JP4012008B2 - 複数のターゲット配列を含むターゲット核酸を検出する方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸断片、核酸プローブ固定化基体およびアッセイキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
特定の核酸配列を持った核酸鎖を検出するためには、先ず、検出対象の配列に相補的な１対の核酸プライマーを用いて増幅し、その後、電気泳動または検出対象の配列に対して相補的な核酸プローブを固定化した基板などを用いて増幅産物を確認または検出する方法が一般的に用いられている（特許第２５７３４４３号および特許第３１７１７９３）。その場合、特定の核酸鎖を特異的に検出するためには、１５塩基程度以上の連続する特異的な配列を有するプローブまたはプライマーが必要である。しかしながら、プライマーまたはプローブ設計ソフトなどを利用しても、変異や多型の多い領域では１５塩基の連続する特異的な配列を選択することは必ずしも容易には達成できない。そのために、最適な検出条件が設定できないという問題がある。
【０００３】
一方、プローブ固定化電極と電気化学的に活性な挿入剤を用いた電流検出型のＤＮＡチップが報告されている。この方法は標識が不要なためランニングコストが安いことと、蛍光検出の場合のような高価で大型の検出装置は不要であることなどがメリットとされている。このような電気化学的な検出では、核酸プローブは長い方が検出感度が高いと考えられているが、挿入剤が一本鎖のプローブ自身に対しても若干反応してしまう。従って、長いプローブを用いるとノイズが増加してしまい、検出感度が不十分であることなどが問題となっている。
【０００４】
また、長いプローブを使って特異的な反応を行なう際は、融解温度（Ｔｍ）が高くなってしまうことから、有害なジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミドなどの添加剤を加えて温度を低温にする必要がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記のような状況から、本発明の目的は、簡便且つ高感度に核酸鎖の検出および／または伸長を可能にする手段を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の目的は、以下のような本発明によって達成される。即ち、
第１のターゲット配列ｘ１と第２のターゲット配列ｘ２とを含むターゲット核酸にハイブリダイズさせるための核酸断片であって、ターゲット配列ｘ１に相補的な配列Ｘ１、任意の配列Ｙ、任意の配列Ｚ、前記配列Ｙに相補的な配列ｙ、およびターゲット配列ｘ２に相補的な配列Ｘ２を含みＸ１−Ｙ−Ｚ−ｙ−Ｘ２で表されることを特徴とする核酸断片；
第１のターゲット配列ｘ１から第ｎ＋１のターゲット配列ｘｎ＋１までの配列を含むターゲット核酸にハイブリダイズさせるための核酸断片であって、ターゲット配列ｘ１に相補的な配列Ｘ１、任意の配列Ｙ１、任意の配列Ｚ１および前記配列Ｙ１に相補的な配列ｙ１からなるＸ１−Ｙ１−Ｚ１−ｙ１から、ターゲット配列ｘｎに相補的な配列Ｘｎ、任意の配列Ｙｎ、任意の配列Ｚｎおよび前記配列Ｙｎに相補的な配列ｙｎからなるＸｎ−Ｙｎ−Ｚｎ−ｙｎまでの連続した配列と、更にターゲット配列ｘｎ＋１に相補的な配列Ｘｎ＋１を含み、Ｘ１−Ｙ１−Ｚ１−ｙ１・・・−Ｘｎ−Ｙｎ−Ｚｎ−ｙｎ−Ｘｎ＋１で表されることを特徴とする核酸断片（ここで、ｎは２以上の整数である）。
【０００７】
プライマーおよび核酸プローブからなる群より選択される試薬として上記の何れかの核酸断片を具備することを特徴とするアッセイキット；
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０からなる群より選択される配列に記載された塩基配列により表されるヒトＣ型肝炎ウイルスを検出するための核酸プローブ；並びに
配列番号２４、配列番号２５および配列番号２６からなる群より選択される配列に記載された塩基配列により表されるヒトＣ型肝炎ウイルス由来の核酸を増幅するためのプライマー；
である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
１．核酸断片
本発明の態様に従う核酸断片は、その一部の配列によりターゲット配列にハイブリダイズさせて使用するための核酸断片である。以下に、図１に示す１例を用いて本発明の態様に従う核酸断片について説明する。
【０００９】
本発明の態様に従う核酸断片がハイブリダイズしようとするターゲット核酸は、ターゲット配列ｘ１とターゲット配列ｘ２を含む。一方、本発明の態様に従う当該核酸断片は、ターゲット配列ｘ１に相補的な配列Ｘ１と、ターゲット配列ｘ２に相補的な配列Ｘ２を含み、それらの間に任意の配列Ｙとこれに相補的な配列ｙを含み、更にそれらの間に任意の配列Ｚを含む。即ち、当該核酸断片は、一般式「Ｘ１−Ｙ−Ｚ−ｙ−Ｘ２」によって表される。
【００１０】
ここで、ターゲット配列に含まれる配列「ｘ１」および配列「ｘ２」（ここでｘは小文字）と、当該核酸断片に含まれる配列「Ｘ１」および配列「Ｘ２」（ここでＸは大文字）は夫々互いに相補的である。当該核酸断片に含まれる配列「ｙ」（ここでｙは小文字）と配列「Ｙ」（ここでＹは大文字）は互いに相補的である。本明細書においては、便宜上、同じアルファベットを大文字と小文字で示した場合には、それらは互いに相補的な塩基配列からなる配列であることを示す。
【００１１】
ここで使用される「ターゲット配列」の語は、本発明の態様に従う核酸断片が結合するための塩基配列を示す。ここで使用される「ターゲット核酸」の語は、ターゲット配列を含む核酸を示す。
【００１２】
ここで使用される「核酸」の語は、ＤＮＡおよびＲＮＡ、Ｓ-オリゴ、メチルホスホネートオリゴ、ＰＮＡ（即ち、ペプチド核酸）およびＬＮＡ（即ち、ロック核酸）などの何れの核酸類似体など、一般的に、その一部の構造を塩基配列によって表されることが可能な物質を総括的に示す語である。また、そのような核酸は、天然に存在するものであっても、人工的に合成されたものであってもよい。
【００１３】
また、本発明の核酸断片は、一般的にそれ自身公知の方法により合成または産生されればよい。例えば、そのような方法は、一般的な核酸の合成に使用される核酸合成機を使用しても、一般的な大腸菌などを利用した遺伝子操作などの手段を利用してもよい。合成あるいは産生された核酸は、液体クロマトグラフィーや、マススペクトロスコピーなどで精製する事が望ましい。
【００１４】
ここで使用される「相補」、「相補的」および「相補性」の語は、複数の配列が、互いに１００％で相補的であることを示す。また、ここで使用される「相同」、「相同的」および「相同性」の語は、複数の配列が、互いに１００％で相同であることを示す。
【００１５】
配列Ｘ１と配列Ｘ２の夫々の長さは、特に限定されるものではないが、約５塩基から約５０塩基の範囲であればよく、好ましくは約５塩基から約９塩基である。
【００１６】
配列Ｙと配列ｙの夫々の長さは、特に限定されるものではないが、約３塩基から約５０塩基の範囲であればよく、好ましくは約５塩基から約１０塩基である。
【００１７】
配列Ｙと配列ｙの相補性が高いほどターゲット配列に結合した際の安定性が高まる。
【００１８】
配列Ｚの長さは、特に限定されるものではないが、約３塩基から約５０塩基であればよく、好ましくは約４塩基から約１０塩基である。
【００１９】
従来使用される核酸の特異的な検出および増幅には、通常、約１５塩基長以上の連続した配列が必要とされる。しかしながら、本発明により開示される当該核酸断片の場合、９塩基長以下の連続した配列であったとしても、ターゲット配列を特異的に検出並びに増幅および伸長が可能である。
【００２０】
また、本発明に従う核酸断片は、ターゲット配列とのハイブリダイゼーションには関与しない配列Ｙおよび配列ｙ並びに配列Ｚを有する。これらの配列を有することで、当該核酸断片内において二本鎖構造、即ち、ヘアピン構造が得られる。
【００２１】
上述の例においては、当該核酸断片内におけるヘアピン構造が１つ含まれ得る例を示したが、それに限定するものではなく、１つの核酸断片内に複数のヘアピン構造が含まれてもよい。その場合、隣合うヘアピン構造の間には、ターゲット配列に相補的な配列が存在していることが好ましい。
【００２２】
例えば、第１のターゲット配列ｘ１から第ｎ＋１のターゲット配列ｘｎ＋１までの配列を含むターゲット核酸にハイブリダイズさせるための核酸断片の場合、第１のターゲット配列ｘ１に相補的な配列Ｘ１と、配列Ｙ１と、配列Ｚ１と、および前記配列Ｙ１に相補的な配列ｙ１とからなるＸ１−Ｙ１−Ｚ１−ｙ１から、第ｎのターゲット配列ｘｎに相補的な配列Ｘｎと、配列Ｙｎと、配列Ｚｎと、および前記配列Ｙｎに相補的な配列ｙｎとからなるＸｎ−Ｙｎ−Ｚｎ−ｙｎまでの連続した配列に、更に第ｎ＋１のターゲット配列ｘｎ＋１に相補的な配列Ｘ（ｎ＋１）を含むような核酸断片、即ち、Ｘ１−Ｙ１−Ｚ１−ｙ１−・・・−Ｘｎ−Ｙｎ−Ｚｎ−ｙｎ−Ｘｎ＋１で表される核酸断片であってもよい。ここで、ｎは２以上の整数である。また、配列Ｙ１から配列Ｙｎまでの配列は互いに等しい配列であってもよく、互いに異なる配列であってもよく、その一部が互いに等しい配列であってもよい。
【００２３】
以上のような本発明の態様に従う核酸断片は、ターゲット配列を検出するための核酸プローブ、またはターゲット配列を含むターゲット核酸に対する相補鎖を伸長するための、若しくはターゲット核酸およびその相補鎖を増幅するためのプライマーとして好ましく使用され得る。
【００２４】
そのような核酸プローブにより検出またはプライマーにより増幅される対象となるターゲット配列またはターゲット核酸は、どのような種類の核酸であってもよく、また、ターゲット配列および／またはターゲット核酸の検出または増幅の対象とされるような核酸が含まれる核酸試料であればよい。
【００２５】
ここで使用される「核酸試料」の語は、核酸を含む試料を示す。核酸試料は、個体から採取した試料、例えば、末梢静脈血等の血液、白血球、血清、尿、糞便、精液、唾液、細胞、臓器および組織など、並びに培養細胞などから、核酸を含有する試料にそれ自身公知の方法によって調製されればよい。ここで使用される「個体」の語は、ヒト、ヒト以外の動物及び植物、並びにウイルス、細菌、バクテリア、酵母及びマイコプラズマ等の微生物であってもよい。また、人工的に合成された核酸を含む試料であってもよい。また試料は、必要に応じて、ホモジネートおよび抽出などの必要な任意の前処理を行ってもよい。このような前処理は試料に応じて当業者によって選択され得る。
【００２６】
２．核酸プローブ
本発明の態様に従う核酸プローブは、ターゲット配列を検出するための手段として使用される。即ち、当該核酸プローブは、検出の目的とされるターゲット配列に相補的な配列を有する。従って、ターゲット配列にハイブリダイズすることが可能である。その後、生じたハイブリダイゼーションを検出することにより、試料核酸中にターゲット配列および／またはターゲット配列を含むターゲット核酸が存在することを検出することが可能である。
【００２７】
ここで使用される「ハイブリダイゼーションを検出する」の語は、ハイブリダイゼーションにより生じた二本鎖核酸を検出すること、または試料核酸を予め何れかの標識物質により標識しておいて、ハイブリダイゼーション後にその標識物質に由来する信号を検出すること、或いはそれ自身公知の他の手段により、反応によって二本鎖核酸が存在することまたはハイブリダイゼーションが生じたことを検出することを総括的に示す語であり、何れの手段により検出が達成されてもよい。
【００２８】
本発明の態様に従う核酸プローブは、上述した本発明に従う核酸断片の他に更なる配列を含んでもよい。また、Ｃｙ５、Ｃｙ３などの蛍光物質、色素物質、磁気性物質、並びにアビジンおよびビオチンなどの互いに特異的に結合する１対の物質の一方を標識物質として付与されてもよい。また、ハプテン、オキシダーゼ若しくはホスファターゼ等の酵素、またはフェロセン若しくはキノン類のが付与されていてもよい。そのような修飾がなされた核酸プローブも本発明として提供される。
【００２９】
また、本発明に従う核酸プローブは、基体に固定化されて使用されてもよい。そのような核酸プローブ固定化基体も本発明の態様として提供される。
【００３０】
３．核酸プローブ固定化基体
本発明の態様において提供され得る核酸プローブ固定化基体は、基本的には、基体と、前記基体に固定化された核酸プローブとからなる。好ましくは前記核酸プローブは前記基体に固定化される。また、当該核酸プローブを具備した核酸プローブ固定化基体も本発明の態様として提供される。
【００３１】
核酸プローブ固定化基体は、一般的にはＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイまたはＤＮＡマクロアレイと称されるそれ自身公知の装置を利用してもよい。また、マイクロビーズや、マイクロタイタープレートなどをプローブの固定化基体として用いることも可能である。
【００３２】
ここで「核酸プローブ」とは、ターゲット配列に相補的な塩基配列を含む核酸であって、基体に固定化されるための核酸断片をいう。核酸プローブは、目的とするターゲット配列に相補的な配列を有し、それによって適切な条件下でターゲット配列とハイブリダイズすることが可能である。
【００３３】
ここで「ターゲット配列」とは、その存在を検出したい塩基配列、または核酸プローブの塩基配列によって捕捉しようとする配列を指す。また、そのようなターゲット配列を含む核酸をターゲット核酸と称す。例えば、プライマーに具備されるタグの塩基配列をターゲット配列とする場合には、核酸プローブの配列は所望のタグの配列に相補的な配列とすればよい。
【００３４】
ここで使用される「相補」、「相補的」および「相補性」の語は、５０％〜１００％の範囲で相補的あればよく、好ましくは１００％で相補的であることをいう。また、ここで使用される「相同」、「相同的」および「相同性」の語は５０％〜１００％の範囲で相同であればよく、好ましくは１００％で相同的であることをいう。
【００３５】
本発明の態様において使用される核酸プローブ固定化基体について、例を用いて以下に説明する。
【００３６】
（１）第１の例
図２に本発明の態様に従い使用され得る核酸プローブ固定化基体の第１の例を模式的に示した。第１の例である核酸プローブ固定化基体は、基体１とその固定化領域２に固定化された核酸プローブとを具備する（図２）。
【００３７】
このような核酸プローブ固定化基体は、例えば、それ自身公知の手段によりシリコン基板などの基体に対して核酸プローブを固定化することにより製造することが可能である。
【００３８】
本態様においては、１つの基体に配置する核酸プローブの数はこれに限定するものではなく、所望に応じて変更してもよく、また、複数種類の塩基配列を有する核酸プローブを１つの基体に配置してもよい。複数および／または複数種類の核酸プローブの基体への固相パターンは、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。そのような核酸プローブ固定化基体も本発明の範囲内である。
【００３９】
（２）第２の例
図３を用いて、本発明の態様において使用され得る核酸プローブ固定化基体の第２の例を説明する。第２例である核酸プローブ固定化基体は、基体１１に具備された電極１２に固定化された核酸プローブを具備する（図３）。電極１２は、電気的情報を取り出すためのパット１３に接続されている。
【００４０】
このような核酸プローブ固定化基体は、例えば、それ自身公知の手段によりシリコン基板などの基体に電極を配置し、その電極表面に対して核酸プローブを固定化することにより製造することが可能である。
【００４１】
本態様においては、電極の数を１０としたが１つの基体に配置する電極の数はこれに限定するものではない。また、電極の配置パターンも図３に示したものに限定されるものではなく、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。必要に応じて参照電極および対極を設けてもよい。そのような核酸プローブ固定化基体も本発明の範囲内である。
【００４２】
上記の例に記載するような蛍光検出を行うための核酸プローブ固定化基体の場合は、上記の何れかの基体に対して核酸プローブを固定化すればよい。また、上記の第１の例に記載するような電気化学的検出を行うための核酸プローブ固定化基体の場合は、上記の何れかの基体に電気化学的な検出が可能であるように電極を配置し、その電極上に核酸プローブを固定化すればよい。
【００４３】
本発明において使用され得る電極は、特に限定されるものではないが、例えば、グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバーのような炭素電極、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウムのような貴金属電極、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛のような酸化物電極、Si、Ge、 ZnO、 CdS、 TiO₂ 、GaAsのような半導体電極、チタン等が挙げられる。これらの電極は導電性高分子によって被覆しても、単分子膜によって被覆してもよく、所望に応じてその他の表面処理剤を処理してもよい。
【００４４】
核酸プローブの固定は、それ自身公知の何れの手段によっても行ってよい。例えば、核酸プローブの固定は、処理または無処理の基体または電極表面に対して、共有結合、イオン結合または物理吸着等によって直接固定化してもよい。或いは、核酸プローブの固定を助けるリンカー剤を用いてもよく、基板または電極に対してスペーサーを介して核酸プローブを固定化してもよい。また、電極に対する試料核酸の非特異的な結合を防止するためのブロッキング剤をリンカー剤と共に電極に処理してもよい。また、ここで使用されるリンカー剤およびブロッキング剤は、例えば、電気化学的検出を有利に行うための物質であってもよい。
【００４５】
また、異なる塩基配列を有する核酸プローブは、それぞれ、異なる電極に対して固定化されてもよく、異なる塩基配列を有する複数種類の核酸プローブが混合された状態で１つの電極に対して固定化されてもよい。
【００４６】
（３）検出
本発明に従う核酸プローブ固定化基体は、前記基体に固定化された核酸プローブとターゲット核酸との間のハイブリダイゼーション反応の結果生じた二本鎖の存在を検知するための手段として、電気化学的方法および蛍光検出法を利用することが可能である。
【００４７】
（ａ）電気化学的検出
電気化学的による二本鎖核酸の検出は、例えば、それ自身公知の二本鎖認識物質を用いて行えばよい。
【００４８】
ここで用いられる二本鎖認識体は特に限定されるものではないが、例えば、ヘキスト３３２５８、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーターおよびポリインターカレーター等を用いることが可能である。更に、これらのインターカレーターを電気化学的に活性な金属錯体、例えば、フェロセン、ビオロゲン等で修飾しておくことも可能である。また、その他の公知の何れの二本鎖認識物質も本発明において好ましく使用される。
【００４９】
本発明に従う核酸プローブ固定化基体では、核酸プローブが電極に対して固定化されている。このような電極を用いての二本鎖核酸の検出は他の一般的な電気化学的検出法と同じように、更に対極や参照極を使用してもよい。参照極を配置する場合、例えば、銀／塩化銀電極や水銀／塩化水銀電極などの一般的な参照極を使用してよい。
【００５０】
続いて、適切なハイブリダイゼーションが可能な条件下で反応を行う。そのような適切な条件は、ターゲット配列に含まれる塩基の種類、核酸プローブ固定化基体に具備される核酸プローブの種類、試料核酸の種類およびそれらの状態などの諸条件に応じて、当業者であれば適宜選択することが可能である。これに限定されるものではないが、例えば以下のような条件下で反応を行ってもよい。
【００５１】
即ち、ハイブリダイゼーション反応溶液は、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液中で行う。この溶液中にはハイブリダイゼーション促進剤である硫酸デキストラン、並びに、サケ精子ＤＮＡ、牛胸腺ＤＮＡ、ＥＤＴＡおよび界面活性剤などを添加してもよい。ここに得られた試料核酸を添加し、９０℃以上で熱変性させる。熱変性された試料核酸への核酸プローブ固定化基体の挿入は、変性直後、あるいは０℃に急冷後に行ってもよい。また、基体上に液を滴下することでハイブリダイゼーション反応を行うことも可能である。
【００５２】
反応中は、撹拌、あるいは振とうなどの操作で反応速度を高めてもよい。反応温度は、例えば、１０℃〜９０℃の範囲で、反応時間は１分以上１晩程度で行えばよい。ハイブリダイゼーション反応後、電極を洗浄する。洗浄には、例えば、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いればよい。試料核酸中にターゲット配列を含むターゲット核酸が存在した場合、核酸プローブとハイブリダイズし、それにより二本鎖核酸が生じる。
【００５３】
続いて、電気化学的手段により、以下のような手順で生じた二本鎖核酸の検出を行う。一般的には、ハイブリダイゼーション反応の後に、基体を洗浄し、電極表面に形成された二本鎖部分に二本鎖認識体を作用させて、それにより生じる信号を電気化学的に測定する。
【００５４】
二本鎖認識体の濃度は、その種類によって異なるが、一般的には１ｎｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの範囲で使用する。この際には、イオン強度０．００１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いればよい。
【００５５】
例えば、電気化学的な測定は、二本鎖認識体が電気化学的に反応する電位以上の電位を印加し、二本鎖認識体に由来する反応電流値を測定してよい。この際、電位は定速で掃引するか、あるいはパルスで印加するか、あるいは、定電位を印加してもよい。測定の際に、例えば、ポテンショスタット、デジタルマルチメーターおよびファンクションジェネレーター等の装置を用いて電流、電圧を制御してもよい。例えば、得られた電流値を基に、検量線からターゲット核酸の濃度を算出してもよい。
【００５６】
このような電気化学的な核酸検出方法において、本発明の態様に従うヘアピン構造を有するヘアピン構造を有する核酸プローブ（ヘアピンプローブとも称される）を使用することにより、挿入剤を使用する電気化学的な核酸検出方法の高感度化が達成される。即ち、ハイブリダイゼーション反応前は、核酸プローブは通常一本鎖の構造を形成している。しかしながら、ターゲット配列と結合、即ち、ハイブリダイズすることによって、ターゲット配列と当該核酸プローブとの間に二本鎖構造が形成されると共に、核酸プローブの内部にも二次構造（即ち、二本鎖）が形成される。このような構造によって、プローブがヘアピン構造を形成していないものに比べ、より多くの挿入剤が結合可能となる。それによって、結果的に電流信号の増大、高感度化が達成される。
【００５７】
また、本発明の態様に従うと、特異性を維持しながらＴｍを低温に設定することが可能であるので、特別な更なる試薬を添加することなく、低温でハイブリダイゼーション反応を達成することが可能である。ＰＣＲ反応を行うことが可能である。
【００５８】
また、それ自体公知の電気化学的検出手段、例えば、以下の文献に開示されている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． １９９４， Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． １９９８）手段なども本発明の方法において好ましく使用できる。当該文献において、橋本らは、ＤＮＡプローブで修飾された金電極と電気化学的に活性な色素を用いる配列特異的遺伝子検出を報告した。色素に由来する陽極の電流は、ターゲットＤＮＡの濃度に相関する。また、ワンらは、インディケーターフリーの電気化学的なＤＮＡのハイブリダイゼーションを報告した。このバイオセンサーの構成は、カーボンペースト電極へのイノシン置換プローブ（グアニンを含まない）の固定化と、当該標識のグアニン酸化ピークの存在による二重鎖の形成のクロノポテンショメトリック検出を含む。これらの文献に記載される検出手段は好ましく本発明において使用されてよい。
【００５９】
（ｂ）蛍光検出法
蛍光標識物質を用いる方法の場合には、アンチセンスプライマーを、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５若しくはローダミンなどの蛍光色素などの蛍光学的な活性が得られる物質で標識しておいてもよい。或いは、その標識の代わりに前述した物質で標識したセカンドプローブを用いることで検出を行ってもよい。複数の標識物質を同時に使用してもよい。
【００６０】
幾つかの態様においては、試料から抽出した核酸成分と核酸プローブ固定化チップに固定化された核酸プローブとのハイブリダイゼーション反応は、例えば、以下のように行う。即ち、ハイブリダイゼーション反応溶液は、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液中で行う。この溶液中にはハイブリダイゼーション促進剤である硫酸デキストラン、並びに、サケ精子ＤＮＡ、牛胸腺ＤＮＡ、ＥＤＴＡおよび界面活性剤などを添加してもよい。ここに抽出した核酸成分を添加し、９０℃以上で熱変性させる。核酸プローブ固定化チップの挿入は、変性直後、あるいは０℃に急冷後に行ってよい。また、基体上に液を滴下することでハイブリダイゼーション反応を行うことも可能である。反応中は、撹拌、あるいは振とうなどの操作で反応速度を高めてもよい。反応温度は、例えば、１０℃〜９０℃の範囲で、反応時間は１分以上１晩程度で行えばよい。ハイブリダイゼーション反応後、洗浄を行う。洗浄には、例えば、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いる。
【００６１】
蛍光検出の場合、ハイブリダイゼーション反応の検出は、標識の種類に応じた適宜の検出装置を用いて、試料中の標識された塩基配列又は２次プローブ中の標識を検出することによって行う。標識が蛍光物質の場合には、例えば、蛍光検出器を用いて標識を検出すればよい。
【００６２】
本発明に従う核酸プライマーを使用すると、特異性を維持しながらＴｍを低温に設定することが可能である。従って、特別な更なる試薬を添加することなく、低温でハイブリダイゼーション反応を達成することが可能である。ＰＣＲ反応を行うことが可能である。
【００６３】
また、本発明の核酸断片、核酸プローブおよび／または核酸プローブ固定化基体を使用したターゲット核酸の検出方法も本発明の態様として提供される。
【００６４】
４．プライマー
本発明の態様に従う核酸断片は、ターゲット核酸に含まれるターゲット配列にハイブリダイズして、核酸を伸長するためのプライマーとして使用されてもよい。
【００６５】
ここで使用される「核酸を伸長する」の語は、鋳型核酸と、その一部の塩基配列に相補的なプライマーとを用いて、ポリメラーゼを作用させることにより、目的とする核酸を伸長することをいい、更に、そのような伸長と、そのような伸長が繰り返し行われる増幅の両方を示す。
【００６６】
本発明の態様に従って利用され得る伸長反応は、それ自体公知の一般的に核酸を伸長するために使用される手段であっても、および核酸を増幅するために使用される手段であってもよく、そのような手段で有れば何れも使用してよい。これらに限定するものではないが、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（一般的にＰＣＲと称される、以下、ＰＣＲと記す）や逆転写ＰＣＲなどを利用した方法を用いることが可能である。また更に、Nucleic acid strand amplification（ＮＡＳＢＡ）、Transcription mediated amplification（ＴＭＡ）、Ligase chain reaction（ＬＣＲ）、Strand displacement amplification（ＳＤＡ）、Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids（ＩＣＡＮＮ）および Rolling circle amplification（ＲＣＡ）法などの手段も本発明の態様に従って利用することが可能である。
【００６７】
ここで使用される「適切に伸長反応が得られる条件」とは、ポリメラーゼが核酸鎖を合成するための各種条件、例えば、温度、ｐＨ、塩濃度およびｄＮＴＰなどの条件が、ポリメラーゼの活性を適切に得るために十分であるような状態を示す。
【００６８】
また更に、当該プライマーの５’端に、塩基配列からなるタグや、Ｃｙ５、Ｃｙ３等の蛍光物質、色素物質、磁気性物質、並びにアビジンおよびビオチンなどの互いに特異的に結合する１対の物質の一方が標識物質として付与されてもよい。また、ハプテン、オキシダーゼ若しくはホスファターゼ等の酵素、またはフェロセン若しくはキノン類が付与されていてもよい。そのような修飾がなされたプライマーも本発明の態様として提供される。
【００６９】
本発明に従う核酸プライマーを使用すると、特異性を維持しながらＴｍを低温に設定することが可能である。従って、特別な更なる試薬を添加することなく、低温で伸長反応を達成することが可能である。
【００７０】
５．アッセイキット
本発明はまた、上述したような本発明の何れの態様に従うプライマー、核酸プローブ、核酸プローブ固定化基体は、使用目的に応じて適切なキットとして提供されてもよい。
【００７１】
例えば、本発明に従うプライマーの場合は、反応容器および／または緩衝液用塩類および／またはその他の必要な試薬、例えば、ポリメラーゼおよび／または基質などと組み合わせてキットを形成し、提供されてもよい。例えば、タグ配列、プライマーおよび伸長産物またはその一部に相補的な配列を含む核酸プローブなども、基板および／または種々の試薬および／または標識物質などと食い合わせてキットを形成し、本発明として提供されてもよい。上記のプライマーと所望の核酸プローブおよび／または核酸プローブ固定化基体を所望に応じて組み合わせてキットとして提供されてもよい。しかしながら、本発明により提供されるキットは、以上の組み合わせに限定されるものではなく、必要に応じて種々のものと組み合わせてキットとして提供されてもよい。また、使用目的もこれに限定するものではなく、上述した何れの目的に対するキットを形成することが可能である。そのようなキットも本発明の範囲に含まれる。
【００７２】
【実施例】
実施例１
図２は、本発明の態様に従う核酸プローブ固定化基体の例である。図２はＣ型肝炎ウイルス（以下、ＨＣＶと記す）の型判定を行うための、所謂、ＤＮＡチップである。図２Ａの核酸プローブ固定化基体Ａの夫々の固相化領域２には、領域毎に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０の核酸配列からなる合成オリゴヌクレオチドプローブを固定した。ＨＣＶの１ｂ型に反応するプローブは配列番号１、配列番号４および配列番号６であり、ＨＣＶの２ａ型に反応するプローブは配列番号２、配列番号５、配列番号７および配列番号９であり、ＨＣＶの２ｂ型に反応するプローブは配列番号３、配列番号５、配列番号８、配列番号１０である（図２Ａ）。またここで、配列番号５からなるプローブはＨＣＶ２ａおよび２ｂの両方に反応する。これらのプローブの末端にアミノ基を導入し、ポリリジン処理したスライドガラス上にスポット後、乾燥固定した。
【００７３】
また、対象として、図２Ｂに示す核酸プローブ固定化基体Ｂの固定化領域２に対して、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０の塩基配列からなる核酸プローブを固定化した（図２Ｂ）。
【００７４】
実施例２
実施例１において作製した核酸プローブ固定化基体を用いて、ＨＣＶのタイピングを行った。血清中から抽出したＨＣＶのゲノムを、配列番号２１および配列番号２２のプライマーで増幅した後、配列ビオチン標識した配列番号２３とｃｙ５で標識した配列番号２２のプライマーとを用いて再ＰＣＲ反応を行った。反応後、アビジン修飾磁気微粒子（Magnotex-SA、宝酒造）を用いて一本鎖ＤＮＡを得た。Ｃｙ５標識したターゲットを２ｘＳＳＣ溶液に溶解し、図２ＡおよびＢに記載の核酸プローブ固定化基体ＡおよびＢに対して反応させ、ＨＣＶの型判定を行った。その結果、従来の核酸プローブ固定化基体Ｂでは最適温度が４０℃であったのに対し、本発明に従う核酸プローブ固定化基体Ａでは、３５℃で特異性が最も高くなった。また、蛍光強度では、核酸プローブ固定化基体Ａと核酸プローブ固定化基体Ｂとでほぼ同程度であった。
【００７５】
実施例３
図３は、本発明の態様に係る電気化学的検出用の核酸プローブ固定化基体の概略構成を示す図である。当該図３は核酸プローブ固定化基体は、基板１１に配置された電極１２と、当該電極１２に固定化された核酸プローブとを具備する。核酸プローブの電極への固定化は、各核酸プローブの末端にチオール基を導入し、パターニングした金電極上に固定することにより行った。
【００７６】
本実施例で使用した核酸プローブはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の型判定を行うための核酸プローブである。図２に示す核酸プローブ固定化基体Ｃの夫々の電極には、電極毎に配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０に記載の塩基配列により表される合成オリゴヌクレオチドプローブが固定化された（図３Ｃ）。ＨＣＶの１ｂ型に反応するプローブは配列番号１、配列番号４および配列番号６であり、ＨＣＶの２ａ型に反応するプローブは配列番号２、配列番号５、配列番号７および配列番号９であり、ＨＣＶの２ｂ型に反応するプローブは配列番号３、配列番号５、配列番号８および配列番号１０である。ここで配列番号５からなるプローブ５は２ａおよび２ｂの両方に反応する。
【００７７】
対象として、核酸プローブ固定化基体Ｄには、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０の核酸配列からなる合成オリゴヌクレオチドプローブを固定化した（図３Ｄ）。
【００７８】
実施例４
上述の実施例３で作製した核酸プローブ固定化基体ＣおよびＤを用いて、ＨＣＶのタイピングを行った。血清中から抽出したＨＣＶのゲノムを、配列番号２１および配列番号２２のプライマーで増幅した後、配列ビオチン標識した配列番号２３と配列番号２２のプライマーで再ＰＣＲ反応を行った。反応後、アビジン修飾磁気微粒子（Magnotex-SA、宝酒造）を用いて一本鎖ＤＮＡを得た。一本鎖ターゲットを２ｘSSC溶液に溶解し、核酸プローブ固定化基体Ｃおよび核酸プローブ固定化基体Ｄの上でハイブリダイゼーション反応を行った。最後にヘキスト３３２５８の電流測定を行った。その結果、核酸プローブ固定化基体Ｄでは最適温度が４０℃であったが、核酸プローブ固定化基体Ｃでは３５℃で特異性が最も高くなった。電流強度は、核酸プローブ固定化基体Ｃの方が核酸プローブ固定化基体Ｄの約１．２倍となり、バックグラウンド電流も低下した。以上の結果からハイブリダイゼーション効率の向上とバックグランドの低下が確認できた。
【００７９】
以上のように本発明の核酸プローブを使用すれば、従来よりも検出感度が向上された。これは、当該核酸プローブがターゲット配列に結合したことにより生じたヘアピン構造のため、従来のプローブに比較してより多くの挿入剤が結合され、その結果、電流強度が増加し、電流信号が増大されたためであると示唆される。
【００８０】
実施例５
血清中から抽出したＨＣＶのゲノムを、配列番号２１、配列番号２２のプライマーで増幅した後、配列番号２３と配列番号２２のプライマーで再ＰＣＲ反応を行った。また、配列番号２４および配列番号２５のプライマーで増幅した後、配列番号２６と配列番号２５のプライマーで再ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応のアニーリング温度は５５℃と６０℃で行った。これらのＰＣＲ産物を電気泳動で解析した結果、配列番号２１および配列番号２２の場合では、５５℃では非特異的な増幅がみられ、６０℃では非特異的な信号は見られないが、収量は少なかった。これに対し配列番号２４および配列番号２５のプライマーを用いた場合では、５５℃でも特異的で増幅効率も高いことが分かった。以上のように、本発明に基づくプライマーを用いると、ＰＣＲ反応を低温でも特異的且つ高効率に行うことが可能である。
【００８１】
従って、簡便且つ高感度に核酸鎖の検出および／または伸長を可能にする手段が提供された。また、このような本発明に従う種々の手段は簡便且つ高感度な上に安価に所望の検出および／または伸長を達成することが可能である。
【００８２】
【発明の効果】
本発明により、特異的にターゲット配列に結合する核酸断片、特異的且つ高感度にターゲット配列を検出するための核酸プローブ、特異的且つ効率的にターゲット配列にハイブリダイズし、伸長するためのプライマー、並びにそれらを具備するキットが提供された。
【００８３】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の態様に従う核酸断片の１例の概略構成を示す図。
【図２】 実施例１および２に係る核酸プローブ固定化基体の概略構成を示す平面図。
【図３】 実施例３および４に係る核酸プローブ固定化基体の概略構成を示す平面図。
【図４】 実施例４に係る比較実験の結果を示すグラフ。
【符号の説明】
１．基体 ２．固定化領域 １１．基体 １２．電極 １３．パット

Claims (5)

1. 複数のターゲット配列を含むターゲット核酸を検出する方法であって、２以上のターゲット配列を含むターゲット核酸に対して、前記２以上のターゲット配列の各々に相補的な２以上のターゲット配列に相補的な配列と、前記２以上のターゲット配列に相補的な配列間に存在して配列Ｙ−配列Ｚ−配列ｙからなるヘアピン構造とが存在する核酸断片であり、且つ前記ターゲット配列に相補的な配列の長さが夫々９塩基から５０塩基である核酸プローブ（ここで、同じアルファベットを大文字と小文字で示した場合、それらは互いに相補的な配列である）をハイブリダイゼーションさせることを具備する方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、前記ターゲット核酸が、第１のターゲット配列ｘ１から第ｎ＋１までの配列を含み、前記核酸断片が、配列Ｘ１から配列Ｘｎ＋１までのｎ＋１個の配列Ｘと、配列Ｙ１から配列Ｙｎまでのｎ個の配列Ｙと、配列Ｚ１から配列Ｚｎまでのｎ個の配列Ｚと、配列ｙ１から配列ｙｎまでのｎ個の配列ｙとからなるＸ１−Ｙ１−Ｚ１−ｙ１・・・Ｘｎ−Ｙｎ−Ｚｎ−ｙｎ−Ｘｎ＋１であることを特徴とする方法（ここで、同じアルファベットを大文字と小文字で示した場合、それらは互いに相補的な配列である）。
3. 請求項１に記載の方法であって、前記ターゲット核酸が、第１のターゲット配列ｘ１と第２のターゲット配列ｘ２とを含み、前記核酸断片が、配列Ｘ１、配列Ｙ、配列Ｚ、配列ｙ、および配列Ｘ２からなるＸ１−Ｙ−Ｚ−ｙ−Ｘ２で表されることを特徴とする方法（ここで、同じアルファベットを大文字と小文字で示した場合、それらは互いに相補的な配列である）。
4. 請求項１から３の何れか１項に記載の方法であって、前記核酸プローブが電気化学的検出用の核酸プローブ固定化基体に固定化されていることを特徴とする方法。
5. 請求項１から４の何れか１項に記載の方法で生じたハイブリダイゼーションの後で、増幅することを更に具備する方法。

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