WO2006129770A1 - 核酸の検出方法 - Google Patents

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WO2006129770A1
WO2006129770A1 PCT/JP2006/311025 JP2006311025W WO2006129770A1 WO 2006129770 A1 WO2006129770 A1 WO 2006129770A1 JP 2006311025 W JP2006311025 W JP 2006311025W WO 2006129770 A1 WO2006129770 A1 WO 2006129770A1
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nucleic acid
ligand
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ligands
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Seiji Kondo
Kento Hashido
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Olympus Corporation
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/131—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties the label being a member of a cognate binding pair, i.e. extends to antibodies, haptens, avidin

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a nucleic acid. More specifically, the present invention relates to a method for detecting a nucleic acid by specific binding between a ligand and a receptor. More specifically, the present invention relates to a method for detecting a nucleic acid using an aggregating reaction of dispersible particles.
  • SNP analysis is based on microarray technology.
  • AmpliChip P450 sold by Roche Diagnostic is a typical SNP measurement device, and is approved by the FDA as an SNP diagnostic kit!
  • detection of nucleic acids by a microarray is performed by hybridization between nucleic acids.
  • reaction conditions between nucleic acids and hybridization must be at a high temperature of 45 ° C or higher, and the reaction conditions vary depending on the GC content in the base sequence of the nucleic acid to be reacted and the length of the nucleic acid. It is difficult to always set optimal reaction conditions.
  • detection of nucleic acids by a microarray is performed by hybridizing sample nucleic acids in a liquid solution to labeled nucleic acids on a solid substrate. Reaction conditions at the interface between liquid and solid are difficult to set because the chemical states of each other are very different. This results in problems of low response and false response.
  • the method for detecting a nucleic acid includes (1) a step of binding the first and second ligands to a nucleic acid to be detected; and (2) a nucleic acid to which the ligand is bound, Binding a first ligand to a solid phase carrier carrying a receptor that specifically binds to the ligand to obtain a nucleic acid solid phase carrier complex; (3) in the complex, A step of binding a second ligand to a receptor modified with a labeling substance that specifically binds to the ligand; and (4) a step of detecting the nucleic acid by detecting the labeling substance.
  • the method for detecting a nucleic acid includes (1) a target nucleic acid bound with different types of first and second ligands, and a receptor that specifically binds to the first ligand. Reacting a plurality of first microparticles to which a plurality of receptors specifically bound to the second ligand are bound, and (2) the two target nucleic acids are By binding to the first and second microparticles, the first and second microparticles are linked, and a plurality of target nucleic acids bind to one microparticle, and each of the target nucleic acids binds to another microparticle. And a step of measuring spectrophotometric agglomeration caused by a large number of fine particles connected to each other.
  • the nucleic acid detection method of the present invention can detect a nucleic acid with high sensitivity and high accuracy.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a step of binding a ligand to a nucleic acid.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a step of binding a ligand to a nucleic acid under a competitive reaction condition.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing a step of binding different ligands to plural kinds of nucleic acids.
  • FIG. 4 is a list of detection methods for nucleic acids modified with a ligand.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing a detection process of a nucleic acid modified with a ligand.
  • FIG. 6 is an amino acid sequence of the ligand of the present invention.
  • FIG. 7 is a nucleotide sequence of the primer of the present invention.
  • FIG. 8 is a base sequence of a nucleic acid to be detected.
  • FIG. 9 is a nucleotide sequence of the nucleic acid probe of the present invention.
  • FIG. 10 shows the nucleotide sequences of the primers of the examples.
  • FIG. 11 shows the nucleotide sequence of the nucleic acid probe of the example.
  • FIG. 12 is a bar graph showing the results of the examples.
  • FIG. 13 is a bar graph showing the results of a modification.
  • FIG. 14 is a conceptual diagram of a target nucleic acid to which a ligand is bound.
  • FIG. 15 is a conceptual diagram of dispersible fine particles to which a receptor is bound.
  • FIG. 16 is a conceptual diagram showing aggregation of fine particles.
  • FIG. 17 is a conceptual diagram when measuring by spectrophotometry.
  • FIG. 18 is a conceptual diagram showing the principle of detecting nucleic acid mutations using the PCR-SSP method.
  • FIG. 19 is a conceptual diagram showing the principle of detecting nucleic acid mutation using ligation.
  • the nucleic acid to be detected means a specific nucleic acid molecule present in a sample.
  • Nucleic acids to be detected include all types of DNA and RNA such as cDNA, genomic DNA, synthetic DNA, mRNA, total RNA, hnRNA, and synthetic RNA.
  • a specific nucleic acid molecule present in a biological sample is detected.
  • the first ligand means a substance that specifically binds to a receptor carried on a solid phase carrier.
  • the second ligand means a substance that specifically binds to a receptor modified with a labeling substance.
  • Ligand substances include hapten, piotin, dioxigen, fluorescein, alexa, sugar chain, peptide, protein, polyhistidine, antigen Z antibody substance, HA, GST, Tap, Flag, etc. Contains substances. Piotin, dioxigen, fluorescein, alexa, etc. are readily available at low prices. Glycans and peptides can be easily selected from multiple types of haptens with a high degree of freedom in the design of chemical structures, and can be selected as needed.
  • the hapten is preferably a hydrophilic organic compound
  • the sugar chain is preferably composed of two or more monosaccharides
  • the preferred peptide is preferably a peptide having an amino acid residue strength of more than one.
  • An antigen Z antibody substance may be used to detect a nucleic acid using an immune reaction. Specific binding between the ligand and the receptor can be achieved by an antigen-antibody reaction.
  • the labeling substance includes any labeling substance known to those skilled in the art.
  • an optical marker capable of generating an optical signal such as fluorescence and luminescence (chemiluminescence, bioluminescence) is preferable.
  • the method for binding the first and second ligands to the nucleic acid to be detected includes modification with a ligand.
  • Methods such as polymerase chain reaction (PCR) using decorated primers ( Figure 1 (0), ligation reactions on nucleic acids to be detected using ligand-modified nucleic acid probes ( Figure 1G0), etc.)
  • PCR polymerase chain reaction
  • Figure 1 (0) ligation reactions on nucleic acids to be detected using ligand-modified nucleic acid probes
  • Figure 1G0 ligand-modified nucleic acid probes
  • the number of nucleic acids to be detected can be modified with a ligand and the number of the nucleic acids can be amplified (Fig. 1 (0).
  • the portion of the nucleic acid to be subjected to the ligation reaction is preliminarily determined. It is preferable to amplify by PCR method
  • the binding of the nucleic acid probe to a similar sequence in another region of the nucleic acid can be prevented in advance, and a highly accurate ligation reaction can be performed.
  • the ligation reaction is performed on the amplified nucleic acid region, and then the nucleic acid modified with the ligand can be obtained by denaturation (FIG. I (iO)).
  • a ligand can be bound to a nucleic acid by a PCR-SSP method using a competitive reaction. That is, a primer similar to the primer modified with the first ligand is previously prepared. This primer has the ability to bind in the same Cf position as the primer modified with the first ligand on the nucleic acid to be detected.
  • a competitive reaction can be used to bind a ligand to a nucleic acid by a ligation reaction, a nucleus similar to a nucleic acid probe modified with the first ligand.
  • An acid probe is prepared in advance, and this nucleic acid probe can bind to the nucleic acid probe to be detected at the same position as that of the nucleic acid probe modified with the first ligand, but its binding end force matches. Therefore, the accuracy of the ligation reaction can be improved by carrying out the ligation reaction in a state including the nucleic acid probe having such a pseudo sequence.
  • the nucleic acid modified with the first and second ligands can be obtained by denaturing the primer or probe modified with the first ligand and the primer or probe having a pseudo sequence.
  • the third ligand is modified, and the nucleic acid modified with the first ligand and the second ligand is combined with the third ligand. It is also possible to obtain nucleic acids modified with Gand and the second ligand simultaneously in the same solution, in which case the nucleic acid modified with the first ligand and the third ligand.
  • By detecting each modified nucleic acid and measuring the ratio of the detected amount of the first and third ligands it is possible to achieve further accuracy without being affected by the concentration of the nucleic acid to be detected or the nonspecific reaction of the probe. High measurement is possible.
  • the first ligand and the second ligand may be the same or different.
  • the first ligand and the second ligand are not necessarily required to have a single molecular force, and each may be composed of two or more molecules.
  • nucleic acid containing a mutated part a nucleic acid containing a standard part. Focusing on two types), a method for detecting this polymorphism through specific binding between a ligand and a receptor will be described.
  • PCR-SSP method Polymerase Chain Reaction-Sequence Specific Primer method
  • PCR-SSP method Polymerase Chain Reaction-Sequence Specific Primer method
  • Fig. 3 (as shown in 0, three types of primers modified with the first and third ligands are prepared (hereinafter referred to as the first to third primers, respectively).
  • the first to third primers has a sequence corresponding to the base sequence including the mutated portion, and its extended end corresponds to the base of the mutated portion, while the second primer has a sequence corresponding to the base sequence including the standard portion.
  • the extension end corresponds to the base of the standard part, and the third primer has a base sequence that allows PCR to be performed in relation to the first and second primers.
  • Nucleotide polymorphism refers to a state in which the nucleotide sequence of a gene is different at one place and its site, that is, the nucleotide sequence before and after the polymorphism is the same in both standard and mutant nucleic acids.
  • the base sequence of the second primer is different only in the extension end force S1 base, and the other base sequences are the same. It is one.
  • the first and second primers compete with each other and bind to nucleic acid (competitive reaction).
  • the primer modified with the first ligand has an extension terminal force S mismatch on the standard nucleic acid, and therefore, an extension reaction with a polymerase is performed. I can't.
  • the primer modified with the second ligand is mismatched on the extension side of the mutant nucleic acid, and thus cannot be extended by polymerase.
  • nucleic acid is amplified by PCR to obtain a nucleic acid modified with a ligand (Fig. 3 (0).
  • the nucleic acid containing the mutated portion is converted into a nucleic acid modified with the first and third ligands, while The nucleic acid containing the standard part is associated with the nucleic acid modified with the second and third ligands, respectively, since this association is performed under competitive reaction conditions and is therefore very accurate.
  • nucleic acid and ligand can be linked by ligation reaction.
  • FIG. 3 (ii) three types of nucleic acid probes modified with the first or third ligand are prepared (hereinafter referred to as the first to third nucleic acid probes, respectively).
  • the first nucleic acid probe has a base sequence corresponding to the nucleic acid sequence containing the mutated portion, and the binding side end thereof corresponds to the base of the mutated portion.
  • the second nucleic acid probe has a base sequence corresponding to the nucleic acid sequence containing the standard part, and its binding end corresponds to the base of the standard part.
  • the third nucleic acid probe has a base sequence capable of performing a ligation reaction in relation to the first and second nucleic acid probes.
  • the base sequences before and after the single nucleotide polymorphism are the same for both the standard type and the mutant type, the base sequences of the first and second nucleic acid probes differ only in the binding side ends. The other sequences are the same. Therefore, the first and second nucleic acid probes compete with each other and bind to the nucleic acid (competitive reaction).
  • the first nucleic acid probe mismatches its binding end force on a standard nucleic acid and is subsequently modified with a third ligand. Ligation reaction cannot be performed with the nucleic acid probe formed. On the other hand, since the binding end of the second nucleic acid probe mismatches on the mutant nucleic acid, a ligation reaction cannot be performed with the third nucleic acid probe. Thereafter, the first nucleic acid probe and the third nucleic acid probe are ligated on the mutant nucleic acid, and the second nucleic acid probe and the third nucleic acid probe are ligated on the standard nucleic acid.
  • a nucleic acid modified with a ligand is obtained through a denaturation reaction (FIG. 3 (ii).
  • a nucleic acid containing a mutated portion contains a standard portion as a nucleic acid modified with a first and a third ligand.
  • Nucleic acids are associated as nucleic acids modified with second and third ligands, respectively.
  • the reaction step can be further simplified, and cost and time can be reduced.
  • it is inconvenient because the sensitivity is poor and the probe design cannot select the force of the SNP site.
  • the same sequence may exist at a position different from the SNP site to be detected. In this case, there is a disadvantage that the accuracy is deteriorated. Therefore, in order to improve sensitivity and accuracy, a PCR reaction is performed around the SNP site to be detected, and the problem can be solved by amplifying the nucleic acid containing the SNP to be detected.
  • the primer and nucleic acid probe are preferably 3 to 60 bases.
  • the number and type of ligands are not limited to this, and the first to third ligands may each be composed of two or more molecules.
  • the nucleic acid can be detected even in the absence of either the first or second ligand.
  • the reaction system can be simplified by reducing the number of ligands.
  • haptens a to c polypeptide
  • primers a to c modified with knopants a to c are prepared (FIG. 7).
  • an amplification reaction was performed on the sample shown in FIG. 8 by the PCR-SSP method.
  • the sample SNP site (# position in Fig. 8)
  • the aryl types are A / A homo, A / G hetero, and G / G homo. If the sample SNP site is homologous to A / A, primer a in Fig.
  • the amplification product 7 matches the SNP site, and amplification is performed by PCR together with primer c. Since amplification is not performed with primer b, the amplification product is double-stranded DNA with both nopten a and hapten c modified at both 5 'ends. In the same way, if the sample SNP site is G / G, the PCR product will be double-stranded DNA with modified nopten b and hapten c at both 5 'ends. Furthermore, when the sample SNP site is A / G, an amplification product is obtained in which double-stranded DNA modified with hapten a and hapten c and double-stranded DNA modified with hapten b and hapten c are mixed.
  • amplification may be performed using only the primer a and the primer c, for example, without preparing three types of primers.
  • a plurality of SNPs of the nucleic acid to be detected can be detected.
  • a primer modified with a different hapten for each SNP site may be prepared, and the nucleic acid to be detected may be amplified by the PCR-SSP method.
  • nucleic acid probes a to c modified with knopants a to c, respectively, are prepared (FIG. 9).
  • a ligation reaction is performed on the sample shown in Fig. 8.
  • probe a in Fig. 4 matches the SNP site, and ligation reaction is performed by ligase together with probe c.
  • Probe b does not perform a ligation reaction.
  • the reaction product is modified with knoptene a and hapten c at both ends of the 5 'and 3' ends, respectively.
  • Single-stranded DNA if the sample SNP site is G / G, the ligation product is a single-stranded DNA modified with nopten b and hapten c at both ends.
  • hapten a and hapten c were modified.
  • a ligation product is obtained in which single-stranded DNA, hapten b, and hapten c are modified.
  • amplification may be performed using only probe a and probe c, for example, without preparing three types of probes!
  • the present invention can also detect a plurality of types of SNPs.
  • a competitive reaction is set for each SNP, so the number of primer Z probes increases depending on the type of SNP position. If two types of SNPs are used, six primer Z probes are required, and the fourth and fifth ligands are the minimum required.
  • the sixth ligand corresponding to the third ligand can be used, but by using the third ligand in common for the detection of various SNPs, BF separation after the reaction can be performed easily and easily. The cost can also be reduced.
  • detection of various SNPs may be performed in separate containers, or may be performed simultaneously in the same container.
  • different SNPs corresponding to the third ligand (Six ligands, ninth ligands Processes such as BF separation can be performed in any order on the types, and two or more types of SNPs can be detected in the same container using a common third ligand.
  • BF separation a common third ligand.
  • Fig. 4 shows a method for detecting a nucleic acid modified with a ligand.
  • Nucleic acid detection methods have various modes, and the present invention includes all modes in which the present invention can be implemented.
  • a representative method is a method of detecting with a fluorescent dye.
  • a solid-phase carrier is preliminarily loaded with a receptor that specifically binds to the first ligand.
  • the receptor that specifically binds to the second ligand is covered with a fluorescent dye.
  • the nucleic acid modified with the ligand is bound to the solid phase carrier via the first ligand, and then the second ligand is fluorescently colored. Binds the elementally modified receptor.
  • the nucleic acid can be detected by detecting this fluorescent dye using an optical device.
  • the first ligand may be previously supported on the solid phase carrier.
  • a receptor that specifically binds to the supported first ligand is bound to the supported first ligand.
  • the first ligand of the nucleic acid modified with the ligand is bound to the receptor.
  • the solid phase carrier carrying the ligand substance is superior in storage stability compared to the solid phase carrier carrying the receptor, and greatly contributes to the practical application of the test method.
  • Fig. 4 (iii) it can also be detected by an enzymatic reaction.
  • the enzyme for example, alkaline phosphatase, peroxidase and the like can be used.
  • the receptor that specifically binds to the second ligand is previously modified with an enzyme, and chemiluminescence generated by reacting the enzyme with a substrate is detected.
  • a solid support on which the first ligand is previously supported may be used (FIG. 4 (iv)).
  • FIG. 5 the detection process of the embodiment shown in FIG. 4 (iii) will be described in more detail (FIG. 5).
  • a receptor is supported on a solid phase carrier.
  • a solid phase carrier on which a receptor is previously supported may be used.
  • a detection target modified with a ligand is used.
  • unbound free nucleic acid is removed by BF separation (FIG. 5 (i0).
  • it is repaired with an enzyme).
  • the decorated antibody is bound to the second ligand, unbound free labeled antibody is removed by BF separation ( Figure 5 (iii)), and finally chemiluminescence is generated by the enzyme-substrate reaction.
  • Fig. 5 (iv) The nucleic acid detection method shown in Fig. 4 (0, (ii), and (iv) should be performed in the same detection process. Can do.
  • nucleic acids modified with the first and second ligands were used for convenience of explanation.
  • detect nucleic acids modified with first and third ligands, and nucleic acids modified with Z or second and third ligands are used for convenience of explanation.
  • the mutant nucleic acid is modified with the first and third ligands
  • the standard nucleic acid is modified with the second and third ligands.
  • a solid phase carrier carrying a receptor that specifically binds to the first ligand and a solid phase carrier carrying a receptor that specifically binds to the second ligand are prepared. Therefore, variant nucleic acids and standard nucleic acids can be detected.
  • the mutant nucleic acid and the standard nucleic acid can be simultaneously detected using a solid phase carrier carrying a receptor that specifically binds to the third ligand.
  • Both the mutant-type nucleic acid and the standard-type nucleic acid can bind to the solid phase carrier carrying a receptor that specifically binds to the third ligand.
  • the mutated nucleic acid has the first ligand unbound
  • the standard nucleic acid has the second ligand unbound. Therefore, a receptor that specifically binds to the first ligand and a receptor that specifically binds to the second ligand are preliminarily modified with different labeling substances, and this labeling substance is used. Mutant nucleic acids and standard nucleic acids can be detected simultaneously.
  • nucleic acid can be detected even in the absence of either the first or second ligand.
  • the reaction system can be made simpler by reducing the number of ligands
  • a receptor means a substance that specifically binds to a ligand substance.
  • a ligand substance For example, when piotin is selected as the ligand, avidin is the receptor, and when hapten is selected as the ligand, the anti-hapten antibody is the receptor.
  • the antibody purified by affinity purification is a monoclonal antibody because specificity is improved and detection accuracy is improved.
  • the ligand and the receptor may be an antigen or an antibody, respectively, and the specific binding between the ligand and the receptor may be performed by an antigen-antibody reaction. By detecting a nucleic acid using an immune reaction, detection with high reactivity and high accuracy becomes possible.
  • the solid phase carrier means any support capable of supporting the receptor.
  • Support material There are no particular restrictions on the quality and shape. Examples of the material include glass, silicon, metal, metal oxide, resin, rubber, ceramics, and the like.
  • the surface of the support has an active group such as a hydroxyl group, a carboxyl group, an amino group, or a thiol group.
  • active group such as a hydroxyl group, a carboxyl group, an amino group, or a thiol group.
  • it since it can be coordinated with a thiol group on the gold surface, it may be good even without an active group.
  • the support may be liquid permeable or liquid impermeable! / ⁇ . Since the liquid-permeable support is often a porous body, there are advantages such as an increased amount of antibody immobilization with a large surface area and an increased degree of freedom in the direction of liquid movement, making it easier to automate the reaction. . However, there are disadvantages such as a narrower selection of materials and, in some cases, an improvement in the detection device, which makes it necessary to select according to circumstances.
  • a low fluorescent silica glass is used as a support.
  • the glass is thoroughly degreased with alcohol and then washed with pure water.
  • the solution is adjusted to 3% by weight of aminopropyltrimethoxysilane (manufactured by Shin-Etsu Silicone) in ethanol.
  • the glass is immersed in this solution at room temperature, reacted for 1 hour with stirring, washed in turn with ethanol and pure water, and then dried at 130 ° C for 20 minutes.
  • EDC manufactured by PIERCE
  • MES buffer so as to be 5% by weight
  • the treated glass is immersed in this solution at room temperature and reacted for 1 hour with stirring.
  • the anti-nopten antibody is a solution obtained by dissolving the anti-nopten a antibody and anti-nopten b antibody corresponding to hapten a and hapten b in Fig. 6 in a MES buffer at a concentration of 5 mg / ml. Prepared and spotted this solution at another location on the glass.
  • the spotting method uses a stylus-type spotting device SPBIO (manufactured by Hitachi Software). After each solution was spotted on each of four locations on the glass, it was allowed to react for 1 hour at room temperature. Soak for hours. After soaking, PBS After washing sequentially with a knofer and 1/10 concentration of PBS buffer, it is dried by spin dry method.
  • the support can be produced as described above.
  • two types of anti-nopten antibodies can be immobilized, it is possible to further increase the types of nucleic acids to be detected.
  • a particulate support can be used as a solid phase carrier, and the support can be supported on the support.
  • the particulate support a product made from rosin is often used. Typical materials include natural rubber, styrene and styrene copolymers, polyurethane, and acrylic resin, but there is no particular limitation on the material for the particulate support used in the present invention.
  • a magnetic substance can be mixed into the particulate support. By giving magnetism to the particulate support, the handling of the particulate support is facilitated.
  • Methods for supporting the receptor on the particulate support include physical adsorption and chemical adsorption, either of which may be used. Since the process is simple, physical adsorption can be used a lot, but chemical adsorption is also good for maintaining the activity of the anti-hapten antibody and realizing a stable reaction. In chemisorption, the support and the antibody are often firmly bonded by a covalent bond via a chemical substance called a linker agent in many cases. The optimal type of linker can be selected according to the material and surface condition of the support and the type of antibody.
  • a solid phase carrier carrying the receptor is prepared, and then bound to the solid phase carrier via at least one ligand of the nucleic acid modified with the ligand, whereby a nucleic acid solid phase carrier complex is obtained. Can be obtained.
  • the nucleic acid detection process using the nucleic acid containing the single nucleotide polymorphism shown in FIG. 8 is described below.
  • the The hapten, primer, and probe used are shown in FIGS. 6, 7 and 9, respectively, as in the PCR-SSP method and the ligation reaction described above.
  • the nucleic acid modified with the hapten is dissolved in MES buffer, dropped onto a support, reacted at 37 ° C for 2 hours, and then washed with MES buffer. At this time, if a nucleic acid modified with hapten a is present in the solution dropped on the support, it binds to the corresponding anti-hapten a antibody, and similarly, if a nucleic acid modified with hapten b is present, Binds to the corresponding anti-noptene b antibody.
  • the hapten c does not exist at the position on the support to which the anti-nopten a antibody corresponding to hapten a is immobilized. Further, when the SNP site of the nucleic acid to be detected is A / G, an unbound hapten is not attached to the position on the support on which the anti-nopten a antibody and anti-nopten b antibody corresponding to each of hapten a and hapten b are immobilized. C exists.
  • a solution prepared by dissolving an antibody solution labeled with CY 5 as a fluorescent dye in the anti-no corresponding to hapten c and a fluorescent dye in the ptene c antibody at a concentration of 10 ⁇ g / ml was added dropwise to the support. And react at 37 ° C for 2 hours. Then wash with MES buffer and 1/10 MES buffer in order, and dry by spin drying. Due to this reaction, CY5 is present only at the position on the support where the hapten c is present.
  • the support is set with a GenePix4000B (manufactured by AXON Instruments) and scanned at an excitation wavelength of 635 nm and a detection wavelength range of 650 nm to 690 nm.
  • an anti-nopten c antibody labeled with an enzyme such as alkaline phosphatase may be used instead of the anti-nopten c antibody labeled with CY5
  • an anti-nopten c antibody labeled with an enzyme such as alkaline phosphatase may be used.
  • the reaction between the hapten c on the support and the alkaline phosphatase-labeled anti-noptene c antibody is carried out by the same reaction as described above.
  • a substrate for example, CDP-Star (Calbio.chem.)
  • the fluorescence intensity is measured with Luminescencer (ATTO), and the position information on the support is measured. Together with this, it becomes possible to detect the SNP of the nucleic acid to be detected.
  • hapten a and hapten b may be supported.
  • the treatment conditions such as a linker agent may be exactly the same.
  • the nopten immobilization support prepared in this way was prepared by dropping a mixed solution of anti-nopten a antibody and anti-hapten b antibody corresponding to the immobilized hapten a and hapten b at 37 ° C for 2 hours. React and wash in the same way.
  • the anti-hapten a antibody and the anti-noptene b antibody are present on the support at the positions of immobilized nopten a and hapten b, respectively, and thereafter, detection is performed in the same manner as described above. Is possible.
  • Antinomy and ptene c antibodies are supported on a magnetic particulate support, and nucleic acids are detected using this.
  • the particulate support carrying the anti-noptene c antibody is dispersed in a phosphate buffer, mixed with a nucleic acid modified with a nopten corresponding to the SNP, and the nucleic acid is mixed with the particulate support. Bond to support. Since the particulate support is magnetic, the external force can be moved by increasing the magnetic force, and the particles can be collected in one place in the solution.
  • the particulate support is fixed to the container wall surface by using a magnet. The solution is removed while the particulate support is fixed to the wall of the container, and a new phosphate buffer is added.
  • a solution in which the particulate support is uniformly dispersed in the phosphate buffer is dispensed in two. The number to be dispensed depends on the number of nucleic acids to be measured and the number of haptens used.
  • hapten a in the case of A / A
  • hapten b in the case of G / G
  • hapten b in the case of A / G
  • Hapten a and nopten b are in an unbonded state. Therefore, labeled anti-noptene a antibody and By using the anti-noptene b antibody, the nucleic acid to be detected can be detected.
  • the enzyme-labeled anti-hapten a antibody and the enzyme-labeled anti-hapten b antibody are separately added to each of the solutions containing the particulate support dispensed into the two, and reacted. After the reaction, the above BF separation step is repeated again to remove the unreacted enzyme-labeled anti-hapten antibody.
  • alkaline phosphatase, peroxidase and the like are preferably used as the enzyme, but are not limited thereto.
  • the compound serving as the enzyme substrate is mixed in each container, and after reacting for a certain period of time, the luminescence intensity, change in absorbance, etc. are measured, thereby simultaneously detecting the SNP of the nucleic acid to be detected. It becomes possible.
  • nucleic acid can be detected by using a support carrying an anti-no, ptene a antibody and a support carrying an anti-no, ptene b antibody.
  • the antibodies immobilized on the magnetic particulate support are anti-noptene a antibody and anti-noptene b antibody, and a separate container containing the particulate support is prepared for each antibody.
  • the SNP of the nucleic acid to be tested is dispensed into two corresponding hapten-modified nucleic acids and each is reacted in a separate container. After the BF separation, an enzyme-labeled anti-hapten c antibody is added and allowed to react.
  • the above-described BF separation step is repeated again, and finally the compound that becomes the substrate of the enzyme is mixed in each container and reacted for a certain period of time, and then the emission intensity, change in absorbance, etc. are measured. It becomes possible to detect the SNP of the target nucleic acid.
  • the antibody immobilization on the particulate support depends on the number of nucleic acids to be measured and the number of haptens used. Furthermore, the kind of enzyme and the modification to a fluorescent dye are applicable.
  • the BF separation step can be performed using a magnetic support! /, Or a particulate support.
  • the above-described embodiments all measure the SNP of nucleic acids.
  • the present invention can be applied to nucleic acid mutations and expression levels. That is, the subsequent treatments may be exactly the same by setting the primers and probes to sequences that have detected mutations and expression levels, respectively.
  • the nucleic acid containing the single nucleotide polymorphism shown in FIG. 8 was detected by the ligation reaction.
  • the base sequences before and after the monobasic polymorphism were amplified by PCR in order to remove the pseudo-sequence and increase the detection sensitivity.
  • Magnetic particles were used as the support, and nucleic acids were detected by enzyme substrate reaction.
  • Sample a combination of human genomic DNA having the sequence shown in FIG.
  • Combination i Combination of A aryl (base # in Figure 8 is A) and A aryl (A / A
  • PCR primer PCR primer with the sequence shown in Figure 10
  • PCR reagent “Accuprime Super Mix II” catalog No.12341-012 manufactured by Invitrogen
  • Probe Assembling of the probe shown in Fig. 11.
  • Combination I Among the probes having the sequence shown in FIG. 9, digoxigenin (Dig) is modified at the 5 ′ end of probe a, 5 ′ end of probe b is unmodified, and 3 ′ of probe c Probe with 5 'end carboxylation modified with piotin at the end
  • Enzyme-labeled antibody DAKO “Anti-Digoxigenin (rabbit polyclonal antibody with A LP) Catalog No.D5105
  • the PCR product amount was measured absorbance, diluted to 4 ⁇ ⁇ / / ⁇ 1.
  • the following reactions are performed in an incubator.
  • the BF separation reaction is performed 3 times each in a phosphate buffer.
  • FIG. Figure 12 is a graph showing the average value of light emission for each sample and probe combination. It can be seen that the result corresponding to the SNP of the sample is obtained as the light emission!
  • the combination of A / A, A / G, and G / G in the sample can be clearly distinguished, and the distinction between A / A and A / G and G / G and A / G, which was difficult with the conventional method, can be made. It is very useful in that it can be distinguished by a single reaction.
  • a nucleic acid containing a single nucleotide polymorphism was detected by amplifying the nucleic acid by the Mediated Amplification method.
  • the inner primer FA (G) and the inner primer RA (G) were primers for detecting the aryl G of the sample and labeled with biotin at the 5 ′ end of the primer.
  • Inner bra Imama FA (A) and inner primer RA (A) were primers for detecting Aryl A, and labeled with digigigenin (Dig) at the 5 ′ end of primer.
  • the preparation was carried out on ice so that the reaction did not proceed during the preparation of the reaction solution.
  • the target polynucleotide (amplified nucleic acid) for amplification is a 1 X 172 base ⁇ DN that is not heat-denatured.
  • the 92 th sequence of the nucleotide sequence is a single nucleotide polymorphism and is G or A.
  • the target region, Flc, F2c, F3c, Rl, R2, and R3 are as follows. is there.
  • Target region single nucleotide polymorphism region: only the 92nd G or A of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • F2c 25th to 50th (26 bp) of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • F3c 1st to 24th position (24bp) of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • R1 93rd to 115th positions (23 bp) of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • R2 129th to 152nd base sequence (24 bp) of SEQ ID NO: 1
  • R3 153 to 172 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 (20 bp)
  • the sample is composed of 2 samples (sample numbers 1-2, aryl combination G / G) containing the G sequence at the 92nd position of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the second base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • Two samples containing the A sequence in the 92nd sample (Sample Nos. 3 to 4, allele combination A / A), and a sample containing the G and A sequences in the 92nd base sequence shown in the SEQ ID No. 1 were mixed.
  • 2 samples (Sample Nos. 5-6, Aryl Combination A / G), a saddle-shaped insert as a negative control! /,
  • And 2 samples (Sample Nos. 7-8) for a total of 8 samples Prepared.
  • Alkaline phosphatase labeled anti-biotin antibody (“Polyclonal Rabbit Anti-Biotin D5107J” manufactured by DAKO) Alkaline phosphatase labeled anti-digoxigenin antibody (“Polyclonal Rabbit Anti-DIG / AP Rabbit F (ab ') Code No. D 5105" manufactured by DAKO)
  • the amount of LAMP product was divided into two, and the following reaction was performed.
  • Table 1 shows the amount of luminescence (unit: cps) for each sample and detection reagent combination
  • FIG. 13 shows this in a graph. It can be seen that the result corresponding to the SNP of the sample is obtained as the amount of luminescence!
  • a / A, A / G, and G / G combinations of samples can be clearly distinguished, and amplification methods other than the PCR method are difficult!
  • a / G, G / G and A / G are very useful in that they can be distinguished by a single reaction.
  • the ligand used is not limited, and may be changed as long as a receptor that specifically reacts can be prepared. Furthermore, detection is possible without attaching a ligand to both the inner primer FA (G) and the inner primer RA (G), and the inner primer FA (A) and the inner primer RA (A).
  • G) Primer 5 'end may be labeled with biotin, and inner primer FA (A) only primer 5' end may be labeled with digigogigenin (Dig)!
  • the present invention provides a nucleic acid detection method that is simpler, more accurate, and highly reproducible by utilizing the agglutination reaction of dispersible particles in the nucleic acid detection method as described above.
  • the nucleic acid to be detected was captured on a fixed substrate, and the captured nucleic acid was detected by an enzyme substrate reaction or the like.
  • nucleic acid can be detected reliably and rapidly by the physical phenomenon of agglomeration of dispersible particles without the need to previously modify the receptor with an enzyme or the need to add a substrate to the enzyme. The method will be described in detail below.
  • the present invention is a method for detecting a target nucleic acid on the basis of aggregation caused by a cross-linking reaction between a target nucleic acid to be detected and dispersible microparticles, wherein different types of first and second ligands are used.
  • a first microparticle in which a plurality of bound target nucleic acids, a receptor that specifically binds to the first ligand are bound, and a second microparticle in which a plurality of receptors that specifically bind to the second ligand are bound.
  • a method for detecting a nucleic acid comprising a step of measuring, by spectrophotometry, agglomeration caused by a large number of microparticles linked together.
  • the present invention provides a spectrophotometric method by reacting a target nucleic acid having a known concentration at which one or more different types of first and second ligands are bound to the first and second microparticles.
  • the step of measuring by the method and the step are similarly performed for different concentrations of target nucleic acid, a calibration curve is created from the measurement results, and the target nucleic acid to be detected is converted into the first and second microparticles.
  • a method capable of quantifying nucleic acid comprising: a step of measuring by spectrophotometry, and a step of determining the concentration of the target nucleic acid to be detected based on the calibration curve.
  • nucleic acid based on the aggregation of the microparticles by binding a ligand to the nucleic acid, reacting with the dispersible microparticles bound to the receptor, and simple and accurate. Nucleic acid can be detected.
  • the nucleic acid detection method of the present invention is a method for detecting nucleic acids by measuring the aggregation of fine particles using dispersible fine particles.
  • the method of the present invention will be described in order.
  • a ligand is bound to a target nucleic acid to be detected.
  • the target nucleic acid may be a nucleic acid contained in a biological sample or a nucleic acid contained in any sample, but is not limited thereto.
  • Nucleic acids are all nucleic acids or nucleic acid analogs including cDNA, genomic DNA, synthetic DNA, mRNA, total RNA, hnRNA, and synthetic RNA. It may be what was done.
  • the ligand to be bound to the target nucleic acid is, for example, a hydrophilic organic compound, dioxygen, fluorescein, alexa, a polypeptide having 6 or more residues, a sugar chain having 2 or more sugars, piotin, protein,
  • the ability to use polyhistidine, HA, GST, Flag (a peptide of DYKDDDDK), etc. is not limited to these.
  • Piotin, dioxigen, fluorescein, alexa, etc. are characterized by their easy availability and low price.
  • first and second ligands are bound to the target nucleic acid.
  • the method for binding a ligand to a target nucleic acid is as follows: (i) a method in which light, platinum or a linker is used to covalently bind to the base of the nucleic acid inside and at the end (Fig. 14a), for example, an amino group at the 5 'end of a nucleic acid. And a method of covalently binding the carboxyl group of the ligand, (ii) a method of extending with a polymerase using a primer to which a ligand is bound during nucleic acid synthesis (FIG.
  • a nucleotide having a ligand bound during nucleic acid synthesis Various methods such as the method of incorporating and extending (Fig. 14c), (iv) the method of tailing the nucleotide bound to the ligand to the 3 'end of the nucleic acid using terminal deoxydyl transferase (Fig. 14d), etc. Can be used.
  • the method (ii) (iii) can be used.
  • the target nucleic acid to be detected is present alone, any method may be used.
  • a target nucleic acid contained in a biological sample or the like may be amplified by a PCR method to detect the force, but may be subjected to detection without being amplified.
  • ligands are used as ligands bound to the target nucleic acid. Since the structure of the nucleic acid is flexible and, as described later, it is essential for the nucleic acid to link two fine particles, it is desirable to use two types of ligands.
  • the two kinds of ligands to be bound to the target nucleic acid may be one each, or two or more may be bound. Since the volume ratio of “nucleic acid” to “particle” is extremely large, it is unlikely that three or more particles bind to one nucleic acid. Therefore, even if a plurality of ligands are bound to one nucleic acid, it is considered that the degree of aggregation of fine particles is not affected.
  • the dispersible fine particles used in the present invention mean particles dispersed in a solution such as colloidal particles, and latex particles are preferably used, but are not limited thereto.
  • fine particles having a particle size of about 80 to 300 nm are suitable for measuring the turbidity with an immunoturbidimetric apparatus.
  • Latex particles are mainly made up of polystyrene, and are used to increase hydrophilicity and dispersibility. Luric acid is copolymerized. There are two types of latex particles: a plain type with no functional groups on the surface and a functional group type with functional groups. The charge on the plain-type surface has a negative charge due to the presence of methacrylic acid and can ionically bind to the positively charged region of the protein. It is also possible to form a hydrophobic bond. Plain type latex particles are admixed with protein just by mixing with protein, so protein immobilization is easy.
  • Latex particles having a functional group are designed such that a carboxy group or an amino group is exposed on the surface, and various types of functional group type latex particles can be used.
  • the method of binding the receptor to the latex particle is the EDAC method in which carboxylic acid and amino group are bonded with water-soluble carpositimide, the method in which EDC and NHS are mixed in advance to bond carboxylic acid and amino group, bipolar
  • EDAC electrosprayse
  • bipolar There are a method of cross-linking amino groups using a linker having an amino acid, a method of binding proteins with activated aldehyde groups and tosyl groups, and the like. Any existing method may be used in the present invention, but the EDAC method is particularly desirable. It should be noted that, even with fine particles other than latex particles, the receptor can be bound by a known method.
  • a receptor that specifically binds to a ligand that is bound to the target nucleic acid to be detected is used as the receptor bound to the dispersible microparticles.
  • a receptor for example, an antibody, a lectin, a streptavidin, a Ni or the like that can be used is not limited to these. Proteins, particularly antibodies, are preferably used.
  • a known method suitable for the fine particles should be used! ,.
  • a single type of receptor is bound to one dispersible fine particle.
  • at least two types of ligands are bound to the target nucleic acid
  • at least two types of dispersible fine particles are prepared for one type of target nucleic acid. That is, the first dispersive fine particles bound to the receptor corresponding to the first ligand (FIG. 15a) and the second dispersible fine particles bound to the receptor corresponding to the second ligand (FIG. 15b). And prepare.
  • two or more types of receptors may be bound to one dispersible fine particle.
  • one of the two ligands bound to one target nucleic acid is one
  • the receptor corresponding to the ligand is bound to a receptor other than the receptor corresponding to the other ligand. That is, it is designed so that both of the two ligands of the target nucleic acid do not bind to the microparticles.
  • the binding of the receptor to the dispersible fine particles in this step may be performed when detecting the nucleic acid, or the dispersible fine particles to which the receptor has been bound in advance may be used for detection. . In addition, this step may be performed before or after the step of preparing the target nucleic acid.
  • the target nucleic acid to which the ligand as described above is bound and the first and second dispersible fine particles to which the receptor is bound are reacted and bound.
  • This reaction may be carried out by simultaneously mixing a solution containing the target nucleic acid and two solutions containing the dispersible fine particles, or may be carried out sequentially by sequentially mixing the dispersible fine particles.
  • FIG. 16 shows a schematic diagram in which the target nucleic acid and the fine particles are bound.
  • the first ligand 31 bound to the target nucleic acid 30 binds to the first microparticle 33.
  • the second ligand 32 bound to the target nucleic acid 30 binds to the second microparticle 34.
  • one target nucleic acid binds to the first fine particle and the second fine particle, thereby connecting the first and second fine particles.
  • a plurality of target nucleic acids bind to one microparticle, and each of the target nucleic acids binds to another microparticle, and as a result, a large number of microparticles are linked together, resulting in aggregation of the microparticles.
  • the dotted line where the receptor strength is also extended is a simplified representation of the nucleic acid.
  • the target nucleic acid when the target nucleic acid is present in the sample, aggregation of fine particles occurs, whereby the target nucleic acid can be detected.
  • the presence or absence of aggregation of fine particles may be detected by labeling with the above-described optical marker, and the dispersion state of the optical signal may be detected.
  • the absorbance is measured by spectrophotometry without using the optical marker.
  • a single fine particle hardly scatters near-infrared light (Fig. 17a).
  • the agglomerated fine particles can cause near-infrared light scattering with an apparent diameter larger than that of individual fine particles (FIG. 17b). Therefore, by measuring the luminous intensity of the transmitted light with respect to incident light in the near-infrared region, the degree of aggregation of the fine particles can be measured. The At this time, since the fine particles having a particle size of 300 nm or less scatter near infrared light when aggregated, it is preferable to use fine particles having a particle size of 300 nm or less.
  • the solution containing fine particles may be prepared such that the final concentration after mixing (before aggregation) is in the range of 0.01 to 1 in terms of OD value, and further, the OD value after aggregation is 3 or less. preferable.
  • the mixed latex mixer is rapidly stirred by pipetting.
  • the buffer used in the reaction system is preferably a solution that promotes aggregation. When using a different buffer, it is recommended to wash the microparticles 2 to 3 times with the different buffer! /.
  • the reaction is preferably performed at a temperature of 0 ° C or higher and 37 ° C or lower for 5 to 30 minutes.
  • Other ligand-receptors can be appropriately selected by using a temperature, time, and buffer suitable for the reaction.
  • the reaction solution after mixing is subjected to spectrophotometric measurement, the aggregated! / Small soot particles do not scatter near-infrared light, so the reaction system that does not require BZF separation is directly used for measurement. be able to.
  • the target nucleic acid is prepared by PCR, if there is a possibility that a measurement error may occur due to an unreacted primer to which a ligand is bound, an unreacted nucleotide, or the like, these may be separated.
  • BZF separation is performed using magnetic particles in which piotin is bound to one ligand and avidin or streptavidin is bound. At this time, the magnetic particles may be used as dispersible fine particles.
  • a method for quantifying nucleic acids using the method of the present invention will be described.
  • a target nucleic acid bound with a ligand as described above is used, and a solution containing the target nucleic acid at various concentrations is prepared.
  • the nucleic acid solution of each concentration is reacted with the microparticles according to the method described above, and the absorbance is measured by spectrophotometry.
  • a calibration curve based on the nucleic acid concentration and absorbance is prepared. Based on this calibration curve, the result of measuring the absorbance of the target nucleic acid to be detected determines the nucleic acid concentration. Thereby, the target nucleic acid can be quantified.
  • a receptor that specifically binds to the ligand bound to the target nucleic acid to be detected by binding two different types of ligand for each type of target nucleic acid
  • a desired target nucleic acid can be simultaneously detected from a sample containing a plurality of types of target nucleic acids.
  • ligands that bind to nucleic acids may all be different ligands.
  • one of the two types of ligands may be the same as the other nucleic acid.
  • Nucleic acid mutations include single nucleotide polymorphism (SNP), deletion, insertion, and the like.
  • Single Nucleotide Polymorphisms refers to the diversity of single nucleotides found on genomic DNA and differing from individual to individual.
  • nucleic acid mutation detection method using the PCR-SSP method there is provided a nucleic acid mutation detection method using the PCR-SSP method.
  • the PCR-SSP method is a method of performing PCR using DNA polymerase. This DNA polymerase has almost no effect unless the 3rd and 3rd ends of the primer are completely hybridized with the vertical DNA.
  • One primer used in this method has a sequence complementary to a target nucleic acid sequence, and its 3 'end corresponds to a mutation site in the target nucleic acid sequence to which a first ligand is bound. It is a primer for detection.
  • the other primer is a common primer having a sequence complementary to the sequence at the 5 ′ end side of the target nucleic acid and a second ligand different from the first ligand.
  • FIG. 18 shows a conceptual diagram of this embodiment.
  • FIG. 18 (a) shows a target nucleic acid 50 without mutation, that is, a standard target nucleic acid 50, and a site where a mutation can exist is represented by a black circle 52.
  • FIG. Fig. 18 (a) Then, the detection primer 54 is completely hybridized, and an amplified product by PCR can be obtained with the common primer 56.
  • FIG. 18 (b) shows a mutant target nucleic acid 50. In this case, the detection primer 54 does not hybridize at the 3 ′ end, and PCR amplification does not occur.
  • PCR is performed using the target nucleic acid and the two kinds of primers 54 and 56.
  • an amplification product can be obtained only when the detection primer 54 is completely hybridized with the target nucleic acid.
  • the common primer 56 hybridizes regardless of the presence or absence of the target nucleic acid mutation.
  • one PCR product binds to the first dispersible fine particles and the second dispersible fine particles, whereby the first and second dispersible fine particles are linked, and Multiple PCR products bind to one dispersive microparticle, and each of the PCR products binds to other dispersible microparticles, thereby aggregating a large number of dispersive microparticles connected together. Measure by.
  • mutations such as single nucleotide polymorphism (SNP), deletion, or insertion in a nucleic acid sequence can be detected simply and rapidly.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • detection primers for both standard and mutant target nucleic acids may be used. That is, as a detection primer, a standard type ligand is bound, a first primer having a sequence complementary to the standard type target nucleic acid, and a mutant type ligand are bound. And a second primer having a sequence complementary to the mutant target nucleic acid is used. These two kinds of detection primers may be subjected to PCR separately, or may be performed simultaneously in the same reaction system.
  • fine particles corresponding to the ligands bound to the respective primers are used as the first dispersible fine particles. That is, dispersive particles for standard type in which a plurality of receptors specifically binding to the ligand for standard type are bound, and dispersibility for mutant type in which a plurality of receptors specifically binding to the ligand for mutant type are bound. Use fine particles.
  • the aggregation reaction in the step (iii) of the first aspect is separately performed for each of the standard-type fine particles and the mutant-type fine particles.
  • the reaction liquid is mixed with a combination of the standard fine particles and the second dispersible fine particles, and the aggregation reaction is performed. If aggregation occurs in this reaction, it can be seen that the target nucleic acid is a standard type.
  • the agglutination reaction is performed using a combination of the fine particles for mutation and the second dispersible fine particles.
  • the target nucleic acid is found to be mutated. Furthermore, when aggregation occurs in any of the aggregation reactions, it can be concluded that the target nucleic acid exists in both a standard type and a mutant type. This can also occur, for example, when a person's genomic DNA is a specimen and the genotype of the single nucleotide polymorphism is heterogeneous.
  • the base type in a single nucleotide polymorphism can be determined by a single PCR reaction, and further, the BZF separation operation is not required, so that the base type can be determined extremely simply and accurately. Can do.
  • the ligand is not limited to the force bound to the primer, but may be bound to the nucleotide.
  • the ligand can also be bound to the amplification product by PCR using nucleotides to which the ligand is bound.
  • the method of this embodiment can also be used when, for example, genomic DNA or the like is used as a sample and a large number of mutation sites are detected simultaneously.
  • the Tag sequence is an artificially designed base sequence.
  • they are sequences that are not present in a biological sample such as a chromosome and are designed to have the same dissociation temperature without mishypli. This Tag sequence is designed and prepared for each mutation site to be detected.
  • a tag sequence is bound to the detection primer in the first embodiment instead of the ligand.
  • This Tag sequence is preferably bound to the 5 'end of the detection primer.
  • piotin is bound to the common primer in the first embodiment.
  • step of this embodiment first, (i) PCR is performed using the target nucleic acid and the two kinds of primers.
  • this PCR as described in the first embodiment, an amplification product is generated only when the detection primer is completely hybridized with the target nucleic acid, that is, when there is no mutation in the target nucleic acid.
  • the PCR product bound to piotin is separated from the PCR reaction solution obtained in (i) above using magnetic particles bound to avidin or streptavidin. Since piotin binds to avidin or streptavidin, it is possible to bind the amplification product to the magnetic particles through this binding, and to separate the magnetic particles from the PCR reaction solution using magnetic force.
  • the PCR product thus separated was combined with (iii) a first primer having a sequence complementary to the Tag sequence and bound with the first ligand, and the second ligand. Use it for PCR with the second primer.
  • an amplification product of the Tag sequence is obtained. That is, when there is no mutation in the target nucleic acid, a primer amplification product is generated, and a tag sequence amplification product is generated therefrom. Therefore, it can be said that the sequence of the mutation site is converted to a Tag sequence.
  • the Tag sequence is designed so that it can be easily amplified by PCR without error, this conversion can be performed smoothly.
  • the amplification product of this Tag sequence is one in which the first and second ligands are bound. Therefore, (iv) the first dispersive particles in which a plurality of receptors that specifically bind to the first ligand are bound, and the second dispersion in which a plurality of receptors that specifically bind to the second ligand are bound. Aggregation may occur as described above by reacting the fine particles, and (V) this aggregation may be measured by spectrophotometry. Finally, (vi) From the measurement results, PCR tag sequence Determine the amplification. That is, if amplification of the Tag sequence is confirmed, it will be found that there is no mutation in the target nucleic acid.
  • the method according to this embodiment described above can also be used when, for example, genomic DNA or the like is used as a sample and a large number of mutation sites are detected simultaneously. Furthermore, by using such a Tag sequence, it is possible to simultaneously detect a large number of mutation sites without being restricted by the type of ligand.
  • the nucleic acid mutation detected in this embodiment is a single nucleotide polymorphism (SNP).
  • the detection primer having a sequence complementary to the target nucleic acid sequence, the 3 ′ end of which corresponds to the single nucleotide polymorphism site and bound with the first ligand, and the target A common sequence with a second ligand bound, which has a sequence complementary to the sequence 5 'to the polymorphic site of the nucleic acid, and whose 5' end corresponds to the base adjacent to the polymorphic site.
  • FIG. 19 shows a conceptual diagram of this embodiment.
  • FIG. 19 (a) shows a target nucleic acid 60 having no mutation, that is, a standard target nucleic acid, and a black circle 62 indicates a site where the mutation can exist.
  • the detection primer 64 is completely hybridized and its 3 ′ end is adjacent to the 5 ′ end of the common primer 66. Therefore, the two primers are linked by subjecting them to a ligation reaction.
  • FIG. 19 (b) shows a mutant target nucleic acid. In this case, since the detection primer 64 does not hybridize at its 3 ′ end, ligation reaction does not occur.
  • the common primer 66 hybridizes regardless of the presence or absence of the target nucleic acid mutation.
  • the steps in this embodiment will be described in order.
  • the two kinds of primers 64 and 66 are hybridized to the target nucleic acid 60.
  • ligation is performed to link the two kinds of primers.
  • the ligated primer obtained here is (iii) A first dispersible fine particle having a plurality of receptors specifically bound to the first ligand, and a second dispersible fine particle having a plurality of receptors specifically bound to the second ligand. React.
  • the presence or absence of a mutation can be detected by a ligation reaction, and it is not necessary to perform PCR. Therefore, the reaction process can be simplified, and cost and time can be reduced. However, this is limited because the probe sequence can only be used before and after the mutation site. Therefore, for example, when a DNA genome sequence or the like is used as a sample, a region containing a mutation site to be detected may be amplified by PCR and cut out. As a result, the effect of improving the detection sensitivity and accuracy of this aspect can also be obtained.
  • the location and number of ligands to be bound to the primer are not limited, but do not inhibit the ligase reaction, such as at positions other than the vicinity of the mutation site, for example, at the end opposite to the mutation site. Preferred to join ,.
  • detection primers for both standard and mutant target nucleic acids may be used. That is, as a detection primer, a standard ligand is bound and the first primer having a sequence complementary to the standard target nucleic acid, and a mutant ligand is bound and complementary to the mutant target nucleic acid. Use a second primer with the correct sequence. These two kinds of detection primers may be separately subjected to a ligation reaction, but may be simultaneously reacted in the same reaction system.
  • fine particles corresponding to the ligand bound to each primer are used as the first dispersible fine particles.
  • dispersion particles for standard type in which a plurality of receptors specifically binding to the ligand for standard type are bonded
  • dispersion for mutant type in which a plurality of receptors specifically binding to the ligand for mutation type are bonded.
  • the aggregation reaction in the step (iii) is performed separately for each of the standard type fine particles and the mutant fine particles.
  • the reaction solution after ligation There are either one or both of the product of the standard primer and the product of the mutant primer.
  • this reaction liquid a combination of the standard type fine particles and the second dispersible fine particles is mixed to perform an agglomeration reaction. If aggregation occurs in this reaction, it can be seen that the target nucleic acid is a standard type.
  • the agglutination reaction is performed using a combination of the fine particles for mutation and the second dispersible fine particles. If aggregation occurs in this reaction, the target nucleic acid is found to be mutated.
  • both the standard type and the mutant type exist for the target nucleic acid. This can also occur, for example, when a person's genomic DNA is a specimen and the genotype of the single nucleotide polymorphism is heterogeneous.
  • the base type in the single nucleotide polymorphism is revealed by a single ligation reaction, and further, since the BZF separation operation is not required, the base type is determined extremely simply and accurately. be able to.
  • nucleic acid variation detection method using a ligation and further using a Tag sequence.
  • the nucleic acid mutation detected in this embodiment is a single nucleotide polymorphism.
  • a Tag sequence is used as in the second embodiment. Further, the mutation is detected using the ligation reaction as in the third embodiment.
  • a detection primer having a sequence complementary to a target nucleic acid sequence, the 3 'end corresponding to a mutation site in the target nucleic acid sequence, and the Tag sequence bound to the 5' end, and Using a common primer having a sequence complementary to the sequence 5 ′ end from the mutation site of the target nucleic acid and bound with biotin,
  • the first and second dispersible fine particles are linked by combining the two PCR products with the first dispersible fine particles and the second dispersible fine particles, and one dispersible fine particle
  • a plurality of PCR products are bound to each other, and each of the PCR products binds to other dispersible microparticles, whereby agglomeration resulting from the coupling of a large number of dispersible microparticles to each other is measured by spectrophotometry
  • the method in this embodiment can be used when, for example, genomic DNA or the like is used as a sample and a large number of mutation sites are detected simultaneously. Furthermore, by using such a Tag sequence, it is possible to detect a large number of mutation sites simultaneously without being restricted by the type of ligand. In addition, the presence or absence of mutation can be detected by ligation reaction, and it is not necessary to perform PCR. Therefore, the reaction process can be simplified, and cost and time can be reduced.
  • a solution containing a target nucleic acid to be detected at a known concentration is prepared and measured in the same manner as described above. This is performed with each concentration of nucleic acid solution, and a calibration curve based on the nucleic acid concentration and absorbance is prepared based on the measurement results. Based on the calibration curve, the nucleic acid concentration is determined from the result of measuring the absorbance of the target nucleic acid to be detected. Thereby, the target nucleic acid can be quantified.
  • the various aspects of the present invention described above can simultaneously detect mutations in a desired target nucleic acid in a sample containing a plurality of types of target nucleic acids and in nucleic acids having a large number of mutation sites. This is because the PCR and ligation reactions are performed simultaneously for multiple mutations, and the reaction solution is dispensed to detect each mutation. By carrying out the agglutination reaction using the conductive fine particles, it is possible to detect changes at a plurality of locations in a simple and simultaneous manner.
  • a desired nucleic acid can be detected simply, rapidly, and with high accuracy.
  • it is useful for simplifying and speeding up clinical examinations, and the simple examination ability can be widely applied to full automatic analysis.
  • Materials used in carrying out the method of the present invention include, for example, 300 nm carboxy-type latex particles (CMP) G0201 (0.104 meq COO / g) (JSR), EDAC (Sigma), Usagi anti-biotin. Antibody (BETHYL laboratory inc.), Usagi anti-digigosinin (Dig.) Antibody (Roche diag nostic corp.), Vertical DNA, 5, biotinylated SD primer, 3, Diog. ED primer, Titanium Taq DNA polymerase (BD And MES (WAKO) can be used.
  • a rotator As a device to be used, a rotator, a vortex mixer, a tangential flow system, a dialysis membrane, a magnetic stirrer, a spectrophotometer, a cell, or the like may be used.
  • the nucleic acid detection method of the present invention is used when testing nucleic acid polymorphisms, mutations, and expression levels.
  • the nucleic acid detection method of the present invention is used when SNP is detected.
  • the nucleic acid detection method of the present invention reveals an individual's SNP and reveals the pathological genetic background of the individual. This makes it possible to develop medicines that are optimal for each individual.

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Abstract

　本発明は、リガンドと受容体との特異的結合によって核酸を検出する方法、特に、リガンドと受容体との特異的結合によってSNPを検出する方法を提供する。本発明はまた、測定操作が一回の簡便かつ測定時間が短い核酸の検出方法を提供する。本発明はまた、液体と固体の界面での反応において、リガンドと受容体との特異的結合反応を使用し、高感度かつ高精度の核酸の検出方法を提供する。本発明はまた、分散性粒子の凝集反応を利用して核酸を検出する。

Description

明 細 書
核酸の検出方法
技術分野
[0001] 本発明は、核酸を検出する方法に関する。さら〖こ詳しくは、リガンドと受容体との特 異的結合によって核酸を検出する方法に関する。さらに詳しくは、分散性粒子の凝 集反応を利用して核酸を検出する方法に関する。
背景技術
[0002] 近年、オーダーメイド医療を実現するために、一塩基多型 (SNP)の解析の必要性が 高まっている。一般に、 SNPの解析はマイクロアレイ技術に基づいて行われている。 例えば、 Roche Diagnostic社が販売している AmpliChip P450は、代表的な SNP測定 デバイスであり、 SNP診断キットとして FDAの許可を取得して!/、る。
[0003] しかし、マイクロアレイによる核酸の検出は、核酸同士のハイブリダィゼーシヨンによ つて行われる。核酸同士のノ、イブリダィゼーシヨンは、一般に反応条件を 45°C以上の 高温にする必要があり、かつ反応させる核酸の塩基配列中の GC含量や核酸の長さ などによって反応条件が異なり、常に最適な反応条件を設定することは難しい。さら に、マイクロアレイによる核酸の検出は、液体溶液中の試料核酸を、固体基板上の標 識核酸にハイブリダィズさせることによって行われる。液体と固体の界面での反応は お互いの化学的状態が大きく異なるので反応条件の設定が難しい。その結果、低反 応および偽反応の問題が起こる。
[0004] これに対し、抗原抗体反応をはじめとしたリガンドと受容体との特異的反応は、ハイ ブリダィゼーシヨン反応と比較して、反応条件の設定が容易であり、かつ反応の感度 および再現性が高 、と 、う利点がある。このリガンドと受容体との特異的反応を利用 したアレイが、例えば日本国の公表特許公報 2003-535569号に開示されている。しか し、溶液ハイブリダィゼーシヨンとエンドヌクレアーゼ反応を含んでおり、二度の測定 操作を行う必要があり、操作が煩雑で測定に時間を要する。さらに、酵素反応を行う 必要がある。酵素反応は、固体基板上の核酸に対して行われるので、前述した液体 と固体の界面での反応を要し、低反応および偽反応の問題が起こる。 発明の開示
[0005] 本発明は、リガンドと受容体との特異的結合によって核酸を検出する方法、特に、リ ガンドと受容体との特異的結合によって SNPを検出する方法を提供することを目的と する。本発明はまた、測定操作が一回の簡便かつ測定時間が短い核酸の検出方法 を提供することを目的とする。本発明はまた、液体と固体の界面での反応において、 リガンドと受容体との特異的結合反応を使用し、高感度かつ高精度の核酸の検出方 法を提供することを目的とする。本発明はまた、分散性粒子の凝集反応を利用して 核酸を検出することを目的とする。
[0006] 本発明の一態様に係る核酸の検出方法は、（1)検出対象の核酸に第一および第二 のリガンドを結合させる工程と、（2)前記リガンドを結合させた核酸において、前記第 一のリガンドを、前記リガンドと特異的に結合する受容体を担持させた固相担体と結 合させ、核酸 固相担体の複合体を得る工程と、（3)前記複合体において、前記第二 のリガンドを、前記リガンドと特異的に結合する標識物質で修飾された受容体と結合 させる工程と、（4)前記標識物質を検出することにより、前記核酸を検出する工程とを 具備する。
[0007] 本発明の他の態様に係る核酸の検出方法は、（1)種類の異なる第一および第二の リガンドが結合した標的核酸と、前記第一のリガンドと特異的に結合する受容体が複 数結合した第一の微粒子と、前記第二のリガンドと特異的に結合する受容体が複数 結合した第二の微粒子とを反応させる工程と、（2)—つの前記標的核酸が前記第一 および第二の微粒子に結合することによって、前記第一および第二の微粒子が連結 し、かつ、一つの微粒子に複数の標的核酸が結合し、前記標的核酸のそれぞれが 他の微粒子と結合することによって、多数の微粒子が互いに連結されて生じる凝集を 、分光光度法によって測定する工程とを具備する。
[0008] 本発明の核酸の検出方法は、高感度かつ高精度で核酸を検出することができる。
その結果、測定結果の高い再現性が保証される。また、ハイブリダィゼーシヨン反応 を使用せず、リガンドと受容体との特異的結合を使用するので、反応条件を 37°C付 近の低温に抑えることができる。さらに、測定操作は一回なので、操作が簡便であり、 短時間の測定が可能になる。その結果、低コストィ匕を実現することができる。 [0009] さらに、分散性高分子の凝集反応を使用して核酸を検出することにより、より簡便か つ高精度な核酸の検出が可能になり、その結果、測定結果のより高い再現性が保証 される。
図面の簡単な説明
[0010] [図 1]図 1は、核酸にリガンドを結合させる工程についての模式図である。
[図 2]図 2は、競合反応条件下で、核酸にリガンドを結合させる工程についての模式 図である。
[図 3]図 3は、複数種類の核酸に異なるリガンドを結合させる工程についての模式図 である。
[図 4]図 4は、リガンドで修飾された核酸の検出方法の一覧図である。
[図 5]図 5は、リガンドで修飾された核酸の検出工程についての模式図である。
[図 6]図 6は、本発明のリガンドのアミノ酸配列である。
[図 7]図 7は、本発明のプライマーの塩基配列である。
[図 8]図 8は、検出対象の核酸の塩基配列である。
[図 9]図 9は、本発明の核酸プローブの塩基配列である。
[図 10]図 10は、実施例のプライマーの塩基配列である。
[図 11]図 11は、実施例の核酸プローブの塩基配列である。
[図 12]図 12は、実施例の結果を示した棒グラフである。
[図 13]図 13は、変形例の結果を示した棒グラフである。
[図 14]図 14は、リガンドが結合された標的核酸の概念図である。
[図 15]図 15は、受容体が結合された分散性微粒子の概念図である。
[図 16]図 16は、微粒子の凝集を示す概念図である。
[図 17]図 17は、分光光度法によって測定する際の概念図である。
[図 18]図 18は、 PCR-SSP法を用いて核酸の変異を検出する原理を示す概念図であ る。
[図 19]図 19は、ライゲーシヨンを用いて核酸の変異を検出する原理を示す概念図で ある。
発明を実施するための最良の形態 [0011] 以下、本発明を詳細に説明する。前段では、本発明のリガンドと受容体との特異的 結合によって核酸を検出する方法について説明する。そして、後段では、本発明のリ ガンドと受容体との特異的結合によって核酸を検出する方法において、特に、分散 性粒子の凝集反応を利用して核酸を検出する方法について説明する。
[0012] I.本発明のリガンドと受容体との特異的結合によって核酸を検出する方法
以下、本発明を、検出対象の核酸をリガンド物質で修飾する工程と、リガンドで修飾 された核酸を検出する工程とに大別し、詳細に説明する。
[0013] 1.検出対象の核酸をリガンド物質で修飾する工程
(1)検出対象の核酸が 1種類の場合
検出対象の核酸とは、試料中に存在する特定の核酸分子を意味する。検出対象の 核酸としては、 cDNA、ゲノム DNA、合成 DNA、 mRNA、全 RNA、 hnRNA、合成 RNAな ど、全ての種類の DNA及び RNAが含まれる。本発明では、特に生体試料中に存在す る特定の核酸分子を検出する。
[0014] 検出対象の核酸力 1種類の場合において、第一のリガンドとは、固相担体に担持さ れた受容体と特異的に結合する物質を意味する。一方、第二のリガンドとは、標識物 質で修飾された受容体と特異的に結合する物質を意味する。
[0015] リガンド物質には、ハプテン、ピオチン、ジォキシゲン、フルォロセイン、アレクサ、糖 鎖、ペプチド、蛋白質、ポリヒスチジン、抗原 Z抗体物質、 HA、 GST、 Tap, Flagなど、 本発明で利用可能な全ての物質が含まれる。ピオチン、ジォキシゲン、フルォロセィ ン、アレクサ等は、巿場カもの入手が容易で低価格である。糖鎖やペプチドは、化学 構造のデザインに自由度が高ぐ複数種類のハプテンをそろえることが容易であり、 必要に応じて選択し得る。ハプテンは親水性有機化合物が好ましぐ糖鎖は 2種以上 の単糖からなるものが好ましぐペプチドはアミノ酸残基数力 ¾以上のものが好ましい 。免疫反応を利用して核酸の検出を行うために抗原 Z抗体物質を用いてもよい。リガ ンドと受容体との間の特異的結合を抗原抗体反応によって達成することができる。
[0016] 標識物質には、当業者に知られた任意の標識物質が含まれる。特に、蛍光、発光（ 化学発光、生物発光）のような光シグナルを発生し得る光マーカーが好ましい。
[0017] 検出対象の核酸に第一および第二のリガンドを結合させる方法には、リガンドで修 飾されたプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)を行う方法 (図 1(0)、リガンド で修飾された核酸プローブを用いて検出対象の核酸上でライゲーシヨン反応を行う 方法 (図 1G0)などがある。 PCR法を用いると、検出対象の核酸をリガンドで修飾すると ともにその数を増幅させることができる (図 1(0)。ライゲーシヨン反応を行う場合は、ライ ゲーシヨン反応を行う核酸の部分を予め PCR法によって増幅させておくのが好ましい
。これにより、核酸の他の領域にある類似配列への核酸プローブの結合を予め防ぐこ とができ、精度の高いライゲーシヨン反応を行うことができる。増幅された核酸領域で 前記ライゲーシヨン反応が行われ、その後に変性させることによってリガンドで修飾さ れた核酸を得ることができる (図 i(iO)。
また、図 2(0に示すように、競合反応を利用して PCR-SSP法によって核酸にリガンド を結合させることができる。すなわち、前記第一のリガンドで修飾されたプライマーと 類似するプライマーを予め作製する。このプライマーは、検出対象の核酸上で前記 第一のリガンドで修飾されたプライマーと同 Cf立置に結合することができる力 その伸 長側末端がミスマッチするため、ポリメラーゼによる伸長反応を行うことができない。こ のような擬似配列をもつプライマーを含む状態で PCR法を行うことによって、検出対 象の核酸へのリガンドの修飾を精度よく行うことができる。図 2(ii)には、同じく競合反 応を利用してライゲーシヨン反応によって核酸にリガンドを結合させることができる。第 一のリガンドで修飾された核酸プローブと類似する核酸プローブを予め作製する。こ の核酸プローブは、検出対象の核酸上で前記第一のリガンドで修飾された核酸プロ ーブと同じ位置に結合することができるが、その結合側末端力 スマッチするため、そ の後にライゲーシヨン反応を行うことができない。このような擬似配列をもつ核酸プロ ーブを含む状態でライゲーシヨン反応を行うことによって、ライゲーシヨン反応の精度 を高めることができる。ライゲーシヨンが完了した後、変性させることにより、第一およ び第二のリガンドで修飾された核酸を得ることができる。このとき、第一のリガンドで修 飾されたプライマーまたはプローブと擬似配列を有するプライマーまたはプローブに 第三のリガンドを修飾しておき、第一のリガンドおよび第二のリガンドで修飾された核 酸と第三のリガンドおよび第二のリガンドで修飾された核酸を同じ溶液中で同時に得 ることも可能である。その場合、第一のリガンドで修飾された核酸と第三のリガンドで 修飾された核酸をそれぞれ検出し、第一のリガンドと第三のリガンドの検出量の比率 を測定することで、検出対象の核酸の濃度やプローブの非特異反応の影響を受ける ことなく更に精度の高い測定が可能となる。
[0019] なお、第一のリガンドと第二のリガンドは、同一であっても異なるものであってもよい 。また、第一のリガンドと第二のリガンドは必ずしも 1分子力もなる必要はなぐ各々が 2 分子以上で構成されて 、てもよ 、。
[0020] (2)検出対象の核酸が複数種類の場合
複数種類の核酸をリガンドと受容体との反応を介して検出するためには、複数種類 の核酸をそれぞれ異なるリガンドの組合せで修飾しなければならな ヽ。このような核 酸とリガンドとの関連づけには様々な方法が想起されるが、本願発明では、特に 1種 類の一塩基多型 (すなわち、変異部分を含む核酸と、標準部分を含む核酸の 2種類） について着目し、この多型をリガンドと受容体との特異的結合を介して検出する方法 について説明する。
[0021] 先ず、 PCR-SSP法によって 2種類の核酸 (1種類の SNP)に異なるリガンドを結合させ る方法について説明する (図 3(0)。 PCR-SSP法（Polymerase Chain Reaction - Sequen ce Specific Primer method)は、 2種類のプライマーの片方の伸長側末端を検出対象 の核酸の SNP部位と重なるように設計し、 SNP部位とプライマーの伸長側末端とのマツ チングの有無によって増幅を制御する方法である。
[0022] 図 3(0に示すように、第一な 、し第三のリガンドで修飾された 3種類のプライマーを 用意する (以下、それぞれ第一ないし第三のプライマーという)。第一のプライマーは、 変異部分を含む塩基配列に対応する配列をもち、かつその伸長側末端がその変異 部分の塩基と対応する。一方、第二のプライマーは、標準部分を含む塩基配列に対 応する配列をもち、かつその伸長側末端がその標準部分の塩基と対応する。第三の プライマーは、前記第一および第二のプライマーとの関係で PCRを行うことができる 塩基配列をもつ。ここで、一塩基多型とは、遺伝子の塩基配列が 1箇所だけ異なる状 態およびその部位を指す。すなわち、その多型の前後の塩基配列は標準型および 変異型のいずれの核酸において同一であるから、第一のプライマーと第二のプライ マーの塩基配列は、その伸長側末端力 S1塩基異なるのみでその他の塩基配列は同 一である。このような 2つのプライマーを含む条件下でハイブリダィゼーシヨンを行うと 、前記第一および第二のプライマーは、互いに競い合って核酸に結合する（競合反 応)。しかし、図に示すように、競合反応条件下で、第一のリガンドで修飾されたブラ イマ一は、標準型の核酸上ではその伸長側末端力 Sミスマッチするため、ポリメラーゼ による伸長反応を行うことができない。一方、第二のリガンドで修飾されたプライマー は、変異型の核酸上ではその伸長側末端力 Sミスマッチするため、ポリメラーゼによる 伸長反応を行うことができな 、。このような競合反応条件下でノ、イブリダィゼーシヨン を行うことにより核酸とリガンドとの関連付けをより確実に行うことができる。
[0023] その後、 PCR法によって核酸を増幅し、リガンドで修飾された核酸を得る (図 3(0)。変 異部分を含む核酸は第一および第三のリガンドで修飾された核酸として、一方、標準 部分を含む核酸は第二および第三のリガンドで修飾された核酸として、それぞれ関 連付けが行われる。この関連付けは競合反応条件下で行って 、るために極めて精度 が高い。
[0024] 次に、ライゲーシヨン反応によって 2種類の核酸 (1種類の SNP)に異なるリガンドを結 合させる方法について説明する (図 3(ii))。上記 PCR-SSP法と同様、ライゲーシヨン反 応によっても核酸とリガンドとの関連づけが可能である。図 3(ii)に示すように、第一な いし第三のリガンドで修飾された 3種類の核酸プローブを用意する（以下、それぞれ 第一ないし第三の核酸プローブという）。第一の核酸プローブは、変異部分を含む核 酸配列に対応する塩基配列をもち、かつその結合側末端がその変異部分の塩基と 対応する。一方、第二の核酸プローブは、標準部分を含む核酸配列に対応する塩 基配列をもち、かつその結合側末端がその標準部分の塩基と対応する。第三の核酸 プローブは、前記第一および第二の核酸プローブとの関係でライゲーシヨン反応を 行うことができる塩基配列をもつ。上記したように、 1塩基多型の前後の塩基配列は標 準型および変異型のいずれも同じであるから、前記第一および第二の核酸プローブ の塩基配列は、その結合側末端だけが異なり、その他の配列は同じである。従って、 前記第一および第二の核酸プローブは、互いに競い合って核酸に結合する（競合反 応)。しかし、図に示すように、競合反応条件下で、第一の核酸プローブは、標準型 の核酸上ではその結合側末端力ミスマッチするため、その後に第三のリガンドで修飾 された核酸プローブとの間でライゲーシヨン反応を行うことができない。一方、第二の 核酸プローブは、変異型の核酸上ではその結合側末端がミスマッチするため、第三 の核酸プローブとの間でライゲーシヨン反応を行うことができない。その後、変異型の 核酸上で第一の核酸プローブと第三の核酸プローブとをライゲーシヨンさせ、標準型 の核酸上で第二の核酸プローブと第三の核酸プローブとをライゲーシヨンさせる。続 いて変性反応を経て、リガンドで修飾された核酸を得る (図 3(ii》。こうして、変異部分 を含む核酸は第一および第三のリガンドで修飾された核酸として、一方、標準部分を 含む核酸は第二および第三のリガンドで修飾された核酸として、それぞれ関連付け が行われる。
[0025] ライゲーシヨン反応では、サンプルを増幅させる工程がないので、より反応工程が簡 略化し、コスト低減と時間の短縮が可能である。ただし、感度が悪くなることと、プロ一 ブ設計が SNPサイトの前後し力選択できず、不自由である。サンプルによっては検出 対象の SNPサイトとは違う位置に同様の配列が存在する可能性もあり、この場合には 精度が悪くなる欠点がある。したがって、感度向上と精度向上のために検出対象の S NPサイトの周辺で PCR反応を行い、検出対象の SNPを含む核酸を増幅させることで 問題を解決することができる。
[0026] なお、図 1〜3では、最も単純なリガンドの構成を示した。プライマーおよび核酸プロ ーブは、 3〜60塩基数が好ましい。リガンドの数および種類はこれに限定されることな ぐ前記第一ないし第三のリガンドが、それぞれ 2分子以上で構成されていてもよい。 また、第一または第二のリガンドのいずれか一方が無い状態でも核酸を検出すること ができる。さらに、リガンドの数を減少させることによって反応系をより単純にすること ができる。
[0027] 次に、図 6〜9に示す具体的なリガンド物質、プライマー、核酸プローブ、および検 出対象の核酸を示しながら上記実施形態を例示する。
[0028] (i)PCR- SSP法
リガンド物質としてハプテン a〜c (ポリペプチド)を使用し (図 6)、それぞれノヽプテン a 〜cで修飾されたプライマー a〜cを用意する (図 7)。次に、図 8に示すサンプルに対し て PCR-SSP法で増幅反応を行った。このとき、サンプルの SNPサイト (図 8の #の位置） が塩基 A (アデニン）と塩基 G (グァニン）の 2タイプがァリルとして存在するとき、ァリル タイプは、 A/Aのホモ、 A/Gのへテロ、 G/Gのホモと 3タイプとなる。サンプルの SNPサ イトが A/Aのホモである場合、図 7のプライマー aが SNPサイトとマッチングし、プライマ 一 cとともに PCRによって増幅が行われる。プライマー bでは増幅が行われないので、 増幅産物は両 5'端にそれぞれノヽプテン aとハプテン cが修飾された 2本鎖 DNAとなる。 同様な考え方でサンプルの SNPサイトが G/Gであった場合、 PCR産物は両 5'端にそ れぞれノヽプテン bとハプテン cが修飾された 2本鎖 DNAとなる。さらにサンプルの SNP サイトが A/Gであった場合、ハプテン aとハプテン cが修飾された 2本鎖 DNAとハプテン bとハプテン cが修飾された 2本鎖 DNAが混合した増幅産物が得られる。
[0029] なお、上記方法にぉ 、て、プライマーを 3種類用意せず、例えばプライマー aとブラ イマ一 cのみで増幅を行っても良い。このときは別の容器でプライマー bとプライマー c のみで増幅を行った結果とあわせることで対応できる力 この方法は精度が悪 、。
[0030] 上述の実施の形態によって、核酸の SNPを検出する場合にその多型に対応したノヽ プテンで修飾された核酸に変換することが可能となる。
[0031] さらに、検出対象の核酸の SNPを複数検出することも可能となる。この場合、 SNPサ イトが異なるごとに異なるハプテンを修飾したプライマーを用意して、 PCR-SSP法によ り検出対象の核酸を増幅させればよい。
[0032] GOライゲーシヨン反応
リガンド物質としてハプテン a〜c (ポリペプチド)を使用し (図 6)、それぞれノヽプテン a 〜cで修飾された核酸プローブ a〜cを用意する (図 9)。次に、図 8に示すサンプルに 対してライゲーシヨン反応を行う。サンプルの SNPサイトが A/Aのホモである場合、図 4 のプローブ aが SNPサイトとマッチングし、プローブ cとともにライゲースによってライゲ ーシヨン反応が行われる。プローブ bではライゲーシヨン反応が行われない。反応後 にバッファーの pHをアルカリ性にするなどによって 2本鎖核酸を 1本鎖に変性反応す ると、反応物は 5'端と 3'端の両端にそれぞれノヽプテン aとハプテン cが修飾された 1本 鎖 DNAとなる。同様な考え方でサンプルの SNPサイトが G/Gであった場合、ライゲー シヨン産物は両端にそれぞれノヽプテン bとハプテン cが修飾された 1本鎖 DNAとなる。 さらにサンプルの SNPサイトが A/Gであった場合、ハプテン aとハプテン cが修飾された 1本鎖 DNAとハプテン bとハプテン cが修飾された 1本鎖 DNAが混合したライゲーシヨン 産物が得られる。なお、上記方法において、プローブを 3種類用意せず、例えばプロ ーブ aとプローブ cのみで増幅を行っても良!、。このときは別の容器でプローブ bとプロ ーブ cのみでライゲーシヨン反応を行った結果とあわせることで対応できる力 この方 法は精度が悪い。
[0033] 上述の実施の形態によって、核酸の SNPを検出する場合にその多型に対応したノヽ プテンで修飾された核酸に変換することが可能となる。
[0034] ここまで、 1種類の SNPを検出する方法について説明してきた力 本発明によって複 数種類の SNPを検出することもできる。複数種類の SNPに対しては、各 SNPごとにそれ ぞれ競合反応を設定するため、プライマー Zプローブは SNPの位置の種類に応じて 種類が多くなる。 2種類の SNPであれば、 6つのプライマー Zプローブになり、リガンド も第四、第五のリガンドが最低限必要になる。第三のリガンドについては第三のリガン ドに対応する第六のリガンドを用いることもできるが、第三のリガンドを各種 SNPの検 出に対し共通に用いることで反応後の BF分離を簡単且つ低コストにすることもできる 。ここで、各種 SNPの検出を別々の容器で実行してもよいし、同一の容器で同時に実 行してもよい。特に、同一の容器で 2種類以上の SNPの検出を行う場合は、第三のリ ガンドに対応する各 SNPごとに異なるリガンド (第六のリガンド、第九のリガンド' · を 用いることにより SNPの種類について任意の順番で BF分離等の工程を行うことができ る。また、同一の容器で 2種類以上の SNPの検出を共通の第三のリガンドを用いて行 うことにより、各種の測定を同時に且つ低コストで実行できるという利点がある。
[0035] 2.リガンドで修飾された核酸を検出する工程
(1)検出対象の核酸が 1種類の場合
図 4にリガンドで修飾された核酸の検出方法を示す。核酸の検出方法には様々な 態様があり、本発明は本発明を実施可能な全ての態様を含む。このうち、代表的態 様として蛍光色素で検出する方法が挙げられる。図 4(0に示すように、固相担体に第 一のリガンドと特異的に結合する受容体を予め担持させておく。また、第二のリガンド と特異的に結合する受容体を蛍光色素で予め修飾しておく。リガンドで修飾された核 酸を、第一のリガンドを介して固相担体に結合させる。次に、第二のリガンドに蛍光色 素で修飾された受容体を結合させる。その後、この蛍光色素を光学装置を用いて検 出することにより核酸を検出することができる。図 4G0に示すように、固相担体に第一 のリガンドを予め担持させておいてもよい。この場合、最初に、前記担持された第一 のリガンドに対し、これと特異的に結合する受容体を結合させる。次に、リガンドで修 飾された核酸のうち第一のリガンドを前記受容体に結合させる。リガンド物質を担持さ せた固相担体は、前記受容体を担持させた固相担体と比べて保存性に優れており、 検査方法の実用化に際して大きな貢献を果す。
[0036] また、図 4(iii)に示すように、酵素反応で検出することもできる。酵素は、例えばアル カリフォスファターゼ、ペルォキシダーゼなどを使用することができる。この場合、前記 第二のリガンドと特異的に結合する受容体を酵素で予め修飾しておき、この酵素に 基質を反応させることによって生じる化学発光を検出する。また、蛍光色素の場合と 同様、第一のリガンドを予め担持させた固相担体を使用してもよい (図 4(iv))。
[0037] 次に、図 4(i)〜Gv)のうち、図 4(iii)に示す態様の検出工程についてより詳細に説明 する (図 5)。図 5(0に示すように、先ず、固相担体に受容体を担持させる。代わりに受 容体を予め担持させた固相担体を用いてもよい。次に、リガンドで修飾された検出対 象の核酸を、受容体とリガンドとの特異的結合を介して前記固相担体に結合させる。 このとき、未結合の遊離の核酸を BF分離によって取り除く (図 5(i0)。その後、酵素で修 飾された抗体を第二のリガンドに結合させる。このとき、未結合の遊離の標識抗体を B F分離によって取り除く (図 5(iii))。最後に酵素-基質反応によって化学発光を生じさせ 、これを検出することによって検出対象の核酸を特定する (図 5(iv))。図 4(0、（ii)、およ び (iv)に示す核酸の検出方法についても同様の検出工程で行うことができる。
[0038] (2)検出対象の核酸が複数種類の場合
検出対象の核酸が複数種類の場合でも、検出工程は同じである。図 4および図 5で は説明の便宜上、第一および第二のリガンドで修飾された核酸を使用した。複数種 類の核酸を使用する場合、特に SNPを検出する場合は、第一および第三のリガンド で修飾された核酸、および Zまたは、第二および第三のリガンドで修飾された核酸を 検出する。例えば、上記 1塩基多型の例では、変異型の核酸は第一および第三のリ ガンドで修飾され、標準型の核酸は第二および第三のリガンドで修飾されている。従 つて、第一のリガンドと特異的に結合する受容体を担持させた固相担体と、第二のリ ガンドと特異的に結合する受容体を担持させた固相担体とを用意し、これによつて変 異型の核酸と標準型の核酸を検出することができる。
[0039] また、第三のリガンドと特異的に結合する受容体を担持させた固相担体を使用して 、前記変異型の核酸と標準型の核酸とを同時に検出することもできる。第三のリガン ドと特異的に結合する受容体を担持させた固相担体には、前記変異型の核酸と標準 型の核酸の両方が結合することができる。この核酸 固相担体では、変異型の核酸 は第一のリガンドが未結合の状態にあり、標準型の核酸は第二のリガンドが未結合の 状態にある。従って、第一のリガンドと特異的に結合する受容体と、第二のリガンドと 特異的に結合する受容体とをそれぞれ異なる標識物質で予め修飾しておき、この標 識物質を使用することによって変異型の核酸と標準型の核酸とを同時に検出すること ができる。
[0040] なお、第一または第二のリガンドのいずれか一方が無い状態でも核酸を検出すること ができる。リガンドの数を減少させることによって反応系をより単純にすることができる
[0041] 次に、本発明で使用される受容体と固相担体について説明する。
[0042] (0受容体
受容体とは、リガンド物質と特異的に結合する物質を意味する。例えば、リガンドと してピオチンを選択した場合、アビジンが受容体となり、リガンドとしてハプテンを選択 した場合、抗ハプテン抗体が受容体となる。抗ハプテン抗体について特に制限はな いが、ァフィユティー精製を行ったもの力、モノクローナル抗体であると、特異性が向 上して検出の精度が向上するのでより望ましい。また、リガンドおよび受容体がそれ ぞれ抗原または抗体であって、前記リガンドと受容体との特異的結合が抗原抗体反 応によって行われてもよい。免疫反応を用いて核酸を検出することにより、反応性が 高くかつ高精度の検出が可能になる。
[0043] (ii)固相担体
0基板状の支持体
固相担体とは、前記受容体を担持可能な任意の支持体を意味する。支持体の材 質、形状に特に制限はない。材質としてはガラス、シリコン、金属、金属酸化物、榭脂 、ゴム、セラミックスなどが考えられる。リンカ一剤と反応させるためには、支持体表面 に水酸基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基などの活性基があるとよりよい。ま た、金表面であればチオール基との配位結合が可能であるので活性基が無くても良 Vヽ場合もある。形状としては高感度に蛍光測定が可能な DNAマイクロアレイスキャナ 一を利用するならばスライドガラス形状 (約 25 X 75 X 1 mm)が良 、し、化学発光のプ レートリーダーを利用するならばマイクロプレート形状 (約 86 X 128mm)が良い。さらに 支持体は液透過性であっても液不透過性であってもかまわな!/ヽ。液透過性支持体は 多くの場合多孔質体であるので、表面積が大きぐ抗体固定ィ匕量が増えることや、液 の移動方向に自由度が高まるので反応を自動化しやすいなどの利点がある。しかし 、材質の選択の幅が狭まることや場合によっては検出装置の改良が必要になるなど 不利な面もあるので、場合に応じて選択することが必要となる。
[0044] ここで、例として一連の反応を示す。下記内容に限らず、上述の内容を満たせば本 発明に使用することが可能である。
[0045] 支持体として低蛍光シリカガラスを使用する。ガラスはアルコールでよく脱脂した後 、純水で洗浄する。次にエタノール中にアミノプロピルトリメトキシシラン (信越シリコー ン社製)を 3重量％になるように溶液を調整する。この溶液中にガラスを室温で浸漬し、 攪拌しながら 1時間反応させ、エタノールと純水で順に洗浄した後、 130°Cで 20分間 乾燥させる。
[0046] 次に EDC (PIERCE社製）を MESバッファーに 5重量％になるように溶解させ、この溶 液に処理済のガラスを室温で浸漬し、攪拌しながら 1時間反応させる。反応後、 MES ノ ッファーと純水で順に洗浄し、スピンドライ法により室温で乾燥させる。
[0047] 抗ノヽプテン抗体は、図 6のハプテン aとハプテン bに対応した抗ノヽプテン a抗体と抗ノヽ プテン b抗体をァフィユティー精製したものを MESバッファーに 5mg/mlの濃度に溶解 した溶液を調製し、この溶液をガラス上の別の位置に点着した。点着方法は触針式 の点着装置 SPBIO (日立ソフトウェア社製)を用いる。それぞれの溶液をガラス上の各 4箇所に点着した後、室温にて 1時間反応させ、その後 BSA (ゥシ血清アルブミン)を 0. 1重量 %の濃度で溶解させた PBSバッファーに室温で 1時間浸漬させる。浸漬後、 PBS ノ ッファーと 1/10濃度の PBSバッファーで順に洗浄した後、スピンドライ法で乾燥させ
、冷暗所に乾燥状態で保管する。
[0048] 上述のように支持体の作製が可能である。また、抗ノヽプテン抗体は 2種類ではなく 更に複数種類を固定ィ匕することもできるので、検出対象の核酸の種類をさらに増加さ せることも可會である。
[0049] ii)粒子状の支持体
本発明の他の態様では、固相担体として粒子状の支持体を使用し、これに前記受 容体を担持させることもできる。
[0050] 粒子状支持体としては、榭脂製が多く用いられる。天然ゴム、スチレンおよびスチレ ン共重合体、ポリウレタン、アクリル榭脂などが代表的な材料であるが、本発明に用い る粒子状支持体として特に材質の制限は無い。また、粒子状支持体に磁性を有する 物質を混入させることができる。粒子状支持体に磁性を持たせることで粒子状支持体 のハンドリングが容易になる。
[0051] 前記受容体を粒子状支持体に担持させる方法としては、物理吸着、化学吸着など があり、どちらでもかまわない。工程が単純であるために物理吸着も多く用いることが できるが、抗ハプテン抗体の活性を維持し、安定した反応を実現させるためには化学 吸着も良い。化学吸着は多くの場合リンカ一剤と呼ばれる化学物質を介して支持体 と抗体とを共有結合で強固に結合させる。リンカ一剤は支持体の材質や表面状態、 抗体の種類によって最適な種類を選択することができる。
[0052] また、リガンドとしてピオチン、その受容体としてアビジンまたはストレプトアビジンを 使用するような場合は、アビジンまたはストレプトアビジンを固定した磁性ビーズが巿 販されており、これを使用することもできる。
[0053] 前記受容体を担持させた固相担体を作製した後、前記リガンドで修飾された核酸 の少なくとも 1つのリガンドを介して前記固相担体に結合させることにより、核酸 固 相担体の複合体を得ることができる。
[0054] (3)実施の形態
(0基板状の支持体
以下、図 8に示す 1塩基多型を含む核酸を用いた核酸の検出工程について説明す る。使用するハプテン、プライマー、およびプローブは、上述の PCR-SSP法およびラ ィゲーシヨン反応と同様、それぞれ図 6、 7および 9に示す。
[0055] 前記ハプテンで修飾された核酸を MESバッファーに溶解し、これを支持体上に滴下 し、 37°Cで 2時間反応させた後、 MESバッファーで洗浄する。このとき、支持体上に滴 下した溶液中にハプテン aで修飾された核酸が存在すると、それに対応する抗ハプテ ン a抗体と結合し、同様にハプテン bで修飾された核酸が存在すると、それに対応する 抗ノヽプテン b抗体と結合する。その結果、検出する核酸の SNPサイトが A/Aの場合に はハプテン aに対応する抗ノ、プテン a抗体が固定された支持体上の位置には未結合 のハプテン cが存在することになる。ハプテン bに対応する抗ノヽプテン b抗体が固定さ れた支持体上の位置にはハプテン cは存在しない。同様に検出する核酸の SNPサイト が G/Gの場合にはハプテン bに対応する抗ノヽプテン b抗体が固定された支持体上の 位置には未結合のハプテン cが存在することになる。ハプテン aに対応する抗ノヽプテ ン a抗体が固定された支持体上の位置にはハプテン cは存在しな 、。さらに検出する 核酸の SNPサイトが A/Gの場合にはハプテン a、ハプテン bそれぞれに対応する抗ノヽ プテン a抗体と抗ノヽプテン b抗体が固定された支持体上の位置には未結合のハプテ ン cが存在することになる。
[0056] この反応後の支持体にハプテン cに対応する抗ノ、プテン c抗体に蛍光色素として CY 5を標識した抗体溶液を MESバッファーに 10 μ g/mlの濃度で溶解させた溶液を滴下 し、 37°Cで 2時間反応させる。その後、 MESバッファーと 1/10濃度の MESバッファーで 順に洗浄しスピンドライで乾燥させる。この反応により、ハプテン cが存在する支持体 上の位置にのみ CY5が存在することになる。
[0057] 支持体を GenePix4000B (AXON instruments社製）〖こセットし、励起波長 635nm、検 出波長域 650nm〜690nmでスキャンして測定する。スキャン画像にお 、て蛍光強度と 支持体上の位置情報をあわせて解析することで、検出対象の核酸の SNPを検出する ことが可能となる。
[0058] また、前記 CY5を標識した抗ノヽプテン c抗体の代わりに、酵素、例えばアルカリフォ スファターゼを標識した抗ノヽプテン c抗体を使用してもよい。この場合、上記と同様の 反応で支持体上のハプテン cとアルカリフォスファターゼ標識抗ノヽプテン c抗体との結 合を行い洗浄した後、基質 (例えば CDP- Star(Calbio. chem.社製))溶液を滴下し、 Lu minescencer (ATTO社製)でィ匕学発光量を測定し、支持体上の位置情報とあわせて 検出対象の核酸の SNPを検出することが可能となる。
[0059] また、支持体に抗ノヽプテン抗体を担持させる代わりに、ハプテン a、ハプテン bを担 持させてもよい。このとき、固定法としては、ハプテンの C末端のカルボキシル基を使 用すればリンカ一剤などの処理条件はまったく同一でよい。このようにして作製したノヽ プテン固定支持体は、固定ィ匕しているハプテン a、ハプテン bに対応する抗ノヽプテン a 抗体と抗ハプテン b抗体の混合溶液を滴下し、 37°Cで 2時間反応させ、同様な方法で 洗浄する。これにより、支持体上には、固定ィ匕したノヽプテン a、ハプテン bの位置に抗 ハプテン a抗体と抗ノヽプテン b抗体がそれぞれ存在することになり、その後は上記と同 様に検出することが可能となる。
[0060] (ii)粒子状の支持体
次に、磁性を帯びた粒子状支持体を用いた核酸の検出工程について説明する。
[0061] 磁性を帯びた粒子状支持体に抗ノ、プテン c抗体を担持させ、これを用いて核酸の 検出を行う。抗ノヽプテン c抗体を担持させた前記粒子状支持体をリン酸バッファー中 に分散させておき、これに前記 SNPに対応したノヽプテンで修飾された核酸を混合さ せ、前記核酸を前記粒子状支持体に結合させる。粒子状支持体は磁性を帯びてい るので、外部力も磁力をカ卩えることによって移動させることができ、粒子を溶液中の一 箇所に集めておくことができる。例えば、磁石を使用することによって前記粒子状支 持体を容器壁面に固定させる。前記粒子状支持体を容器壁面に固定した状態で溶 液を取り除き、新たなリン酸バッファーを加える。その後、磁石をはずして粒子状支持 体を前記新たなリン酸バッファー溶液中に拡散させる。この工程を数回繰り返すこと で、溶液中の未反応核酸や副生成物などを除去することができる (BF分離工程)。 BF 分離工程後、リン酸バッファ一中に粒子状支持体が均一に分散している溶液を 2つ に分注する。分注する数は測定対象核酸の数と使用するハプテンの数に応じて決ま る。検出対象の核酸は、ハプテン cを介して前記粒子状支持体に結合しているから、 A/Aの場合にはハプテン a、 G/Gの場合にはハプテン b、 A/Gの場合にはハプテン a およびノヽプテン bが未結合の状態にある。従って、標識ィ匕された抗ノヽプテン a抗体お よび抗ノヽプテン b抗体を使用することによって検出対象の核酸を検出することができ る。
[0062] 前記 2つに分注した粒子状支持体を含む溶液のそれぞれに酵素標識抗ハプテン a 抗体と酵素標識抗ハプテン b抗体を別々に投入し、反応させる。反応後、上述の BF 分離工程を再度繰り返し、未反応の酵素標識抗ハプテン抗体を除去する。このとき、 酵素としてはアルカリフォスファターゼ、ペルォキシターゼなどが好適に用いられるが 、これに限定されるものではない。
[0063] 最後に、酵素の基質となる化合物をそれぞれの容器に混合させ、一定時間反応さ せた後にその発光強度、吸光度変化などを測定することで、検出対象の核酸の SNP を同時に検出することが可能となる。
[0064] 酵素の代わりに、抗ノ、プテン a抗体および抗ノ、プテン b抗体に蛍光色素を標識して おくことで、蛍光強度により検出対象の核酸の SNPを同時に検出することが可能とな る。
[0065] また、抗ノ、プテン a抗体を担持させた支持体と抗ノ、プテン b抗体を担持させた支持 体を使用することによって、核酸を検出することができる。磁性を持つ粒子状支持体 へ固定する抗体を抗ノヽプテン a抗体および抗ノヽプテン b抗体とし、それぞれの抗体ご とに粒子状支持体を含む容器を別に用意しておく。ここに検査対象の核酸の SNP〖こ 対応したハプテンを修飾した核酸を 2つに分注してそれぞれ別容器で反応させる。 B F分離後に酵素標識抗ハプテン c抗体を投入し、反応させる。反応後、上述の BF分 離工程を再度繰り返し、最後に酵素の基質となる化合物をそれぞれの容器に混合さ せ、一定時間反応させた後にその発光強度、吸光度変化などを測定することで、検 出対象の核酸の SNPを検出することが可能となる。ここで、上述の理由により粒子状 支持体への抗体固定は測定対象核酸の数と使用するハプテンの数に応じて決まる。 さらに酵素の種類や蛍光色素への変形例も適用することができる。
[0066] なお、磁性を帯びて!/、な 、粒子状支持体を用いて BF分離工程を行うこともできる。
この場合、（0フィルターで粒子状支持体をトラップして行う、 GO静置、遠心分離などで 粒子状支持体を沈殿させて、上清を取り除いて行う、（m)大きな粒子径を持つ粒子 状支持体を使うと、ピペットで吸引できないので、そのまま溶液交換を行う、などの方 法がある。
[0067] 上記実施の形態は、全て核酸の SNPを測定するものであった力 本発明は核酸の 変異や発現量にも用意に適用できる。すなわち、前記プライマーやプローブをそれ ぞれ変異や発現量を検出した 、配列に設定することで、後の処理はまったく同じでよ い。
[0068] [実施例]
図 8に示す一塩基多型を含む核酸をライゲーシヨン反応によって検出した。ライゲ ーシヨン反応を行う前に、擬似配列を除きかつ検出感度を高めるために、前記一塩 基多型の前後の塩基配列を PCRによって増幅した。支持体には磁性を帯びた粒子 を使用し、酵素基質反応によって核酸を検出した。
[0069] 1.試薬調製、準備
以下の試薬を用意する。
[0070] ·サンプル：図 8に示す配列を有するヒトゲノム DNAの組み合わせ
組み合わせ i： Aァリル (図 8の #の位置の塩基が A)と Aァリルの組み合わせ (A/A
)
組み合わせう： Aァリルと Gァリルの組み合わせ (A/G)
組み合わせ iii： Gァリルと Gァリルの組み合わせ（G/G)
•PCRプライマー：図 10に示す配列を有する PCRプライマー
•PCR試薬： Invitrogen社製「Accuprime Super Mix II」カタログ No.12341—012 •プローブ：図 11に示すプローブの糸且み合わせ。
[0071] 組み合わせ I：図 9に示す配列を有するプローブのうち、プローブ aの 5'端にジゴ キシゲニン（Dig)を修飾し、且つプローブ bの 5'端は未修飾、且つプローブ cの 3'端に ピオチンを修飾し、 5'端カ^ン酸ィ匕したプローブ
組み合わ II：図 9に示す配列を有するプローブのうち、プローブ aの 5'端は未修飾 、且つプローブ bの 5'端にジゴキシゲニン（Dig)を修飾し、且つプローブ cの 3'端にビ ォチンを修飾し、 5'端がリン酸化したプローブ
•ライゲース： BioLabs社製「Taq DNA Ligase」カタログ No.M0208S
'磁性化粒子状支持体： DYNAL社製「Dynabeads M-280 streptavidin」カタログ No.l 12.06
•酵素標識抗体： DAKO社製「Anti- Digoxigenin ( rabbit polyclonal antibody with A LP)カタログ No.D5105
•発光基質： Wako社製「CDP- Star substrate]カタログ No.69086
2.反応
サンプルの組み合わせ 3種類ごとに上記試薬を用いて以下の手順で反応を行う。
[0072] · 5ng/ μ 1に調整したサンプル 1 μ 1
•PCR試薬 10 ^ 1
• 1 μ Μに調整したプライマー 各 1 1 (計 2 1)
，純水 7 μ ΐ
合計 20 1
上記内容で PCR溶液を調整し、サーマルサイクラ一で下記反応を行う。
[0073] (1) 94°C、 2分間
(2) 94°C、 30秒間
(3) 68°C、 6分間
(4)上記 (2)、（3)を 40回繰り返す
PCR後、 PCR産物量を吸光度測定し、 4η§/ /ζ 1に希釈する。
[0074] 希釈したサンプルを 2つに分注し、
• 4ng/ μ 1に調整した上記サンプル 1 μ 1
•Taq Ligaseバッファー（キット付属） 3 μ 1
• 40U/ μ 1の Taq Ligase 0.5 ^ 1
• 10nMに調整したプローブ組み合わせほたは II 各 1 μ 1 (計 3 μ 1)
，純水 22.5
合計 30 1
とそれぞれに調整し、インキュベーターで下記反応を行う。
[0075] (1) 95°C、 5分間
(2) 58°C、 15分間
反応後、磁性化粒子状支持体 5 μ 1を加え、室温で 5分反応させる。 [0076] 反応後、リン酸バッファーで 2回 BF分離反応を行う。
[0077] それぞれに 100倍に希釈した酵素標識抗体を 20 μ 1加え、室温で 60分反応させる。
[0078] リン酸バッファーでそれぞれ 3回 BF分離反応を行う。
[0079] それぞれに基質 100 μ 1を加え、室温で 1分間反応させる。
[0080] 測定用 96 wellブラックプレートに移し変え、発光量測定器（ATTO社製 Luminescen cer-JNRII)中で 10秒間積算測定を行う。
[0081] 3.測定結果
上記反応をそれぞれのサンプルに対して 9回繰り返した結果を図 12に示す。図 12は それぞれのサンプルとプローブの組み合わせにおいて発光量の平均値を示したダラ フであり、サンプルの SNPに対応した結果が発光量となって得られて!/、ることが分かる 。特にサンプルの A/Aと A/Gと G/Gの組み合わせが明確に区別できており、従来の 方法では難 ヽかった A/Aと A/G、 G/Gと A/Gの区別を 1回の反応で区別できる点で 非常に有用である。
[0082] [変形例]
以下、変形例を示す。本変形例は PCR法による核酸増幅ではなぐ LAMP (Loop
Mediated Amplification)法で核酸を増幅して一塩基多型を含む核酸を検出した。
[0083] LAMP法の反応および測定として、以下の試薬を用いて反応を行う。
[0084] 100 L中
20mM Tris-HCl pH 8.8
10mM KC1
lOmM (NH ) SO
4 2 4
4mM MgSO
4
1Mベタイン
0.4mM dNTP
8U Bst DNA polymerase
以下の配列を有するプライマーを反応液中に入れ、反応溶液を作成した。インナー プライマー FA(G)およびインナープライマー RA(G)は検体のァリル Gを検出するため のプライマーでプライマー 5'端にピオチン (biotin)を標識させた。また、インナーブラ イマ一 FA(A)およびインナープライマー RA(A)はァリル Aを検出するためのプライマ 一でプライマー 5'端にジゴギジゲニン (Dig)を標識させた。
[0085] プライマー：
1600nMインナープライマー FA(G)
biotin - CTCCCCTCAGA ACATAACATA GTAATGCGGT AAGTCGCATA AAAA CCATTC
1600nMインナープライマー FA(A)
Dig - TTCCCCTCAGA ACATAACATA GTAATGCGGT AAGTCGCATA AAAAC CATTC
1600nMインナープライマー RA(G) AT
1600nMインナープライマー RA(A)
400nMアウタープライマー F3
GCTTATCTTTCCCTTTATTTTTGC
400nMアウタープライマー R3
GCTGATCGGCAAGGTGTTCT
反応液調製中に反応が進まな 、ように調製は氷上で行った。
[0086] 増幅の目的ポリヌクレオチド (铸型核酸）は、熱変性をしない 1 X 172塩基の λ DN
Α (配列番号 1)を用いた。
[0087] <配列番号 1 >
Figure imgf000023_0001
CACCTTGCCGATCAGC
配列番号 1にお 、て塩基配列の第 92番目の #の配列は一塩基多型を示し Gまたは Aである。標的領域、 Flc、 F2c、 F3c、 Rl、 R2、 R3に対応する領域は以下の通りで ある。
[0088] 標的領域 (一塩基多型領域）：配列番号 1に示す塩基配列の第 92番目の Gまたは A のみ
Flc：配列番号 1に示す塩基配列の第 68〜91番目（24bp)
F2c：配列番号 1に示す塩基配列の第 25〜50番目（26bp)
F3c :配列番号 1に示す塩基配列の第 1〜24番目（24bp)
R1：配列番号 1に示す塩基配列の第 93〜115番目（23bp)
R2 :配列番号 1に示す塩基配列の第 129〜152番目（24bp)
R3 :配列番号 1に示す塩基配列の第 153〜172番目（20bp)
また、ネガティブコントロールとして、铸型核酸を入れないサンプルを用意した。
[0089] サンプルは配列番号 1に示す塩基配列の第 92番目が Gの配列を含む検体を 2検 体 (検体番号 1〜2、ァリル組み合わせ G/G)、配列番号 1に示す塩基配列の第 92番 目が Aの配列を含む検体を 2検体 (検体番号 3〜4、ァリル組み合わせ A/A)、配列番 号 1に示す塩基配列の第 92番目が Gと Aの配列を含む検体を混合させた検体を 2検 体 (検体番号 5〜6、ァリル組み合わせ A/G)、ネガティブコントロールとなる铸型の入 つてな!/、検体が 2検体 (検体番号 7〜8)の合計 8検体を用意した。
[0090] サンプルチューブ内の反応溶液に検体番号 1〜8の铸型核酸を添加し、 65°Cに設 定したヒートブロックに乗せ、各チューブがちょうど 45分後になるようにヒートブロックか ら順次取り上げるように反応させた。
[0091] 検出を行うために、以下の検出試薬を用意、調製した。
[0092] ·抗体固定化磁性粒子
抗ビォチン抗体標識磁性粒子（DYNAL社製「Dynabeads M-450 Epoxy」に DAKO 社製「Monoclonal Mouse Anti— Biotin Code No. M 0743」を標識）
抗ジゴキシゲニン抗体標識磁性粒子（DYNAL社製「Dynabeads M-450 EpoxyJにじ
OVALAB R&D社製 Anti Digoxigenin Unlabeled]を標識）
•酵素標識抗体
アルカリフォスファターゼ標識抗ビォチン抗体（DAKO社製「Polyclonal Rabbit Anti- Biotin D5107J ) アルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体（DAKO社製「Polyclonal Rabbi t Anti-DIG/AP Rabbit F(ab') Code No. D 5105」）
LAMP反応後、 LAMP産物量を 2つに分注し、以下の反応を行った。
[0093] ·分注したそれぞれに抗ビォチン抗体標識磁性粒子と抗ジゴキシゲニン抗体標識磁 性粒子を 5 Lを加え、室温でそれぞれ 5分反応させる。
[0094] '反応後、リン酸バッファーで 2回 BF分離反応を行う。
[0095] 'それぞれの分注溶液に対応した 100倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗 ピオチン抗体とアルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体をそれぞれ 20 L加え、室温で 60分反応させる。
[0096] 'リン酸バッファーでそれぞれ 3回 BF分離反応を行う。
[0097] ·それぞれに基質 100 μ Lを加え、室温で 1分間反応させる。このとき、発光基質は Wa ko社製 rCDP-Star substrate]カタログ No.69086を使用した。
[0098] ·測定用 96 wellブラックプレートに移し変え、発光量測定器（ATTO社製 Luminescen cer-JNRII)中で 10秒間積算測定を行う。
[0099] 測定結果
上記反応の結果を表 1および図 13に示す。表 1はそれぞれのサンプルと検出試薬 の組み合わせにおいて発光量（単位: cps)を示した表であり、図 13はこれをグラフで 表わして 、る。サンプルの SNPに対応した結果が発光量となって得られて!/、ることが 分かる。特にサンプルの A/Aと A/Gと G/Gの組み合わせが明確に区別できており、 P CR法以外の増幅法にお!、ても従来の方法では難し!/、かった A/Aと A/G、 G/Gと A/G の区別を 1回の反応で区別できる点で非常に有用である。
[0100] 本変形例にお 、て使用したリガンドには制限はなく、特異的に反応する受容体が 用意できるものであれば変更してもかまわない。また、インナープライマー FA(G)およ びインナープライマー RA(G)と、インナープライマー FA(A)およびインナープライマー RA(A)の両方にリガンドをつけなくても検出可能であり、例えばインナープライマー F A(G)のみのプライマー 5'端にピオチン (biotin)を標識させ、インナープライマー FA(A )のみのプライマー 5'端にジゴギジゲニン (Dig)を標識させても良!、。
[表 1] 表 1
Figure imgf000026_0001
[0101] II.本発明のリガンドと受容体との特異的結合によって核酸を検出する方法におい て、特に、分散性粒子の凝集反応を利用して核酸を検出する方法
本発明は、上述したような核酸の検出方法において、分散性粒子の凝集反応を利 用することによって、より簡便かつ高精度な、高い再現性のある核酸の検出方法を提 供する。
[0102] 上述した本発明の核酸の検出方法では、検出対象の核酸が固定基板上に捕捉さ れ、この捕捉された核酸を、酵素基質反応等によって検出した。
[0103] これに対し、分散性粒子の凝集反応を利用して核酸を検出する方法では、固定基 板を使用せず、代わりに分散性粒子を使用する。分散性粒子の表面には複数の受 容体が配置されており、検出対象の核酸はこの受容体を介して分散性粒子に結合 する。分散性粒子は、検出対象の核酸を介して次々に連結され、大きな凝集塊が生 まれる。これを分光光度計によって測定する。当該方法では、受容体を酵素で予め 修飾する必要性や、酵素に基質を添加する必要性がなぐ分散性粒子の凝集という 物理的現象によって確実かつ迅速に核酸を検出することができる。以下、当該方法 について詳細に説明する。
[0104] 本発明は、検出されるべき標的核酸と分散性微粒子との架橋反応によって生じる 凝集に基づいて、前記標的核酸を検出する方法であって、種類の異なる第一および 第二のリガンドが結合した標的核酸と、前記第一のリガンドと特異的に結合する受容 体が複数結合した第一の微粒子と、前記第二のリガンドと特異的に結合する受容体 が複数結合した第二の微粒子とを反応させる工程と、一つの前記標的核酸が前記第 一および第二の微粒子と結合することによって、前記第一および第二の微粒子が連 結し、かつ、一つの微粒子に複数の標的核酸が結合し、前記標的核酸のそれぞれ が他の微粒子と結合することによって、多数の微粒子が互いに連結されて生じる凝 集を、分光光度法によって測定する工程とを具備する核酸の検出方法を提供する。
[0105] また、本発明は、前記種類の異なる第一および第二のリガンドがそれぞれ一以上 結合した濃度が既知の標的核酸を、前記第一および第二の微粒子と反応させて、分 光光度法によって測定する工程と、前記工程を、異なる濃度の標的核酸について同 様に行い、測定結果から検量線を作成する工程と、前記検出されるべき標的核酸を 、前記第一および第二の微粒子と反応させて、分光光度法によって測定する工程と 、前記検量線に基づいて前記検出されるべき標的核酸の濃度を決定する工程とを具 備する核酸の定量が可能な方法を提供する。
[0106] 本発明に拠れば、核酸にリガンドを結合し、受容体を結合した分散性微粒子と反応 させ、前記微粒子の凝集に基づいて核酸を検出することが可能であり、簡便かつ正 確な核酸の検出が可能である。
[0107] 本発明の核酸検出方法は、分散性微粒子を用い、該微粒子の凝集を測定すること によって核酸の検出を行う方法である。以下、本発明の方法を順に説明する。
[0108] まず、検出されるべき標的核酸にリガンドを結合する。ここで、標的核酸は、生体試 料に含まれる核酸や、任意の検体に含まれる核酸であってよいが、これらに限定され ない。また、核酸とは、 cDNA、ゲノム DNA、合成 DNA、 mRNA、全 RNA、 hnRNA、合成 RNAを含む全ての核酸または核酸類似体であり、天然に存在するものであっても、人 ェ的に合成されたものであってもよい。
[0109] 標的核酸に結合されるリガンドは、例えば、親水性有機化合物、ジォキシゲン、フ ルォロセイン、アレクサ、残基数が 6以上のポリペプチド、糖が 2つ以上の糖鎖、ピオ チン、タンパク質、ポリヒスチジン、 HA、 GST、 Flag (DYKDDDDKのペプチド）等を 用いることができる力 これらに限定されない。ピオチン、ジォキシゲン、フルォロセィ ン、アレクサなどは巿場カもの入手が容易で低価格という特徴をもっている。また、糖 鎖やペプチドは化学構造のデザインに自由度が高ぐ複数種類をそろえることが容 易である。検出対象の標的核酸、試料等によって、使用するリガンドを適宜選択して よい。
[0110] 標的核酸には、種類の異なる第一のリガンド及び第二のリガンドがそれぞれ一以上 結合される。標的核酸にリガンドを結合する方法は、（i)光、プラチナまたはリンカ一 を用いて核酸内部および末端部の塩基に共有結合させる手法（図 14a)、例えば、核 酸の 5'末端のァミノ基と、リガンドのカルボキシル基を共有結合させる方法、（ii)核酸 合成時にリガンドを結合させたプライマーを用いてポリメラーゼにより伸長させる方法 (図 14b)、（iii)核酸合成時にリガンドを結合させたヌクレオチドを取り込ませて伸長さ せる方法（図 14c)、（iv)ターミナルデォキシジルトランスフェラーゼを用いてリガンド を結合させたヌクレオチドを核酸の 3'末端にテーリングする手法（図 14d)、等の各種 方法を用いることができる。
[0111] 生体試料または任意の検体等のように、標的核酸が他の核酸と共に存在する試料 では、 (ii) (iii)の手法を用いることができる。検出されるべき標的核酸が単独で存在 する場合には、何れの手法を用いてもよい。なお、例えば生体試料等に含まれる標 的核酸は、 PCR法によって増幅させて力 検出しても良いが、増幅させずにそのまま 検出に供してもよい。
[0112] 標的核酸に結合されるリガンドには、図 14に示したように二種類のリガンドを用いる 。核酸の構造は柔軟であり、本方法においては、後述するように、核酸が二つの微粒 子を連結することが必須であるため、二種類のリガンドを用いることが望ましい。
[0113] また、標的核酸に結合される二種類のリガンドは、それぞれ一つずつでも良いが、 二つ以上結合されてもよい。「核酸」対「粒子」の体積比は極めて大きいため、一つの 核酸に三つ以上の粒子が結合する可能性は低い。従って、一本の核酸に、複数のリ ガンドが結合していても、微粒子の凝集度には影響を与えないものと考えられる。
[0114] 次に、分散性微粒子に、標的核酸に結合したリガンドと特異的に結合する受容体を 結合する。本発明に用いる分散性微粒子とは、例えばコロイド粒子のように溶液中で 分散する粒子を意味し、ラテックス粒子が好適に用いられるが、これに限定されない 。分散性微粒子としては、粒径が約 80〜300nm程度の微粒子であることが、免疫比 濁法装置で比濁を測定するには好適である。
[0115] ラテックス粒子は主にポリスチレン力 成り、親水性と分散性とを高めるためメタタリ ル酸が共重合されている。ラテックス粒子には、表面に官能基がないプレーンタイプ と官能基を有する官能基タイプがある。プレーンタイプの表面の荷電はメタクリル酸の 存在のために負の電荷を有しており、タンパク質の正の電荷をもつ領域とイオン結合 することができる。また、疎水結合させることも可能である。プレーンタイプのラテックス 粒子はタンパク質と混合するだけで、タンパク質が吸着するので、タンパク質の固定 操作が容易である。
[0116] 官能基を有するラテックス粒子は、表面にカルボキル基ゃァミノ基等が露出するよう に設計されており、様々なタイプの官能基タイプラテックス粒子が利用可能である。ラ テックス粒子に受容体を結合させる方法は、水溶性カルポジイミドでカルボン酸とアミ ノ基を結合させる EDAC方法、 EDCと NHSとをあらかじめ混合してカルボン酸とアミノ 基とを結合させる方法、双極性を有するリンカ一を用いてアミノ基同士を架橋する方 法、活性ィ匕したアルデヒド基やトシル基でタンパク質を結合する方法等がある。本発 明においては既存のいかなる方法を用いてもよいが、特に EDAC法が望ましい。なお 、ラテックス粒子以外の微粒子であっても、周知の方法によって受容体を結合するこ とがでさる。
[0117] 分散性微粒子に結合される受容体は、検出する標的核酸に結合されたリガンドと 特異的に結合する受容体を用いる。受容体としては、例えば、抗体、レクチン、ストレ プトアビジン、 Ni等を用いることができる力 これらに限定されない。タンパク質、特に 抗体が好適に用いられる。受容体を微粒子に結合させる方法は、微粒子によって適 した周知の方法を用いればよ！、。
[0118] 一つの態様において、一つの分散性微粒子には、単一種類の受容体を結合させる 。本態様によれば、標的核酸には少なくとも二種類のリガンドが結合されているため、 一種類の標的核酸に対して少なくとも二種類の分散性微粒子を準備する。即ち、第 一のリガンドに対応する受容体が結合された第一の分散性微粒子（図 15a)と、第二 のリガンドに対応する受容体が結合された第二の分散性微粒子（図 15b)とを準備す る。
[0119] 他の態様においては、一つの分散性微粒子に二種類以上の受容体を結合させて もよい。本態様では、一つの標的核酸に結合された二種類のリガンドのうち、一つの リガンドに対応する受容体と、もう一つのリガンドに対応する受容体以外の受容体を 結合させる。即ち、標的核酸の二種のリガンドの双方が微粒子に結合しないように設 計する。
[0120] なお、本工程による分散性微粒子への受容体の結合は、核酸を検出する際に実施 してもよいが、予め受容体を結合させた分散性微粒子を検出に使用してもよい。また 、本工程は、上記の標的核酸を調製する工程と前後して実施してよい。
[0121] 次に、標的核酸と微粒子を結合させる工程を説明する。上記したようなリガンドが結 合された標的核酸と、受容体が結合された第一および第二の分散性微粒子を反応さ せて結合させる。この反応は、標的核酸が含まれる溶液と分散性微粒子が含まれる 二つの溶液を同時に混合して行ってもよぐ或いは、各分散性微粒子を順に混合し て、逐次的に行ってもよい。
[0122] 図 16に、標的核酸と微粒子が結合した模式図を示す。図 16において、標的核酸 3 0に結合した第一のリガンド 31は、第一の微粒子 33と結合する。また、標的核酸 30 に結合した第二のリガンド 32は、第二の微粒子 34と結合する。即ち、一つの標的核 酸が第一の微粒子と第二の微粒子に結合することによって、第一および第二の微粒 子が連結される。さらに、一つの微粒子に複数の標的核酸が結合し、その標的核酸 のそれぞれが他の微粒子と結合することによって、多数の微粒子が互いに連結され た結果、微粒子の凝集が生じることになる。なお、図 16において受容体力も延ばされ た点線は、核酸を簡易的に表したものである。
[0123] これにより、標的核酸が試料中に存在している場合、微粒子の凝集が生じ、これに よって標的核酸を検出することができる。ここで、微粒子の凝集の有無は、上述した 光マーカーでラベリングすることにより光シグナルの分散状態を検出してもよいが、好 ましくは光マーカーを用いずに分光光度法で吸光度を測定することによって判定す る。
[0124] 図 17に模式図を示したように、単独の微粒子は近赤外光を殆ど散乱しない（図 17a )。一方、凝集した微粒子は、単独の微粒子に比べて見かけ上の径が大きぐ近赤外 光の散乱を生じさせることができる（図 17b)。従って、近赤外領域の入射光に対する 透過光の光度を光度計で測定することにより、微粒子の凝集度を測定することができ る。このとき、粒径 300nm以下の微粒子は、凝集すると近赤外光を散乱させるため、 粒径が 300nm以下の微粒子を用いることが好まし 、。
[0125] 微粒子を含む溶液は、混合後 (凝集前)の最終濃度が、 OD値で 0.01〜1の範囲で あり、さらに、凝集後の OD値が 3以下であるように調製されることが好ましい。標的核 酸を含む溶液と、微粒子を含む溶液を混合する際、リガンドと受容体との結合の偏在 を避けるため、一方の容量が他方の容量の 20%を下回らないようにすることが望まし ぐまた、混合ラテックスミキサーゃピペッティングですばやく攪拌することが好ましい 。反応系に用いるバッファ一は、凝集を促進する溶液を使用することが好ましい。異 なるバッファーを用いる場合は、当該異なるバッファーで微粒子を 2〜3回洗浄して用 、ることが好まし!/、。
[0126] リガンドー受容体に抗原抗体を用いる場合は、 0°C以上 37°C以下の温度で、 5分〜 30分で反応させることが好ましい。その他のリガンドー受容体は、反応に適した温度、 時間、バッファーを用いればよぐこれらは適宜選択可能である。
[0127] なお、混合後の反応溶液を分光光度測定に供する際、凝集して!/ヽな ヽ微粒子は近 赤外光を散乱しないため、 BZF分離する必要がなぐ反応系を直接測定に供するこ とができる。また、標的核酸を PCRによって調製したとき、リガンドが結合した未反応 のプライマーや、未反応のヌクレオチド等によって測定誤差を生じるおそれがある場 合、これらを分離してもよい。分離する方法は、例えば一方のリガンドにピオチンを結 合し、アビジン又はストレプトアビジンを結合した磁性粒子を用いて BZF分離する。 このとき、該磁性粒子は、分散性微粒子として用いてよい。
[0128] [核酸の定量を行う方法]
次に、本発明の方法を用いて核酸の定量を行う方法を説明する。定量を行う際に は、上記したようなリガンドを結合した標的核酸を用い、該標的核酸を各種濃度で含 む溶液を調製する。各濃度の核酸溶液を、上述した方法に従って微粒子と反応させ て分光光度法により吸光度を測定する。該測定結果に基づいて、核酸濃度と吸光度 による検量線を作成する。この検量線に基づいて、検出対象の標的核酸の吸光度を 測定した結果力 核酸濃度を決定する。これによつて、標的核酸の定量を行うことが できる。 [0129] また、複数種類の標的核酸が含まれる試料において、標的核酸の種類毎に異なる 二種のリガンドを結合させ、検出すべき標的核酸に結合されたリガンドと特異的に結 合する受容体を結合された分散性微粒子のみを反応に供することによって、複数種 類の標的核酸を含む試料から、所望の標的核酸を同時に検出することができる。
[0130] ここで、核酸に結合するリガンドは、全て異なるリガンドをもちいてよい。或いは、二 種類のリガンドのうち、一方のリガンドは、他の核酸と共通のリガンドを用いてもよい。
[0131] なお、上述した検出方法では、一つの標的核酸について二種類のリガンドを用い たが、 3種類以上のリガンドを用いてもよぐ各種類のリガンドに特異的に結合する受 容体が結合された分散性微粒子を用いてもよ!ヽ。
[0132] [核酸の塩基配列における変異を検出する方法]
次に、本発明に従って核酸の塩基配列における変異を検出する方法を説明する。 核酸の変異としては、一塩基多型（SNP)、欠失、挿入等が挙げられる。ここで、 SNP
(Single Nucleotide Polymorphisms)とは、ゲノム DNA上に散見され、個体によって異 なる一塩基の多様性をいう。
[0133] 本発明の第一の態様として、 PCR-SSP法を用いた核酸変異検出方法が提供される
。 PCR-SSP法は、 DNAポリメラーゼを用いて PCRを行う方法である力 この DNAポリメ ラーゼは、プライマーの 3，末端が铸型 DNAと完全にハイブリダィズして 、な 、と殆ど 作用しない。
[0134] 従って、標準型の標的核酸配列と相補的な配列を有するプライマーを用い、 PCR によって増幅産物が生じた場合は変異がなぐ反対に、増幅産物が生じない場合は 変異があることが判明する。
[0135] この方法で用いる一つのプライマーは、標的核酸配列に相補的な配列を有し、そ の 3'末端が前記標的核酸配列における変異部位に対応する、第一のリガンドが結 合された検出用プライマーである。もう一方のプライマーは、前記標的核酸の該変異 部位より 5'末端側の配列に相補的な配列を有する、前記第一のリガンドとは異なる 第二のリガンドが結合された共通プライマーである。
[0136] 図 18に本態様の概念図を示した。図 18 (a)は、変異のない標的核酸 50、即ち標 準型の標的核酸 50であり、変異が存在し得る部位を黒丸 52で表している。図 18 (a) では、検出用プライマー 54が完全にハイブリダィズし、共通プライマー 56との間で P CRによる増幅産物を得ることができる。一方、図 18 (b)は変異型の標的核酸 50であ る。この場合、検出用プライマー 54はその 3'末端がハイブリダィズせず、 PCRによる 増幅が生じない。
[0137] 以下、本態様における工程を順に説明する。まず、（i)前記標的核酸、及び、前記 二種類のプライマー 54、 56によって PCRを行う。この PCRでは、上述したように、検 出用プライマー 54が標的核酸と完全にノ、イブリダィズした場合にのみ増幅産物が得 られる。なお、共通プライマー 56は、標的核酸の変異の有無に関係なくハイブリダィ ズする。
[0138] 次に、（ii)前記工程で得られた PCR産物、前記第一のリガンドと特異的に結合する 受容体が複数結合した第一の分散性微粒子、及び前記第二のリガンドと特異的に結 合する受容体が複数結合した第二の分散性微粒子を反応させる。
[0139] さらに、（iii)一つの前記 PCR産物が前記第一の分散性微粒子及び第二の分散性 微粒子と結合することによって、該第一及び第二の分散性微粒子が連結し、且つ、 一つの分散性微粒子に複数の PCR産物が結合し、該 PCR産物のそれぞれが他の 分散性微粒子と結合することによって、多数の分散性微粒子が互いに連結されて生 じる凝集を、分光光度法によって測定する。
[0140] これらの工程 (ii)及び (m)は、上記で詳細に説明した分散性微粒子を用いた検出 方法についての記載の通りに実施される。次いで、（iv)該測定結果から、前記 PCR による核酸の増幅を判定する。微粒子の凝集が生じた場合、増幅産物が得られたこ とが分かる。従って、凝集が生じた場合には、標的核酸における変異が存在しないこ とが分かる。
[0141] 以上に述べた本態様に拠れば、核酸配列における一塩基多型（SNP)、欠失、又 は挿入等の変異が簡便且つ迅速に検出可能である。
[0142] さらに、標的核酸配列における変異が一塩基多型である場合、本態様の他の実施 形態として、標準型と変異型の双方の標的核酸のための検出用プライマーを用いて もよい。即ち、検出用プライマーとして、標準型用リガンドが結合され、標準型の標的 核酸に相補的な配列を有する第一のプライマー、並びに、変異型用リガンドが結合さ れ、変異型の標的核酸に相補的な配列を有する第二のプライマーを用いる。これら の二種類の検出用プライマーは、別個に PCRに供してもよいが、同一の反応系で同 時に PCRを行ってもよい。
[0143] 本実施形態においては、第一の分散性微粒子として、それぞれのプライマーに結 合されたリガンドに対応した微粒子を使用する。即ち、標準型用リガンドと特異的に 結合する受容体が複数結合された標準型用分散性微粒子、及び、変異型用リガンド と特異的に結合する受容体が複数結合された変異型用分散性微粒子を用いる。
[0144] これに伴 、、本実施形態では、前記第一の態様の工程 (iii)における凝集反応を、 標準型用微粒子と変異型微粒子のそれぞれにつ 、て別個に行う。 PCR反応液中に は、標準型用プライマーによる PCR産物と、変異型用プライマーによる PCR産物の 何れか一方、又は両方が存在している。従って、この反応液中に、標準型用微粒子 と第二の分散性微粒子との組み合わせを混合して、凝集反応を行う。この反応で凝 集が生じた場合、標的核酸は標準型であることが分かる。これとは別に、変異型用微 粒子と第二の分散性微粒子との組み合わせを用いて凝集反応を行う。この反応で凝 集が生じた場合、標的核酸は変異型であることが分かる。さらに、何れの凝集反応で も凝集が生じた場合、標的核酸は標準型及び変異型の双方が存在することが分力る 。これは例えば、ある人物のゲノム DNAが検体であって、その一塩基多型における 遺伝子型がヘテロである場合等にも起こり得る。
[0145] 本実施形態に拠れば、一度の PCR反応によって、一塩基多型における塩基型が 判明し、さらに、 BZF分離操作が必要ないため、極めて簡便、且つ、精確に塩基型 を決定することができる。
[0146] なお、本態様では、リガンドはプライマーに結合させた力 これに限らず、ヌクレオチ ドに結合させてもょ 、。リガンドが結合されたヌクレオチドを用いて PCRすることによつ て、増幅産物にリガンドを結合させることもできる。
[0147] また、本態様の方法は、例えばゲノム DNA等を試料とし、多数の変異部位を同時 に検出する際にも用いることができる。
[0148] 本発明の第二の態様として、 PCR-SSP法を用い、さらに Tag配列を用いた核酸変 異検出方法が提供される。ここで、 Tag配列とは、人工的に設計された塩基配列であ り、好ましくは染色体等の生体試料中に存在せず、互いにミスハイプリがなく解離温 度が同一に設計された配列である。この Tag配列は、検出すべき変異部位毎に設計 •調製する。
[0149] 本態様においては、前記第一の態様における検出用プライマーに、リガンドの代わ りに Tag配列を結合させる。この Tag配列は、検出用プライマーの 5'末端に結合され ることが望ましい。また、前記第一の態様における共通プライマーに、リガンドの代わ りにピオチンが結合される。
[0150] 本態様における工程では、まず、（i)前記標的核酸、及び、前記二種類のプライマ 一によつて PCRを行う。この PCRでは、上記第一の態様で記載したように、検出用プ ライマーが標的核酸と完全にハイブリダィズした時、即ち、標的核酸に変異がない場 合にのみ増幅産物が生じる。
[0151] 次 、で、（ii)上記 (i)で得られた PCR反応液から、ピオチンが結合した PCR産物を 、アビジン又はストレプトアビジンが結合した磁性粒子を用いて分離する。ピオチンは 、アビジン又はストレプトアビジンと結合するため、この結合を介して磁性粒子に増幅 産物を結合させ、磁力を用いて該磁性粒子を PCR反応液から分離することが可能で ある。
[0152] 次に、このようにして分離された PCR産物を、（iii) Tag配列に相補的な配列を有し 、第一のリガンドが結合した第一のプライマー、及び第二のリガンドが結合した第二 のプライマーを用いた PCRに供する。これにより、 Tag配列の増幅産物が得られる。 即ち、標的核酸に変異がない場合に、プライマーの増幅産物が生じ、これから Tag配 列の増幅産物が生じる。従って、変異部位の配列が Tag配列へ変換されると言える。 上記したように、 Tag配列は PCRで容易且つ誤差なく増幅するような配列であるよう に設計されるため、この変換は円滑に行われることができる。
[0153] この Tag配列の増幅産物は、第一及び第二のリガンドが結合されたものである。よ つて、 (iv)第一のリガンドと特異的に結合する受容体が複数結合した第一の分散性 微粒子、及び第二のリガンドと特異的に結合する受容体が複数結合した第二の分散 性微粒子を反応させることにより、上述したように凝集が生じ得、（V)この凝集を分光 光度法によって測定すればよい。最後に、（vi)測定結果から、 PCRによる Tag配列 の増幅を判定する。即ち、 Tag配列の増幅が確認されれば、標的核酸に変異がない ことが判明する。
[0154] 以上記載した本態様における方法も、例えばゲノム DNA等を試料とし、多数の変 異部位を同時に検出する際に用いることができる。さらに、このような Tag配列を用い ることによって、リガンドの種類に制限されることなぐ多数の変異部位を同時に検出 することが可能である。
[0155] なお、以上記載した本態様の方法では、標的核酸に変異がない場合を例に説明し たが、例えば一塩基多型であって、変異型を検出する場合にも同様に行うことができ る。この場合、検出用プライマーに変異型の標的核酸と相補的な配列を有するプライ マーを用いることにより、上記と同様に検出することができる。
[0156] 本発明の第三の態様として、ライゲーシヨンを用いた核酸変異検出方法が提供され る。本態様において検出される核酸変異は一塩基多型 (SNP)である。本態様にお いては、標的核酸配列に相補的な配列を有し、その 3'末端が前記一塩基多型部位 に対応する、第一のリガンドが結合された検出用プライマー、及び、前記標的核酸の 該多型部位より 5'末端側の配列に相補的な配列を有し、その 5'末端が、該多型部 位に隣接する塩基に対応する、第二のリガンドが結合された共通プライマーを用いる
[0157] 図 19に本態様の概念図を示した。図 19 (a)は、変異のない標的核酸 60、即ち標 準型の標的核酸であり、変異が存在し得る部位を黒丸 62で表している。図 19 (a)で は、検出用プライマー 64が完全にハイブリダィズし、その 3 '末端が、共通プライマー 66の 5'末端と隣接している。従って、これらをライゲーシヨン反応に供することによつ て、二つのプライマーの間が連結される。一方、図 19 (b)は変異型の標的核酸であ る。この場合、検出用プライマー 64はその 3'末端がハイブリダィズしないため、ライゲ ーシヨン反応が起こらない。なお、共通プライマー 66は、標的核酸の変異の有無に 関係なくハイブリダィズする。
[0158] 以下、本態様における工程を順に説明する。まず、（i)前記二種類のプライマー 64 、 66を、前記標的核酸 60にハイブリダィズさせる。続いて、（ii)ライゲーシヨンを行い 、前記二種類のプライマーを連結する。ここで得られた連結されたプライマーを、 (iii) 前記第一のリガンドと特異的に結合する受容体が複数結合した第一の分散性微粒 子、及び前記第二のリガンドと特異的に結合する受容体が複数結合した第二の分散 性微粒子を反応させる。
[0159] この反応によって生じた凝集を、（iv)分光光度法によって測定し、（V)該測定結果 から、前記 PCRによる核酸の増幅を判定し、該判定結果によって、前記標的核酸配 列における一塩基多型を判別する。
[0160] 本態様に拠れば、ライゲーシヨン反応によって変異の有無を検出することができ、 P CRを行う必要がない。よって、反応工程がより簡略ィ匕し、コスト低減と時間の短縮が 可能である。しかしながら、プローブの配列が変異部位の前後しか使用できないため に制限される。よって、例えば DNAゲノム配列等を試料とする場合は、検出対象の 変異部位を含む領域を PCRによって増幅し、切り出してもよい。これによつて、本態様 の検出感度及び精度を向上させる効果も得られる。
[0161] 本態様においては、リガンドをプライマーに結合する場所や数に制限はないが、ラ ィゲースの反応を阻害しな 、ように変異部位の近傍以外の位置、例えば変異部位と 反対の末端に結合することが好まし 、。
[0162] さらに、本態様における他の実施形態として、標準型と変異型の双方の標的核酸 のための検出用プライマーを用いてもよい。即ち、検出用プライマーとして、標準型 用リガンドが結合され、標準型の標的核酸に相補的な配列を有する第一のプライマ 一、並びに、変異型用リガンドが結合され、変異型の標的核酸に相補的な配列を有 する第二のプライマーを用いる。これらの二種類の検出用プライマーは、別個にライ ゲーシヨン反応に供してもよいが、同一の反応系で同時に反応を行ってもよい。
[0163] このような実施形態においては、第一の分散性微粒子として、それぞれのプライマ 一に結合されたリガンドに対応した微粒子を使用する。即ち、標準型用リガンドと特 異的に結合する受容体が複数結合された標準型用分散性微粒子、及び、変異型用 リガンドと特異的に結合する受容体が複数結合された変異型用分散性微粒子を用い る。
[0164] これに伴、、該実施形態では、前記工程 (iii)における凝集反応を、標準型用微粒 子と変異型微粒子のそれぞれにつ 、て別個に行う。ライゲーシヨン後の反応液中に は、標準型用プライマーによる産物と、変異型用プライマーによる産物の何れか一方 、又は両方が存在している。この反応液中に、標準型用微粒子と第二の分散性微粒 子との組み合わせを混合して、凝集反応を行う。この反応で凝集が生じた場合、標的 核酸は標準型であることが分かる。これとは別に、変異型用微粒子と第二の分散性 微粒子との組み合わせを用いて凝集反応を行う。この反応で凝集が生じた場合、標 的核酸は変異型であることが分かる。さら〖こ、何れの凝集反応でも凝集が生じた場合 、標的核酸は標準型及び変異型の双方が存在することが分かる。これは例えば、あ る人物のゲノム DNAが検体であって、その一塩基多型における遺伝子型がヘテロ である場合等にも起こり得る。
[0165] 本実施形態に拠れば、一度のライゲーシヨン反応によって、一塩基多型における塩 基型が判明し、さらに、 BZF分離操作が必要ないため、極めて簡便、且つ、精確に 塩基型を決定することができる。
[0166] 本発明の第四の態様として、ライゲーシヨンを用い、さらに Tag配列を用いた核酸変 異検出方法が提供される。本態様において検出される核酸変異は、一塩基多型であ る。
[0167] 本態様においては、上記第二の態様と同様に Tag配列を用いる。また、上記第三 の態様と同様にライゲーシヨン反応を用いて変異を検出する。
[0168] 即ち、標的核酸配列に相補的な配列を有し、その 3'末端が前記標的核酸配列に おける変異部位に対応し、その 5'末端に Tag配列が結合された検出用プライマー、 及び、前記標的核酸の該変異部位より 5'末端側の配列に相補的な配列を有し、ビ ォチンが結合された共通プライマーを用い、
(i)前記二種類のプライマーを、前記標的核酸にハイブリダィズさせる工程と、
(ii)前記工程 (i)に続いてライゲーシヨンを行い、前記二種類のプライマーを連結す る工程と、
(iii)前記工程 (ii)における反応系から、ピオチンが結合した連結されたプライマー を、アビジン又はストレプトアビジンが結合した磁性粒子を用いて分離する工程と、
(iv)前記工程 (iii)で得られた連結されたプライマー、及び、前記 Tag配列に相補的 な配列を有し、第一のリガンドが結合した第一のプライマー、及び第二のリガンドが結 合した第二のプライマーを用いて PCRを行 ヽ、該 Tag配列の PCR産物を得る工程と
(v)前記工程 (iv)で得られた PCR産物、前記第一のリガンドと特異的に結合する受 容体が複数結合した第一の分散性微粒子、及び前記第二のリガンドと特異的に結合 する受容体が複数結合した第二の分散性微粒子を反応させる工程と、
(vi)—つの前記 PCR産物が前記第一の分散性微粒子及び第二の分散性微粒子 と結合することによって、該第一及び第二の分散性微粒子が連結し、且つ、一つの 分散性微粒子に複数の PCR産物が結合し、該 PCR産物のそれぞれが他の分散性 微粒子と結合することによって、多数の分散性微粒子が互いに連結されて生じる凝 集を、分光光度法によって測定する工程と、
(vii)該測定結果から、前記 PCRによる核酸の増幅を判定し、該判定結果によって 、前記標的核酸配列における変異を検出する工程とを具備する。
[0169] 本態様における方法は、例えばゲノム DNA等を試料とし、多数の変異部位を同時 に検出する際に用いることができる。さらに、このような Tag配列を用いることによって 、リガンドの種類に制限されることなぐ多数の変異部位を同時に検出することが可能 である。また、ライゲーシヨン反応によって変異の有無を検出することができ、 PCRを 行う必要がない。よって、反応工程がより簡略ィ匕し、コスト低減と時間の短縮が可能で ある。
[0170] 以上述べた本発明の各種の態様は、さらに標的核酸の定量に用いることもできる。
定量を行う際には、検出対象である標的核酸を既知の濃度で含む溶液を調製し、上 記の方法と同様に測定する。これを各濃度の核酸溶液で行い、その測定結果に基 づいて、核酸濃度と吸光度による検量線を作成する。この検量線に基づいて、検出 対象の標的核酸の吸光度を測定した結果から核酸濃度を決定する。これによつて、 標的核酸の定量を行うことができる。
[0171] また、以上述べた本発明の各種の態様は、複数種類の標的核酸が含まれる試料 や、変異部位が多数存在する核酸において、所望の標的核酸の変異を同時に検出 することができる。これは、複数箇所の変異について、 PCRやライゲーシヨン反応を 同時に行い、該反応溶液を分注して、それぞれの変異箇所を検出するための分散 性微粒子を用いて凝集反応を行うことにより、簡便且つ同時並行的に複数箇所の変 異を検出することができる。
[0172] なお、以上述べた検出方法では、一つの標的核酸について二種類のリガンドを用 いたが、 3種類以上のリガンドを用いてもよぐ各種類のリガンドに特異的に結合する 受容体が結合された分散性微粒子を用いてもょ ヽ。
[0173] 以上詳述したように、本願発明の方法によれば、所望の核酸が簡便で迅速、且つ 精度良く検出することができる。これにより、例えば臨床検査の簡便化と迅速化に役 立ち、さらに簡易検査力も全自動分析に至るまで幅広く応用することも可能である。
[0174] 本発明の方法を実施する際に用いる材料は、例えば、 300nmカルボキシタイプラテ ックス粒子（CMP) G0201 (0.104meq COO/g) (JSR社）、 EDAC (Sigma社)、ゥサギ抗ビ ォチン抗体（BETHYL laboratory inc.) ,ゥサギ抗ジゴゲシニン (Dig.)抗体（Roche diag nostic corp.)、铸型 DNA、 5，ビォチン化 SDプライマー、 3，Diog.化 EDプライマー、 Tita niumn taq DNA polymerase (BD社)、 MES (WAKO社)を用いることができる。また、使 用する機器としては、ロテーター、ボルテックスミキサー、タンジェンタルフローシステ ム、透析膜、マグネティックスターラー、分光光度計、セル等を用いてよい。
[0175] なお、上述した Iおよび Πの方法は、いずれも反応性が高くかつ特異性も高い。さら には、マルチプレックスな反応も容易な為、キュベットやマイクロウェルのような溶液系 の反応にとって非常に都合が良い。従って、分注ノズルを組合せた液体ノヽンドリング によるハイスループットな自動分析装置に最適な検出方法を提供できる。
産業上の利用可能性
[0176] 本発明の核酸の検出方法は、核酸の多型、変異、発現量の検査を行う際に使用さ れる。特に、本発明の核酸の検出方法は、 SNPの検出を行う際に使用される。本発明 の核酸の検出方法によって個々人の SNPが明らかになり、個々人の病的遺伝背景が 明らかになる。これによつて、個々人に最適な医薬品の開発が可能になる。

Claims

請求の範囲
[1] (1)検出対象の核酸に第一および第二のリガンドを結合させる工程と、
(2)前記リガンドを結合させた核酸において、前記第一のリガンドを、前記リガンドと 特異的に結合する受容体を担持させた固相担体と結合させ、核酸 固相担体の複 合体を得る工程と、
(3)前記複合体において、前記第二のリガンドを、前記リガンドと特異的に結合する 標識物質で修飾された受容体と結合させる工程と、
(4)前記標識物質を検出することにより、前記核酸を検出する工程と
を具備する核酸の検出方法。
[2] 前記第一のリガンドが前記第二のリガンドと同一または異なる請求項 1に記載の核 酸の検出方法。
[3] 検出対象である複数種類の核酸を検出する方法であって、
(1)前記複数種類の核酸それぞれに第一および第二のリガンドを結合させるにあた り、前記核酸の種類ごとに第一のリガンドの種類が異なるように、前記第一および第 二のリガンドを結合させる工程と、
(2)前記第一のリガンドと特異的に結合する受容体を担持させた固相担体を、前記 第一のリガンドの種類ごとに用意するとともに、前記第一のリガンドをそれぞれに対応 する前記固相担体に結合させ、前記第一のリガンドの種類ごとに前記核酸を分離す る工程と、
(3)前記固相担体と結合した核酸において、前記第二のリガンドと特異的に結合す る標識物質で修飾された受容体を、前記第二のリガンドに結合させる工程と、
(4)前記標識物質を検出することにより、前記複数種類の核酸を検出する工程と を具備する核酸の検出方法。
[4] 検出対象である複数種類の核酸を同時に検出する方法であって、
(1)前記複数種類の核酸それぞれに第一および第二のリガンドを結合させるにあた り、前記核酸の種類ごとに第二のリガンドの種類が異なるように、前記第一および第 二のリガンドを結合させる工程と、
(2)前記第一のリガンドを、前記リガンドと特異的に結合する受容体を担持させた固 相担体と結合させ、核酸 固相担体の複合体を得る工程と、
(3)前記複数種類の第二のリガンドそれぞれと特異的に結合する複数種類の受容体 であって、前記リガンドの種類ごとに異なる標識物質で修飾された複数種類の受容 体を用意するとともに、前記第二のリガンドにそれぞれに対応する前記受容体を結合 させる工程と、
(4)前記異なる標識物質をそれぞれ検出することにより、前記複数種類の核酸を同 時に検出する工程と
を具備する核酸の検出方法。
[5] 前記検出対象の核酸にリガンドを結合させる工程において、
前記核酸の変異部分に対応する塩基を伸長側末端に有する第一のリガンド付きプ ライマーと、前記プライマーとの関係で、前記核酸を PCR法によって増幅可能な第二 のリガンド付きプライマーとを含む検査試薬を、前記核酸を含むサンプルに添加し、 PCR法によって増幅された前記第一および第二のリガンドを結合させた核酸を得る 請求項 1〜4のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
[6] 前記検出対象の核酸にリガンドを結合させる工程において、
前記核酸の変異部分に対応する塩基を結合側末端に有する第一のリガンド付き核 酸プローブと、前記核酸上で前記核酸プローブとライゲーシヨン反応を行うことができ る第二のリガンド付き核酸プローブとを含む検査試薬を、前記核酸を含むサンプルに 添加し、次に前記第一および第二のリガンド付き核酸プローブを前記核酸上にノ、ィ ブリダィズさせ、最後に前記第一および第二のリガンド付き核酸プローブをライゲー シヨン反応によって結合させ、前記第一および第二のリガンドを結合させた核酸を得 る請求項 1〜4のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
[7] 前記ライゲーシヨン反応を行う前に、 PCR法によって少なくとも前記ライゲーシヨン 反応を行う核酸の部分を含む領域をあら力じめ増幅させる請求項 6に記載の核酸の 検出方法。
[8] 核酸サンプル中から検出対象である変異部分を含む核酸および Zまたは標準部 分を含む核酸を検出する方法であって、
(1) (0前記核酸の変異部分に対応する塩基を伸長側末端に有する第一のリガンド付 きプライマーと、 GO前記核酸の変異部分に対応する塩基を伸長側末端にもたず、前 記標準部分に対応する塩基を伸長側末端に有する第二のリガンド付きプライマーと
、（m)前記第一および第二のリガンド付きプライマーとの関係で、前記変異部分およ び標準部分を含む核酸を PCR法によって増幅可能なように設計した第三のリガンド 付きプライマーとを含む検査試薬を、前記核酸サンプルに添加する工程と、
(2)前記第一および第三のリガンド付きプライマーの間、および Zまたは、前記第二 および第三のリガンド付きプライマーの間で PCRを行 、、増幅された前記第一およ び第三のリガンドで修飾された変異部分を含む核酸、および Zまたは、前記第二お よび第三のリガンドで修飾された標準部分を含む核酸を得る工程と、
(3)前記第一または第二のリガンドと特異的に結合する受容体を担持させた固相担 体をそれぞれ用意するとともに、前記第一または第二のリガンドをそれぞれに対応す る前記固相担体に結合させ、前記第一のリガンドで修飾された変異部分を含む核酸 と、前記第二のリガンドで修飾された標準部分を含む核酸とを分離する工程と、
(4)前記固相担体と結合した核酸において、前記第三のリガンドと特異的に結合す る標識物質で修飾された受容体を、前記第三のリガンドに結合させる工程と、
(5)前記標識物質を検出することにより、前記検出対象である変異部分を含む核酸 および Zまたは標準部分を含む核酸を検出する工程と
を具備する核酸の検出方法。
核酸サンプル中から検出対象である変異部分を含む核酸および Zまたは標準部 分を含む核酸を検出する方法であって、
(1) (0前記核酸の変異部分に対応する塩基を結合側末端に有する第一のリガンド付 き核酸プローブと、 GO前記核酸の変異部分に対応する塩基を結合側末端にもたず、 前記標準部分に対応する塩基を結合側末端に有する第二のリガンド付き核酸プロ一 ブと、（ )前記第一および第二のリガンド付き核酸プローブの結合側末端とライゲー シヨン反応が可能なように設計された第三のリガンド付き核酸プローブとを含む検査 試薬を、前記核酸サンプルに添加する工程と、
(2)前記第一および第三のリガンド付き核酸プローブを前記変異部分を含む核酸上 、および Zまたは、前記第二および第三のリガンド付き核酸プローブを前記標準部 4 2 分を含む核酸上でハイプリダイズさせる工程と、
( 3 )前記第一および第三のリガンド付き核酸プローブの間、 および Zまたは、前記 第二および第三のリガンド付き核酸プローブの間でライゲーション反応を行い、前記 第一おょぴ第三のリガンドで修飾された変異部分を含む核酸、および zまたは、前記 第二および第三のリガンドで修飾された標準部分を含む核酸を得る工程と、
( 4 )前記第一または第二のリガンドと特異的に結合する受容体を担持させた固相担 体をそれぞれ用意するとともに、前記第一または第二のリガンドをそれぞれに対応す る前記固相担体に結合させ、前記第一のリガンドで修飾された変異部分を含む核酸と、 前記第二のリガンドで修飾された標準部分を含む核酸とを分離する工程と、
( 5 )前記固相担体と結合した核酸において、前記第三のリガンドと特異的に結合す る標識物質で修飾された受容体を、 前記第三のリガンドに結合させる工程と、
( 6 )前記標識物質を検出することにより、前記検出対象である変異部分を含む核酸 および Zまたは標準部分を含む核酸を検出する工程と
を具備する核酸の検出方法。
1 0 . 前記ライゲーシヨン反応を行う前に、 P C R法によって前記ライゲーシヨン 反応を行う核酸の部分をあらかじめ増幅させる請求項 9に記載の核酸の検出方法。
1 1 . 核酸サンプル中から検出対象である変異部分を含む核酸および/または標準 部分を含む核酸を検出する方法であって、
( 1 ) 0)前記核酸の変異部分に対応する塩基を伸長側末端に有する第一のリガンド付 きプライマーと、 （ii)前記核酸の変異部分に対応する塩基を伸長側末端にもたず、 前 記標準部分に対応する塩基を伸長側末端に有する第二のリガンド付きプライマーと、
(iii)前記第一および第二のリガンド付きプライマーとの関係で、 前記変異部分および 標準部分を含む核酸を P C R法によつて増幅可能なように設計した第三のリガンド 付きプライマーとを含む検査試薬を、 前記核酸サンプルに添加する工程と、
( 2 ) 前記第一および第三のリガンド付きプライマーの間、および/または、前記第 二および第三のリガンド付きプライマーの間で P C Rを行い、増幅された前記第一お よび第三のリガンドで修飾された変異部分を含む核酸、および/または、前記第二お よび第三のリガンドで修飾された標準部分を含む核酸を得る工程と、
訂正された用紙 則 91) ( 3 )前記第三のリガンドを、前記リガンドと特異的に結合する受容体を担持させた 固相担体と結合させ、 核酸一固相担体の複合体を得る工程と、
( 4 )前記第一または第二のリガンドとそれぞれ特異的に結合する異なる標識物質で 修飾された二種類の受容体を用意するとともに、前記第一および第二のリガンドにそ れぞれに対応する前記受容体を結合させる工程と、
( 5 )前記異なる標識物質をそれぞれ検出することにより、前記検出対象である変異 部分を含む核酸および/または標準部分を含む核酸を同時に検出する工程と を具備する核酸の検出方法。
1 2 . 核酸サンプル中から検出対象である変異部分を含む核酸および/または標準 部分を含む核酸を検出する方法であって、
( 1 ) (i)前記核酸の変異部分に対応する塩基を結合側末端に有する第一のリガンド付 き核酸プローブと、 （ii)前記核酸の変異部分に対応する塩基を結合側末端にもたず、 前記標準部分に対応する塩基を結合側末端に有する第二のリガンド付き核酸プロ一 ブと、 （iii)前記第一および第二のリガンド付き核酸プローブの結合側末端とライゲー ション反応が可能なように設計された第三のリガンド付き核酸プローブとを含む検 查試薬を、 前記核酸サンプルに添加する工程と、
( 2 )前記第一および第三のリガンド付き核酸プローブを前記変異部分を含む核酸上、 および zまたは、前記第二および第三のリガンド付き核酸プローブを前記標準部分を 含む核酸上でハイブリダイズさせる工程と、
( 3 ) 前記第一および第三のリガンド付き核酸プローブの間、 および Zまたは、前記 第二および第三のリガンド付き核酸プローブの間でライゲーシヨン反応を行い、前記 第一および第三のリガンドで修飾された変異部分を含む核酸、および zまたは、前記 第二および第三のリガンドで修飾された標準部分を含む核酸を得る工程と、
( 4 )前記第三のリガンドを、前記リガンドと特異的に結合する受容体を担持させた 固相担体と結合させ、 核酸一固相担体の複合体を得る工程と、
( 5 )前記第一または第二のリガンドとそれぞれ特異的に結合する異なる標識物質で 修飾された二種類の受容体を用意するとともに、前記第一および第二のリガンドにそ れぞれに対応する前記受容体を結合させる工程と、
訂正された 羝 (規則 ) (6)前記異なる標識物質をそれぞれ検出することにより、前記検出対象である変異 部分を含む核酸および/または標準部分を含む核酸を同時に検出する工程と を具備する核酸の検出方法。
13. 前記ライゲーシヨン反応を行う前に、 PCR法によって前記ライゲーシヨン 反応を行う核酸の部分をあらかじめ増幅させる請求項 12に記載の核酸の検出方法。
14. 前記固相担体が磁性を帯びた粒子状の支持体であって、外部から磁力を加え ることによって前記磁性粒子を一箇所に集めることができることを特徴とする請求 項 1〜4
訂正された用紙 (規則 91) 、 8〜 1 0のレヽずれか一項に記載の核酸の検出方法。
1 5 . 前記リガンドおよび受容体がそれぞれ抗原または抗体であって、前記リガン ドと受容体との特異的結合が抗原抗体反応によって行われる請求項 1〜4、 8〜1 0 のレ、ずれか一項に記載の核酸の検出方法。
1 6 . 検出されるべき標的核酸と分散性微粒子との架橋反応によって生じる凝集に 基づいて、 前記標的核酸を検出する方法であって、
( 1 ) 種類の異なる第一および第二のリガンドが結合した標的核酸と、 前記第一のリ ガンドと特異的に結合する受容体が複数結合した第一の微粒子と、 前記第二のリガン ドと特異的に結合する受容体が複数結合した第二の微粒子とを反応させる工程と、
( 2 ) 一つの前記標的核酸が前記第一および第二の微粒子に結合することによって、 前記第一および第二の微粒子が連結し、 力つ、 一つの微粒子に複数の標的核酸が結合 し、 前記標的核酸のそれぞれが他の微粒子と結合することによって、 多数の微粒子が 互いに連結されて生じる凝集を、 分光光度法によつて測定する工程と
を具備する核酸の検出方法。
1 7 . ( 1 ) 前記種類の異なる第一および第二のリガンドがそれぞれ一以上結合し た濃度が既知の標的核酸を、 前記第一および第二の微粒子と反応させて、 分光光度法 によって測定する工程と、
( 2 ) 前記工程を、 異なる濃度の標的核酸について同様に行い、 測定結果から検量線 を作成する工程と、
( 3 ) 前記検出されるべき標的核酸を、 前記第一および第二の微粒子と反応させて、 分光光度法によつて測定する工程と、
( 4 ) 前記検量線に基づいて、 検出されるべき標的核酸の濃度を決定する工程と を具備する請求項 1 6に記載の核酸の検出方法。
1 8 . 前記標的核酸が、 3種類以上のリガンドが結合された標的核酸であり、 かつ、 前記分散性微粒子が、 前記 3種類以上のリガンドのそれぞれに特異的に結合する受容 体が結合された分散性微粒子である請求項 1 6に記載の核酸の検出方法。
1 9 . 複数種類の標的核酸を含む試料において、 標的核酸の種類毎に異なる一種ま たは二種のリガンドが結合され、 かつ、 前記分散性微粒子が、 検出すべき標的核酸に
'訂正された 紙 (規則 91) 結合されたリガンドと特異的に結合する受容体を結合された分散性微粒子であり、 前 記複数種類の標的核酸を含む試料から前記検出すべき標的核酸のみを検出する請求項
1 8に記載の核酸の検出方法。
2 0 . 前記分散性微粒子が、 粒径 3 0 0 nm 以下のラテックス粒子である請求項 1 9に記載の核酸の検出方法。
2 1 . 前記リガンドが、 親水性有機化合物、 ジォキシゲン、 フルォロセイン、 ァレ クサ、残基数が 6以上のポリぺプチド、糖が 2つ以上の糖鎖、ピオチン、タンパク質、 ポリヒスチジン、 HA、 GST, および Flagから選択される請求項 1 6に記載の核酸 の検出方法。
2 2. 前記リガンドが結合された標的核酸力 S、第一のリガンドを結合させた第一の プライマーと、第一のリガンドと異なる種類の第二のリガンドを結合させた第二のプ ライマーとを用いたポリメラーゼ連鎖反応法によって調製される請求項 1 6に記載 の核酸の検出方法。
2 3 . 前記リガンドが結合された標的核酸が、所望のリガンドを結合させたヌクレ ォチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応法によって調製される請求項 1 6に記載の核 酸の検出方法。
訂正された用紙 (規則 91)
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