JP4037766B2 - 標的核酸の検出方法および伸長方法、並びにアッセイキット - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標的核酸の検出方法および伸長方法、並びにアッセイキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
特定の核酸配列を持った核酸鎖を検出するためには、検出対象の配列に相補的な１対の核酸プライマーを用いて増幅した後に電気泳動で確認したり（特許文献１を参照されたい）、検出対象の配列に相補的なプローブを固定化した基板を用いたりする方法が一般的に用いられている（特許文献２を参照されたい）。特定の核酸鎖を特異的に検出するためには、１５塩基程度以上の連続する特異的な配列をもつプローブあるいはプライマーが必要になる。しかしながら、プライマーあるいはプローブ設計ソフトなどを利用しても、変異や多型の多い領域では必ずしも１５塩基の連続する特異的な配列を選択するのが難しく、最適な検出条件が設定できない問題があった。
【０００３】
さらに、合成核酸は長くなる程分離精製が難しくなり、結果として収率が悪くなることが知られている。しかし、短いプローブでは特異性が出せない、感度が低い等の問題から、価格が高くても長い配列を使わざるを得なかった。
【０００４】
また、プローブ固定化電極と電気化学的に活性な挿入剤を用いた電流検出型のＤＮＡチップが報告されている（特許文献３を参照されたい）。この方法は標識が不要なためランニングコストが安い、蛍光検出のような高価で大型の検出装置が不要などのメリットがある。また、そのような方法で使用される通常のプローブは、長い方が検出感度が高いと考えられている。しかしながら、挿入剤がプローブにも若干反応するため、長いプローブを用いるとノイズが増加してしまい、検出感度が不十分であるなどの問題があった。
【０００５】
【特許文献１】
特許第３１７１７９２号公報（第３９−４０頁）
【０００６】
【特許文献２】
特表平９−５０７１２１号公報（第８０−９３頁）
【０００７】
【特許文献３】
特開平１０−１４６１８３号公報（第１３−２２頁）
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、プローブあるいはプライマー設計の自由度が向上され、且つ特異的、効率的および／または高感度に標的核酸を検出する方法、および標的核酸を伸長する方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記の課題を解決するために次のような手段を提供する。
【００１０】
本発明の第１の態様に従うと、第１の標的配列Ａ’と第２の標的配列Ｃ’とを含み、Ａ’−Ｃ’（５’→３’）で表される配列を含む標的核酸の検出方法であって、
（１）試料と、
標的配列Ａ’に相補的な配列Ａ、配列Ｂ、スペーサＳおよび官能基Ｘを含み、Ｘ−Ｓ−Ｂ−Ａ（５’→３’）で表される第１のプローブと、
配列Ｂに相補的な配列Ｂ’および標的配列Ｃ’に相補的な配列Ｃを含み、Ｃ−Ｂ’（５’→３’）で表される第２のプローブと、
を適切なハイブリダイゼーションが得られる条件下で反応させること、および
（２）前記（１）の反応させることにより生じたハイブリダイゼーションを検出することにより、標的核酸の存在を判定することを具備する標的核酸の検出方法が提供される。
【００１１】
本発明の第２の態様に従うと、第１の標的配列Ａ’と第２の標的配列Ｃ’とを含み、Ｃ’−Ａ’（５’→３’）で表される配列を含む標的核酸の検出方法であって、
（１）試料と、
標的配列Ａ’に相補的な配列Ａ、配列Ｂ、スペーサＳおよび官能基Ｘを含み、Ａ−Ｂ−Ｓ−Ｘ（５’→３’）で表される第１のプローブと、
配列Ｂに相補的な配列Ｂ’および標的配列Ｃ’に相補的な配列Ｃを含み、Ｂ−Ｃ’（５’→３’）で表される第２のプローブと、
を適切なハイブリダイゼーションが得られる条件下で反応させること、および
（２）前記（１）の反応させることにより生じたハイブリダイゼーションを検出することにより、標的核酸の存在を判定すること、
を具備する標的核酸の検出方法が提供される。
【００１２】
本発明の第３の態様に従うと、第１の標的配列Ａ’、第２の標的配列Ｃ’および第３の標的配列Ｅ’を含み、Ａ’−Ｃ’−Ｅ’（５’→３’）で表される配列を含む標的核酸の検出方法であって、
（１）試料と、
標的配列Ａ’に相補的な配列Ａ、配列Ｂ含み、Ｘ−Ｓ−Ｂ−Ａ（５’→３’）で表される第１のプローブと、
配列Ｂに相補的な配列Ｂ’、標的配列Ｃ’に相補的な配列Ｃおよび配列Ｄを含み、Ｄ−Ｃ−Ｂ’（５’→３’）で表される第２のプローブと、
配列Ｄに相補的な配列Ｄ’、標的配列Ｅ’に相補的な配列Ｅを含み、Ｅ−Ｄ’（５’→３’）で表される第３のプローブと、
を適切なハイブリダイゼーションが得られる条件下で反応させること、および
（２）前記（１）の反応させることにより生じたハイブリダイゼーションを検出することにより、標的核酸の存在を判定すること、
を具備する標的核酸の検出方法が提供される。
【００１３】
本発明の第４の態様に従うと、少なくとも、前記第１のプローブおよび第２のプローブを具備することを特徴とする前記第１の態様から第３の態様の何れか１項に記載の標的核酸の検出方法を行うためのアッセイキットが提供される。
【００１４】
本発明の第５の態様に従うと、（１）配列Ｂと配列Ａを含み、Ｂ−Ａ（５’→３’）で表される第１の核酸鎖と、配列Ｂに相補的な配列Ｂ’と配列Ｃを含みＣ−Ｂ’（５’→３’）で表される第２の核酸鎖とを含み、前記配列Ｂと配列Ｂ’がハイブリダイズすることによって連結してなるプライマーを、標的核酸と共に存在させることと、
（２）前記（１）に記載のプライマーと標的核酸とを適切な伸長反応が得られる条件下で反応させることと、
を具備する標的核酸の伸長方法が提供される。
【００１５】
本発明の第６の態様に従うと、少なくとも前記第１の核酸鎖と第２の核酸鎖とを具備する前記第５の態様に記載の標的核酸の伸長方法を行うためのアッセイキットが提供される。
【００１６】
本発明の第７の態様に従うと、第１の標的配列Ａ’と第２の標的配列Ｃ’とを含み、Ａ’−Ｃ’（５’→３’）で表される配列を含む標的核酸の検出方法であって、少なくとも前記第１の核酸鎖と第２の核酸鎖とを具備する請求項６に記載の標的核酸の伸長を行い、伸長産物の有無から標的核酸を検出する方法。
【００１７】
本発明の第８の態様に従うと、第１の標的配列Ａ’と第２の標的配列Ｃ’とを含み、Ａ’−Ｃ’（５’→３’）で表される配列を含む標的核酸を検出する方法であって、
（１）検出用配列Ｄと配列Ｂおよび標的配列Ａ’に相補的な配列Ａを含み、Ｄ−Ｂ−Ａ（５’→３’）で表される第１の核酸鎖と、配列Ｂに相補的な配列Ｂ’および標的配列Ｃ’に相補的な配列Ｃを含みＣ−Ｂ’（５’→３’）で表される第２の核酸鎖とを含み、前記配列Ｂと配列Ｂ’がハイブリダイズすることによって連結してなる第１のプライマーを、第２のプライマーと共に、前記標的核酸に対して、適切な伸長反応が得られる条件下で反応させることと、
（２） 前記（１）で生じた二本鎖反応産物を、検出用配列Ｄに相補的な配列を有するプローブを具備するプローブ固定化基体に対して適切なハイブリダイゼーションが得られる条件下で反応させることと、
（３）前記（２）の反応させることにより生じたハイブリダイゼーションを検出することにより、標的核酸の存在を判定することと、
を具備する標的核酸を検出する方法が提供される。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明に従うと、短い核酸鎖を組み合わせて使用し、標的核酸を検出または伸長する方法が提供される。
【００１９】
１．用語の説明
ここで使用される「核酸」の語は、ＤＮＡおよびＲＮＡ、Ｓ-オリゴ、メチルホスホネートオリゴ、ＰＮＡ（即ち、ペプチド核酸）およびＬＮＡ（即ち、ロック核酸）などの何れの核酸類似体など、一般的に、その一部の構造を塩基配列によって表すことが可能な物質を総括的に示す語である。また、そのような核酸は、天然に存在するものであっても、人工的に合成されたものであって、それらの混合物であってもよい。
【００２０】
また、本発明の核酸は、一般的にそれ自身公知の方法により合成または産生されればよい。例えば、そのような方法は、一般的な核酸の合成に使用される核酸合成機を使用しても、一般的な大腸菌などを利用した遺伝子操作などの手段を利用してもよい。合成あるいは産生された核酸は、液体クロマトグラフィーや、マススペクトロスコーピーなどで精製することが望ましい。
【００２１】
ここで使用される「標的配列」の語は、本発明の態様に従うプローブが結合するための塩基配列を示す。ここで使用される「標的核酸」の語は、標的配列を含む核酸を示す。本発明の態様に従う方法で検出対象となる標的核酸は、特に限定されるものではなく、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＲＮＡおよびｍＲＮＡなど、また、人工的に製造した核酸類似物であってもよい。また、本発明の態様に従って検出に供される標的核酸は、所望に応じて、未修飾でもあっても、それ自身公知の手段によって何れかの修飾が施されていてもよい。例えばＣｙ５、Ｃｙ３、ＦＩＴＣ等の蛍光色素で標識しておけば、蛍光検出器を用いた検出が可能であり、ハプテンや酵素で標識することにより、発色または発光での検出が可能である。
【００２２】
ここで使用される「相補」、「相補的」および「相補性」の語は、複数の配列が、互いに５０％から１００％の範囲で相補的あることを示す。本発明における好ましい相補性は、８０％以上で相補的な場合であり、より好ましくは９０％以上で相補的な場合である。
【００２３】
２．第１の態様
（１）検出方法
本発明に従う第１の態様は、基本的にはプローブを使用して目的とする標的核酸を検出する方法である。図１を用いて、本発明の第１の態様を説明する。
【００２４】
本発明の態様に従う方法では、第１のプローブと、第１のプローブに対して一部分でハイブリダイズする第２のプローブとを用いる。
【００２５】
第１のプローブ１は、官能基Ｘと、スペーサーＳと、配列Ｂと、配列Ａを有する核酸である（図１Ａ）。当該第１のプローブ１は、官能基Ｘを介して基体２に固定化されている。第１のプローブ１は、配列Ａに相補的な配列Ａ’を含む標的核酸３にハイブリダイズする（図１Ｂ）。
【００２６】
第２のプローブ４は、配列Ｂに相補的な配列Ｂ’と、配列Ｃを含む。第２のプローブ４の配列Ｂ’は、第１のプローブ１の配列Ｂとハイブリダイズする（図１Ｃ）。第１のプローブ１と第２のプローブ４は、配列Ｂと配列Ｂ’により、一部分で連結している。また、第２のプローブ４の配列Ｃは、標的配列３に含まれる配列Ｃ’にハイブリダイズする（図１Ｃ）。
【００２７】
従って、本発明の方法では、上述のように一部で連結している第１のプローブ１と第２のプローブ４に対してハイブリダイズしたことにより、標的配列が検出される（図１Ｃ）。
【００２８】
従来使用されるプローブ固定化基体は、図１Ｄに示すように、プローブ５が基体２に垂直方向に固定化されている。当該プローブ５に図１Ｄに示すように標的核酸と１対１でハイブリダイズする。また、従来のプローブ固定化基体は、基体２の表面に対してプローブ５が垂直方向に固定化されている。従って、当該プローブ５に対してハイブリダイズした標的核酸６も、基体２の表面に対して垂直に捕捉される（図１Ｄ）。
【００２９】
これに対して、上述のような本発明の態様に従うと、標的核酸３は、第１のプローブ１と第２のプローブ４の両方にハイブリダイズすることにより、基体２の表面からより遠い位置で捕捉される（図１Ｃ）。このように捕捉されることにより、従来のように垂直に捕捉される場合に比べて立体障害が生じ難い。従って、効率よく目的のハイブリダイズが達成される。例えば図１Ｄの従来の手段では、標的核酸６が非常に長く、特に、プローブ５とのハイブリダイズ領域よりも基体側に長い場合、標的核酸６のプローブ５へのハイブリダイゼーションは阻害されてしまう。しかしながら、本発明の態様に従えば、標的核酸３の長さに関係なく、効率よいハイブリダイゼーションが達成される。
【００３０】
また、ハイブリダイゼーション反応前は各プローブは一本鎖の構造を形成しているが、標的核酸と結合することで、標的核酸とプローブとの間に二本鎖構造が形成されると共に、各プローブ間にも二本鎖が形成される。よって、本発明の態様のように複数のプローブを使用しない場合に比べ、挿入剤をたくさん結合することができる。それにより、結果的に電流信号の増大、高感度化が達成される。更に、各プローブは従来よりもその長さが短い。従って、ノイズを減少することも可能であり、最適な検出条件の設定が従来よりも容易であり、且つ低コストで製造することが可能である。
【００３１】
従って、プローブの設計の自由度が向上され、且つ特異的、効率的および／または高感度に標的核酸を検出することが可能である。
【００３２】
（２）構成
第１のプローブに含まれる配列Ａおよび第２のプローブに含まれる配列Ｃの長さは、特に限定されるものではないが、５〜５０塩基の範囲でよく、好ましくは５〜１４塩基、更に好ましくは５〜９塩基である。
【００３３】
配列Ｂと、配列Ｂ’は上述した通り、互いに相補的な配列である。配列Ｂと配列Ｂ’は、特に限定されるものではないが、長さは３〜５０塩基の範囲でよく、好ましくは５〜１４塩基、更に好ましくは５〜９塩基である。
【００３４】
標的核酸における第１および第２のプローブに結合する領域は、各々、第１の標的配列、第２の標的配列である。これらの配列は、第１のプローブの配列Ａに結合するための配列Ａ’と、第２のプローブの配列Ｃに結合するための配列Ｃ’である。標的核酸上での配列Ａ’と配列Ｃ’は、互いに隣接していてもよく、配列Ａ’と配列Ｃ’の間に２００〜１塩基が存在してもよく、好ましくは５０〜１塩基、より好ましくは１０〜１塩基が存在するように、プローブの設計を行う。
【００３５】
本発明の第１のプローブ１の配列は、その５’末端側から３’末端側に向かい（即ち、５’→３’と示す）、官能基Ｘ、スペーサーＳ、配列Ｂ、配列Ａと配置される、即ち、Ｘ−Ｓ−Ｂ−Ａ（５’→３’）であってもよく、その５’末端側から配列Ａ、配列Ｂ、スペーサーＳ、官能基Ｘ、即ち、Ａ−Ｂ−Ｓ−Ｘ（５’→３’）であってもよい。但し、第１のプローブ１を構成する成分の並び方に応じて、第２のプローブ４の構成が決定される。即ち、第１のプローブ１がＸ−Ｓ−Ｂ−Ａ（５’→３’）の場合、第２のプローブ４はＢ’−Ｃ（３’→５’）である。また、第１のプローブ１がＡ−Ｂ−Ｓ−Ｘ（５’→３’）の場合、第２のプローブ４はＣ−Ｂ’（３’→５’）である。何れの場合も、第１のプローブ１を基体２に固定化する場合には、官能基Ｘを介して行われることが好ましい。
【００３６】
本発明の態様に従って使用されるスペーサーＳには、特に限定されるものではないが、トリエチレングリコールおよびヘキサエチレングリコールなどのエチレングリコール鎖、メチレングリコール鎖、アルキル鎖並びに塩基などを用いることが可能であり、その長さは５００原子程度までが好ましい。また、当該スペーサーは直鎖であることが望ましいが、枝状に分岐した分子も本発明の態様において使用することが可能である。また、分子中に芳香環などが入っていてもよい。
【００３７】
本発明の態様に従って使用される官能基Ｘは、当該第１のプローブを基体表面に固定化するためのものである。従って、基体に固定化しないで使用する場合には、必ずしも必要ではない。本発明において使用され得る官能基Ｘは、これらに限定されるものではないが、例えば、メルカプト基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基およびビオチンなどを用いることが可能である。これらの官能基Ｘの選択は、基体または基体表面の性質または処理に応じて行ってよい。これらの官能基と基体または表面表面の選択およびプローブの固相化は、それ自身公知の手段により達成することが可能である。
【００３８】
本発明の態様に従って使用され得る基体は、ガラス、シリコンおよび樹脂などから構成された担体などの基体であればよい。また、その形状は、板状、球状および棒状であってもよい。また、容器を基体として用い、その内部を構成する底面および／または壁面など、またはその一部に対してプローブを固定化してもよい。
【００３９】
（３）反応の手順
本発明の第１の態様に従って、プローブと標的核酸を反応させる際の手順の例を図１を用いて以下に説明する。
【００４０】
まず、第１のプローブ１を基体２の表面に固定化する（図１Ａ）。次に、標的核酸３を第１のプローブ１に対して、ハイブリダイズさせる（図１Ｂ）。続いて、第２のプローブ４を標的核酸３と第１のプローブ１に対してハイブリダイズさせる（図１Ｃ）。
【００４１】
または次のように行ってもよい。まず、標的核酸３と第２のプローブ４をハイブリダイズさせる。これを、基体２の表面に固定化された第１のプローブ１に添加して、ハイブリダイズさせる。
【００４２】
或いは、次のように行ってもよい。最初に、第１のプローブ１と第２のプローブ４をハイブリダイズさせ、それに対して標的核酸３を添加してハイブリダイズさせる。
【００４３】
このような反応を利用して、試料中の標的核酸の存在を検出する場合には、例えば、次のように行えばよい。まず、標的核酸の配列を基に、標的配列を選択し、第１のプローブと第２のプローブを設計し用意する。次に、第１のプローブを基体に固定化する。その一方で、試験の対象となる核酸を含有する試料を準備する。準備された試料に対して、第２のプローブを添加し、適切なハイブリダイゼーションが得られる条件下で反応を行う。次に、得られた反応産物を、適切なハイブリダイゼーションが得られる条件下で、基体に固定化された第１のプローブと反応させる。基体に固定化された第１のプローブと第２のプローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションの存在を検出することによって、当該試料中の標的核酸を検出することが可能である。また、このような試料中の標的核酸の存在を検出する方法は、上述のプローブと標的核酸を反応させる際の手順に応じて、手順を入れ替えるなどの必要な種々の変更を行ってもよい。
【００４４】
ハイブリダイゼーションの存在の検出は、それ自身公知の何れの手段を利用して行ってもよい。例えば、ハイブリダイゼーションが生じた部位に取り込まれるインタカレータを利用しても、抗原抗体反応を利用しても、また、試料核酸を予め標識する手段を利用してもよい。
【００４５】
（４）プローブ固定化基体
本発明の態様において使用されるプローブ固定化基体について、例を用いて以下に説明する。
【００４６】
（ａ）第１の例
図２に本発明の態様に従い使用され得るプローブ固定化基体の第１の例を模式的に示した。第１の例であるプローブ固定化基体は、基体１６とその表面に存在する１以上の固定化領域１５に夫々１以上で固定化されたプローブ１１から１４を具備する（図２）。
【００４７】
このようなプローブ固定化基体は、例えば、それ自身公知の手段によりシリコン基板などの基体に対してプローブを固定化することにより製造することが可能である。
【００４８】
本発明に従うと、１つの基体に配置する固定化領域１５の数も、そこに固定化されるプローブの数もこれに限定するものではなく、所望に応じて変更してよい。また、複数種類の塩基配列をプローブとして１つの基体に配置してもよい。複数および／または複数種類のプローブの基体への固相パターンは、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。このようなプローブ固定化基体は本発明の範囲内である。
【００４９】
（ｂ）第２の例
図３を用いて、本発明の態様において使用され得るプローブ固定化基体の第２の例を説明する。第２例であるプローブ固定化基体は、基体２２に具備された１以上の電極２３に夫々１以上で固定化されたプローブ１７から２０を具備する（図３）。電極２３は、電気的情報を取り出すためのパット２４に接続されている。
【００５０】
このようなプローブ固定化基体は、例えば、それ自身公知の手段によりシリコン基板などの基体に電極を配置し、その電極表面に対してプローブを固定化することにより製造することが可能である。
【００５１】
本態様においては、電極の数を５としたが１つの基体に配置する電極の数はこれに限定するものではない。また、電極の配置パターンも図３に示したものに限定されるものではなく、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。必要に応じて参照電極および対極を設けてもよい。そのようなプローブ固定化基体も本発明の範囲内である。
【００５２】
上記の例に記載するような蛍光検出を行うためのプローブ固定化基体の場合は、上記の何れかの基体に対してプローブを固定化すればよい。また、上記の第１の例に記載するような電気化学的検出を行うためのプローブ固定化基体の場合は、上記の何れかの基体に電気化学的な検出が可能であるように電極を配置し、その電極上にプローブを固定化すればよい。
【００５３】
本発明において使用され得る電極は、特に限定されるものではないが、例えば、グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバーのような炭素電極、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウムのような貴金属電極、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛のような酸化物電極、Si、Ge、 ZnO、 CdS、 TiO2 、GaAsのような半導体電極、チタン等が挙げられる。これらの電極は導電性高分子によって被覆しても、単分子膜によって被覆してもよく、所望に応じてその他の表面処理剤を処理してもよい。
【００５４】
また、異なる塩基配列を有するプローブは、それぞれ、異なる電極に対して固定化されてもよく、異なる塩基配列を有する複数種類のプローブが混合された状態で１つの電極に対して固定化されてもよい。
【００５５】
（５）検出
本発明に従うプローブ固定化基体を用いる場合、前記基体に固定化されたプローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーション反応の結果生じた二本鎖の存在を検知するための手段として、電気化学的方法および蛍光検出法を利用することが可能である。
【００５６】
（ａ）電気化学的検出
電気化学的による二本鎖核酸の検出は、例えば、それ自身公知の二本鎖認識物質を用いて行えばよい。
【００５７】
ここで用いられる二本鎖認識体は特に限定されるものではないが、例えば、ヘキスト３３２５８、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーターおよびポリインターカレーター等を用いることが可能である。更に、これらのインターカレーターを電気化学的に活性な金属錯体、例えば、フェロセン、ビオロゲン等で修飾しておくことも可能である。また、その他の公知の何れの二本鎖認識物質も本発明において好ましく使用される。
【００５８】
本発明に従うプローブ固定化基体では、プローブが電極に対して固定化されている。このような電極を用いての二本鎖核酸の検出は他の一般的な電気化学的検出法と同じように、更に対極や参照極を使用してもよい。参照極を配置する場合、例えば、銀／塩化銀電極や水銀／塩化水銀電極などの一般的な参照極を使用してよい。
【００５９】
続いて、適切なハイブリダイゼーションが可能な条件下で反応を行う。そのような適切な条件は、標的配列に含まれる塩基の種類、プローブ固定化基体に具備されるプローブの種類、試料核酸の種類およびそれらの状態などの諸条件に応じて、当業者であれば適宜選択することが可能である。これに限定されるものではないが、例えば以下のような条件下で反応を行ってもよい。
【００６０】
例えば、ハイブリダイゼーション反応溶液は、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液中で行う。この溶液中にはハイブリダイゼーション促進剤である硫酸デキストラン、並びに、サケ精子ＤＮＡ、牛胸腺ＤＮＡ、ＥＤＴＡおよび界面活性剤などを添加してもよい。ここに得られた試料核酸を添加し、９０℃以上で熱変性させる。熱変性された試料核酸へのプローブ固定化基体の挿入は、変性直後、あるいは０℃に急冷後に行ってもよい。また、基体上に液を滴下することでハイブリダイゼーション反応を行うことも可能である。
【００６１】
反応中は、撹拌、あるいは振とうなどの操作で反応速度を高めてもよい。反応温度は、例えば、１０℃〜９０℃の範囲で、反応時間は１分以上１晩程度で行えばよい。ハイブリダイゼーション反応後、電極を洗浄する。洗浄には、例えば、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いればよい。試料核酸中に標的配列を含む標的核酸が存在した場合、プローブとハイブリダイズし、それにより二本鎖核酸が生じる。
【００６２】
続いて、電気化学的手段により、以下のような手順で生じた二本鎖核酸の検出を行う。一般的には、ハイブリダイゼーション反応の後に、基体を洗浄し、電極表面に形成された二本鎖部分に二本鎖認識体を作用させて、それにより生じる信号を電気化学的に測定する。
【００６３】
二本鎖認識体の濃度は、その種類によって異なるが、一般的には１ｎｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの範囲で使用する。この際には、イオン強度０．００１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いればよい。
【００６４】
例えば、電気化学的な測定は、二本鎖認識体が電気化学的に反応する電位以上の電位を印加し、二本鎖認識体に由来する反応電流値を測定してよい。この際、電位は定速で掃引するか、あるいはパルスで印加するか、あるいは、定電位を印加してもよい。測定の際に、例えば、ポテンショスタット、デジタルマルチメーターおよびファンクションジェネレーター等の装置を用いて電流、電圧を制御してもよい。例えば、得られた電流値を基に、検量線から標的核酸の濃度を算出してもよい。
【００６５】
また、それ自体公知の電気化学的検出手段、例えば、以下の文献に開示されている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． １９９４， Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． １９９８）手段なども本発明の方法において好ましく使用できる。当該文献において、橋本らは、ＤＮＡプローブで修飾された金電極と電気化学的に活性な色素を用いる配列特異的遺伝子検出を報告した。色素に由来する陽極の電流は、標的ＤＮＡの濃度に相関する。また、ワンらは、インディケーターフリーの電気化学的なＤＮＡのハイブリダイゼーションを報告した。このバイオセンサーの構成は、カーボンペースト電極へのイノシン置換プローブ（グアニンを含まない）の固定化と、当該標識のグアニン酸化ピークの存在による二重鎖の形成のクロノポテンショメトリック検出を含む。これらの文献に記載される検出手段は好ましく本発明において使用されてよい。
【００６６】
（ｂ）蛍光検出法
蛍光標識物質を用いる方法の場合には、標的核酸を、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５若しくはローダミンなどの蛍光色素などの蛍光学的な活性が得られる物質で標識しておいてもよい。或いは、そのような標識の代わりに前述の物質で標識したセカンドプローブを用いてもよい。また、複数の標識物質を同時に使用してもよい。
【００６７】
幾つかの態様においては、試料から抽出した核酸成分とプローブ固定化基体に固定化されたプローブとのハイブリダイゼーション反応は、例えば、以下のように行う。例えば、ハイブリダイゼーション反応溶液は、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液中で行う。この溶液中にはハイブリダイゼーション促進剤である硫酸デキストラン、並びに、サケ精子ＤＮＡ、牛胸腺ＤＮＡ、ＥＤＴＡおよび界面活性剤などを添加してもよい。ここに抽出した核酸成分を添加し、９０℃以上で熱変性させる。プローブ固定化基体の挿入は、変性直後、あるいは０℃に急冷後に行ってよい。また、基体上に液を滴下することでハイブリダイゼーション反応を行うことも可能である。反応中は、撹拌、あるいは振とうなどの操作で反応速度を高めてもよい。反応温度は、例えば、１０℃〜９０℃の範囲で、反応時間は１分以上１晩程度で行えばよい。ハイブリダイゼーション反応後、洗浄を行う。洗浄には、例えば、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いる。
【００６８】
蛍光検出の場合、ハイブリダイゼーション反応の検出は、標識の種類に応じた適宜の検出装置を用いて、試料中の標識された塩基配列又は２次プローブ中の標識を検出することによって行う。標識が蛍光物質の場合には、例えば、蛍光検出器を用いて標識を検出すればよい。
【００６９】
３．第２の態様
上述の第１の態様に使用した第１のプローブと第２のプローブに加えて、更に第３のプローブを使用して、第１の態様に記載の事項に準じて標的核酸を検出してもよい。
【００７０】
（１）検出方法
図４を用いて説明する。本発明の態様に従う方法では、第１のプローブ１と、第２のプローブ７と、第３のプローブ８を用いる。
【００７１】
第１のプローブ１は、官能基Ｘと、スペーサＳと、配列Ｂと、配列Ａを有する核酸である。当該第１のプローブ１は、官能基Ｘを介して基体２に固定化されている。第１のプローブ１は、標的核酸３に含まれる標的配列である配列Ａ’にハイブリダイズする。即ち、配列Ａは配列Ａ’に相補的である。
【００７２】
第２のプローブ７は、配列Ｂに相補的な配列Ｂ’と、配列Ｃと、配列Ｄを含む。第２のプローブ７は、標的核酸３に含まれる標的配列である配列Ｃ’にハイブリダイズする。即ち、配列Ｃと配列Ｃ’は相補的である。
【００７３】
第３のプローブ８は、配列Ｄに相補的な配列Ｄ’と、配列Ｅを含む。第３のプローブ８は、標的核酸３に含まれる標的Ｅ’にハイブリダイズする。即ち、配列Ｅと配列Ｅ’は相補的である。
【００７４】
（２）構成
配列Ａ、配列Ｃおよび配列Ｅの長さは、特に限定されるものではないが、５〜５０塩基の範囲でよく、好ましくは５〜１４塩基、更に好ましくは５〜９塩基である。
【００７５】
配列Ｂと配列Ｂ’、配列Ｄと配列Ｄ’は互いに相補的な配列であり、これらの長さは、特に限定されるものではないが、３〜５０塩基の範囲でよく、好ましくは５〜１４塩基、更に好ましくは５〜９塩基である。
【００７６】
標的核酸上の配列Ａ’、配列Ｃ’および配列Ｅ’は、互いに接していてもよく、それぞれの配列の間に２００〜１塩基が存在してもよく、好ましくは５０〜１塩基、より好ましくは１０〜１塩基が存在するように、プローブの設計を行う。
【００７７】
本発明の第１のプローブ１の構成は、その５’末端側から官能基Ｘ、スペーサーＳ、配列Ｂ、配列Ａ、即ち、Ｘ−Ｓ−Ｂ−Ａ（５’→３’）であってもよく、その５’末端側から配列Ａ、配列Ｂ、スペーサーＳ、官能基Ｘ、即ち、Ａ−Ｂ−Ｓ−Ｘ（５’→３’）であってもよい。第１のプローブ１を構成する成分の並び方に応じて、第２のプローブ７および第３のプローブ８の構成が決定される。
【００７８】
以上の事項以外は、第２の態様のために、第１の態様において記載した方法および検出手段などを用いることが可能であり、また、第１の態様に記載に従って所望の変更を行ってもよい。
【００７９】
また、第２の態様では３つのプローブを用いる例を示したが、本発明の趣旨に従って４以上のプローブを用いても同様に標的核酸の検出を行うことが可能である。また、連結数の多い方が検出感度をより向上させる。
【００８０】
このような本態様により、効率的な検出を阻害する立体障害を抑制し、効率のよい標的核酸の検出が可能である。また、ハイブリダイゼーション反応前は各プローブは一本鎖の構造を形成しているが、標的核酸と結合することで、標的核酸とプローブとの間に二本鎖構造が形成されると共に、各プローブ間にも二本鎖が形成される。よって、本発明の態様のように複数のプローブを使用しない場合に比べ、挿入剤がたくさん結合することができる。それにより、結果的に電流信号の増大、高感度化が達成される。また、夫々のプローブは、従来よりもその長さが短い。従って、ノイズを減少することも可能であり、その製造も低コストで達成できる。
【００８１】
従って、プローブの設計の自由度が向上され、且つ特異的、効率的および／または高感度に標的核酸を検出することが可能である。
【００８２】
４．第３の態様
更に、本発明に従うと、第３の態様として図５に示すような構成の第１のプローブ２６と第２のプローブ２７を用いる標的核酸３を検出する方法が提供される。以下、図５を用いて説明する。
【００８３】
第１のプローブ２６は、官能基Ｘと、スペーサーＳと、配列Ａと、配列Ｂを、Ｘ−Ｓ−Ａ−Ｂ（５’→３’）の配列で有する。第１のプローブ２６は、官能基Ｘを介して基体２に固定されている。第１のプローブ２６の配列Ａは、標的配列３に含まれる配列Ａ’にハイブリダイズする。
【００８４】
第２のプローブ２７は、配列Ｂに相補的な配列Ｂ’と配列Ｃを、Ｂ’−Ｃ（５’→３’）の配列で有する。第２のプローブ２７は、配列Ｂ’を介して第１のプローブ２６にハイブリダイズし、更に第１および第２のプローブは、配列Ａと配列Ｃにより、標的配列３にハイブリダイズする（図５）。
【００８５】
以上の事項以外は、第１の態様に記載の通りに反応および検出を行うことが可能である。また、第２の態様に記載の方法に準じて３以上のプローブを設計し、それを用いて標的配列３を検出してもよい。また、第１および第２の態様に従って、所望の事項を変更してもよい。
【００８６】
本態様に従うと、従来よりも短い核酸鎖をプローブとして使用することにより、標的核酸を検出することが可能である。即ち、プローブは夫々は従来よりもその長さが短い。従って、ノイズを減少することも可能である。また、ハイブリダイゼーション反応前は各プローブは一本鎖の構造を形成しているが、標的核酸と結合することで、標的核酸とプローブとの間に二本鎖構造が形成されると共に、各プローブ間にも二本鎖が形成される。よって、本発明の態様のように複数のプローブを使用しない場合に比べ、挿入剤がたくさん結合することができる。それにより、結果的に電流信号の増大、高感度化が達成される。
【００８７】
従って、プローブの設計の自由度が向上され、且つ特異的、効率的および／または高感度に標的核酸を検出することが可能である。
【００８８】
５．第４の態様
本発明に従い、短い核酸鎖を組み合わせて使用して標的核酸を伸長する方法を第４の態様として以下に説明する。これに限定されるものではないが、ここでは第４の態様に従う本発明の２つの例を示す。
【００８９】
（１）第１の例
以下、図６を用いて説明する。第１の例は、標的核酸２２を鋳型として用い、短い核酸が組み合わされてなるフォワードプライマーと、リバースプライマーとを用いて、適切な伸長反応が得られる条件下で反応させ、目的とする核酸を伸長する方法である。
【００９０】
図６には、フォワードプライマーに含まれる各成分が、９塩基の配列Ａ、９塩基の配列ＢおよびＢ’、並びに９塩基の配列Ｃであるものを例として示したが、これに限定するものではなく、以下のように変更することが可能である。また、図６には、標的核酸として、１１４塩基のオリゴＤＮＡの例を示したが、これに限定されるものではなく以下のように変更してもよい。
【００９１】
フォワードプライマーとしては、配列Ａと配列Ｂを含む第１の核酸鎖２８と、配列Ｂ’と配列Ｃを含む第２の核酸鎖２９とを、互いに相補的な配列Ｂと配列Ｂ’により連結されたものを使用する。このような形態をした本発明に従うプライマーを「連結プライマー」とも称する。
【００９２】
配列Ａおよび配列Ｃの長さは、特に限定されるものではないが、５〜５０塩基の範囲でよく、好ましくは５〜１４塩基、更に好ましくは５〜９塩基である。
【００９３】
配列Ｂおよび配列Ｂ’は互いに相補的な配列である。配列Ｂと配列Ｂ’は、特に限定されるものではないが、長さは３〜５０塩基の範囲でよく、好ましくは５〜１４塩基、更に好ましくは５〜９塩基である。
【００９４】
標的核酸は、鋳型核酸として使われる。フォワードプライマーの構成要素である第１および第２の核酸鎖に結合する標的核酸の領域は、各々、第１の標的配列および第２の標的配列である。例えば、これらの配列は、第１のプローブの配列Ａに結合するための配列Ａ’と、第２のプローブの配列Ｃに結合するための配列Ｃ’である。標的核酸上の配列Ａ’と配列Ｃ’の位置は、互いに隣接していてもよく、配列Ａ’と配列Ｃ’の間に２００〜１塩基が存在してもよく、好ましくは５０〜１塩基、より好ましくは１０〜１塩基が存在するように、プローブの設計を行ってよい。
【００９５】
リバースプライマーは、それ自身公知の一般的にプライマーとして使用される何れの核酸を使用してもよい。或いは、上記のフォワードプライマーと同様な短い核酸が組み合わされてなる核酸をリバースプライマーとして使用してもよい。
【００９６】
ここで使用される「核酸を伸長する」の語は、鋳型核酸と、その一部の塩基配列に相補的なプライマーとを用いて、ポリメラーゼを作用させることにより、目的とする核酸を伸長することをいい、更に、そのような伸長と、そのような伸長が繰り返し行われる増幅の両方を示す。
【００９７】
本発明の態様に従って利用され得る伸長反応は、それ自体公知の一般的に核酸を伸長するために使用される手段であっても、および核酸を増幅するために使用される手段であってもよく、そのような手段で有れば何れも使用してよい。これらに限定するものではないが、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（一般的にＰＣＲと称される、以下、ＰＣＲと記す）や逆転写ＰＣＲなどを利用した方法を用いることが可能である。また更に、Nucleic acid strand amplification（ＮＡＳＢＡ）、Transcription mediated amplification（ＴＭＡ）、Ligase chain reaction（ＬＣＲ）、Strand displacement amplification（ＳＤＡ）、Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids（ＩＣＡＮＮ）および Rolling circle amplification（ＲＣＡ）法、Loop mediated amplification （ＬＡＭＰ）法などの手段も本発明の態様に従って利用することが可能である。
【００９８】
ここで使用される「適切に伸長反応が得られる条件」とは、ポリメラーゼが核酸鎖を合成するための各種条件、例えば、温度、ｐＨ、塩濃度およびｄＮＴＰなどの条件が、ポリメラーゼの活性を適切に得るために十分であるような状態を示す。
【００９９】
上述の例では２つの核酸鎖を組み合わせてフォワードプライマーとして使用する例を示したが、３以上で核酸鎖を組み合わせてもよい。また、ここではフォワードプライマーとして、２つ以上の核酸鎖を組み合わせた核酸を用いる例を示したが、フォワードプライマーを通常のプライマーを使用し、リバースプライマーを本発明に従う２つ以上の核酸鎖を組み合わせた核酸としてもよい。或いは、フォワードプライマーとリバースプライマーの両方に、本発明に従う２つ以上の核酸鎖を組み合わせた核酸を使用してもよい。
【０１００】
本態様に従うと、従来よりも短い核酸鎖を組み合わせてプライマーとして使用することにより、標的核酸に効率よく結合し、高感度に伸長反応を達成することが可能である。また、非特異的結合を減少することが可能であるので、ノイズを減少することも可能である。
【０１０１】
従って、プローブの設計の自由度が向上され、且つ特異的、効率的および／または高感度に標的核酸を伸長することが可能である。
【０１０２】
（２）第２の例
また更に、第１の例の標的核酸の伸長に続いて、その伸長反応産物を回収し、且つ伸長産物に含まれる特定の配列を検出することにより、標的核酸の存在を検出することも可能である。そのような例を図１４を用いて以下に説明する。
【０１０３】
図１４に示す方法において使用されるフォワードプライマー４０（図中、Ｆプライマーとも記す）は、第１の核酸鎖４１と第２の核酸鎖４２からなる。第１の核酸鎖４１は、５’側から配列Ａと配列Ｂを含む。第２の核酸鎖４２は、５’側から配列Ｄ、配列Ｂ’および配列Ｃを含む。第１の核酸鎖４１と第２の核酸鎖４２は、互いに相補的な配列Ｂと配列Ｂ’で連結される。本例において使用されるプライマーは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーともに、互いに相補的な配列の結合による連結部を有するので、両者とも「連結プローブ」とも称される。
【０１０４】
標的核酸に結合する配列は、第１の核酸鎖４１の配列Ａと第２の核酸鎖４２の配列Ｃである。第２の核酸鎖４２に含まれる配列Ｄは、検出用配列４３であり、この検出用配列４３の存在が、標的核酸４４ａが存在し、且つ適切な伸長反応が生じたことを検出するための指標となる。
【０１０５】
図１４に示す方法において使用されるリバースプライマー４５（図中、Ｒプライマーとも記す）は、第１の核酸鎖４６と第２の核酸鎖４７からなる。第１の核酸鎖４６は、５’側から配列Ｆと配列Ｅを含み、５’末端にはビオチンが付与されている。第２の核酸鎖４７は、５’側から配列Ｇと配列Ｆ’を含む。第１の核酸鎖４６と第２の核酸鎖４７は、互いに相補的な配列Ｆと配列Ｆ’で連結されてる。また、標的核酸４４ｂに結合する配列は、第１の核酸鎖４６の配列Ｅと第２の核酸鎖４７の配列Ｇである。第２の核酸鎖に含まれるビオチンは、伸長された核酸を回収するために使用される。
【０１０６】
上述のフォワードプライマー４０とリバースプライマー４５と標的核酸４４とを、ポリメラーゼを用い、適切な伸長反応が得られる条件下、例えば、適切なＰＣＲ反応が得られる条件下で反応を行う。反応後、アビジンに対してビオチンを特異的に結合させることによって反応産物を回収する。更に、反応産物として得られた二本鎖核酸を一本鎖に解離する。
【０１０７】
得られた一本鎖を、検出用配列４３に相補的な配列を有する検出用プローブ４８を固定化したプローブ固定化基体５０上で反応を行う。その後、使用したプローブ固定化基体の種類に応じて、プローブ固定化基体５０上で生じたハイブリダイゼーションの存在を検出する。これにより、標的核酸を鋳型として、当該フォワードプライマー４０とリバースプライマー４５を用いて伸長された二本鎖核酸のうちの一本鎖が検出される。従って、試料中の標的核酸の存在を検出できる。
【０１０８】
図１４では、例として金電極４９を具備したプローブ固定化基体５０を用いて、電気化学的に検出を行う場合の略図を示した。しかしながら、これに限定されるものではなく、上述した態様において示した種々のプローブ固定化基体の何れを使用してもよい。
【０１０９】
ここで、配列Ａおよび配列Ｃの長さは、特に限定されるものではないが、５〜５０塩基の範囲でよく、好ましくは５〜１４塩基、更に好ましくは５〜９塩基である。
【０１１０】
配列Ｂおよび配列Ｂ’は、互いに相補的な配列である。配列Ｂと配列Ｂ’は、特に限定されるものではないが、長さは３〜５０塩基の範囲でよく、好ましくは５〜１４塩基、更に好ましくは５〜９塩基である。また、配列Ｂおよび配列Ｂ’は必ずしも同じ長さである必要はない。
【０１１１】
配列Ｄは、フォワードプライマーおよびリバースプライマー、並びに標的核酸とは、互いにハイブリダイズし難い配列とすることが望ましい。また、配列Ｄの長さは、特に限定されるものではないが、５〜１００塩基の範囲でよく、好ましくは１０〜５０塩基、更に好ましくは１５〜３０塩基である。配列Ｄの塩基配列は特に限定されるのものではないが、正規直行配列のようなミスハイブリの起こり難い配列であることが望ましい。また、上述の方法では、検出用配列である配列Ｄは、フォワードプライマーの第２の核酸鎖の５’端に配置した例を記載したが、それに限定するものではない。本発明の態様に従うと、検出用配列は第１の核酸鎖に配置してもよい。また、検出用配列は、目的とする当該伸長反応を妨げない限り、第１および第２の核酸鎖の３’または５’端の何れの位置に配置されてもよい。
【０１１２】
また、配列Ｅおよび配列Ｇの長さは、特に限定されるものではないが、５〜５０塩基の範囲でよく、好ましくは５〜１４塩基、更に好ましくは５〜９塩基である。
【０１１３】
配列Ｆおよび配列Ｆ’は、互いに相補的な配列である。配列Ｆと配列Ｆ’は、特に限定されるものではないが、長さは３〜５０塩基の範囲でよく、好ましくは５〜１４塩基、更に好ましくは５〜９塩基である。また、配列Ｆおよび配列Ｆ’は必ずしも同じ長さである必要はない。
【０１１４】
上述の方法では、ビオチンをリバースプライマーに付与し、アビジンで回収した例を示したが、当該方法は、ビオチンとアビジンの組み合わせに限定するものではなく、ビオチンとストレプトアビジンを組み合わせて使用しても、或いは互いに特異的に結合する２つの結合子からなる結合対を使用してもよい。また、当該結合子が付与されるリバースプライマーにおける位置は、第１の核酸鎖であっても第２の核酸鎖であってもよく、また、当該伸長反応を妨げない限り、３’若しくは５’末端またはその他の位置のどの位置に付与されてもよい。また、一本鎖の増幅産物を回収する方法はビオチンを付与した核酸プライマーとアビジン化磁気ビーズを使用した方法に限定されるものでは無く、例えばＳ-オリゴプライマーとＴ７ヌクレアーゼを用いる方法や、リン酸化プライマーとλ−ヌクレアーゼを用いる方法などが利用可能である。
【０１１５】
また、核酸の伸長反応は、上述の第１の例に記載するのと同様に変更することが可能である。
【０１１６】
本例において使用するフォワードプライマーとリバースプライマーは、第１の例と同様に変更してもよい。また、本例ではフォワードプライマーに検出用配列を付与し、リバースプライマーに結合対を構成する一方の結合子を付与したが、リバースプライマーに検出用配列を付与し、フォワードプライマーに結合子を付与してもよい。
【０１１７】
また、複数の標的核酸について１つの反応系で伸長反応を行い、１つのプローブ固相化基体上の検出用プローブを用いて検出を行うことも可能である。その場合、標的核酸の種類毎に、少なくともフォワードプライマーの配列Ｄの塩基配列と、配列Ａおよび／または配列Ｃの塩基配列とを変更すれば、標的核酸の種類毎に検出用配列が与えられる。従って、これらの複数種類の検出用配列を検出すればよい。その場合、使用される複数種類の検出用配列に対して、相補的な複数種類の検出用プローブをプローブ固定化基体に固定化しておけば、一度に複数種類の検出用配列を検出することが可能である。ここで、フォワードプライマーに加えて、リバースプライマーの配列や、そこに付与されるビオチンなどの結合子の種類を、標的核酸の種類毎に変更してもよい。また、一本鎖の増幅産物を回収する方法はビオチンを付与した核酸プライマーとアビジン化磁気ビーズを使用した方法に限定されるものでは無く、例えばＳ-オリゴプライマーとＴ７ヌクレアーゼを用いる方法や、リン酸化プライマーとλ−ヌクレアーゼを用いる方法などが利用可能である。
【０１１８】
本態様に従うと、当該検出は、リバースプライマー側のビオチンで回収する工程と、フォワードプライマー側の検出用配列で検出する工程の２つの工程を具備しているので、伸長反応が生じないことに由来するノイズを低く抑えることができ、且つ得られた検出が偽陽性の結果となることを防止できる。また、標的核酸の情報を検出用配列に置き換えて検出しているので、ミスハイブリが起こり難く、検出用プローブとの反応を安定して行うことも可能である。
【０１１９】
それに加えて、従来よりも短い核酸鎖を組み合わせてプライマーとして使用していることにより、標的核酸に効率よく結合し、高感度に伸長反応を達成することが可能である。また、非特異的結合を減少することが可能であるので、伸長反応に由来するノイズを減少することが可能である。
【０１２０】
また、プローブの設計の自由度が向上され、且つ特異的、効率的および／または高感度に標的核酸を伸長することが可能である。
【０１２１】
６．アッセイキット
本発明はまた、上述したような何れかの態様に従うプローブまたはプローブ固定化基体およびプライマー、並びにプライマーを構成する核酸鎖を、使用目的に応じて適切なアッセイキットとして提供することも可能である。
【０１２２】
例えば、第１のプローブと第２のプローブ、または所望の種類のプローブを組み合わせてアッセイキットとして提供してもよく、それらに基体を組み合わせてアッセイキットとして提供してもよい。また、第１のプローブを固定化したプローブ固定化基体と、第２のプローブ、または所望の種類のプローブを組み合わせてアッセイキットとして提供してもよい。更に、緩衝液用塩類および／またはその他の必要な試薬および／または標識物質などを組み合わせてアッセイキットとして提供されてもよい。
【０１２３】
また例えば、本発明に従うプライマーおよび／または核酸鎖の場合は、反応容器および／または緩衝液用塩類および／またはその他の必要な試薬、例えば、ポリメラーゼおよび／または基質および／またはプローブ固定化基体などと組み合わせてキットとして提供されてもよい。
【０１２４】
【実施例】
以下、図面を参照しながら本発明の実施例を説明する。
【０１２５】
実施例１
図１Ａは、本発明の第１の実施形態に係る核酸鎖検出方法の概略構成を示す図である。当該第１のプローブ１として、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の型判定を行うためのプローブを具備するプローブ固定化基体を用いて、標的核酸の検出を行う例を以下に説明する。
【０１２６】
第１のプローブ１は配列番号３の核酸配列からなる１０ｍｅｒのＨＣＶゲノム配列を含み、且つ３’末端にアミノ基を導入した合成オリゴヌクレオチドプローブである。このプローブをカルボジイミド処理したガラス基板２と反応させ、基板２上に固定化した（図１Ａ）。次に、配列番号１のＨＣＶのゲノム配列を含み且つＣｙ５標識した標的核酸と、２ｘＳＳＣ緩衝液中で４５℃でハイブリダイゼーションを行なった。このハイブリダイゼーション反応を行なう際に、１０ｍｅｒのＨＣＶゲノム配列を含む配列番号４の合成核酸も同時に存在させた。
【０１２７】
他方、コントロールとして、アミノ基を導入した配列番号５のＨＣＶ特異的配列の２０ｍｅｒのプローブをガラス基板上に固定化し、配列番号１の標的核酸とハイブリダイゼーション反応を行なった。
【０１２８】
その結果、配列番号３のプローブを固定化した基板により、配列番号４の核酸を共存させた状態で特異的な信号を検出することができた。これは、２０ｍｅｒの配列からなる配列番号５のプローブを用いた場合とほぼ同等の信号であった（図７）。ここで、図７のグラフＡは配列番号３を固定化した電極のみの場合、グラフＢは配列番号３を固定化した電極と配列番号１の核酸を反応させた場合、Ｃは配列番号３を固定化した電極と配列番号４、配列番号１の核酸を反応させた場合、Ｄは配列番号５を固定化した電極と配列番号１を反応させた場合である。
【０１２９】
以上の結果から、本発明の方法により、プローブの設計の自由度が向上され、且つ特異的に標的核酸を検出することが可能であることが示された。
【０１３０】
実施例２
図８は、本発明の第２の実施形態に係る核酸鎖検出方法の概略構成を示す図である。当該検出方法を利用して、ｒａｓ遺伝子の変異を検出するためのプローブ固定化基体を製造し、ｒａｓ遺伝子の変異を検出した。
【０１３１】
ガラス基板３０上には金の電極３１がパターニングしてあり、プローブ固定化部位が６箇所、対極３３、参照極３４がそれぞれ一箇所づつの構造になっている。まず、ｒａｓ Ｍｕｔａｎｔ ｓｅｔ（宝酒造製）を用いてｃ−Ｈａ−ｒａｓ−ｃｏｄｏｎ １２の正常なＰＣＲ産物（変異部位がＧｌｙである）を作製した。ＰＣＲプライマーは５’末端をリン酸化した配列番号６と配列番号７を用いた。反応後、ＰＣＲ反応液中にλ−ヌクレアーゼを添加して３７℃で１５分反応させた。これにより、リン酸化されているプライマー側の鎖を分解して一本鎖産物を作製した。配列番号８（変異部位がＧｌｙ）、配列番号１０（変異部位がＡｒｇ）、配列番号１１（変異部位がＳｅｒ）、配列番号１２（変異部位がＣｙｓ）を含むプローブに、予め３’末端にチオール基を導入しておき、金電極上に固定化した。ポジティブコントロールとして配列番号７の相補鎖の配列を、またネガティブコントロールとして配列番号２のｒＤＮＡの配列を固定化した。更に、比較のためにそれぞれ２０ｍｅｒの合成プローブ、配列番号１３（変異部位がＧｌｙ）、配列番号１４（変異部位がＡｒｇ）、配列番号１５（変異部位がＳｅｒ）、配列番号１６（変異部位がＣｙｓ）も金電極上に固定化した。
【０１３２】
一本鎖ＰＣＲ産物に配列番号９の核酸鎖を添加した後、２ｘＳＳＣ緩衝液中で９５℃で５分の熱変性を行った。その後、１０分間３５℃でアニーリングを行なった。このサンプルを、プローブ固定化電極に滴下し、３５℃で３０分ハイブリダイゼーション反応を行なった。反応後、０．２ｘＳＳＣで１５分間洗浄を行い、最後に、ヘキスト３３２５８の電流応答を測定した。その結果、特異的な電流信号は配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２を固定化した本発明の態様に従う電極の方（図９）が、比較例であるコントロール(図１０)よりも高い値が得られた。
【０１３３】
以上の結果から、本発明の方法により、プローブの設計の自由度が向上され、且つ特異的、効率的および／または高感度に標的核酸を検出することが可能であることが示された。
【０１３４】
実施例３
図４は、本発明の第３の態様に係る核酸検出方法の概略構成を示す図である。
当該検出方法を利用して、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の型判定を行った。第１のプローブ１として、配列番号１７の核酸配列からなる６ｍｅｒのＨＣＶゲノム配列を含み、且つ３‘末端にアミノ基を導入した合成オリゴヌクレオチドプローブを用いた。この第１のプローブ１をカルボジイミド処理したガラス基板２と反応させ、基板上に固定化した。配列番号１のＨＣＶのゲノム配列を含み、且つＣｙ５で標識された標的核酸と２ｘＳＳＣ緩衝液中で、４５℃でハイブリダイゼーションを行なった。このハイブリダイゼーション反応を行なう際に、１９ｍｅｒのＨＣＶゲノム配列を含む配列番号１８の合成核酸と、１３ｍｅｒの配列番号１９の合成核酸とを同時に存在させた。
【０１３５】
他方、コントロールとして、アミノ基を導入した配列番号５のＨＣＶ特異的配列の２０ｍｅｒをプローブとしてガラス基板上に固定化して、配列番号１のターゲットとハイブリダイゼーション反応を行なった。
【０１３６】
その結果、配列番号３のプローブを固定化した基板でも、配列番号４の核酸が共存することで特異的な信号が検出でき、２０ｍｅｒの配列からなる配列番号５のプローブを用いた場合よりも高い信号強度が得られた（図１１）。
【０１３７】
図１１では、本発明の態様を用いて行った結果を「連結プローブ」のグラフとして示し、従来の方法を用いて行った比較例を「コントロール」のグラフとして示した。
【０１３８】
以上の結果から、本発明の方法により、プローブの設計の自由度が向上され、且つ特異的、効率的および／または高感度に標的核酸を検出することが可能であることが示された。
【０１３９】
実施例４
図６は、本発明の第４の態様に係る標的核酸を伸長する方法の概要を示す模式図である。当該フォワードプライマーとして、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸の増幅を行なうためのＰＣＲプライマーを使用した例を以下に説明する。
【０１４０】
配列番号２０と２１をフォワードのプラーマーとしてまた配列番号２３をリバースのプライマーとして用い、鋳型に配列番号２２の合成オリゴを使用してＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ条件は図１３に示した。
【０１４１】
コントロールとして配列番号２４をフォワードプライマーとして使用して増幅を行った。その結果、コントロールと比較して高い温度まで増幅断片が確認できた（図１２）。以上の結果から、本発明で使用したプライマーを用いると、高い特異性で核酸断片の増幅が可能であることが示された。
【０１４２】
実施例５
図１４は、本発明の第４の態様に係る標的核酸を伸長する方法を用い、且つプローブ固定化基板を使って標的核酸の検出を行う方法の模式図である。２種の連結プライマーのうちの下流側の５’端に検出用の配列を導入することで、ＰＣＲ産物を簡便に検出することが可能となる。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸の増幅を行ない、増幅産物を基板検出した例を以下に説明する。
【０１４３】
配列番号２０と配列番号２５をフォワードの連結プライマーとして、また５’ビオチン標識した配列番号３５と配列番号３４をリバースの連結プライマーとして用い、鋳型に配列番号２２の合成オリゴを使用してＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ条件は図１３に示すもので、アニール温度は４８℃とした。
【０１４４】
ここで、図１４に示すフォワードプライマー４０がフォワードの連結プライマーであり、第１の核酸鎖が配列番号２０で示される核酸であり、第２の核酸鎖が配列番号２５で示される核酸である。また、配列Ａは、配列番号２０の５’末端から９塩基までの核酸であり、配列Ｂは、配列番号２０の残りの９塩基である。第２の核酸鎖は、配列番号２５で示される核酸であり、検出用配列Ｄが、配列番号２５の５’末端から２０塩基までであり、配列Ｂ’はその次の９塩基であり、配列Ｃは、３’末側の９塩基である。
【０１４５】
また、図１４に示すリバースプライマー４７が、リバースの連結プライマーであり、第１の核酸鎖が配列番号３５で示される核酸であり、第２の核酸鎖が配列番号３４で示される核酸である。また、配列Ｅは、配列番号３５の５’末端から９塩基までの核酸であり、配列Ｆは次の９塩基である。配列Ｆ’は、配列番号３４の５’末端から９塩基までの核酸であり、配列Ｇは３’側の９塩基である。また、リバースプライマー４７の第２の核酸鎖である配列番号３５で示される核酸の５’末端には、ビオチンが付与されている。
【０１４６】
図１４に示すように、コントロールとしては、連結プライマーではない、分割しない通常のプライマーの５’端に２０ｍｅｒの検出用配列５１を結合したコントロールプライマー５２（配列番号２６）をフォワードプライマーとして用いて増幅を行った。また、鋳型ＤＮＡを添加しないサンプルも用意し配列番号２０と配列番号２５をフォワードの連結プライマーとして、同様に操作した。
【０１４７】
次いで、ＰＣＲ産物にアビジン被覆磁気微粒子を添加して、ビオチン導入されたＰＣＲ産物をビーズ上にトラップした。上清を除去しビーズを洗浄した後、０．１ＮのＮａＯＨを添加してアルカリ変性で一本鎖ＤＮＡを遊離させた後、ＨＣｌで中和しターゲットサンプルとした。
【０１４８】
さらに、配列番号２７（検出用配列２０ｍｅｒの相補配列）の３’端をチオール修飾したプローブＤＮＡを金電極上に固定化した基板にターゲットサンプルをハイブリダイズさせた。すなわち、サンプルを２×ＳＳＣ緩衝液で希釈し、９５℃で５分間熱変性を行った後、基板上に滴下し、３５℃で３０分ハイブリダイゼーションを行った。反応後、０．２×ＳＳＣ緩衝液で１５分間洗浄し、最後にヘキスト３３２５８を作用させて、その電流応答を測定した。
【０１４９】
その結果、コントロールと同等以上の信号が得られた。また、鋳型のないサンプルでは電流値増加が認められなかった（図１５）。
【０１５０】
配列番号２５のプライマーには検出用配列が存在するため、ＰＣＲ産物をそのまま基板測定すると、この部分が反応して信号が出てしまうことが予想されるが、ビオチン−アビジン精製によりＰＣＲ産物のみを得ているので、鋳型なしのサンプルでは信号なしとなったと考えられる。以上の結果から、本発明の態様に従うプライマーを用いると、高い特異性で核酸断片の増幅が可能であることが示された。また、プライマーに検出用配列を具備することにより、基板での簡便な検出が可能となることが示された。
【０１５１】
実施例６
本発明の第４の態様に係る標的核酸を伸長する方法を用い、且つプローブ固定化基板を使って標的核酸の検出を行う方法でモデルＨＣＶの型判定を行った例を以下に示す。
【０１５２】
表１に示す通り、配列番号２０、配列番号２５は１ｂ型を、配列番号２８、配列番号２９は２ａ型を、配列番号３１、配列番号３２は２ｂ型を特異的に認識するフォワード連結プライマーである。
【０１５３】
【表１】
【０１５４】
さらに配列番号２２は１ｂ型の、配列番号３０は２ａ型の、配列番号３３は２ｂ型のそれぞれＨＣＶモデル合成ＤＮＡである。５’ビオチン標識した配列番号３５、配列番号３４をリバースの連結プライマーとして用いて、上記フォワード連結プライマーおよび鋳型の各組み合わせで実施例５と同様にＰＣＲを行い、ビオチン−アビジン法で一本鎖ターゲットＰＣＲ産物を得た。検出用配列の相補鎖プローブ（配列番号２７）を固定化した金電極にハイブリダイズさせ、ヘキスト３３２５８の電流応答を測定したところ、表２の通り、型の合致した組み合わせでのみ、信号が得られた。
【０１５５】
【表２】
【０１５６】
以上の結果から、本発明で使用したプライマーを用いると、高い特異性で核酸断片の増幅が可能であること、および、プライマーに検出用配列を具備することにより、簡便なＨＣＶ型判定が可能となることが示された。
【０１５７】
【発明の効果】
本発明に基づく方法を用いると、プローブあるいはプライマー設計の自由度が向上され、且つ特異的、効率的および／または高感度に標的核酸を検出すること、または標的核酸を伸長することが可能になる。
【０１５８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 第１の態様に係る標的核酸を検出する方法の概要と従来の方法とを比較して示す模式図。
【図２】 本発明の態様に従い使用され得るプローブ固定化基体の例を示す図。
【図３】 本発明の態様に従い使用され得るプローブ固定化基体の例を示す図。
【図４】 第２の態様に係る標的核酸を検出する方法において得られる標的核酸と第１のプローブ、第２のプローブおよび第３のプローブとの結合の様子を示す模式図。
【図５】 第３の態様に係る標的核酸を検出する方法において得られる標的核酸と第１のプローブおよび第２のプローブとの結合の様子を示す模式図。
【図６】 第４の態様に係る標的核酸を伸長する方法の概要を示す模式図。
【図７】 実施例１で得られた結果を示すグラフ。
【図８】 実施例２で用いたプローブ固定化基体を示す図。
【図９】 本発明の態様を用いて実施例２で得られた結果を示すグラフ。
【図１０】 コントロールについて実施例２で得られた結果を示すグラフ。
【図１１】 実施例３で得られた結果を示すグラフ。
【図１２】 実施例４で得られた増幅産物を示す電気泳動の写真。
【図１３】 実施例４で行ったＰＣＲの条件を示す図。
【図１４】 第４の態様に係る標的核酸を伸長した後に、検出を行う方法の概要を示す模式図。
【図１５】 実施例５で行った検出の結果を示すグラフ。
【符号の説明】
１．第１のプローブ ２、１６、２２、３０．基体 ３、６、４４．標的核酸 ４．第２のプローブ ５．従来のプローブ ７、２７．第２のプローブ ８．第３のプローブ １１、１２、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１．プローブ １５．固定化領域 ２３、３１．電極 ２４、３２．パット ２８、４１、４６．第１の核酸鎖 ２９、４２、４７．第２の核酸鎖 ３３．対極 ３４．参照極 ４０．フォワードプライマー ４３、５１．検出用配列 ４５．リバースプライマー ４８．検出用プローブ ４９．金電極 ５０．プローブ固定化基体 ５２．コントロールプライマー
【発明の属する技術分野】
本発明は、標的核酸の検出方法および伸長方法、並びにアッセイキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
特定の核酸配列を持った核酸鎖を検出するためには、検出対象の配列に相補的な１対の核酸プライマーを用いて増幅した後に電気泳動で確認したり（特許文献１を参照されたい）、検出対象の配列に相補的なプローブを固定化した基板を用いたりする方法が一般的に用いられている（特許文献２を参照されたい）。特定の核酸鎖を特異的に検出するためには、１５塩基程度以上の連続する特異的な配列をもつプローブあるいはプライマーが必要になる。しかしながら、プライマーあるいはプローブ設計ソフトなどを利用しても、変異や多型の多い領域では必ずしも１５塩基の連続する特異的な配列を選択するのが難しく、最適な検出条件が設定できない問題があった。
【０００３】
さらに、合成核酸は長くなる程分離精製が難しくなり、結果として収率が悪くなることが知られている。しかし、短いプローブでは特異性が出せない、感度が低い等の問題から、価格が高くても長い配列を使わざるを得なかった。
【０００４】
また、プローブ固定化電極と電気化学的に活性な挿入剤を用いた電流検出型のＤＮＡチップが報告されている（特許文献３を参照されたい）。この方法は標識が不要なためランニングコストが安い、蛍光検出のような高価で大型の検出装置が不要などのメリットがある。また、そのような方法で使用される通常のプローブは、長い方が検出感度が高いと考えられている。しかしながら、挿入剤がプローブにも若干反応するため、長いプローブを用いるとノイズが増加してしまい、検出感度が不十分であるなどの問題があった。
【０００５】
【特許文献１】
特許第３１７１７９２号公報（第３９−４０頁）
【０００６】
【特許文献２】
特表平９−５０７１２１号公報（第８０−９３頁）
【０００７】
【特許文献３】
特開平１０−１４６１８３号公報（第１３−２２頁）
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、プローブあるいはプライマー設計の自由度が向上され、且つ特異的、効率的および／または高感度に標的核酸を検出する方法、および標的核酸を伸長する方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記の課題を解決するために次のような手段を提供する。
【００１０】
本発明の第１の態様に従うと、第１の標的配列Ａ’と第２の標的配列Ｃ’とを含み、Ａ’−Ｃ’（５’→３’）で表される配列を含む標的核酸の検出方法であって、
（１）試料と、
標的配列Ａ’に相補的な配列Ａ、配列Ｂ、スペーサＳおよび官能基Ｘを含み、Ｘ−Ｓ−Ｂ−Ａ（５’→３’）で表される第１のプローブと、
配列Ｂに相補的な配列Ｂ’および標的配列Ｃ’に相補的な配列Ｃを含み、Ｃ−Ｂ’（５’→３’）で表される第２のプローブと、
を適切なハイブリダイゼーションが得られる条件下で反応させること、および
（２）前記（１）の反応させることにより生じたハイブリダイゼーションを検出することにより、標的核酸の存在を判定することを具備する標的核酸の検出方法が提供される。
【００１１】
本発明の第２の態様に従うと、第１の標的配列Ａ’と第２の標的配列Ｃ’とを含み、Ｃ’−Ａ’（５’→３’）で表される配列を含む標的核酸の検出方法であって、
（１）試料と、
標的配列Ａ’に相補的な配列Ａ、配列Ｂ、スペーサＳおよび官能基Ｘを含み、Ａ−Ｂ−Ｓ−Ｘ（５’→３’）で表される第１のプローブと、
配列Ｂに相補的な配列Ｂ’および標的配列Ｃ’に相補的な配列Ｃを含み、Ｂ−Ｃ’（５’→３’）で表される第２のプローブと、
を適切なハイブリダイゼーションが得られる条件下で反応させること、および
（２）前記（１）の反応させることにより生じたハイブリダイゼーションを検出することにより、標的核酸の存在を判定すること、
を具備する標的核酸の検出方法が提供される。
【００１２】
本発明の第３の態様に従うと、第１の標的配列Ａ’、第２の標的配列Ｃ’および第３の標的配列Ｅ’を含み、Ａ’−Ｃ’−Ｅ’（５’→３’）で表される配列を含む標的核酸の検出方法であって、
（１）試料と、
標的配列Ａ’に相補的な配列Ａ、配列Ｂ含み、Ｘ−Ｓ−Ｂ−Ａ（５’→３’）で表される第１のプローブと、
配列Ｂに相補的な配列Ｂ’、標的配列Ｃ’に相補的な配列Ｃおよび配列Ｄを含み、Ｄ−Ｃ−Ｂ’（５’→３’）で表される第２のプローブと、
配列Ｄに相補的な配列Ｄ’、標的配列Ｅ’に相補的な配列Ｅを含み、Ｅ−Ｄ’（５’→３’）で表される第３のプローブと、
を適切なハイブリダイゼーションが得られる条件下で反応させること、および
（２）前記（１）の反応させることにより生じたハイブリダイゼーションを検出することにより、標的核酸の存在を判定すること、
を具備する標的核酸の検出方法が提供される。
【００１３】
本発明の第４の態様に従うと、少なくとも、前記第１のプローブおよび第２のプローブを具備することを特徴とする前記第１の態様から第３の態様の何れか１項に記載の標的核酸の検出方法を行うためのアッセイキットが提供される。
【００１４】
本発明の第５の態様に従うと、（１）配列Ｂと配列Ａを含み、Ｂ−Ａ（５’→３’）で表される第１の核酸鎖と、配列Ｂに相補的な配列Ｂ’と配列Ｃを含みＣ−Ｂ’（５’→３’）で表される第２の核酸鎖とを含み、前記配列Ｂと配列Ｂ’がハイブリダイズすることによって連結してなるプライマーを、標的核酸と共に存在させることと、
（２）前記（１）に記載のプライマーと標的核酸とを適切な伸長反応が得られる条件下で反応させることと、
を具備する標的核酸の伸長方法が提供される。
【００１５】
本発明の第６の態様に従うと、少なくとも前記第１の核酸鎖と第２の核酸鎖とを具備する前記第５の態様に記載の標的核酸の伸長方法を行うためのアッセイキットが提供される。
【００１６】
本発明の第７の態様に従うと、第１の標的配列Ａ’と第２の標的配列Ｃ’とを含み、Ａ’−Ｃ’（５’→３’）で表される配列を含む標的核酸の検出方法であって、少なくとも前記第１の核酸鎖と第２の核酸鎖とを具備する請求項６に記載の標的核酸の伸長を行い、伸長産物の有無から標的核酸を検出する方法。
【００１７】
本発明の第８の態様に従うと、第１の標的配列Ａ’と第２の標的配列Ｃ’とを含み、Ａ’−Ｃ’（５’→３’）で表される配列を含む標的核酸を検出する方法であって、
（１）検出用配列Ｄと配列Ｂおよび標的配列Ａ’に相補的な配列Ａを含み、Ｄ−Ｂ−Ａ（５’→３’）で表される第１の核酸鎖と、配列Ｂに相補的な配列Ｂ’および標的配列Ｃ’に相補的な配列Ｃを含みＣ−Ｂ’（５’→３’）で表される第２の核酸鎖とを含み、前記配列Ｂと配列Ｂ’がハイブリダイズすることによって連結してなる第１のプライマーを、第２のプライマーと共に、前記標的核酸に対して、適切な伸長反応が得られる条件下で反応させることと、
（２） 前記（１）で生じた二本鎖反応産物を、検出用配列Ｄに相補的な配列を有するプローブを具備するプローブ固定化基体に対して適切なハイブリダイゼーションが得られる条件下で反応させることと、
（３）前記（２）の反応させることにより生じたハイブリダイゼーションを検出することにより、標的核酸の存在を判定することと、
を具備する標的核酸を検出する方法が提供される。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明に従うと、短い核酸鎖を組み合わせて使用し、標的核酸を検出または伸長する方法が提供される。
【００１９】
１．用語の説明
ここで使用される「核酸」の語は、ＤＮＡおよびＲＮＡ、Ｓ-オリゴ、メチルホスホネートオリゴ、ＰＮＡ（即ち、ペプチド核酸）およびＬＮＡ（即ち、ロック核酸）などの何れの核酸類似体など、一般的に、その一部の構造を塩基配列によって表すことが可能な物質を総括的に示す語である。また、そのような核酸は、天然に存在するものであっても、人工的に合成されたものであって、それらの混合物であってもよい。
【００２０】
また、本発明の核酸は、一般的にそれ自身公知の方法により合成または産生されればよい。例えば、そのような方法は、一般的な核酸の合成に使用される核酸合成機を使用しても、一般的な大腸菌などを利用した遺伝子操作などの手段を利用してもよい。合成あるいは産生された核酸は、液体クロマトグラフィーや、マススペクトロスコーピーなどで精製することが望ましい。
【００２１】
ここで使用される「標的配列」の語は、本発明の態様に従うプローブが結合するための塩基配列を示す。ここで使用される「標的核酸」の語は、標的配列を含む核酸を示す。本発明の態様に従う方法で検出対象となる標的核酸は、特に限定されるものではなく、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＲＮＡおよびｍＲＮＡなど、また、人工的に製造した核酸類似物であってもよい。また、本発明の態様に従って検出に供される標的核酸は、所望に応じて、未修飾でもあっても、それ自身公知の手段によって何れかの修飾が施されていてもよい。例えばＣｙ５、Ｃｙ３、ＦＩＴＣ等の蛍光色素で標識しておけば、蛍光検出器を用いた検出が可能であり、ハプテンや酵素で標識することにより、発色または発光での検出が可能である。
【００２２】
ここで使用される「相補」、「相補的」および「相補性」の語は、複数の配列が、互いに５０％から１００％の範囲で相補的あることを示す。本発明における好ましい相補性は、８０％以上で相補的な場合であり、より好ましくは９０％以上で相補的な場合である。
【００２３】
２．第１の態様
（１）検出方法
本発明に従う第１の態様は、基本的にはプローブを使用して目的とする標的核酸を検出する方法である。図１を用いて、本発明の第１の態様を説明する。
【００２４】
本発明の態様に従う方法では、第１のプローブと、第１のプローブに対して一部分でハイブリダイズする第２のプローブとを用いる。
【００２５】
第１のプローブ１は、官能基Ｘと、スペーサーＳと、配列Ｂと、配列Ａを有する核酸である（図１Ａ）。当該第１のプローブ１は、官能基Ｘを介して基体２に固定化されている。第１のプローブ１は、配列Ａに相補的な配列Ａ’を含む標的核酸３にハイブリダイズする（図１Ｂ）。
【００２６】
第２のプローブ４は、配列Ｂに相補的な配列Ｂ’と、配列Ｃを含む。第２のプローブ４の配列Ｂ’は、第１のプローブ１の配列Ｂとハイブリダイズする（図１Ｃ）。第１のプローブ１と第２のプローブ４は、配列Ｂと配列Ｂ’により、一部分で連結している。また、第２のプローブ４の配列Ｃは、標的配列３に含まれる配列Ｃ’にハイブリダイズする（図１Ｃ）。
【００２７】
従って、本発明の方法では、上述のように一部で連結している第１のプローブ１と第２のプローブ４に対してハイブリダイズしたことにより、標的配列が検出される（図１Ｃ）。
【００２８】
従来使用されるプローブ固定化基体は、図１Ｄに示すように、プローブ５が基体２に垂直方向に固定化されている。当該プローブ５に図１Ｄに示すように標的核酸と１対１でハイブリダイズする。また、従来のプローブ固定化基体は、基体２の表面に対してプローブ５が垂直方向に固定化されている。従って、当該プローブ５に対してハイブリダイズした標的核酸６も、基体２の表面に対して垂直に捕捉される（図１Ｄ）。
【００２９】
これに対して、上述のような本発明の態様に従うと、標的核酸３は、第１のプローブ１と第２のプローブ４の両方にハイブリダイズすることにより、基体２の表面からより遠い位置で捕捉される（図１Ｃ）。このように捕捉されることにより、従来のように垂直に捕捉される場合に比べて立体障害が生じ難い。従って、効率よく目的のハイブリダイズが達成される。例えば図１Ｄの従来の手段では、標的核酸６が非常に長く、特に、プローブ５とのハイブリダイズ領域よりも基体側に長い場合、標的核酸６のプローブ５へのハイブリダイゼーションは阻害されてしまう。しかしながら、本発明の態様に従えば、標的核酸３の長さに関係なく、効率よいハイブリダイゼーションが達成される。
【００３０】
また、ハイブリダイゼーション反応前は各プローブは一本鎖の構造を形成しているが、標的核酸と結合することで、標的核酸とプローブとの間に二本鎖構造が形成されると共に、各プローブ間にも二本鎖が形成される。よって、本発明の態様のように複数のプローブを使用しない場合に比べ、挿入剤をたくさん結合することができる。それにより、結果的に電流信号の増大、高感度化が達成される。更に、各プローブは従来よりもその長さが短い。従って、ノイズを減少することも可能であり、最適な検出条件の設定が従来よりも容易であり、且つ低コストで製造することが可能である。
【００３１】
従って、プローブの設計の自由度が向上され、且つ特異的、効率的および／または高感度に標的核酸を検出することが可能である。
【００３２】
（２）構成
第１のプローブに含まれる配列Ａおよび第２のプローブに含まれる配列Ｃの長さは、特に限定されるものではないが、５〜５０塩基の範囲でよく、好ましくは５〜１４塩基、更に好ましくは５〜９塩基である。
【００３３】
配列Ｂと、配列Ｂ’は上述した通り、互いに相補的な配列である。配列Ｂと配列Ｂ’は、特に限定されるものではないが、長さは３〜５０塩基の範囲でよく、好ましくは５〜１４塩基、更に好ましくは５〜９塩基である。
【００３４】
標的核酸における第１および第２のプローブに結合する領域は、各々、第１の標的配列、第２の標的配列である。これらの配列は、第１のプローブの配列Ａに結合するための配列Ａ’と、第２のプローブの配列Ｃに結合するための配列Ｃ’である。標的核酸上での配列Ａ’と配列Ｃ’は、互いに隣接していてもよく、配列Ａ’と配列Ｃ’の間に２００〜１塩基が存在してもよく、好ましくは５０〜１塩基、より好ましくは１０〜１塩基が存在するように、プローブの設計を行う。
【００３５】
本発明の第１のプローブ１の配列は、その５’末端側から３’末端側に向かい（即ち、５’→３’と示す）、官能基Ｘ、スペーサーＳ、配列Ｂ、配列Ａと配置される、即ち、Ｘ−Ｓ−Ｂ−Ａ（５’→３’）であってもよく、その５’末端側から配列Ａ、配列Ｂ、スペーサーＳ、官能基Ｘ、即ち、Ａ−Ｂ−Ｓ−Ｘ（５’→３’）であってもよい。但し、第１のプローブ１を構成する成分の並び方に応じて、第２のプローブ４の構成が決定される。即ち、第１のプローブ１がＸ−Ｓ−Ｂ−Ａ（５’→３’）の場合、第２のプローブ４はＢ’−Ｃ（３’→５’）である。また、第１のプローブ１がＡ−Ｂ−Ｓ−Ｘ（５’→３’）の場合、第２のプローブ４はＣ−Ｂ’（３’→５’）である。何れの場合も、第１のプローブ１を基体２に固定化する場合には、官能基Ｘを介して行われることが好ましい。
【００３６】
本発明の態様に従って使用されるスペーサーＳには、特に限定されるものではないが、トリエチレングリコールおよびヘキサエチレングリコールなどのエチレングリコール鎖、メチレングリコール鎖、アルキル鎖並びに塩基などを用いることが可能であり、その長さは５００原子程度までが好ましい。また、当該スペーサーは直鎖であることが望ましいが、枝状に分岐した分子も本発明の態様において使用することが可能である。また、分子中に芳香環などが入っていてもよい。
【００３７】
本発明の態様に従って使用される官能基Ｘは、当該第１のプローブを基体表面に固定化するためのものである。従って、基体に固定化しないで使用する場合には、必ずしも必要ではない。本発明において使用され得る官能基Ｘは、これらに限定されるものではないが、例えば、メルカプト基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基およびビオチンなどを用いることが可能である。これらの官能基Ｘの選択は、基体または基体表面の性質または処理に応じて行ってよい。これらの官能基と基体または表面表面の選択およびプローブの固相化は、それ自身公知の手段により達成することが可能である。
【００３８】
本発明の態様に従って使用され得る基体は、ガラス、シリコンおよび樹脂などから構成された担体などの基体であればよい。また、その形状は、板状、球状および棒状であってもよい。また、容器を基体として用い、その内部を構成する底面および／または壁面など、またはその一部に対してプローブを固定化してもよい。
【００３９】
（３）反応の手順
本発明の第１の態様に従って、プローブと標的核酸を反応させる際の手順の例を図１を用いて以下に説明する。
【００４０】
まず、第１のプローブ１を基体２の表面に固定化する（図１Ａ）。次に、標的核酸３を第１のプローブ１に対して、ハイブリダイズさせる（図１Ｂ）。続いて、第２のプローブ４を標的核酸３と第１のプローブ１に対してハイブリダイズさせる（図１Ｃ）。
【００４１】
または次のように行ってもよい。まず、標的核酸３と第２のプローブ４をハイブリダイズさせる。これを、基体２の表面に固定化された第１のプローブ１に添加して、ハイブリダイズさせる。
【００４２】
或いは、次のように行ってもよい。最初に、第１のプローブ１と第２のプローブ４をハイブリダイズさせ、それに対して標的核酸３を添加してハイブリダイズさせる。
【００４３】
このような反応を利用して、試料中の標的核酸の存在を検出する場合には、例えば、次のように行えばよい。まず、標的核酸の配列を基に、標的配列を選択し、第１のプローブと第２のプローブを設計し用意する。次に、第１のプローブを基体に固定化する。その一方で、試験の対象となる核酸を含有する試料を準備する。準備された試料に対して、第２のプローブを添加し、適切なハイブリダイゼーションが得られる条件下で反応を行う。次に、得られた反応産物を、適切なハイブリダイゼーションが得られる条件下で、基体に固定化された第１のプローブと反応させる。基体に固定化された第１のプローブと第２のプローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションの存在を検出することによって、当該試料中の標的核酸を検出することが可能である。また、このような試料中の標的核酸の存在を検出する方法は、上述のプローブと標的核酸を反応させる際の手順に応じて、手順を入れ替えるなどの必要な種々の変更を行ってもよい。
【００４４】
ハイブリダイゼーションの存在の検出は、それ自身公知の何れの手段を利用して行ってもよい。例えば、ハイブリダイゼーションが生じた部位に取り込まれるインタカレータを利用しても、抗原抗体反応を利用しても、また、試料核酸を予め標識する手段を利用してもよい。
【００４５】
（４）プローブ固定化基体
本発明の態様において使用されるプローブ固定化基体について、例を用いて以下に説明する。
【００４６】
（ａ）第１の例
図２に本発明の態様に従い使用され得るプローブ固定化基体の第１の例を模式的に示した。第１の例であるプローブ固定化基体は、基体１６とその表面に存在する１以上の固定化領域１５に夫々１以上で固定化されたプローブ１１から１４を具備する（図２）。
【００４７】
このようなプローブ固定化基体は、例えば、それ自身公知の手段によりシリコン基板などの基体に対してプローブを固定化することにより製造することが可能である。
【００４８】
本発明に従うと、１つの基体に配置する固定化領域１５の数も、そこに固定化されるプローブの数もこれに限定するものではなく、所望に応じて変更してよい。また、複数種類の塩基配列をプローブとして１つの基体に配置してもよい。複数および／または複数種類のプローブの基体への固相パターンは、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。このようなプローブ固定化基体は本発明の範囲内である。
【００４９】
（ｂ）第２の例
図３を用いて、本発明の態様において使用され得るプローブ固定化基体の第２の例を説明する。第２例であるプローブ固定化基体は、基体２２に具備された１以上の電極２３に夫々１以上で固定化されたプローブ１７から２０を具備する（図３）。電極２３は、電気的情報を取り出すためのパット２４に接続されている。
【００５０】
このようなプローブ固定化基体は、例えば、それ自身公知の手段によりシリコン基板などの基体に電極を配置し、その電極表面に対してプローブを固定化することにより製造することが可能である。
【００５１】
本態様においては、電極の数を５としたが１つの基体に配置する電極の数はこれに限定するものではない。また、電極の配置パターンも図３に示したものに限定されるものではなく、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。必要に応じて参照電極および対極を設けてもよい。そのようなプローブ固定化基体も本発明の範囲内である。
【００５２】
上記の例に記載するような蛍光検出を行うためのプローブ固定化基体の場合は、上記の何れかの基体に対してプローブを固定化すればよい。また、上記の第１の例に記載するような電気化学的検出を行うためのプローブ固定化基体の場合は、上記の何れかの基体に電気化学的な検出が可能であるように電極を配置し、その電極上にプローブを固定化すればよい。
【００５３】
本発明において使用され得る電極は、特に限定されるものではないが、例えば、グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバーのような炭素電極、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウムのような貴金属電極、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛のような酸化物電極、Si、Ge、 ZnO、 CdS、 TiO2 、GaAsのような半導体電極、チタン等が挙げられる。これらの電極は導電性高分子によって被覆しても、単分子膜によって被覆してもよく、所望に応じてその他の表面処理剤を処理してもよい。
【００５４】
また、異なる塩基配列を有するプローブは、それぞれ、異なる電極に対して固定化されてもよく、異なる塩基配列を有する複数種類のプローブが混合された状態で１つの電極に対して固定化されてもよい。
【００５５】
（５）検出
本発明に従うプローブ固定化基体を用いる場合、前記基体に固定化されたプローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーション反応の結果生じた二本鎖の存在を検知するための手段として、電気化学的方法および蛍光検出法を利用することが可能である。
【００５６】
（ａ）電気化学的検出
電気化学的による二本鎖核酸の検出は、例えば、それ自身公知の二本鎖認識物質を用いて行えばよい。
【００５７】
ここで用いられる二本鎖認識体は特に限定されるものではないが、例えば、ヘキスト３３２５８、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーターおよびポリインターカレーター等を用いることが可能である。更に、これらのインターカレーターを電気化学的に活性な金属錯体、例えば、フェロセン、ビオロゲン等で修飾しておくことも可能である。また、その他の公知の何れの二本鎖認識物質も本発明において好ましく使用される。
【００５８】
本発明に従うプローブ固定化基体では、プローブが電極に対して固定化されている。このような電極を用いての二本鎖核酸の検出は他の一般的な電気化学的検出法と同じように、更に対極や参照極を使用してもよい。参照極を配置する場合、例えば、銀／塩化銀電極や水銀／塩化水銀電極などの一般的な参照極を使用してよい。
【００５９】
続いて、適切なハイブリダイゼーションが可能な条件下で反応を行う。そのような適切な条件は、標的配列に含まれる塩基の種類、プローブ固定化基体に具備されるプローブの種類、試料核酸の種類およびそれらの状態などの諸条件に応じて、当業者であれば適宜選択することが可能である。これに限定されるものではないが、例えば以下のような条件下で反応を行ってもよい。
【００６０】
例えば、ハイブリダイゼーション反応溶液は、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液中で行う。この溶液中にはハイブリダイゼーション促進剤である硫酸デキストラン、並びに、サケ精子ＤＮＡ、牛胸腺ＤＮＡ、ＥＤＴＡおよび界面活性剤などを添加してもよい。ここに得られた試料核酸を添加し、９０℃以上で熱変性させる。熱変性された試料核酸へのプローブ固定化基体の挿入は、変性直後、あるいは０℃に急冷後に行ってもよい。また、基体上に液を滴下することでハイブリダイゼーション反応を行うことも可能である。
【００６１】
反応中は、撹拌、あるいは振とうなどの操作で反応速度を高めてもよい。反応温度は、例えば、１０℃〜９０℃の範囲で、反応時間は１分以上１晩程度で行えばよい。ハイブリダイゼーション反応後、電極を洗浄する。洗浄には、例えば、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いればよい。試料核酸中に標的配列を含む標的核酸が存在した場合、プローブとハイブリダイズし、それにより二本鎖核酸が生じる。
【００６２】
続いて、電気化学的手段により、以下のような手順で生じた二本鎖核酸の検出を行う。一般的には、ハイブリダイゼーション反応の後に、基体を洗浄し、電極表面に形成された二本鎖部分に二本鎖認識体を作用させて、それにより生じる信号を電気化学的に測定する。
【００６３】
二本鎖認識体の濃度は、その種類によって異なるが、一般的には１ｎｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの範囲で使用する。この際には、イオン強度０．００１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いればよい。
【００６４】
例えば、電気化学的な測定は、二本鎖認識体が電気化学的に反応する電位以上の電位を印加し、二本鎖認識体に由来する反応電流値を測定してよい。この際、電位は定速で掃引するか、あるいはパルスで印加するか、あるいは、定電位を印加してもよい。測定の際に、例えば、ポテンショスタット、デジタルマルチメーターおよびファンクションジェネレーター等の装置を用いて電流、電圧を制御してもよい。例えば、得られた電流値を基に、検量線から標的核酸の濃度を算出してもよい。
【００６５】
また、それ自体公知の電気化学的検出手段、例えば、以下の文献に開示されている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． １９９４， Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． １９９８）手段なども本発明の方法において好ましく使用できる。当該文献において、橋本らは、ＤＮＡプローブで修飾された金電極と電気化学的に活性な色素を用いる配列特異的遺伝子検出を報告した。色素に由来する陽極の電流は、標的ＤＮＡの濃度に相関する。また、ワンらは、インディケーターフリーの電気化学的なＤＮＡのハイブリダイゼーションを報告した。このバイオセンサーの構成は、カーボンペースト電極へのイノシン置換プローブ（グアニンを含まない）の固定化と、当該標識のグアニン酸化ピークの存在による二重鎖の形成のクロノポテンショメトリック検出を含む。これらの文献に記載される検出手段は好ましく本発明において使用されてよい。
【００６６】
（ｂ）蛍光検出法
蛍光標識物質を用いる方法の場合には、標的核酸を、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５若しくはローダミンなどの蛍光色素などの蛍光学的な活性が得られる物質で標識しておいてもよい。或いは、そのような標識の代わりに前述の物質で標識したセカンドプローブを用いてもよい。また、複数の標識物質を同時に使用してもよい。
【００６７】
幾つかの態様においては、試料から抽出した核酸成分とプローブ固定化基体に固定化されたプローブとのハイブリダイゼーション反応は、例えば、以下のように行う。例えば、ハイブリダイゼーション反応溶液は、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液中で行う。この溶液中にはハイブリダイゼーション促進剤である硫酸デキストラン、並びに、サケ精子ＤＮＡ、牛胸腺ＤＮＡ、ＥＤＴＡおよび界面活性剤などを添加してもよい。ここに抽出した核酸成分を添加し、９０℃以上で熱変性させる。プローブ固定化基体の挿入は、変性直後、あるいは０℃に急冷後に行ってよい。また、基体上に液を滴下することでハイブリダイゼーション反応を行うことも可能である。反応中は、撹拌、あるいは振とうなどの操作で反応速度を高めてもよい。反応温度は、例えば、１０℃〜９０℃の範囲で、反応時間は１分以上１晩程度で行えばよい。ハイブリダイゼーション反応後、洗浄を行う。洗浄には、例えば、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いる。
【００６８】
蛍光検出の場合、ハイブリダイゼーション反応の検出は、標識の種類に応じた適宜の検出装置を用いて、試料中の標識された塩基配列又は２次プローブ中の標識を検出することによって行う。標識が蛍光物質の場合には、例えば、蛍光検出器を用いて標識を検出すればよい。
【００６９】
３．第２の態様
上述の第１の態様に使用した第１のプローブと第２のプローブに加えて、更に第３のプローブを使用して、第１の態様に記載の事項に準じて標的核酸を検出してもよい。
【００７０】
（１）検出方法
図４を用いて説明する。本発明の態様に従う方法では、第１のプローブ１と、第２のプローブ７と、第３のプローブ８を用いる。
【００７１】
第１のプローブ１は、官能基Ｘと、スペーサＳと、配列Ｂと、配列Ａを有する核酸である。当該第１のプローブ１は、官能基Ｘを介して基体２に固定化されている。第１のプローブ１は、標的核酸３に含まれる標的配列である配列Ａ’にハイブリダイズする。即ち、配列Ａは配列Ａ’に相補的である。
【００７２】
第２のプローブ７は、配列Ｂに相補的な配列Ｂ’と、配列Ｃと、配列Ｄを含む。第２のプローブ７は、標的核酸３に含まれる標的配列である配列Ｃ’にハイブリダイズする。即ち、配列Ｃと配列Ｃ’は相補的である。
【００７３】
第３のプローブ８は、配列Ｄに相補的な配列Ｄ’と、配列Ｅを含む。第３のプローブ８は、標的核酸３に含まれる標的Ｅ’にハイブリダイズする。即ち、配列Ｅと配列Ｅ’は相補的である。
【００７４】
（２）構成
配列Ａ、配列Ｃおよび配列Ｅの長さは、特に限定されるものではないが、５〜５０塩基の範囲でよく、好ましくは５〜１４塩基、更に好ましくは５〜９塩基である。
【００７５】
配列Ｂと配列Ｂ’、配列Ｄと配列Ｄ’は互いに相補的な配列であり、これらの長さは、特に限定されるものではないが、３〜５０塩基の範囲でよく、好ましくは５〜１４塩基、更に好ましくは５〜９塩基である。
【００７６】
標的核酸上の配列Ａ’、配列Ｃ’および配列Ｅ’は、互いに接していてもよく、それぞれの配列の間に２００〜１塩基が存在してもよく、好ましくは５０〜１塩基、より好ましくは１０〜１塩基が存在するように、プローブの設計を行う。
【００７７】
本発明の第１のプローブ１の構成は、その５’末端側から官能基Ｘ、スペーサーＳ、配列Ｂ、配列Ａ、即ち、Ｘ−Ｓ−Ｂ−Ａ（５’→３’）であってもよく、その５’末端側から配列Ａ、配列Ｂ、スペーサーＳ、官能基Ｘ、即ち、Ａ−Ｂ−Ｓ−Ｘ（５’→３’）であってもよい。第１のプローブ１を構成する成分の並び方に応じて、第２のプローブ７および第３のプローブ８の構成が決定される。
【００７８】
以上の事項以外は、第２の態様のために、第１の態様において記載した方法および検出手段などを用いることが可能であり、また、第１の態様に記載に従って所望の変更を行ってもよい。
【００７９】
また、第２の態様では３つのプローブを用いる例を示したが、本発明の趣旨に従って４以上のプローブを用いても同様に標的核酸の検出を行うことが可能である。また、連結数の多い方が検出感度をより向上させる。
【００８０】
このような本態様により、効率的な検出を阻害する立体障害を抑制し、効率のよい標的核酸の検出が可能である。また、ハイブリダイゼーション反応前は各プローブは一本鎖の構造を形成しているが、標的核酸と結合することで、標的核酸とプローブとの間に二本鎖構造が形成されると共に、各プローブ間にも二本鎖が形成される。よって、本発明の態様のように複数のプローブを使用しない場合に比べ、挿入剤がたくさん結合することができる。それにより、結果的に電流信号の増大、高感度化が達成される。また、夫々のプローブは、従来よりもその長さが短い。従って、ノイズを減少することも可能であり、その製造も低コストで達成できる。
【００８１】
従って、プローブの設計の自由度が向上され、且つ特異的、効率的および／または高感度に標的核酸を検出することが可能である。
【００８２】
４．第３の態様
更に、本発明に従うと、第３の態様として図５に示すような構成の第１のプローブ２６と第２のプローブ２７を用いる標的核酸３を検出する方法が提供される。以下、図５を用いて説明する。
【００８３】
第１のプローブ２６は、官能基Ｘと、スペーサーＳと、配列Ａと、配列Ｂを、Ｘ−Ｓ−Ａ−Ｂ（５’→３’）の配列で有する。第１のプローブ２６は、官能基Ｘを介して基体２に固定されている。第１のプローブ２６の配列Ａは、標的配列３に含まれる配列Ａ’にハイブリダイズする。
【００８４】
第２のプローブ２７は、配列Ｂに相補的な配列Ｂ’と配列Ｃを、Ｂ’−Ｃ（５’→３’）の配列で有する。第２のプローブ２７は、配列Ｂ’を介して第１のプローブ２６にハイブリダイズし、更に第１および第２のプローブは、配列Ａと配列Ｃにより、標的配列３にハイブリダイズする（図５）。
【００８５】
以上の事項以外は、第１の態様に記載の通りに反応および検出を行うことが可能である。また、第２の態様に記載の方法に準じて３以上のプローブを設計し、それを用いて標的配列３を検出してもよい。また、第１および第２の態様に従って、所望の事項を変更してもよい。
【００８６】
本態様に従うと、従来よりも短い核酸鎖をプローブとして使用することにより、標的核酸を検出することが可能である。即ち、プローブは夫々は従来よりもその長さが短い。従って、ノイズを減少することも可能である。また、ハイブリダイゼーション反応前は各プローブは一本鎖の構造を形成しているが、標的核酸と結合することで、標的核酸とプローブとの間に二本鎖構造が形成されると共に、各プローブ間にも二本鎖が形成される。よって、本発明の態様のように複数のプローブを使用しない場合に比べ、挿入剤がたくさん結合することができる。それにより、結果的に電流信号の増大、高感度化が達成される。
【００８７】
従って、プローブの設計の自由度が向上され、且つ特異的、効率的および／または高感度に標的核酸を検出することが可能である。
【００８８】
５．第４の態様
本発明に従い、短い核酸鎖を組み合わせて使用して標的核酸を伸長する方法を第４の態様として以下に説明する。これに限定されるものではないが、ここでは第４の態様に従う本発明の２つの例を示す。
【００８９】
（１）第１の例
以下、図６を用いて説明する。第１の例は、標的核酸２２を鋳型として用い、短い核酸が組み合わされてなるフォワードプライマーと、リバースプライマーとを用いて、適切な伸長反応が得られる条件下で反応させ、目的とする核酸を伸長する方法である。
【００９０】
図６には、フォワードプライマーに含まれる各成分が、９塩基の配列Ａ、９塩基の配列ＢおよびＢ’、並びに９塩基の配列Ｃであるものを例として示したが、これに限定するものではなく、以下のように変更することが可能である。また、図６には、標的核酸として、１１４塩基のオリゴＤＮＡの例を示したが、これに限定されるものではなく以下のように変更してもよい。
【００９１】
フォワードプライマーとしては、配列Ａと配列Ｂを含む第１の核酸鎖２８と、配列Ｂ’と配列Ｃを含む第２の核酸鎖２９とを、互いに相補的な配列Ｂと配列Ｂ’により連結されたものを使用する。このような形態をした本発明に従うプライマーを「連結プライマー」とも称する。
【００９２】
配列Ａおよび配列Ｃの長さは、特に限定されるものではないが、５〜５０塩基の範囲でよく、好ましくは５〜１４塩基、更に好ましくは５〜９塩基である。
【００９３】
配列Ｂおよび配列Ｂ’は互いに相補的な配列である。配列Ｂと配列Ｂ’は、特に限定されるものではないが、長さは３〜５０塩基の範囲でよく、好ましくは５〜１４塩基、更に好ましくは５〜９塩基である。
【００９４】
標的核酸は、鋳型核酸として使われる。フォワードプライマーの構成要素である第１および第２の核酸鎖に結合する標的核酸の領域は、各々、第１の標的配列および第２の標的配列である。例えば、これらの配列は、第１のプローブの配列Ａに結合するための配列Ａ’と、第２のプローブの配列Ｃに結合するための配列Ｃ’である。標的核酸上の配列Ａ’と配列Ｃ’の位置は、互いに隣接していてもよく、配列Ａ’と配列Ｃ’の間に２００〜１塩基が存在してもよく、好ましくは５０〜１塩基、より好ましくは１０〜１塩基が存在するように、プローブの設計を行ってよい。
【００９５】
リバースプライマーは、それ自身公知の一般的にプライマーとして使用される何れの核酸を使用してもよい。或いは、上記のフォワードプライマーと同様な短い核酸が組み合わされてなる核酸をリバースプライマーとして使用してもよい。
【００９６】
ここで使用される「核酸を伸長する」の語は、鋳型核酸と、その一部の塩基配列に相補的なプライマーとを用いて、ポリメラーゼを作用させることにより、目的とする核酸を伸長することをいい、更に、そのような伸長と、そのような伸長が繰り返し行われる増幅の両方を示す。
【００９７】
本発明の態様に従って利用され得る伸長反応は、それ自体公知の一般的に核酸を伸長するために使用される手段であっても、および核酸を増幅するために使用される手段であってもよく、そのような手段で有れば何れも使用してよい。これらに限定するものではないが、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（一般的にＰＣＲと称される、以下、ＰＣＲと記す）や逆転写ＰＣＲなどを利用した方法を用いることが可能である。また更に、Nucleic acid strand amplification（ＮＡＳＢＡ）、Transcription mediated amplification（ＴＭＡ）、Ligase chain reaction（ＬＣＲ）、Strand displacement amplification（ＳＤＡ）、Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids（ＩＣＡＮＮ）および Rolling circle amplification（ＲＣＡ）法、Loop mediated amplification （ＬＡＭＰ）法などの手段も本発明の態様に従って利用することが可能である。
【００９８】
ここで使用される「適切に伸長反応が得られる条件」とは、ポリメラーゼが核酸鎖を合成するための各種条件、例えば、温度、ｐＨ、塩濃度およびｄＮＴＰなどの条件が、ポリメラーゼの活性を適切に得るために十分であるような状態を示す。
【００９９】
上述の例では２つの核酸鎖を組み合わせてフォワードプライマーとして使用する例を示したが、３以上で核酸鎖を組み合わせてもよい。また、ここではフォワードプライマーとして、２つ以上の核酸鎖を組み合わせた核酸を用いる例を示したが、フォワードプライマーを通常のプライマーを使用し、リバースプライマーを本発明に従う２つ以上の核酸鎖を組み合わせた核酸としてもよい。或いは、フォワードプライマーとリバースプライマーの両方に、本発明に従う２つ以上の核酸鎖を組み合わせた核酸を使用してもよい。
【０１００】
本態様に従うと、従来よりも短い核酸鎖を組み合わせてプライマーとして使用することにより、標的核酸に効率よく結合し、高感度に伸長反応を達成することが可能である。また、非特異的結合を減少することが可能であるので、ノイズを減少することも可能である。
【０１０１】
従って、プローブの設計の自由度が向上され、且つ特異的、効率的および／または高感度に標的核酸を伸長することが可能である。
【０１０２】
（２）第２の例
また更に、第１の例の標的核酸の伸長に続いて、その伸長反応産物を回収し、且つ伸長産物に含まれる特定の配列を検出することにより、標的核酸の存在を検出することも可能である。そのような例を図１４を用いて以下に説明する。
【０１０３】
図１４に示す方法において使用されるフォワードプライマー４０（図中、Ｆプライマーとも記す）は、第１の核酸鎖４１と第２の核酸鎖４２からなる。第１の核酸鎖４１は、５’側から配列Ａと配列Ｂを含む。第２の核酸鎖４２は、５’側から配列Ｄ、配列Ｂ’および配列Ｃを含む。第１の核酸鎖４１と第２の核酸鎖４２は、互いに相補的な配列Ｂと配列Ｂ’で連結される。本例において使用されるプライマーは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーともに、互いに相補的な配列の結合による連結部を有するので、両者とも「連結プローブ」とも称される。
【０１０４】
標的核酸に結合する配列は、第１の核酸鎖４１の配列Ａと第２の核酸鎖４２の配列Ｃである。第２の核酸鎖４２に含まれる配列Ｄは、検出用配列４３であり、この検出用配列４３の存在が、標的核酸４４ａが存在し、且つ適切な伸長反応が生じたことを検出するための指標となる。
【０１０５】
図１４に示す方法において使用されるリバースプライマー４５（図中、Ｒプライマーとも記す）は、第１の核酸鎖４６と第２の核酸鎖４７からなる。第１の核酸鎖４６は、５’側から配列Ｆと配列Ｅを含み、５’末端にはビオチンが付与されている。第２の核酸鎖４７は、５’側から配列Ｇと配列Ｆ’を含む。第１の核酸鎖４６と第２の核酸鎖４７は、互いに相補的な配列Ｆと配列Ｆ’で連結されてる。また、標的核酸４４ｂに結合する配列は、第１の核酸鎖４６の配列Ｅと第２の核酸鎖４７の配列Ｇである。第２の核酸鎖に含まれるビオチンは、伸長された核酸を回収するために使用される。
【０１０６】
上述のフォワードプライマー４０とリバースプライマー４５と標的核酸４４とを、ポリメラーゼを用い、適切な伸長反応が得られる条件下、例えば、適切なＰＣＲ反応が得られる条件下で反応を行う。反応後、アビジンに対してビオチンを特異的に結合させることによって反応産物を回収する。更に、反応産物として得られた二本鎖核酸を一本鎖に解離する。
【０１０７】
得られた一本鎖を、検出用配列４３に相補的な配列を有する検出用プローブ４８を固定化したプローブ固定化基体５０上で反応を行う。その後、使用したプローブ固定化基体の種類に応じて、プローブ固定化基体５０上で生じたハイブリダイゼーションの存在を検出する。これにより、標的核酸を鋳型として、当該フォワードプライマー４０とリバースプライマー４５を用いて伸長された二本鎖核酸のうちの一本鎖が検出される。従って、試料中の標的核酸の存在を検出できる。
【０１０８】
図１４では、例として金電極４９を具備したプローブ固定化基体５０を用いて、電気化学的に検出を行う場合の略図を示した。しかしながら、これに限定されるものではなく、上述した態様において示した種々のプローブ固定化基体の何れを使用してもよい。
【０１０９】
ここで、配列Ａおよび配列Ｃの長さは、特に限定されるものではないが、５〜５０塩基の範囲でよく、好ましくは５〜１４塩基、更に好ましくは５〜９塩基である。
【０１１０】
配列Ｂおよび配列Ｂ’は、互いに相補的な配列である。配列Ｂと配列Ｂ’は、特に限定されるものではないが、長さは３〜５０塩基の範囲でよく、好ましくは５〜１４塩基、更に好ましくは５〜９塩基である。また、配列Ｂおよび配列Ｂ’は必ずしも同じ長さである必要はない。
【０１１１】
配列Ｄは、フォワードプライマーおよびリバースプライマー、並びに標的核酸とは、互いにハイブリダイズし難い配列とすることが望ましい。また、配列Ｄの長さは、特に限定されるものではないが、５〜１００塩基の範囲でよく、好ましくは１０〜５０塩基、更に好ましくは１５〜３０塩基である。配列Ｄの塩基配列は特に限定されるのものではないが、正規直行配列のようなミスハイブリの起こり難い配列であることが望ましい。また、上述の方法では、検出用配列である配列Ｄは、フォワードプライマーの第２の核酸鎖の５’端に配置した例を記載したが、それに限定するものではない。本発明の態様に従うと、検出用配列は第１の核酸鎖に配置してもよい。また、検出用配列は、目的とする当該伸長反応を妨げない限り、第１および第２の核酸鎖の３’または５’端の何れの位置に配置されてもよい。
【０１１２】
また、配列Ｅおよび配列Ｇの長さは、特に限定されるものではないが、５〜５０塩基の範囲でよく、好ましくは５〜１４塩基、更に好ましくは５〜９塩基である。
【０１１３】
配列Ｆおよび配列Ｆ’は、互いに相補的な配列である。配列Ｆと配列Ｆ’は、特に限定されるものではないが、長さは３〜５０塩基の範囲でよく、好ましくは５〜１４塩基、更に好ましくは５〜９塩基である。また、配列Ｆおよび配列Ｆ’は必ずしも同じ長さである必要はない。
【０１１４】
上述の方法では、ビオチンをリバースプライマーに付与し、アビジンで回収した例を示したが、当該方法は、ビオチンとアビジンの組み合わせに限定するものではなく、ビオチンとストレプトアビジンを組み合わせて使用しても、或いは互いに特異的に結合する２つの結合子からなる結合対を使用してもよい。また、当該結合子が付与されるリバースプライマーにおける位置は、第１の核酸鎖であっても第２の核酸鎖であってもよく、また、当該伸長反応を妨げない限り、３’若しくは５’末端またはその他の位置のどの位置に付与されてもよい。また、一本鎖の増幅産物を回収する方法はビオチンを付与した核酸プライマーとアビジン化磁気ビーズを使用した方法に限定されるものでは無く、例えばＳ-オリゴプライマーとＴ７ヌクレアーゼを用いる方法や、リン酸化プライマーとλ−ヌクレアーゼを用いる方法などが利用可能である。
【０１１５】
また、核酸の伸長反応は、上述の第１の例に記載するのと同様に変更することが可能である。
【０１１６】
本例において使用するフォワードプライマーとリバースプライマーは、第１の例と同様に変更してもよい。また、本例ではフォワードプライマーに検出用配列を付与し、リバースプライマーに結合対を構成する一方の結合子を付与したが、リバースプライマーに検出用配列を付与し、フォワードプライマーに結合子を付与してもよい。
【０１１７】
また、複数の標的核酸について１つの反応系で伸長反応を行い、１つのプローブ固相化基体上の検出用プローブを用いて検出を行うことも可能である。その場合、標的核酸の種類毎に、少なくともフォワードプライマーの配列Ｄの塩基配列と、配列Ａおよび／または配列Ｃの塩基配列とを変更すれば、標的核酸の種類毎に検出用配列が与えられる。従って、これらの複数種類の検出用配列を検出すればよい。その場合、使用される複数種類の検出用配列に対して、相補的な複数種類の検出用プローブをプローブ固定化基体に固定化しておけば、一度に複数種類の検出用配列を検出することが可能である。ここで、フォワードプライマーに加えて、リバースプライマーの配列や、そこに付与されるビオチンなどの結合子の種類を、標的核酸の種類毎に変更してもよい。また、一本鎖の増幅産物を回収する方法はビオチンを付与した核酸プライマーとアビジン化磁気ビーズを使用した方法に限定されるものでは無く、例えばＳ-オリゴプライマーとＴ７ヌクレアーゼを用いる方法や、リン酸化プライマーとλ−ヌクレアーゼを用いる方法などが利用可能である。
【０１１８】
本態様に従うと、当該検出は、リバースプライマー側のビオチンで回収する工程と、フォワードプライマー側の検出用配列で検出する工程の２つの工程を具備しているので、伸長反応が生じないことに由来するノイズを低く抑えることができ、且つ得られた検出が偽陽性の結果となることを防止できる。また、標的核酸の情報を検出用配列に置き換えて検出しているので、ミスハイブリが起こり難く、検出用プローブとの反応を安定して行うことも可能である。
【０１１９】
それに加えて、従来よりも短い核酸鎖を組み合わせてプライマーとして使用していることにより、標的核酸に効率よく結合し、高感度に伸長反応を達成することが可能である。また、非特異的結合を減少することが可能であるので、伸長反応に由来するノイズを減少することが可能である。
【０１２０】
また、プローブの設計の自由度が向上され、且つ特異的、効率的および／または高感度に標的核酸を伸長することが可能である。
【０１２１】
６．アッセイキット
本発明はまた、上述したような何れかの態様に従うプローブまたはプローブ固定化基体およびプライマー、並びにプライマーを構成する核酸鎖を、使用目的に応じて適切なアッセイキットとして提供することも可能である。
【０１２２】
例えば、第１のプローブと第２のプローブ、または所望の種類のプローブを組み合わせてアッセイキットとして提供してもよく、それらに基体を組み合わせてアッセイキットとして提供してもよい。また、第１のプローブを固定化したプローブ固定化基体と、第２のプローブ、または所望の種類のプローブを組み合わせてアッセイキットとして提供してもよい。更に、緩衝液用塩類および／またはその他の必要な試薬および／または標識物質などを組み合わせてアッセイキットとして提供されてもよい。
【０１２３】
また例えば、本発明に従うプライマーおよび／または核酸鎖の場合は、反応容器および／または緩衝液用塩類および／またはその他の必要な試薬、例えば、ポリメラーゼおよび／または基質および／またはプローブ固定化基体などと組み合わせてキットとして提供されてもよい。
【０１２４】
【実施例】
以下、図面を参照しながら本発明の実施例を説明する。
【０１２５】
実施例１
図１Ａは、本発明の第１の実施形態に係る核酸鎖検出方法の概略構成を示す図である。当該第１のプローブ１として、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の型判定を行うためのプローブを具備するプローブ固定化基体を用いて、標的核酸の検出を行う例を以下に説明する。
【０１２６】
第１のプローブ１は配列番号３の核酸配列からなる１０ｍｅｒのＨＣＶゲノム配列を含み、且つ３’末端にアミノ基を導入した合成オリゴヌクレオチドプローブである。このプローブをカルボジイミド処理したガラス基板２と反応させ、基板２上に固定化した（図１Ａ）。次に、配列番号１のＨＣＶのゲノム配列を含み且つＣｙ５標識した標的核酸と、２ｘＳＳＣ緩衝液中で４５℃でハイブリダイゼーションを行なった。このハイブリダイゼーション反応を行なう際に、１０ｍｅｒのＨＣＶゲノム配列を含む配列番号４の合成核酸も同時に存在させた。
【０１２７】
他方、コントロールとして、アミノ基を導入した配列番号５のＨＣＶ特異的配列の２０ｍｅｒのプローブをガラス基板上に固定化し、配列番号１の標的核酸とハイブリダイゼーション反応を行なった。
【０１２８】
その結果、配列番号３のプローブを固定化した基板により、配列番号４の核酸を共存させた状態で特異的な信号を検出することができた。これは、２０ｍｅｒの配列からなる配列番号５のプローブを用いた場合とほぼ同等の信号であった（図７）。ここで、図７のグラフＡは配列番号３を固定化した電極のみの場合、グラフＢは配列番号３を固定化した電極と配列番号１の核酸を反応させた場合、Ｃは配列番号３を固定化した電極と配列番号４、配列番号１の核酸を反応させた場合、Ｄは配列番号５を固定化した電極と配列番号１を反応させた場合である。
【０１２９】
以上の結果から、本発明の方法により、プローブの設計の自由度が向上され、且つ特異的に標的核酸を検出することが可能であることが示された。
【０１３０】
実施例２
図８は、本発明の第２の実施形態に係る核酸鎖検出方法の概略構成を示す図である。当該検出方法を利用して、ｒａｓ遺伝子の変異を検出するためのプローブ固定化基体を製造し、ｒａｓ遺伝子の変異を検出した。
【０１３１】
ガラス基板３０上には金の電極３１がパターニングしてあり、プローブ固定化部位が６箇所、対極３３、参照極３４がそれぞれ一箇所づつの構造になっている。まず、ｒａｓ Ｍｕｔａｎｔ ｓｅｔ（宝酒造製）を用いてｃ−Ｈａ−ｒａｓ−ｃｏｄｏｎ １２の正常なＰＣＲ産物（変異部位がＧｌｙである）を作製した。ＰＣＲプライマーは５’末端をリン酸化した配列番号６と配列番号７を用いた。反応後、ＰＣＲ反応液中にλ−ヌクレアーゼを添加して３７℃で１５分反応させた。これにより、リン酸化されているプライマー側の鎖を分解して一本鎖産物を作製した。配列番号８（変異部位がＧｌｙ）、配列番号１０（変異部位がＡｒｇ）、配列番号１１（変異部位がＳｅｒ）、配列番号１２（変異部位がＣｙｓ）を含むプローブに、予め３’末端にチオール基を導入しておき、金電極上に固定化した。ポジティブコントロールとして配列番号７の相補鎖の配列を、またネガティブコントロールとして配列番号２のｒＤＮＡの配列を固定化した。更に、比較のためにそれぞれ２０ｍｅｒの合成プローブ、配列番号１３（変異部位がＧｌｙ）、配列番号１４（変異部位がＡｒｇ）、配列番号１５（変異部位がＳｅｒ）、配列番号１６（変異部位がＣｙｓ）も金電極上に固定化した。
【０１３２】
一本鎖ＰＣＲ産物に配列番号９の核酸鎖を添加した後、２ｘＳＳＣ緩衝液中で９５℃で５分の熱変性を行った。その後、１０分間３５℃でアニーリングを行なった。このサンプルを、プローブ固定化電極に滴下し、３５℃で３０分ハイブリダイゼーション反応を行なった。反応後、０．２ｘＳＳＣで１５分間洗浄を行い、最後に、ヘキスト３３２５８の電流応答を測定した。その結果、特異的な電流信号は配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２を固定化した本発明の態様に従う電極の方（図９）が、比較例であるコントロール(図１０)よりも高い値が得られた。
【０１３３】
以上の結果から、本発明の方法により、プローブの設計の自由度が向上され、且つ特異的、効率的および／または高感度に標的核酸を検出することが可能であることが示された。
【０１３４】
実施例３
図４は、本発明の第３の態様に係る核酸検出方法の概略構成を示す図である。
当該検出方法を利用して、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の型判定を行った。第１のプローブ１として、配列番号１７の核酸配列からなる６ｍｅｒのＨＣＶゲノム配列を含み、且つ３‘末端にアミノ基を導入した合成オリゴヌクレオチドプローブを用いた。この第１のプローブ１をカルボジイミド処理したガラス基板２と反応させ、基板上に固定化した。配列番号１のＨＣＶのゲノム配列を含み、且つＣｙ５で標識された標的核酸と２ｘＳＳＣ緩衝液中で、４５℃でハイブリダイゼーションを行なった。このハイブリダイゼーション反応を行なう際に、１９ｍｅｒのＨＣＶゲノム配列を含む配列番号１８の合成核酸と、１３ｍｅｒの配列番号１９の合成核酸とを同時に存在させた。
【０１３５】
他方、コントロールとして、アミノ基を導入した配列番号５のＨＣＶ特異的配列の２０ｍｅｒをプローブとしてガラス基板上に固定化して、配列番号１のターゲットとハイブリダイゼーション反応を行なった。
【０１３６】
その結果、配列番号３のプローブを固定化した基板でも、配列番号４の核酸が共存することで特異的な信号が検出でき、２０ｍｅｒの配列からなる配列番号５のプローブを用いた場合よりも高い信号強度が得られた（図１１）。
【０１３７】
図１１では、本発明の態様を用いて行った結果を「連結プローブ」のグラフとして示し、従来の方法を用いて行った比較例を「コントロール」のグラフとして示した。
【０１３８】
以上の結果から、本発明の方法により、プローブの設計の自由度が向上され、且つ特異的、効率的および／または高感度に標的核酸を検出することが可能であることが示された。
【０１３９】
実施例４
図６は、本発明の第４の態様に係る標的核酸を伸長する方法の概要を示す模式図である。当該フォワードプライマーとして、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸の増幅を行なうためのＰＣＲプライマーを使用した例を以下に説明する。
【０１４０】
配列番号２０と２１をフォワードのプラーマーとしてまた配列番号２３をリバースのプライマーとして用い、鋳型に配列番号２２の合成オリゴを使用してＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ条件は図１３に示した。
【０１４１】
コントロールとして配列番号２４をフォワードプライマーとして使用して増幅を行った。その結果、コントロールと比較して高い温度まで増幅断片が確認できた（図１２）。以上の結果から、本発明で使用したプライマーを用いると、高い特異性で核酸断片の増幅が可能であることが示された。
【０１４２】
実施例５
図１４は、本発明の第４の態様に係る標的核酸を伸長する方法を用い、且つプローブ固定化基板を使って標的核酸の検出を行う方法の模式図である。２種の連結プライマーのうちの下流側の５’端に検出用の配列を導入することで、ＰＣＲ産物を簡便に検出することが可能となる。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸の増幅を行ない、増幅産物を基板検出した例を以下に説明する。
【０１４３】
配列番号２０と配列番号２５をフォワードの連結プライマーとして、また５’ビオチン標識した配列番号３５と配列番号３４をリバースの連結プライマーとして用い、鋳型に配列番号２２の合成オリゴを使用してＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ条件は図１３に示すもので、アニール温度は４８℃とした。
【０１４４】
ここで、図１４に示すフォワードプライマー４０がフォワードの連結プライマーであり、第１の核酸鎖が配列番号２０で示される核酸であり、第２の核酸鎖が配列番号２５で示される核酸である。また、配列Ａは、配列番号２０の５’末端から９塩基までの核酸であり、配列Ｂは、配列番号２０の残りの９塩基である。第２の核酸鎖は、配列番号２５で示される核酸であり、検出用配列Ｄが、配列番号２５の５’末端から２０塩基までであり、配列Ｂ’はその次の９塩基であり、配列Ｃは、３’末側の９塩基である。
【０１４５】
また、図１４に示すリバースプライマー４７が、リバースの連結プライマーであり、第１の核酸鎖が配列番号３５で示される核酸であり、第２の核酸鎖が配列番号３４で示される核酸である。また、配列Ｅは、配列番号３５の５’末端から９塩基までの核酸であり、配列Ｆは次の９塩基である。配列Ｆ’は、配列番号３４の５’末端から９塩基までの核酸であり、配列Ｇは３’側の９塩基である。また、リバースプライマー４７の第２の核酸鎖である配列番号３５で示される核酸の５’末端には、ビオチンが付与されている。
【０１４６】
図１４に示すように、コントロールとしては、連結プライマーではない、分割しない通常のプライマーの５’端に２０ｍｅｒの検出用配列５１を結合したコントロールプライマー５２（配列番号２６）をフォワードプライマーとして用いて増幅を行った。また、鋳型ＤＮＡを添加しないサンプルも用意し配列番号２０と配列番号２５をフォワードの連結プライマーとして、同様に操作した。
【０１４７】
次いで、ＰＣＲ産物にアビジン被覆磁気微粒子を添加して、ビオチン導入されたＰＣＲ産物をビーズ上にトラップした。上清を除去しビーズを洗浄した後、０．１ＮのＮａＯＨを添加してアルカリ変性で一本鎖ＤＮＡを遊離させた後、ＨＣｌで中和しターゲットサンプルとした。
【０１４８】
さらに、配列番号２７（検出用配列２０ｍｅｒの相補配列）の３’端をチオール修飾したプローブＤＮＡを金電極上に固定化した基板にターゲットサンプルをハイブリダイズさせた。すなわち、サンプルを２×ＳＳＣ緩衝液で希釈し、９５℃で５分間熱変性を行った後、基板上に滴下し、３５℃で３０分ハイブリダイゼーションを行った。反応後、０．２×ＳＳＣ緩衝液で１５分間洗浄し、最後にヘキスト３３２５８を作用させて、その電流応答を測定した。
【０１４９】
その結果、コントロールと同等以上の信号が得られた。また、鋳型のないサンプルでは電流値増加が認められなかった（図１５）。
【０１５０】
配列番号２５のプライマーには検出用配列が存在するため、ＰＣＲ産物をそのまま基板測定すると、この部分が反応して信号が出てしまうことが予想されるが、ビオチン−アビジン精製によりＰＣＲ産物のみを得ているので、鋳型なしのサンプルでは信号なしとなったと考えられる。以上の結果から、本発明の態様に従うプライマーを用いると、高い特異性で核酸断片の増幅が可能であることが示された。また、プライマーに検出用配列を具備することにより、基板での簡便な検出が可能となることが示された。
【０１５１】
実施例６
本発明の第４の態様に係る標的核酸を伸長する方法を用い、且つプローブ固定化基板を使って標的核酸の検出を行う方法でモデルＨＣＶの型判定を行った例を以下に示す。
【０１５２】
表１に示す通り、配列番号２０、配列番号２５は１ｂ型を、配列番号２８、配列番号２９は２ａ型を、配列番号３１、配列番号３２は２ｂ型を特異的に認識するフォワード連結プライマーである。
【０１５３】
【表１】
さらに配列番号２２は１ｂ型の、配列番号３０は２ａ型の、配列番号３３は２ｂ型のそれぞれＨＣＶモデル合成ＤＮＡである。５’ビオチン標識した配列番号３５、配列番号３４をリバースの連結プライマーとして用いて、上記フォワード連結プライマーおよび鋳型の各組み合わせで実施例５と同様にＰＣＲを行い、ビオチン−アビジン法で一本鎖ターゲットＰＣＲ産物を得た。検出用配列の相補鎖プローブ（配列番号２７）を固定化した金電極にハイブリダイズさせ、ヘキスト３３２５８の電流応答を測定したところ、表２の通り、型の合致した組み合わせでのみ、信号が得られた。
【０１５５】
【表２】
以上の結果から、本発明で使用したプライマーを用いると、高い特異性で核酸断片の増幅が可能であること、および、プライマーに検出用配列を具備することにより、簡便なＨＣＶ型判定が可能となることが示された。
【０１５７】
【発明の効果】
本発明に基づく方法を用いると、プローブあるいはプライマー設計の自由度が向上され、且つ特異的、効率的および／または高感度に標的核酸を検出すること、または標的核酸を伸長することが可能になる。
【０１５８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 第１の態様に係る標的核酸を検出する方法の概要と従来の方法とを比較して示す模式図。
【図２】 本発明の態様に従い使用され得るプローブ固定化基体の例を示す図。
【図３】 本発明の態様に従い使用され得るプローブ固定化基体の例を示す図。
【図４】 第２の態様に係る標的核酸を検出する方法において得られる標的核酸と第１のプローブ、第２のプローブおよび第３のプローブとの結合の様子を示す模式図。
【図５】 第３の態様に係る標的核酸を検出する方法において得られる標的核酸と第１のプローブおよび第２のプローブとの結合の様子を示す模式図。
【図６】 第４の態様に係る標的核酸を伸長する方法の概要を示す模式図。
【図７】 実施例１で得られた結果を示すグラフ。
【図８】 実施例２で用いたプローブ固定化基体を示す図。
【図９】 本発明の態様を用いて実施例２で得られた結果を示すグラフ。
【図１０】 コントロールについて実施例２で得られた結果を示すグラフ。
【図１１】 実施例３で得られた結果を示すグラフ。
【図１２】 実施例４で得られた増幅産物を示す電気泳動の写真。
【図１３】 実施例４で行ったＰＣＲの条件を示す図。
【図１４】 第４の態様に係る標的核酸を伸長した後に、検出を行う方法の概要を示す模式図。
【図１５】 実施例５で行った検出の結果を示すグラフ。
【符号の説明】
１．第１のプローブ ２、１６、２２、３０．基体 ３、６、４４．標的核酸 ４．第２のプローブ ５．従来のプローブ ７、２７．第２のプローブ ８．第３のプローブ １１、１２、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１．プローブ １５．固定化領域 ２３、３１．電極 ２４、３２．パット ２８、４１、４６．第１の核酸鎖 ２９、４２、４７．第２の核酸鎖 ３３．対極 ３４．参照極 ４０．フォワードプライマー ４３、５１．検出用配列 ４５．リバースプライマー ４８．検出用プローブ ４９．金電極 ５０．プローブ固定化基体 ５２．コントロールプライマー
Claims (11)
- 第１の標的配列Ａ’と第２の標的配列Ｃ’とを含み、Ａ’−Ｃ’（５’→３’）で表される配列（ただし、前記標的核酸の第１の標的配列Ａ’と第２の標的配列Ｃ’とが隣接する）を含む標的核酸の検出方法であって、
（１）試料と、
標的配列Ａ’に相補的な配列Ａ、配列Ｂ、スペーサＳおよび官能基Ｘを含み、Ｘ−Ｓ−Ｂ−Ａ（５’→３’）で表される第１のプローブと、
配列Ｂに相補的な配列Ｂ’および標的配列Ｃ’に相補的な配列Ｃを含み、Ｃ−Ｂ’（５’→３’）で表される第２のプローブと、
を適切なハイブリダイゼーションが得られる条件下で反応させること、および
（２）前記（１）の反応させることにより生じたハイブリダイゼーションを検出することにより、標的核酸の存在を判定すること、
を具備することを特徴とする標的核酸の検出方法。 - 第１の標的配列Ａ’と第２の標的配列Ｃ’とを含み、Ｃ’−Ａ’（５’→３’）で表される配列（ただし、前記標的核酸の第１の標的配列Ａ’と第２の標的配列Ｃ’とが隣接する）を含む標的核酸の検出方法であって、
（１）試料と、
標的配列Ａ’に相補的な配列Ａ、配列Ｂ、スペーサＳおよび官能基Ｘを含み、Ａ−Ｂ−Ｓ−Ｘ（５’→３’）で表される第１のプローブと、
配列Ｂに相補的な配列Ｂ’および標的配列Ｃ’に相補的な配列Ｃを含み、Ｂ−Ｃ’（５’→３’）で表される第２のプローブと、
を適切なハイブリダイゼーションが得られる条件下で反応させること、および
（２）前記（１）の反応させることにより生じたハイブリダイゼーションを検出することにより、標的核酸の存在を判定すること、
を具備することを特徴とする標的核酸の検出方法。 - 第１の標的配列Ａ’と第２の標的配列Ｃ’とを含み、Ａ’−Ｃ’（５’→３’）で表される配列（ただし、前記標的核酸の第１の標的配列Ａ’と第２の標的配列Ｃ’とが隣接する）を含む標的核酸の伸長方法であって、
（１）配列Ｂと、標的配列Ａ’に相補的な配列Ａを含み、Ｂ−Ａ（５’→３’）で表される第１の核酸鎖と、配列Ｂに相補的な配列Ｂ’と標的配列Ｃ’に相補的な配列Ｃを含みＣ−Ｂ’（５’→３’）で表される第２の核酸鎖とを含み、前記配列Ｂと配列Ｂ’がハイブリダイズすることによって連結してなるプライマーを、標的核酸と共に存在させること、および
（２）前記（１）に記載のプライマーと標的核酸とを適切な伸長反応が得られる条件下で反応させること、
を具備する標的核酸の伸長方法。 - 第１の標的配列Ａ’と第２の標的配列Ｃ’とを含み、Ａ’−Ｃ’（５’→３’）で表される配列を含む標的核酸の検出方法であって、
請求項３に記載の標的核酸の伸長を行うこと、得られた伸長産物の存在を確認することにより標的核酸を検出することを具備する方法。 - 第１の標的配列Ａ’と第２の標的配列Ｃ’とを含み、Ａ’−Ｃ’（５’→３’）で表される配列（ただし、前記標的核酸の第１の標的配列Ａ’と第２の標的配列Ｃ’とが隣接する）を含む標的核酸を検出する方法であって、
（１）検出用配列Ｄと配列Ｂおよび標的配列Ａ’に相補的な配列Ａを含み、Ｄ−Ｂ−Ａ（５’→３’）で表される第１の核酸鎖と、配列Ｂに相補的な配列Ｂ’および標的配列Ｃ’に相補的な配列Ｃを含みＣ−Ｂ’（５’→３’）で表される第２の核酸鎖とを含み、前記配列Ｂと配列Ｂ’がハイブリダイズすることによって連結してなる第１のプライマーを、第２のプライマーと共に、前記標的核酸に対して、適切な伸長反応が得られる条件下で反応させることと、
（２） 前記（１）で生じた反応産物を、検出用配列Ｄに相補的な配列を有するプローブを具備するプローブ固定化基体に対して適切なハイブリダイゼーションが得られる条件下で反応させることと、
（３）前記（２）の反応させることにより生じたハイブリダイゼーションを検出することにより、標的核酸の存在を判定することと、
を具備する標的核酸を検出する方法。 - 第１の標的配列Ａ’、第２の標的配列Ｃ’および第３の標的配列Ｅ’を含み、Ａ’−Ｃ’−Ｅ’（５’→３’）で表される配列（ただし、前記標的核酸の第１の標的配列Ａ’と第２の標的配列Ｃ’とが隣接すること、および第２の標的配列Ｃ’と第３の標的配列Ｅ’とが隣接すること。）を含む標的核酸の検出方法であって、
（１）試料と、
標的配列Ａ’に相補的な配列Ａ、配列Ｂ、スペーサＳおよび官能基Ｘを含み、Ｘ−Ｓ−Ｂ−Ａ（５’→３’）で表される第１のプローブと、
配列Ｂに相補的な配列Ｂ’、標的配列Ｃ’に相補的な配列Ｃおよび配列Ｄを含み、Ｄ−Ｃ−Ｂ’（５’→３’）で表される第２のプローブと、
配列Ｄに相補的な配列Ｄ’、標的配列Ｅ’に相補的な配列Ｅを含み、Ｅ−Ｄ’（５’→３’）で表される第３のプローブと、
を適切なハイブリダイゼーションが得られる条件下で反応させること、および
（２）前記（１）の反応させることにより生じたハイブリダイゼーションを検出することにより、標的核酸の存在を判定すること、
を具備することを特徴とする標的核酸の検出方法。 - 請求項１、２、４、５および６の何れか１項に記載の方法であって、前記第１のプローブが前記官能基Ｘを介して基体に固定されていることを特徴とする標的核酸の検出方法。
- 請求項１に記載の検出方法を行うためのアッセイキットであって、
標的配列Ａ’に相補的な配列Ａ、配列Ｂ、スペーサＳおよび官能基Ｘを含み、Ｘ−Ｓ−Ｂ−Ａ（５’→３’）で表される第１のプローブと、
配列Ｂに相補的な配列Ｂ’および標的配列Ｃ’に相補的な配列Ｃを含み、Ｃ−Ｂ’（５’→３’）で表される第２のプローブと
を具備することを特徴とするアッセイキット。 - 請求項２に記載の検出方法を行うためのアッセイキットであって、
標的配列Ａ’に相補的な配列Ａ、配列Ｂ、スペーサＳおよび官能基Ｘを含み、Ａ−Ｂ−Ｓ−Ｘ（５’→３’）で表される第１のプローブと
配列Ｂに相補的な配列Ｂ’および標的配列Ｃ’に相補的な配列Ｃを含み、Ｂ−Ｃ’（５’→３’）で表される第２のプローブと、
を具備することを特徴とするアッセイキット。 - 請求項３に記載の伸長方法を行うためのアッセイキットであって、
配列Ｂと、標的配列Ａ’に相補的な配列Ａを含み、Ｂ−Ａ（５’→３’）で表される第１の核酸鎖と、
配列Ｂに相補的な配列Ｂ’と標的配列Ｃ’に相補的な配列Ｃを含みＣ−Ｂ’（５’→３’）で表される第２の核酸鎖と、
を具備するアッセイキット。 - 請求項６に記載の検出方法を行うためのアッセイキットであって、
標的配列Ａ’に相補的な配列Ａ、配列Ｂ、スペーサＳおよび官能基Ｘを含み、Ｘ−Ｓ−Ｂ−Ａ（５’→３’）で表される第１のプローブと、
配列Ｂに相補的な配列Ｂ’、標的配列Ｃ’に相補的な配列Ｃおよび配列Ｄを含み、Ｄ−Ｃ−Ｂ’（５’→３’）で表される第２のプローブと、
配列Ｄに相補的な配列Ｄ’、標的配列Ｅ’に相補的な配列Ｅを含み、Ｅ−Ｄ’（５’→３’）で表される第３のプローブと、
を具備することを特徴とするアッセイキット。
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