プローブ(23G、24G、25G)および変異型核酸プローブ(26A、28A、29A)の双方により高い信号値が検出された。
シークエンス解析によって野生ホモ型、変異ホモ型、ヘテロ型であると判明したヒトゲノムを鋳型に用い、T341C検出用プライマーセット6及び10を用いて、63℃で1時間LAMP増幅を行った。T341C検出用プライマーセット6及び10は上記試験3の結果、最良のプライマーであることが判明したセットである。得られた増幅産物を、電流検出型のDNAチップで検出した。
試験した核酸プローブの塩基配列を表9に示した。核酸プローブは、プラス鎖のものを用いた。核酸プローブは、電極に固定化するために3’末端をチオール修飾した。ネガティブコントロールプローブについては、NAT2遺伝子配列とは全く無関係な配列を示すものを使用した。
核酸プローブ固定化基体は試験5−1と同様に作製した。
1−2電極 ネガティブプローブ(配列番号51)
3−4電極 野生型核酸プローブ 16mer (配列番号71)
5−6電極 野生型核酸プローブ 18mer (配列番号72)
7−8電極 野生型核酸プローブ 19mer (配列番号73)
9−10電極 野生型核酸プローブ 20mer (配列番号74)
11−12電極 変異型核酸プローブ 16mer (配列番号75)
13−14電極 変異型核酸プローブ 17mer (配列番号76)
15−16電極 変異型核酸プローブ 18mer (配列番号77)
17−18電極 変異型核酸プローブ 19mer (配列番号78)
19−20電極 変異型核酸プローブ 20mer (配列番号79)
増幅産物と核酸プローブのハイブリダイゼーション及び検出:
上記増幅によって得られた増幅産物に終濃度2×SSCの塩を添加し、電極に固定化された核酸プローブとハイブリダイゼーション反応させた。反応温度は、55℃で20分間反応させた。その後、45℃で20分洗浄した。この電極を挿入剤であるヘキスト33258溶液を50μM含むリン酸緩衝液中に10分間浸漬した後、洗浄し、ヘキスト33258分子の酸化電流応答を測定した。
結果を図18に示す。図18Aはプライマーセット6の結果であり、図18Bはプライマーセット10の結果である。野生型検出用核酸プローブ(18T、19T)及び、変異型検出用核酸プローブ(17C、18C、19C)で理想的な検出パターンを示した。野生型増幅産物においては、野生型検出用核酸プローブ(18T、19T)から高い信号増加が検出され、変異型検出用核酸プローブ(17C、18C、19C)では非特異的なハイブリが剥離され、信号増加はほとんど見られなかった。同様に、変異型増幅産物においては、変異型検出用核酸プローブ(17C、18C、19C)から高い信号増加が検出され、野生型検出用核酸プローブ(18T、19T)では非特異的なハイブリが剥離され、信号増加はほとんど見られなかった。また、ヘテロ型の増幅産物においては、野生型検出用核酸プローブ(18T、19T)および変異型検出用核酸プローブ(17C、18C、19C)から高い信号増加が検出された。また、T341C検出用プライマーセット6及び10のそれぞれを用いて得られた増幅産物は、ほぼ同一の検出パターンを示した。
PCR-RFLP解析によって野生ホモ型、変異ホモ型、ヘテロ型であると判明したヒトゲノムを鋳型に用い、G590AおよびG857A検出用プライマーセット6を用いて、63℃でLAMP増幅を行った。G590AおよびG857A検出用プライマーセット6は上記試験4の結果、最良のプライマーであることが判明したセットである。得られた増幅産物を、電流検出型のDNAチップで検出した。
G590A及びG857A検出用プライマーセットは、増幅に1.5時間近くかかる。よって、ループプライマーを導入し、増幅時間の短縮を検証した。ループプライマーは表6に記載のLBプライマー(配列番号80)を用い、25μl反応液中、40pmol添加した。増幅の結果、ループプライマーの導入により1時間以内で増幅することが明らかになった。
ループプライマーを導入して増幅したG590A及びG857A検出用プライマーセット6の増幅産物について、試験5及び6における検討の結果、最適な核酸プローブであることが判明している以下の核酸プローブを用いて検出した。
G590Aについては、表7に示す野生型検出用プローブ(配列番号54)、変異型検出用プローブ(配列番号59)を用い、G857Aについては、表8に示す野生型検出用プローブ(配列番号62)、変異型検出用プローブ(配列番号67)を用いた。G590A検出用核酸プローブはマイナス鎖のもの、G857A検出用核酸プローブはプラス鎖のものを用いた。核酸プローブは、電極に固定化するために3’末端をチオール修飾した。
核酸プローブ固定化基体は試験5−1と同様に作製した。
1−2電極 ネガティブプローブ(配列番号51)
3−4電極 野生型核酸プローブ 26mer (配列番号54)
5−6電極 変異型核酸プローブ 27mer (配列番号59)
7−8電極 野生型核酸プローブ 23mer (配列番号62)
9−10電極 変異型核酸プローブ 26mer (配列番号67)
増幅産物と核酸プローブのハイブリダイゼーション及び検出:
上記試験7と同様の方法で行った。
結果を図19に示す。G590A野生型検出用プローブ(配列番号54)、変異型検出用プローブ(配列番号59)、G857A野生型検出用プローブ(配列番号62)、変異型検出用プローブ(配列番号67)を用いることで、理想的な検出結果が得られた。
本発明が対象とする検体は特に限定される物ではなく、例えば、ヒトから採取した血液、血清、白血球、毛根、口腔粘膜などを用いることができる。これら検体試料から核酸成分の抽出を行い、標的核酸の検出試験に供される試料溶液を調製する。抽出方法は特に限定されないが、例えば、市販の核酸抽出方法QIAamp(QIAGEN社製)、スマイテスト(住友金属社製)等を利用することも可能である。
本発明の他の側面から、本発明の検出方法に用いるための、LAMP法のための上記プライマーセットを具備するキットが提供される。該キットは、任意に、鎖置換型DNA合成酵素、合成基質、及び緩衝溶液などを具備することができる。
また、該核酸プローブ又は核酸プローブ固定化基体をさらに具備する上記キットも提供される。
G590A、G857A、T341Cを同時に検出する試験を行った。G590A検出用核酸プライマーセット9(試験1−2)、G857A検出用核酸プライマーセット5(試験2)、又はT341C検出用核酸プライマーセット6及び10(試験3)のそれぞれを用いて、ヒトゲノムを63℃で1時間増幅した。ヒトゲノムは、PCR-RFLP解析またはシークエンス解析により、野生ホモ型、変異ホモ型、ヘテロ型であると判明している3種類のヒトゲノムを用いた。増幅反応後、3つの増幅産物を混合し、混合反応液を調製した。
この混合反応液を、G590A用の核酸プローブ、G857A用の核酸プローブ、及びT341C用の核酸プローブを用いる検出に供した。用いた核酸プローブは、次の通りである:
G590A 野生型核酸プローブ(配列番号54)、変異型核酸プローブ(配列番号59)、
G857A 野生型核酸プローブ(配列番号62)、変異型核酸プローブ(配列番号67)
T341C 野生型核酸プローブ(配列番号72)、変異型核酸プローブ(配列番号76)
核酸プローブは全てプラス鎖のものを用い、3’末端をチオール修飾した。
上記試験5−1に記載の方法と同様にプローブ核酸固定化電極を作製した。
1−2電極 ネガティブプローブ(配列番号51)
3−4電極 G590A野生型核酸プローブ 26mer (配列番号54)
5−6電極 G590A 変異型核酸プローブ 27mer (配列番号59)
7−8電極 G857A 野生型核酸プローブ 23mer (配列番号62)
9−10電極 G857A 変異型核酸プローブ 26mer (配列番号67)
11−12電極 T341C 野生型核酸プローブ 18mer (配列番号72)
13−14電極 T341C 変異型核酸プローブ 17mer (配列番号76)
増幅産物と核酸プローブのハイブリダイゼーション及び検出:
上記試験7と同様に行った。
結果を図20に示す。図20Aはプライマーセット9,5,6を用いた結果であり、図20Bはプライマーセット9,5,10を用いた結果である。G590A、G857A、T341Cの各型において、理想的な検出パターンを示した。このことから、DNAチップを用いてG590A、G857A、T341Cを同時検出できることが示された。
Claims (46)
- NAT2遺伝子の一塩基多型G590Aにおける遺伝子型を検出するための、LAMP増幅用核酸プライマーセットであって、
標的核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域及びF1領域、及び3’末端側から順にB3c領域、B2c領域及びB1c領域とし、
核酸プライマーが3’末端側に前記F2領域と同じ配列を有し且つ5’末端側に前記F1領域と相補的な配列を有するFIPプライマー、前記F3領域と同じ配列から成るF3プライマー、3’末端側に前記B2c領域と相補的な配列を有し且つ5’末端側に前記B1c領域と同じ配列を有するBIPプライマー、及び、前記B3c領域と相補的な配列から成るB3プライマーである場合に、
表2及び3に記載されたプライマーセット1〜16から選択されるFIPプライマー及びBIPプライマー、
前記標的核酸のF2領域の5’末端から60塩基以内の領域に結合するF3プライマー、及び、
前記標的核酸のB2c領域の3’末端から60塩基以内の領域に結合するB3プライマーを具備する、核酸プライマーセット。 - 前記FIPプライマー及びBIPプライマーが、表2及び3に記載されたプライマーセット3、4、及び9から選択される、請求項1に記載の核酸プライマーセット。
- 前記FIPプライマー及びBIPプライマーが、表3に記載されたプライマーセット9のプライマーである、請求項1に記載の核酸プライマーセット。
- NAT2遺伝子の一塩基多型G590Aにおける遺伝子型を検出するための、請求項1〜3の何れか一項に記載の核酸プライマーセットを具備するキット。
- 請求項1〜3の何れか一項に記載の核酸プライマーセットを使用して標的核酸を増幅する工程と、
得られた増幅産物に含まれる、野生型の増幅産物と変異型の増幅産物のそれぞれの量を測定し、比較する工程と
を具備する、NAT2遺伝子の一塩基多型G590Aにおける遺伝子型の検出方法。 - 前記増幅産物の測定が、基体に固定化された核酸プローブと該増幅産物とをハイブリダイゼーションさせ、該核酸プローブに結合した増幅産物の量を測定することによって行われ、
該核酸プローブが、前記野生型の増幅産物と相補的な野性型核酸プローブ、及び、前記変異型の増幅産物と相補的な変異型核酸プローブであることを特徴とする、請求項5に記載の検出方法。 - 前記野生型核酸プローブが62〜70℃のTm値を有し、前記変異型核酸プローブが61〜69℃のTm値を有し、且つ、前記一塩基多型G590A部位がそれぞれの核酸プローブの末端から3塩基以上内側に位置することを特徴とする、請求項6に記載の検出方法。
- 前記野生型核酸プローブが62〜66℃のTm値を有し、前記変異型核酸プローブが66〜67℃のTm値を有することを特徴とする、請求項7に記載の検出方法。
- 前記野生型核酸プローブが配列番号53又は54の配列又はそれらの相補配列から成り、前記変異型核酸プローブが配列番号59の配列又はその相補配列から成る、請求項6に記載の検出方法。
- 前記野生型核酸プローブが配列番号54の配列又はその相補配列から成り、前記変異型核酸プローブが配列番号59の配列又はその相補配列から成る、請求項9に記載の検出方法。
- NAT2遺伝子の一塩基多型G590Aにおける遺伝子型を検出するための野性型及び変異型の核酸プローブであって、
標的核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域及びF1領域、及び3’末端側から順にB3c領域、B2c領域及びB1c領域とし、
核酸プライマーが3’末端側に前記F2領域と同じ配列を有し且つ5’末端側に前記F1領域と相補的な配列を有するFIPプライマー、前記F3領域と同じ配列から成るF3プライマー、3’末端側に前記B2c領域と相補的な配列を有し且つ5’末端側に前記B1c領域と同じ配列を有するBIPプライマー、及び、前記B3c領域と相補的な配列から成るB3プライマーである場合に、
表2及び3に記載されたプライマーセット1〜16から選択されるFIPプライマー及びBIPプライマー、前記標的核酸のF2領域の5’末端から60塩基以内の領域に結合するF3プライマー、及び、前記標的核酸のB2c領域の3’末端から60塩基以内の領域に結合するB3プライマーから成る核酸プライマーセットを用いて標的核酸を増幅し、得られた増幅産物を検出するために用いられ、
前記野性型核酸プローブが、野生型の増幅産物と相補的であり、62〜70℃のTm値を有し、且つ、前記一塩基多型G590A部位がその末端から3塩基以上内側に位置することを特徴とし、
前記変異型核酸プローブが、変異型の増幅産物と相補的であり、61〜69℃のTm値を有し、且つ、前記一塩基多型G590A部位がその末端から3塩基以上内側に位置することを特徴とする、野性型及び変異型の核酸プローブ。 - 前記野生型核酸プローブが配列番号53又は54の配列又はそれらの相補配列から成り、前記変異型核酸プローブが配列番号59の配列又はその相補配列から成る、請求項11に記載の野性型及び変異型の核酸プローブ。
- 請求項11又は12に記載の野性型及び変異型の核酸プローブを固定化した核酸プローブ固定化基体。
- NAT2遺伝子の一塩基多型G857Aにおける遺伝子型を検出するための、LAMP増幅用核酸プライマーセットであって、
標的核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域及びF1領域、及び3’末端側から順にB3c領域、B2c領域及びB1c領域とし、
核酸プライマーが3’末端側に前記F2領域と同じ配列を有し且つ5’末端側に前記F1領域と相補的な配列を有するFIPプライマー、前記F3領域と同じ配列から成るF3プライマー、3’末端側に前記B2c領域と相補的な配列を有し且つ5’末端側に前記B1c領域と同じ配列を有するBIPプライマー、及び、前記B3c領域と相補的な配列から成るB3プライマーである場合に、
表4に記載されたプライマーセット1〜5から選択されるFIPプライマー及びBIPプライマー、
前記標的核酸のF2領域の5’末端から60塩基以内の領域に結合するF3プライマー、及び、
前記標的核酸のB2c領域の3’末端から60塩基以内の領域に結合するB3プライマーを具備する、核酸プライマーセット。 - 前記FIPプライマー及びBIPプライマーが、表4に記載されたプライマーセット5のプライマーである、請求項14に記載の核酸プライマーセット。
- NAT2遺伝子の一塩基多型G857Aにおける遺伝子型を検出するための、請求項14又は15に記載の核酸プライマーセットを具備するキット。
- 請求項14又は15に記載の核酸プライマーセットを使用して標的核酸を増幅する工程と、
得られた増幅産物に含まれる、野生型の増幅産物と変異型の増幅産物のそれぞれの量を測定し、比較する工程と
を具備する、NAT2遺伝子の一塩基多型G857Aにおける遺伝子型の検出方法。 - 前記増幅産物の測定が、基体に固定化された核酸プローブと該増幅産物とをハイブリダイゼーションさせ、該核酸プローブに結合した増幅産物の量を測定することによって行われ、
該核酸プローブが、前記野生型の増幅産物と相補的な野性型核酸プローブ、及び、前記変異型の増幅産物と相補的な変異型核酸プローブであることを特徴とする、請求項17に記載の検出方法。 - 前記野生型核酸プローブが59〜68℃のTm値を有し、前記変異型核酸プローブが58〜68℃のTm値を有し、且つ、前記一塩基多型G857A部位がそれぞれの核酸プローブの末端から3塩基以上内側に位置することを特徴とする、請求項18に記載の検出方法。
- 前記野生型核酸プローブが64〜65℃のTm値を有し、前記変異型核酸プローブが64〜66℃のTm値を有することを特徴とする、請求項19に記載の検出方法。
- 前記野生型核酸プローブが配列番号62、63又は64の配列又はそれらの相補配列から成り、前記変異型核酸プローブが配列番号67、68又は69の配列又はそれらの相補配列から成る、請求項20に記載の検出方法。
- 前記野生型核酸プローブが配列番号62の配列又はその相補配列から成り、前記変異型核酸プローブが配列番号67の配列又はその相補配列から成る、請求項21に記載の検出方法。
- NAT2遺伝子の一塩基多型G857Aにおける遺伝子型を検出するための野性型及び変異型の核酸プローブであって、
標的核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域及びF1領域、及び3’末端側から順にB3c領域、B2c領域及びB1c領域とし、
核酸プライマーが3’末端側に前記F2領域と同じ配列を有し且つ5’末端側に前記F1領域と相補的な配列を有するFIPプライマー、前記F3領域と同じ配列から成るF3プライマー、3’末端側に前記B2c領域と相補的な配列を有し且つ5’末端側に前記B1c領域と同じ配列を有するBIPプライマー、及び、前記B3c領域と相補的な配列から成るB3プライマーである場合に、
表4に記載されたプライマーセット1〜5から選択されるFIPプライマー及びBIPプライマー、前記標的核酸のF2領域の5’末端から60塩基以内の領域に結合するF3プライマー、及び、前記標的核酸のB2c領域の3’末端から60塩基以内の領域に結合するB3プライマーから成る核酸プライマーセットを用いて標的核酸を増幅し、得られた増幅産物を検出するために用いられ、
前記野性型核酸プローブが、野生型の増幅産物と相補的であり、59〜68℃のTm値を有し、且つ、前記一塩基多型G857A部位がその末端から3塩基以上内側に位置することを特徴とし、
前記変異型核酸プローブが、変異型の増幅産物と相補的であり、58〜68℃のTm値を有し、且つ、前記一塩基多型G857A部位がその末端から3塩基以上内側に位置することを特徴とする、野性型及び変異型の核酸プローブ。 - 前記野生型核酸プローブが配列番号62、63又は64の配列又はそれらの相補配列から成り、前記変異型核酸プローブが配列番号67、68又は69の配列又はそれらの相補配列から成る、請求項23に記載の野性型及び変異型の核酸プローブ。
- 請求項23又は24に記載の野性型及び変異型の核酸プローブを固定化した核酸プローブ固定化基体。
- NAT2遺伝子の一塩基多型T341Cにおける遺伝子型を検出するための、LAMP増幅用核酸プライマーセットであって、
標的核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域及びF1領域、及び3’末端側から順にB3c領域、B2c領域及びB1c領域とし、
核酸プライマーが3’末端側に前記F2領域と同じ配列を有し且つ5’末端側に前記F1領域と相補的な配列を有するFIPプライマー、前記F3領域と同じ配列から成るF3プライマー、3’末端側に前記B2c領域と相補的な配列を有し且つ5’末端側に前記B1c領域と同じ配列を有するBIPプライマー、及び、前記B3c領域と相補的な配列から成るB3プライマーである場合に、
表5に記載されたプライマーセット1〜10から選択されるFIPプライマー及びBIPプライマー、
前記標的核酸のF2領域の5’末端から60塩基以内の領域に結合するF3プライマー、及び、
前記標的核酸のB2c領域の3’末端から60塩基以内の領域に結合するB3プライマーを具備する、核酸プライマーセット。 - 前記FIPプライマー及びBIPプライマーが、表5に記載されたプライマーセット3、69及び10から選択される、請求項26に記載の核酸プライマーセット。
- 前記FIPプライマー及びBIPプライマーが、表5に記載されたプライマーセット6又は10のプライマーである、請求項26に記載の核酸プライマーセット。
- NAT2遺伝子の一塩基多型T341Cにおける遺伝子型を検出するための、請求項26〜28の何れか一項に記載の核酸プライマーセットを具備するキット。
- 請求項26〜28の何れか一項に記載の核酸プライマーセットを使用して標的核酸を増幅する工程と、
得られた増幅産物に含まれる、野生型の増幅産物と変異型の増幅産物のそれぞれの量を測定し、比較する工程と
を具備する、NAT2遺伝子の一塩基多型T341Cにおける遺伝子型の検出方法。 - 前記増幅産物の測定が、基体に固定化された核酸プローブと該増幅産物とをハイブリダイゼーションさせ、該核酸プローブに結合した増幅産物の量を測定することによって行われ、
該核酸プローブが、前記野生型の増幅産物と相補的な野性型核酸プローブ、及び、前記変異型の増幅産物と相補的な変異型核酸プローブであることを特徴とする、請求項30に記載の検出方法。 - 前記野生型核酸プローブが61〜69℃のTm値を有し、前記変異型核酸プローブが58〜70℃のTm値を有し、且つ、前記一塩基多型T341C部位がそれぞれの核酸プローブの末端から3塩基以上内側に位置することを特徴とする、請求項31に記載の検出方法。
- 前記野生型核酸プローブが66〜68℃のTm値を有し、前記変異型核酸プローブが63〜69℃のTm値を有することを特徴とする、請求項32に記載の検出方法。
- 前記野生型核酸プローブが配列番号72又は73の配列又はそれらの相補配列から成り、前記変異型核酸プローブが配列番号76、77又は78の配列又はそれらの相補配列から成る、請求項33に記載の検出方法。
- 前記野生型核酸プローブが配列番号72の配列又はその相補配列から成り、前記変異型核酸プローブが配列番号76の配列又はその相補配列から成る、請求項34に記載の検出方法。
- NAT2遺伝子の一塩基多型T341Cにおける遺伝子型を検出するための野性型及び変異型の核酸プローブであって、
標的核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域及びF1領域、及び3’末端側から順にB3c領域、B2c領域及びB1c領域とし、
核酸プライマーが3’末端側に前記F2領域と同じ配列を有し且つ5’末端側に前記F1領域と相補的な配列を有するFIPプライマー、前記F3領域と同じ配列から成るF3プライマー、3’末端側に前記B2c領域と相補的な配列を有し且つ5’末端側に前記B1c領域と同じ配列を有するBIPプライマー、及び、前記B3c領域と相補的な配列から成るB3プライマーである場合に、
表5に記載されたプライマーセット1〜10から選択されるFIPプライマー及びBIPプライマー、前記標的核酸のF2領域の5’末端から60塩基以内の領域に結合するF3プライマー、及び、前記標的核酸のB2c領域の3’末端から60塩基以内の領域に結合するB3プライマーから成る核酸プライマーセットを用いて標的核酸を増幅し、得られた増幅産物を検出するために用いられ、
前記野性型核酸プローブが、野生型の増幅産物と相補的であり、61〜69℃のTm値を有し、且つ、前記一塩基多型T341C部位がその末端から3塩基以上内側に位置することを特徴とし、
前記変異型核酸プローブが、変異型の増幅産物と相補的であり、58〜70℃のTm値を有し、且つ、前記一塩基多型T341C部位がその末端から3塩基以上内側に位置することを特徴とする、野性型及び変異型の核酸プローブ。 - 前記野生型核酸プローブが配列番号72又は73の配列又はそれらの相補配列から成り、前記変異型核酸プローブが配列番号76、77又は78の配列又はそれらの相補配列から成る、請求項36に記載の野性型及び変異型の核酸プローブ。
- 請求項36又は37に記載の野性型及び変異型の核酸プローブを固定化した核酸プローブ固定化基体。
- NAT2遺伝子の一塩基多型G590A及びG857Aにおける遺伝子型を検出するための、LAMP増幅用核酸プライマーセットであって、
標的核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域及びF1領域、及び3’末端側から順にB3c領域、B2c領域及びB1c領域とし、
核酸プライマーが3’末端側に前記F2領域と同じ配列を有し且つ5’末端側に前記F1領域と相補的な配列を有するFIPプライマー、前記F3領域と同じ配列から成るF3プライマー、3’末端側に前記B2c領域と相補的な配列を有し且つ5’末端側に前記B1c領域と同じ配列を有するBIPプライマー、及び、前記B3c領域と相補的な配列から成るB3プライマーである場合に、
表6に記載されたプライマーセット1〜8から選択されるFIPプライマー及びBIPプライマー、
前記標的核酸のF2領域の5’末端から60塩基以内の領域に結合するF3プライマー、及び、
前記標的核酸のB2c領域の3’末端から60塩基以内の領域に結合するB3プライマーを具備する、核酸プライマーセット。 - 前記FIPプライマー及びBIPプライマーが、表6に記載されたプライマーセット1、6、7及び8から選択される、請求項39に記載の核酸プライマーセット。
- 前記FIPプライマー及びBIPプライマーが、表6に記載されたプライマーセット6のプライマーである、請求項40に記載の核酸プライマーセット。
- NAT2遺伝子の一塩基多型G590A及びG857Aにおける遺伝子型を検出するための、請求項39〜41の何れか一項に記載の核酸プライマーセットを具備するキット。
- 請求項39〜41の何れか一項に記載の核酸プライマーセットを使用して標的核酸を増幅する工程と、
得られた増幅産物に含まれる、野生型の増幅産物と変異型の増幅産物のそれぞれの量を測定し、比較する工程と
を具備する、NAT2遺伝子の一塩基多型G590A及びG857Aにおける遺伝子型の検出方法。 - 前記増幅産物の測定が、基体に固定化された核酸プローブと該増幅産物とをハイブリダイゼーションさせ、該核酸プローブに結合した増幅産物の量を測定することによって行われ、
該核酸プローブが、前記野生型の増幅産物と相補的な野性型核酸プローブ、及び、前記変異型の増幅産物と相補的な変異型核酸プローブであることを特徴とする、請求項43に記載の検出方法。 - 前記野生型核酸プローブが配列番号54の配列又はその相補配列から成るG590A用の野性型核酸プローブ、及び、配列番号62の配列又はその相補配列から成るG857A用の野性型核酸プローブであり、前記変異型核酸プローブが配列番号59の配列又はその相補配列から成るG590A用の変異型核酸プローブ、及び、配列番号67の配列又はその相補配列から成るG857A用の変異型核酸プローブである、請求項44に記載の検出方法。
- NAT2遺伝子の一塩基多型G590A、G857A及びT341Cにおける遺伝子型を同時に検出する方法であって、
表3に記載されたプライマーセット9を使用して標的核酸を増幅する工程と、
表4に記載されたプライマーセット5を使用して標的核酸を増幅する工程と、
表5に記載されたプライマーセット6又は10を使用して標的核酸を増幅する工程と、
得られた増幅産物を混合して混合液を調製する工程と、
配列番号54の配列又はその相補配列から成るG590A用野生型核酸プローブ、配列番号59の配列又はその相補配列から成るG590A用変異型核酸プローブ、配列番号62の配列又はその相補配列から成るG857A用野生型核酸プローブ、配列番号67の配列又はその相補配列から成るG857A用変異型核酸プローブ、配列番号72の配列又はその相補配列から成るT341C用野生型核酸プローブ、及び、配列番号76の配列又はその相補配列から成るT341C用変異型核酸プローブが固定された核酸プローブ固定化基体と前記混合液を接触させ、前記増幅産物と前記核酸プローブとをハイブリダイゼーションさせる工程と、
前記それぞれの核酸プローブに結合した増幅産物の量を測定する工程と
前記G590A用野生型核酸プローブ及びG590A用変異型核酸プローブに結合した増幅産物の量を測定して比較する工程と、
前記G857A用野生型核酸プローブ及びG857A用変異型核酸プローブに結合した増幅産物の量を測定して比較する工程と、
前記T341C用野生型核酸プローブ及びT341C用変異型核酸プローブに結合した増幅産物の量を測定して比較する工程と、
を具備する、NAT2遺伝子の一塩基多型G590A、G857A及びT341Cにおける遺伝子型の同時検出方法。
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