CN101180539A - 核酸的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及核酸的检测方法。本发明提供了利用配体与受体的特异性结合来检测核酸的方法，尤其是利用配体与受体的特异性结合检测SNP的方法。本发明还提供测定操作为一次的简便且测定时间短的核酸的检测方法。本发明进一步提供一种高灵敏度且高精度地检测核酸的方法，该方法在液体与固体的界面处的反应中利用配体与受体的特异性结合反应。本发明还利用分散性颗粒的凝集反应来检测核酸。

Description

核酸的检测方法

技术领域

本发明涉及检测核酸的方法。更详细地说，本发明涉及利用配体与受体的特异性结合检测核酸的方法。进一步详细地说，本发明涉及利用分散性颗粒的凝集反应检测核酸的方法。

背景技术

近年来，为了实现“量身定做”治疗，对单核苷酸多态性(SNP)进行解析的必要性有所增加。通常，SNP的解析基于微阵列技术来进行。例如，Roche Diagnostic公司销售的AmpliChip P450为具有代表性的SNP测定装置，其作为SNP诊断试剂盒获得了FDA的批准。

但是，利用微阵列的核酸检测通过核酸之间的杂交来进行。核酸之间的杂交通常需要将反应条件设在45℃以上的高温，并且反应条件会因所反应的核酸的碱基序列中的GC含量和核酸的长度等而不同，常常难以设定最佳的反应条件。此外，利用微阵列的核酸检测通过使液体溶液中的试样核酸与固体基板上的标记核酸进行杂交来进行。对于在液体和固体的界面处发生的反应，由于彼此的化学状态有较大不同而难以设定反应条件。其结果，会出现低反应和假反应的问题。

与此相对，与杂交反应相比，以抗原抗体反应为首的配体与受体的特异性反应易于设定反应条件，且具有反应灵敏度高和再现性高的优点。利用了这种配体与受体的特异性反应的阵列在例如日本的公表专利公报2003-535569号中有公开。但是，其中包括溶液杂交和核酸内切酶反应，需要进行两次测定操作，操作繁杂，测定耗费时间。另外，还需要进行酶反应。由于酶反应针对固体基板上的核酸来进行，需要进行上述的在液体与固体的界面处的反应，会出现低反应和假反应的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用配体与受体的特异性结合检测核酸的方法，尤其是利用配体与受体的特异性结合检测SNP的方法。本发明的目的还在于提供测定操作为一次的简便且测定时间短的核酸的检测方法。本发明的目的还在于提供一种高灵敏度且高精度地检测核酸的方法，该方法在液体与固体的界面处的反应中利用配体与受体的特异性结合反应。本发明的目的还在于利用分散性颗粒的凝集反应来检测核酸。

本发明的第一方式的核酸的检测方法包括如下工序：(1)在检测对象的核酸上结合第一和第二配体的工序；(2)在结合了所述配体的核酸中，使所述第一配体与担载有与该配体特异性结合的受体的固相载体相结合，获得核酸-固相载体的复合体的工序；(3)在所述复合体中，使所述第二配体与经标记物质修饰的与该配体特异性结合的受体相结合的工序；和(4)通过检测所述标记物质来检测所述核酸的工序。

本发明的其他的方式的核酸的检测方法包括如下工序：(1)使结合有种类不同的第一和第二配体的靶向核酸、结合有两个以上的与所述第一配体特异性结合的受体的第一微粒、以及结合有两个以上的与所述第二配体特异性结合的受体的第二微粒发生反应的工序；和(2)一个所述靶向核酸结合在所述第一和第二微粒上，从而使所述第一和第二微粒连结，并且，一个微粒上结合有2个以上的靶向核酸，所述靶向核酸各自与其他微粒结合，从而使多个微粒相互连结产生凝集，利用分光光度法对所述凝集进行测定的工序。

本发明的核酸的检测方法能够以高灵敏度和高精度来检测核酸。其结果，能够确保测定结果的高再现性。并且，由于利用配体与受体的特异性结合而不利用杂交反应，因而可以将反应条件控制在37℃附近的低温。并且，由于测定操作为一次，因而操作简便，可以在短时间内测定。其结果，能够实现低成本化。

进而，通过利用分散性高分子的凝集反应来检测核酸，能够更简便地进行高精度的核酸检测，其结果，能够确保测定结果的更高的再现性。

附图说明

图1是关于使核酸结合在配体上的工序的示意图。

图2是关于在竞争反应条件下使核酸结合在配体上的工序的示意图。

图3是关于在两种以上的核酸上结合不同配体的工序的示意图。

图4是经配体修饰的核酸的检测方法的示意图。

图5是关于经配体修饰的核酸的检测工序的示意图。

图6是本发明的配体的氨基酸序列。

图7是本发明的引物的碱基序列。

图8是检测对象的核酸的碱基序列。

图9是本发明的核酸探针的碱基序列。

图10是实施例的引物的碱基序列。

图11是实施例的核酸探针的碱基序列。

图12是显示实施例结果的柱状图。

图13是显示变形例结果的柱状图。

图14是结合有配体的靶向核酸的概念框图。

图15是结合有受体的分散性微粒的概念框图。

图16是显示微粒的凝集的概念框图。

图17是利用分光光度法进行测定时的概念框图。

图18是显示利用PCR-SSP法检测核酸的变异的原理的概念框图。

图19是显示利用连接来检测核酸的变异的原理的概念框图。

具体实施方式

下面详细地说明本发明。在前半部分中，将就本发明的利用配体与受体的特异性结合检测核酸的方法进行说明。然后，在后半部分中，在本发明的利用配体与受体的特异性结合检测核酸的方法中，将特别就利用分散性颗粒的凝集反应来检测核酸的方法进行说明。

I.本发明的利用配体与受体的特异性结合检测核酸的方法

下面，将本发明大致分为以配体物质对检测对象的核酸进行修饰的工序、和对经配体修饰的核酸进行检测的工序，详细地进行说明。

1.以配体物质对检测对象的核酸进行修饰的工序

(1)检测对象的核酸为1种的情况

检测对象的核酸指的是试样中存在的特定的核酸分子。作为检测对象的核酸，包括cDNA、基因组DNA、合成DNA、mRNA、全RNA、hnRNA、合成RNA等全部种类的DNA和RNA。本发明中，特别是对生物试样中存在的特定的核酸分子进行检测。

在检测对象的核酸为1种的情况中，第一配体是指，固相载体上所担载的与受体特异性结合的物质。另一方面，第二配体是指，与经标记物质修饰过的受体特异性结合的物质。

配体物质中包括半抗原、生物素、分子氧、荧光素、Alexa(一种荧光染料)、糖链、肽、蛋白质、聚组氨酸、抗原/抗体物质、HA(血凝素)、GST(谷胱甘肽S转移酶)、Tap(人胰蛋白酶原激活肽)、Flag(小肽，序列为DYKDDDDK)等能够在本发明中利用的全部物质。生物素、分子氧、荧光素、Alexa等易于由市售得到，价格低。糖链和肽在化学结构的设计上自由度高，易于配齐两种以上的半抗原，可以根据需要选择。半抗原优选亲水性有机化合物，糖链优选由2种以上的单糖构成，肽优选氨基酸残基数为6以上的肽。为了利用免疫反应进行核酸的检测，也可以使用抗原/抗体物质。可以通过抗原抗体反应来实现配体和受体之间的特异性结合。

标记物质包括本领域技术人员已知的任意的标记物质。特别优选能够产生荧光、发光(化学发光、生物发光)这样的光信号的发光标记物。

在检测对象的核酸上结合第一和第二配体的方法包括利用经配体修饰的引物进行聚合酶链反应(PCR)的方法(图1(i))、利用经配体修饰的核酸探针在检测对象的核酸上进行连接反应的方法(图1(ii))等。利用PCR法时，可以在以配体修饰检测对象的核酸的同时使核酸的数量得到扩增(图1(i))。进行连接反应的情况中，优选预先利用PCR法对进行连接反应的核酸的部分进行扩增。由此可以预先防止核酸探针结合在存在于核酸的其他区域的类似序列上，能够进行精度高的连接反应。可以在扩增后的核酸区域进行所述连接反应，然后通过变性来获得经配体修饰的核酸(图1(ii))。

并且，如图2(i)所示，可以利用竞争反应通过PCR-SSP法(聚合酶链反应-序列特异性引物法)使配体结合在核酸上。即，预先制作与经所述第一配体修饰的引物相类似的引物。对于该引物，其在检测对象的核酸上能够结合在与经所述第一配体修饰的引物相同的位置上，但由于其伸长侧末端发生错配，而无法利用聚合酶进行伸长反应。通过在这种含有具有模拟序列的引物的状态下进行PCR法，能够高精度地对检测对象的核酸进行配体的修饰。图2(ii)显示出可以同样地利用竞争反应通过连接反应使配体结合在核酸上。预先制作与经第一配体修饰的核酸探针相类似的核酸探针。对于该核酸探针，其在检测对象的核酸上能够结合在与经所述第一配体修饰的核酸探针相同的位置上，但由于其结合侧末端发生错配，而无法在其后进行连接反应。通过在这种含有具有模拟序列的核酸探针的状态下进行连接反应，能够提高连接反应的精度。连接完毕后，可以通过变性获得经第一和第二配体修饰的核酸。此时，预先在具有与经第一配体修饰的引物或探针相近的序列的引物或探针上修饰第三配体，可以在同一溶液中同时得到经第一配体和第二配体修饰的核酸以及经第三配体和第二配体修饰的核酸。这种情况下，可以分别检测经第一配体修饰的核酸和经第三配体修饰的核酸，通过测定第一配体和第三配体的检测量的比例，在不受检测对象的核酸的浓度或探针的非特异反应的影响的情况下进行精度更高的测定。

此外，第一配体和第二配体既可以相同也可以不同。并且，第一配体和第二配体不是一定要由1分子构成，也可以分别由2分子以上构成。

(2)检测对象的核酸为两种以上的情况

为了通过配体和受体的反应来检测两种以上的核酸，需要对两种以上的核酸分别用不同的配体组合来修饰。对于这种核酸与配体的关系会想到各种各样的方法，但在本申请发明中，特别着眼于1种的单核苷酸多态性(即，含有变异部分的核酸和含有标准部分的核酸这2种)，下面对通过配体与受体的特异性结合来检测该多态性的方法进行说明。

首先，对利用PCR-SSP法在2种核酸(1种SNP)上结合不同配体的方法进行说明(图3(i))。PCR-SSP法(聚合酶链反应-序列特异性引物法)是如下的方法：设计2种引物使其一侧的伸长侧末端与检测对象的核酸的SNP部位互补，通过SNP部位与引物的伸长侧末端有无配对来控制扩增。

如图3(i)所示，先准备经第一至第三配体修饰的3种引物(下文中分别称为第一至第三引物)。第一引物具有与含有变异部分的碱基序列相对应的序列，并且其伸长侧末端与该变异部分的碱基相对应。另一方面，第二引物具有与含有标准部分的碱基序列相对应的序列，并且其伸长侧末端与该标准部分的碱基相对应。第三引物具有可以利用与所述第一和第二引物的关系进行PCR的碱基序列。此处，单核苷酸多态性是指，基因的碱基序列仅1处不同的状态及其部位。即，由于该多态性前后的碱基序列在标准型和变异型的核酸中都相同，所以第一引物和第二引物的碱基序列中，其伸长侧末端仅有1个碱基不同，其他的碱基序列都相同。在含有这样的2个引物的条件下进行杂交时，所述第一和第二引物相互竞争着与核酸结合(竞争反应)。但是，如图所示，在竞争反应条件下，经第一配体修饰的引物在标准型的核酸上其伸长侧末端会错配，从而无法进行利用聚合酶的伸长反应。另一方面，经第二配体修饰的引物在变异型的核酸上其伸长侧末端会错配，从而无法进行利用聚合酶的伸长反应。通过在这样的竞争反应条件下进行杂交，能够更确实地将核酸和配体关联起来。

然后，利用PCR法扩增核酸，获得经配体修饰的核酸(图3(i))。分别进行关联，其中含有变异部分的核酸为经第一和第三配体修饰的核酸，另一方面，含有标准部分的核酸为经第二和第三配体修饰的核酸。由于这种关联建立在竞争反应条件下，因此精度极高。

接着对通过连接反应在2种核酸(1种SNP)上结合不同配体的方法进行说明(图3(ii))。与上述PCR-SSP法相同，利用连接反应也可以将核酸和配体关联起来。如图3(ii)所示，先准备经第一至第三配体修饰的3种核酸探针(下文中分别称为第一至第三核酸探针)。第一核酸探针具有与含有变异部分的核酸序列相对应的碱基序列，并且其结合侧末端与该变异部分的碱基相对应。另一方面，第二核酸探针具有与含有标准部分的核酸序列相对应的碱基序列，并且其结合侧末端与该标准部分的碱基相对应。第三核酸探针具有能够通过与所述第一和第二核酸探针的关系进行连接反应的碱基序列。如上所述，单核苷酸多态性前后的碱基序列在标准型和变异型的核酸中均相同，因而所述第一和第二核酸探针的碱基序列仅在其结合侧末端不同，其他的序列相同。因此，所述第一和第二核酸探针彼此竞争着结合在核酸上(竞争反应)。但是，如图所示，在竞争反应条件下，由于第一核酸探针在标准型的核酸上其结合侧末端会错配，从而无法在其后与经第三配体修饰的核酸探针之间发生连接反应。另一方面，第二核酸探针在变异型的核酸上其结合侧末端会错配，从而无法与第三核酸探针之间发生连接反应。其后，在变异型的核酸上，第一核酸探针与第三核酸探针相连接，在标准型的核酸上，第二核酸探针与第三核酸探针相连接。接着经过变性反应，获得经配体修饰的核酸(图3(ii))。如此地分别进行关联，其中含有变异部分的核酸为经第一和第三配体修饰的核酸，另一方面，含有标准部分的核酸为经第二和第三配体修饰的核酸。

由于连接反应中没有扩增样品的工序，能够进一步使反应工序简化、降低成本、缩短时间。但是，其灵敏度差，探针设计只能选择在SNP位点前后，缺少自由。在某些样品中，可能会在与检测对象的SNP位点不同的位置上存在同样的序列，这种情况下具有精度差的缺点。因此，为了提高灵敏度和精度，可以通过在检测对象的SNP位点附近进行PCR反应，对含有检测对象的SNP的核酸进行扩增来解决这个问题。

另外，图1～3给出了最简单的配体的构成。引物和核酸探针优选碱基数为3～60个。配体的数量和种类不受此限定，所述第一至第三配体也可以分别由2分子以上构成。并且，在没有第一或第二配体中任一个的状态下也能够检测核酸。进而，可以通过减少配体的数量来使反应体系更简单。

下面给出图6～9所示的具体的配体物质、引物、核酸探针和检测对象的核酸，同时举出上述实施方式。

(i)PCR-SSP法

使用半抗原a～c(多肽)作为配体物质(图6)，准备分别经半抗原a～c修饰过的引物a～c(图7)。接着，对图8所示的样品利用PCR-SSP法进行扩增反应。此时，样品的SNP位点(图8中#的位置)作为烯丙基(アリル)存在碱基A(腺嘌呤)和碱基G(鸟嘌呤)这2种时，烯丙基类型为：A/A纯合、A/G杂合、G/G纯合这3种。样品的SNP位点为A/A纯合的情况下，图7的引物a与SNP位点匹配，与引物c一起进行PCR扩增。由于引物b不进行扩增，因而扩增产物为两个5’端分别为经半抗原a和半抗原c修饰的双链DNA。出于同样的观点，样品的SNP位点为G/G的情况下，PCR产物为两个5’端分别为经半抗原b和半抗原c修饰过的双链DNA。进而，样品的SNP位点为A/G的情况下，会得到混合有经半抗原a和半抗原c修饰过的双链DNA以及经半抗原b和半抗原c修饰过的双链DNA的扩增产物。

另外，上述方法中，也可以不准备3种引物，而仅用例如引物a和引物c进行扩增。这时可以将其与利用其他容器仅用引物b和引物c进行扩增所得的结果合并来对应，但该方法的精度差。

可以利用上述的实施方式，在检测核酸的SNP时，转换为以对应其多态性的半抗原修饰的核酸。

此外，也可以对检测对象的核酸的两个以上的SNP进行检测。这种情况下，可以根据不同的SNP位点准备用不同的半抗原修饰过的引物，利用PCR-SSP法对检测对象的核酸进行扩增。

(ii)连接反应

使用半抗原a～c(多肽)作为配体物质(图6)，准备分别以半抗原a～c修饰过的核酸探针a～c(图9)。接着，对图8所示的样品进行连接反应。样品的SNP位点为A/A纯合的情况下，图4的探针a与SNP位点匹配，与探针c一起通过连接进行连接反应。探针b不进行连接反应。反应后，将缓冲液的pH调为碱性等，从而进行变性反应将双链核酸改为单链，反应物成为在5’端和3’端的两端分别经半抗原a和半抗原c修饰过的单链DNA。出于同样的观点，样品的SNP位点为G/G的情况下，连接产物为两端分别经半抗原b和半抗原c修饰过的单链DNA。进而，样品的SNP位点为A/G的情况下，会得到混合有经半抗原a和半抗原c修饰过的单链DNA以及经半抗原b和半抗原c修饰过的单链DNA的连接产物。另外，上述方法中，也可以不准备3种探针，而仅用例如探针a和探针c进行扩增。这时可以将其与利用其他容器仅用探针b和探针c进行连接所得的结果合并来对应，但该方法的精度差。

可以利用上述的实施方式，在检测核酸的SNP时，转换为以对应其多态性的半抗原修饰的核酸。

至此，对检测1种SNP的方法进行了说明，利用本发明还可以对两种以上的SNP进行检测。对于两种以上的SNP，由于要针对每个SNP来分别设定竞争反应，所以根据SNP的位置的种类，引物/探针的种类会变多。若为2种SNP，则需要6个引物/探针，配体也最少需要第四、第五配体。对于第三配体，也可以使用与第三配体对应的第六配体，但也可以在各种SNP的检测中通用第三配体，以使反应后的BF分离变得简单且能够降低成本。此处，既可以在不同的容器中进行各种SNP的检测，也可以在同一容器中同时进行各种SNP的检测。特别是在同一容器中进行2种以上的SNP的检测时，对每个与第三配体对应的各SNP使用不同的配体(第六配体、第九配体……)，由此可以以任意顺序对SNP的种类进行BF分离等工序。并且，在同一容器中使用通用的第三配体进行2种以上的SNP的检测时，具有能够同时且低成本地进行各种测定的优点。

2.对经配体修饰过的核酸进行检测的工序

(1)检测对象的核酸为1种的情况

图4给出了经配体修饰过的核酸的检测方法。核酸的检测方法有各种各样的方式，本发明包括能够实施本发明的全部方式。其中，可以举出以荧光色素进行检测的方法作为有代表性的实施方式。如图4(i)所示，预先在固相载体上担载与第一配体特异性结合的受体。并且，使用荧光色素对与第二配体特异性结合的受体预先进行修饰。经配体修饰过的核酸通过第一配体结合在固相载体上。接着，与第二配体上经荧光色素修饰的受体相结合。然后，通过利用光学装置检测该荧光色素就可以检测核酸。如图4(ii)所示，也可以在固相载体上预先担载第一配体。这种情况下，首先，相对于所述担载上的第一配体，结合与其特异性结合的受体。然后，使经配体修饰后的核酸中的第一配体与所述受体结合。担载有配体物质的固相载体与担载有所述受体的固相载体相比保存性更优异，在检查方法的实用化方面起到巨大的作用。

并且，如图4(iii)所示，也可以利用酶反应进行检测。酶可以使用例如碱性磷酸酶、过氧化酶等。这种情况下，预先用酶修饰用于与所述第二配体特异性结合的受体，对由于基质与该酶进行反应所产生的化学发光进行检测。并且与荧光色素的情况相同，也可以使用预先担载有第一配体的固相载体(图4(iv))。

下面，对图4(i)～(iv)中图4(iii)所示的方式的检测工序进行更详细的说明(图5)。如图5(i)所示，首先，在固相载体上担载受体。也可以作为替代而使用预先担载有受体的固相载体。然后，通过受体与配体的特异性结合，将经配体修饰的检测对象的核酸结合在所述固相载体上。此时，利用BF分离将未结合的游离核酸去除(图5(ii))。然后，使经酶修饰的抗体与第二配体相结合。这时，利用BF分离将未结合的游离标记抗体去除(图5(iii))。最后，通过酶-基质反应产生化学发光，通过对其进行检测来确定检测对象的核酸(图5(iv))。对于如图4(i)、(ii)和(iv)所示的核酸的检测方法，也可以进行同样的检测工序。

(2)检测对象的核酸为两种以上的情况

检测对象的核酸为两种以上的情况下，检测工序也相同。为了便于说明，在图4和图5中，使用了经第一和第二配体修饰的核酸。使用两种以上的核酸的情况中，特别是检测SNP的情况中，对经第一和第三配体修饰的核酸、和/或经第二和第三配体修饰的核酸进行检测。例如，在上述单核苷酸多态性的例子中，变异型的核酸受到第一和第三配体的修饰，标准型的核酸受到第二和第三配体的修饰。因此，可以准备担载有与第一配体特异性结合的受体的固相载体、和担载有与第二配体特异性结合的受体的固相载体，由此对变异型的核酸和标准型的核酸进行检测。

并且，也可以使用担载有与第三配体特异性结合的受体的固相载体，同时检测所述变异型的核酸和标准型的核酸。所述变异型的核酸和标准型的核酸都能结合在担载有与第三配体特异性结合的受体的固相载体上。该核酸-固相载体中，变异型的核酸中第一配体呈未结合的状态，标准型的核酸中第二配体呈未结合的状态。因此，可以预先用不同的标记物质分别对与第一配体特异性结合的受体和与第二配体特异性结合的受体进行修饰，通过使用该标记物质来同时对变异型的核酸和标准型的核酸进行检测。

另外，也可以在没有第一或第二配体中任一个的状态下检测核酸。可以通过减少配体的数量来使反应体系变得更简单。

下面，对本发明所使用的受体和固相载体进行说明。

(i)受体

受体是指与配体物质特异性结合的物质。例如，选择生物素作为配体的情况中，抗生物素蛋白是受体，选择半抗原作为配体的情况中，抗半抗原抗体是受体。对于抗半抗原抗体没有特别限制，但若是经过亲和精制的抗体、或是单克隆抗体的话，由于会提高特异性、提高检测的精度，因而更加优选。并且，配体和受体也可以分别为抗原或抗体，通过抗原抗体反应进行所述配体与受体的特异性结合。通过利用免疫反应检测核酸，能够高反应性且高精度地进行检测。

(ii)固相载体

i)基板状的支持体

固相载体是指能够担载所述受体的任意的支持体。对支持体的材质、形状没有特别限制。作为材质可以考虑玻璃、硅、金属、金属氧化物、树脂、橡胶、陶瓷等。为了与连接剂反应，在支持体表面上具有羟基、羧基、氨基、巯基等活性基团则更佳。并且若为金表面，则由于能够与巯基配位键合，有时也可以没有活性基团。作为形状，若使用能够以高灵敏度进行荧光测定的DNA微阵列扫描仪，则载波片形状(约25×75×1mm)较为适宜，若利用化学发光的平板读取器，则微板(microplate)形状(约86×128mm)较为适宜。并且，支持体既可以为透液性，也可以为不透液性。透液性支持体大多情况下为多孔质体，所以表面积大，抗体固定化量增大，液体在移动方向上的自由度增高，从而具有易于使反应自动化等的优点。但是，由于材质的选择范围窄，有时需要对检测装置进行改良等，由于还具有这些不利的方面，所以需要根据情况来进行选择。

此处，作为示例给出一系列的反应，但只要满足上述内容，就可以用于本发明而不受下述内容的限制。

使用低荧光二氧化硅玻璃作为支持体。玻璃用醇充分脱脂后，用纯水清洗。然后制备在乙醇中含有3重量％的氨基丙基三甲氧基硅烷(信越有机硅社制造)的溶液。在室温中将玻璃浸泡在该溶液中，搅拌下反应1小时，按照乙醇和纯水的顺序进行清洗后，于130℃干燥20分钟。

接着，将EDC(PIERCE社制造)以5重量％溶解在MES缓冲液中，在该溶液中于室温浸泡上述经处理的玻璃，搅拌下反应1小时。反应后，按照MES缓冲液和纯水的顺序进行清洗，利用旋转干燥法于室温干燥。

对于抗半抗原抗体，将对应于图6的半抗原a和半抗原b的抗半抗原a抗体和抗半抗原b抗体经亲和精制后的产物以5mg/ml的浓度溶解在MES缓冲液中，制备溶液，将该溶液点样至玻璃上的其他位置。点样方法中使用触针式的点样装置SPBIO(日立软件公司制造)。将每一溶液在玻璃上进行各4处的点样后，于室温反应1小时，然后在溶解有浓度为0.1重量％的BSA(牛血清白蛋白)的PBS缓冲液中于室温浸泡1小时。浸泡后，按照PBS缓冲液和1/10浓度的PBS缓冲液的顺序进行清洗，然后，用旋转干燥法进行干燥，在干燥状态下于冷暗处保存。

可以如上制作支持体。并且，抗半抗原抗体可以不止2种，还可以进一步固定两种以上，因此可以进一步增加检测对象的核酸的种类。

ii)颗粒状的支持体

本发明的其他的方式中，还可以使用颗粒状的支持体作为固相载体，在其上担载所述受体。

作为颗粒状支持体，大多使用树脂制成。具有代表性的材料为天然橡胶、苯乙烯和苯乙烯共聚物、聚氨酯、丙烯酸树脂等，作为用于本发明的颗粒状支持体的材质没有特别限制。并且，还可以在颗粒状支持体中混入具有磁性的物质。通过使颗粒状支持体具有磁性而便于对颗粒状支持体进行处理。

作为将所述受体担载在颗粒状支持体上的方法，包括物理吸附和化学吸附等，哪种方法都可以。由于物理吸附的工序简单，所以可以较多地使用物理吸附，但为了维持抗半抗原抗体的活性，实现稳定的反应，化学吸附也是适宜的。化学吸附在多数情况下借助被称为连接剂的化学物质以共价键将支持体和抗体牢固结合。连接剂可以根据支持体的材质、表面状态、抗体的种类来选择最佳的种类。

并且，在使用生物素作为配体、使用抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素作为其受体的情况下，固定有抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素的磁性珠粒有市售，可以使用该市售品。

制作完担载有所述受体的固相载体后，借助经所述配体修饰过的核酸上的至少1个配体与所述固相载体相结合，由此可以获得核酸-固相载体的复合体。

(3)实施方式

(i)基板状的支持体

下面对使用含有图8所示的单核苷酸多态性的核酸进行的核酸的检测工序进行说明。所使用的半抗原、引物和探针与上述PCR-SSP法和连接反应相同，分别在图6、图7和图9中给出。

将经所述半抗原修饰过的核酸溶解在MES缓冲液中，将其滴加在支持体上，于37℃反应2小时后，用MES缓冲液清洗。此时，滴加在支持体上的溶液中若存在经半抗原a修饰过的核酸，则与相对应的抗半抗原a抗体结合，同样，若存在经半抗原b修饰过的核酸，则与相对应的抗半抗原b抗体结合。其结果，在待检测的核酸的SNP位点为A/A的情况下，在固定有与半抗原a对应的抗半抗原a抗体的支持体上的位置存在未结合的半抗原c。在固定有与半抗原b对应的抗半抗原b抗体的支持体上的位置不存在半抗原c。同样，在待检测的核酸的SNP位点为G/G的情况下，在固定有与半抗原b对应的抗半抗原b抗体的支持体上的位置存在未结合的半抗原c。在固定有与半抗原a对应的抗半抗原a抗体的支持体上的位置不存在半抗原c。进而，在待检测的核酸的SNP位点为A/G的情况下，在固定有与半抗原a、半抗原b分别对应的抗半抗原a抗体和抗半抗原b抗体的支持体上的位置存在未结合的半抗原c。

使用CY5作为荧光色素对与半抗原c对应的抗半抗原c抗体进行标记制成抗体溶液，将该抗体溶液以10μg/ml的浓度溶解在MES缓冲液中，将所得溶液滴加在反应后的支持体上，于37℃反应2小时。然后，按照MES缓冲液和1/10浓度的MES缓冲液的顺序进行清洗，以旋转干燥法干燥。通过该反应，仅在存在半抗原c的支持体上的位置存在CY5。

将支持体安装在GenePix4000B(AXON instruments社制造)上，在激发波长635nm、检测波段650nm～690nm的条件下扫描，进行测定。在扫描图像中，通过对照荧光强度与支持体上的位置信息进行解析，能够对检测对象的核酸的SNP进行检测。

并且，还可以使用标记有酶(例如碱性磷酸酶)的抗半抗原c抗体来代替所述标记有CY5的抗半抗原c抗体。这种情况下，可以通过与上述相同的反应进行支持体上的半抗原c与碱性磷酸酶标记抗半抗原c抗体的结合，进行清洗后滴加基质(例如CDP-Star(Calbio.chem.社制造))溶液，使用Luminescencer(ATTO社制造)测定化学发光量，对照支持体上的位置信息，对检测对象的核酸的SNP进行检测。

并且，也可以在支持体上担载半抗原a和半抗原b来代替担载抗半抗原抗体。此时，作为固定法，若利用半抗原的C末端的羧基，则连接剂等的处理条件完全相同。在如此制作的半抗原固定支持体上，滴加与固定化的半抗原a和半抗原b相对应的抗半抗原a抗体和抗半抗原b抗体的混合溶液，于37℃反应2小时，用同样的方法进行清洗。由此，在支持体上，在经固定化的半抗原a、半抗原b的位置分别存在抗半抗原a抗体和抗半抗原b抗体，之后可以与上述同样地进行检测。

(ii)颗粒状的支持体

下面，对使用带有磁性的颗粒状支持体进行核酸检测的工序进行说明。

在带有磁性的颗粒状支持体上担载抗半抗原c抗体，用其进行核酸的检测。将担载有抗半抗原c抗体的所述颗粒状支持体预先分散在磷酸缓冲液中，向其中混合对应于所述SNP的经半抗原修饰的核酸，使所述核酸结合在所述颗粒状支持体上。由于颗粒状支持体带有磁性，因而可以通过在外部施加磁力来使其移动，从而能够将颗粒预先聚集在溶液中的一处。例如，通过使用磁石使所述颗粒状支持体固定在容器壁上。在将所述颗粒状支持体固定在容器壁上的状态下去除溶液，添加新的磷酸缓冲液。然后移开磁石，使颗粒状支持体在所述新的磷酸缓冲液溶液中扩散。可以通过重复该工序数次来除去溶液中未反应的核酸和副产物等(BF分离工序)。BF分离工序后，将在磷酸缓冲液中均匀地分散有颗粒状支持体的溶液分注为2份。分成的份数取决于测定对象核酸的数目和所使用的半抗原的数目。检测对象的核酸通过半抗原c与所述颗粒状支持体相结合，因此在A/A的情况下半抗原a为未结合的状态，G/G的情况下半抗原b为未结合的状态，A/G的情况下半抗原a和半抗原b为未结合的状态。因此，可以通过使用标记后的抗半抗原a抗体和抗半抗原b抗体来对检测对象的核酸进行检测。

将酶标记抗半抗原a抗体和酶标记抗半抗原b抗体分别投入所述分注为2份的含有颗粒状支持体的溶液中，进行反应。反应后，再次重复上述的BF分离工序，去除未反应的酶标记抗半抗原抗体。此时，作为酶，可以适宜地使用碱性磷酸酶、过氧化酶等，但并不限于此。

最后，向各自的容器中混合成为酶的基质的化合物，反应一定时间后，测定其发光强度、吸光度变化等，由此可以同时对检测对象的核酸的SNP进行检测。

也可以用荧光色素替代酶来标记抗半抗原a抗体和抗半抗原b抗体，利用荧光强度来同时对检测对象的核酸的SNP进行检测。

并且，可以通过使用担载有抗半抗原a抗体的支持体和担载有抗半抗原b抗体的支持体来检测核酸。设在具有磁性的颗粒状支持体上固定的抗体为抗半抗原a抗体和抗半抗原b抗体，分别准备含有针对每种抗体的颗粒状支持体的容器。将与检查对象的核酸的SNP相对应的经半抗原修饰的核酸分注为2份，分别注入所述的不同容器中进行反应。BF分离后投入酶标记抗半抗原c抗体，进行反应。反应后，再次重复上述的BF分离工序，最后在各自的容器中混合成为酶的基质的化合物，反应一定时间后，测定其发光强度、吸光度变化等，由此可以对检测对象的核酸的SNP进行检测。此处，基于上述理由，抗体在颗粒状支持体上的固定取决于测定对象核酸的数目和所使用的半抗原的数目。进而，对酶的种类或荧光色素进行了改变的变形例也是适用的。

此外，也可以使用不带有磁性的颗粒状支持体进行BF分离工序。这种情况下包括下述方法等：(i)用过滤器捕获颗粒状支持体进行分离；(ii)通过静置、离心分离等使颗粒状支持体沉淀，除去上清进行分离；(iii)若使用具有大粒径的颗粒状支持体，则由于不能用移液管进行吸引，因而直接进行溶液交换。

上述实施方式均是测定核酸的SNP，本发明也可以简单地应用于核酸的变异和表达量。即，将所述引物或探针分别设定为要检测变异或表达量的序列，之后的处理可以完全相同。

[实施例]

利用连接反应对图8所示的含有单核苷酸多态性的核酸进行了检测。进行连接反应前为了除去模拟序列并提高检测灵敏度，对所述单核苷酸多态性前后的碱基序列进行了PCR扩增。在支持体中使用带有磁性的颗粒，利用酶-基质反应来检测核酸。

1.试剂的制备、准备

准备如下的试剂。

■样品：具有图8所示序列的人类基因组DNA的组合

组合i：A烯丙基(图8中#位置的碱基为A)与A烯丙基的组合(A/A)

组合ii：A烯丙基与G烯丙基的组合(A/G)

组合iii：G烯丙基与G烯丙基的组合(G/G)

■PCR引物：具有图10所示序列的PCR引物

■PCR试剂：Invitrogen社制造“Accuprime Super Mix II”目录No.12341-012

■探针：图11所示的探针的组合。

组合I：具有图9所示序列的探针中的这样的探针：用异羟基洋地黄毒苷(Dig，地高辛)修饰探针a的5’端，且探针b的5’端未经修饰，且用生物素修饰探针c的3’端，5’端被磷酸化。

组合II：具有图9所示序列的探针中的这样的探针：探针a的5’端未经修饰，且用异羟基洋地黄毒甙元(Dig)修饰探针b的5’端，且用生物素修饰探针c的3’端，5’端被磷酸化。

■连接酶：BioLabs社制造的“Taq DNA Ligase”目录No.M0208S

■磁化颗粒状支持体：DYNAL社制造的“Dynabeads M-280streptavidin”目录No.112.06

■酶标记抗体：DAKO社制造的“Anti-Digoxigenin(rabbit polyclonalantibody with ALP)”目录No.D5105

■发光基质：Wako社制造的“CDP-Star substrate”目录No.69086

2.反应

使用上述试剂，按照如下的步骤，针对样品的三种组合分别进行反应。

■调制为5ng/μl的样品      1μl

■PCR试剂                  10μl

■调制为1μM的引物         各1μl(共计2μl)

■纯水                     7μl

合计                       20μl

按照上述内容制备PCR溶液，使用热循环仪进行下述反应。

(1)94℃            2分钟

(2)94℃            30秒

(3)68℃            6分钟

(4)重复上述(2)、(3)40次

PCR结束后，利用吸光度测定PCR产物量，稀释至4ng/μl。

将稀释后的样品分注为2份，

■调制为4ng/μl的上述样品         1μl

■Taq Ligase缓冲液(试剂盒中附带)       3μl

■40U/μl的Taq Ligase                  0.5μl

■调制为10nM的探针组合I或II各1μl(共计3μl)

■纯水          22.5μl

合计            30μl

分别如上进行调制后，在温育器中进行下述反应。

(1)95℃  5分钟

(2)58℃  15分钟

反应后，添加5μl磁性化颗粒状支持体，在室温反应5分钟。

反应后，用磷酸缓冲液进行2次BF分离反应。

添加20μl分别稀释至100倍的酶标记抗体，在室温反应60分钟。

用磷酸缓冲液分别进行3次BF分离反应。

分别添加100μl基质，在室温反应1分钟。

移至测定用96孔黑板，在发光量测定器(ATTO社制造Luminescencer-JNRII)中进行10秒积分测定。

3.测定结果

对于每种样品重复上述反应9次，结果如图12所示。图12为在各种样品和探针的组合下显示发光量的平均值的棒状图，可知与样品的SNP相对应的结果作为发光量而得到。特别是样品的A/A、A/G和G/G的组合能够明确区分，能够以1次的反应来区分A/A与A/G、G/G与A/G，而这在过去是困难的，从这个方面来说上述方法是非常有用的。

[变形例]

下面给出变形例。本变形例不利用PCR法进行核酸扩增，而是利用LAMP(环介导等温扩增)法扩增核酸，对含有单核苷酸多态性的核酸进行检测。

LAMP法的反应和测定使用如下试剂来进行。

100μl中

20mM Tris-HCl pH8.8

10mM KCl

10mM(NH₄)₂SO₄

4mM MgSO₄

1M甜菜碱

0.4mM dNTP

8U Bst DNA聚合酶

将具有如下序列的引物加入反应液中，制成反应溶液。内引物FA(G)和内引物RA(G)是用于检测检体的烯丙基G(アリルG)的引物，在引物5’端上标记有生物素(biotin)。并且，内引物FA(A)和内引物RA(A)是用于检测烯丙基A的引物，在引物5’端上标记有异羟基洋地黄毒苷(Dig)。

引物：

1600nM内引物FA(G)

biotin-CTCCCCTCAGAACATAACATAGTAATGCGGTAAGTCGCATAAAAACCATTC

1600nM内引物FA(A)

Dig-TTCCCCTCAGAACATAACATAGTAATGCGGTAAGTCGCATAAAAACCATTC

1600nM内引物RA(G)

biotin-GTGAAAATTCCCCTAATTCGATGAGGTCGGCGCATAGCTGATAACAAT

1600nM内引物RA(A)

Dig-TTGAAAATTCCCCTAATTCGATGAGGTCGGCGCATAGCTGATAACAAT

400nM外引物F3

GCTTATCTTTCCCTTTATTTTTGC

400nM外引物R3

GCTGATCGGCAAGGTGTTCT

在冰上进行调制以使在制备反应液的过程中不发生反应。

扩增的目标聚核苷酸(模板核酸)使用不会热变性的1×172碱基的λDNA(序列编号1)。

<序列编号1>

GCTTATCTTTCCCTTTATTTTTGCTGCGGTAAGTCGCATAAAAACCATTCTT

CATAATTCAATCCATTTACTATGTTATGTTCTGAGGGGA#TGAAAATTCCCC

TAATTCGATGAAGATTCTTGCTCAATTGTTATCAGCTATGCGCCGACCAGAA

CACCTTGCCGATCAGC

序列编号1中碱基序列的第92个碱基处的#序列表示单核苷酸多态性，为G或A。与靶向区域、F1c、F2c、F3c、R1、R2、R3对应的区域如下。

靶向区域(单核苷酸多态性区域)：仅为序列编号1所示的碱基序列的第92个碱基处的G或A

F1c：序列编号1所示的碱基序列的第68～91个碱基(24bp)

F2c：序列编号1所示的碱基序列的第25～50个碱基(26bp)

F3c：序列编号1所示的碱基序列的第1～24个碱基(24bp)

R1：序列编号1所示的碱基序列的第93～115个碱基(23bp)

R2：序列编号1所示的碱基序列的第129～152个碱基(24bp)

R3：序列编号1所示的碱基序列的第153～172个碱基(20bp)

并且，作为阴性对照，准备了未添加模板核酸的样品。

准备检体如下：包含序列编号1所示的碱基序列的第92个碱基为G的序列的检体2个(检体编号1～2、烯丙基组合G/G)、包含序列编号1所示的碱基序列的第92个碱基为A的序列的检体2个(检体编号3～4、烯丙基组合A/A)、包含序列编号1所示的碱基序列的第92个碱基为G和A的序列的检体的混合检体2个(检体编号5～6、烯丙基组合A/G)、作为阴性对照的未添加模板的检体2个(检体编号7～8)，共计8个检体。

向样品管内的反应溶液中添加检体编号为1～8的模板核酸，放置在设定为65℃的加热器中，进行反应，然后从加热器中依次取出以使各样品管正好反应45分钟。

为了进行检测，准备如下的检测试剂，进行了制备。

■抗体固定化磁性颗粒

抗生物素抗体标记磁性颗粒(在DYNAL社制造的“Dynabeads M-450Epoxy”上标记DAKO社制造的“Monoclonal Mouse Anti-Biotin Code No.M0743”)

抗异羟基洋地黄毒苷抗体标记磁性颗粒(在DYNAL社制造的“Dynabeads M-450 Epoxy”上标记COVALAB R&D社制造的“AntiDigoxigenin Unlabeled”)

■酶标记抗体

碱性磷酸酶标记抗生物素抗体(DAKO社制造的“Polyclonal RabbitAnti-Biotin D5107”)

碱性磷酸酶标记抗异羟基洋地黄毒苷抗体(DAKO社制造的“Polyclonal Rabbit Anti-DIG/AP Rabbit F(ab’)Code No.D 5105”)

LAMP反应后，将LAMP产物分注为2份，进行如下的反应。

■向分注后的产物中分别添加5μl抗生物素抗体标记磁性颗粒和抗异羟基洋地黄毒苷抗体标记磁性颗粒，于室温各自反应5分钟。

■反应后，用磷酸缓冲液进行2次BF分离反应。

■分别添加20μl对应于各自的分注溶液的稀释至100倍的碱性磷酸酶标记抗生物素抗体和碱性磷酸酶标记抗异羟基洋地黄毒苷抗体，于室温反应60分钟。

■用磷酸缓冲液分别进行3次BF分离反应。

■各自添加100μl基质，于室温反应1分钟。此时，发光基质使用Wako社制造的“CDP-Star substrate”目录No.69086。

■移至测定用96孔黑板，在发光量测定器(ATTO社制造Luminescencer-JNRII)中进行10秒积分测定。

测定结果

上述反应的结果见表1和图13。表1表示在各种样品和检测试剂的组合下的发光量(单元：cps)，图13将该结果以棒状图表示。可知与样品的SNP相对应的结果作为发光量而得到。特别是样品的A/A、A/G和G/G的组合能够明确区分，能够利用PCR法以外的扩增法以1次的反应来区分A/A与A/G、G/G与A/G，而这在过去是困难的，从这个方面来说是非常有用的。

对在本变形例中使用的配体没有限制，只要能准备出与其特异性反应的受体，就可以进行变更。并且，在内引物FA(G)与内引物RA(G)、内引物FA(A)与内引物RA(A)的双方不带有配体也可以进行检测，例如，可以仅在内引物FA(G)的引物5’端标记生物素(biotin)，仅在内引物FA(A)的引物5’端标记异羟基洋地黄毒苷(Dig)。

[表1]

检体编号	烯丙基类型	抗生物素抗体修饰检测试剂	抗Dig抗体修饰检测试剂
				1	G/G	1047721	88771
2	G/G	1049072	80365
				3	A/A	778620	156982
4	A/A	759002	157842
				5	A/G	570613	349345
6	A/G	568269	345009
				7	阴性对照	428835	72617
8	阴性对照	425009	80345

II.在本发明的利用配体与受体的特异性结合检测核酸的方法中特别是利用分散性颗粒的凝集反应来检测核酸的方法

本发明提供如下的核酸检测方法：在上述那样的核酸的检测方法中，通过利用分散性颗粒的凝集反应，更加简单且高精度地进行具有高再现性的检测。

在上述本发明的核酸的检测方法中，检测对象的核酸被捕捉在固定基板上，利用酶基质反应等对该经捕捉的核酸进行检测。

与此相对，在利用分散性颗粒的凝集反应检测核酸的方法中，不使用固定基板，取而代之地使用分散性颗粒。在分散性颗粒的表面配置2个以上的受体，检测对象的核酸通过该受体结合在分散性颗粒上。分散性颗粒通过检测对象的核酸相继连结在一起，生成巨大的凝集块。利用分光光度计对其进行测定。该方法中，不需要预先用酶对受体进行修饰，不需要向酶中添加基质，能够利用分散性颗粒的凝集这种物理现象来确实且快速地检测核酸。下面详细地对该方法进行说明。

本发明提供一种核酸的检测方法，该方法基于由应检测的靶向核酸与分散性微粒的交联反应所产生的凝集来检测所述靶向核酸，所述检测方法包括如下工序：使结合有种类不同的第一和第二配体的靶向核酸、结合有两个以上的与所述第一配体特异性结合的受体的第一微粒、和结合有两个以上的与所述第二配体特异性结合的受体的第二微粒发生反应的工序；一个所述靶向核酸结合在所述第一和第二微粒上，从而使所述第一和第二微粒连结，并且，一个微粒上结合有2个以上的靶向核酸，所述靶向核酸各自与其他微粒结合，从而使多个微粒相互连结产生凝集，利用分光光度法对所述凝集进行测定的工序。

并且，本发明还提供一种可对核酸进行定量的方法，该方法包括如下工序：使分别结合有一个以上的所述种类不同的第一和第二配体的浓度已知的靶向核酸与所述第一和第二微粒反应，利用分光光度法进行测定的工序；对于不同浓度的靶向核酸同样地进行上述工序，由测定结果制作标准曲线的工序；使所述应检测的靶向核酸与所述第一和第二微粒反应，利用分光光度法进行测定的工序；基于所述标准曲线，确定应检测的靶向核酸的浓度的工序。

根据本发明，在核酸上结合配体，使其与结合有受体的分散性微粒反应，可以通过所述微粒的凝集来检测核酸，能够简单且精确地进行核酸的检测。

本发明的核酸检测方法使用分散性微粒，通过测定该微粒的凝集来进行核酸的检测。下面依次对本发明的方法进行说明。

首先，在应检测的靶向核酸上结合配体。此处，靶向核酸可以是生物试样所含有的核酸，也可以是任意的检体所含有的核酸，但并不限于这些。并且，核酸是指包括cDNA、基因组DNA、合成DNA、mRNA、全RNA、hnRNA、合成RNA的全部的核酸或核酸类似物，既可以是天然存在的核酸，也可以是人工合成的核酸。

与靶向核酸结合的配体可以使用例如亲水性有机化合物、分子氧、荧光素、Alexa、残基数为6以上的多肽、糖为2以上的糖链、生物素、蛋白质、聚组氨酸、HA、GST、Flag(DYKDDDDK的肽)等，但并不限于这些。生物素、分子氧、荧光素、Alexa等易于由市售获得，具有价格低的特征。并且，糖链和肽在化学结构的设计上自由度高，易于配齐两种以上。可以根据检测对象的靶向核酸、试样等来适当地选择所使用的配体。

靶向核酸上分别结合有一个以上的种类不同的第一配体和第二配体。在靶向核酸上结合配体的方法可以使用如下各种方法：(i)利用光、铂或连接物使核酸内部和末端部的碱基共价键合的方法(图14a)，例如，使核酸5’末端的氨基与配体的羧基共价键合的方法；(ii)合成核酸时使用结合有配体的引物，利用聚合酶伸长的方法(图14b)；(iii)合成核酸时，引入结合有配体的核苷酸来伸长的方法(图14c)；(iv)将利用末端脱氧核苷酸转移酶结合了配体的核苷酸嵌入核酸的3’末端的方法(图14d)等。

像生物试样或任意的检体等那样，在靶向核酸与其他核酸共存的试样中，可以使用(ii)(iii)的方法。在应检测的靶向核酸单独存在的情况中，使用任意的方法都可以。此外，在例如生物试样等中所含有的靶向核酸既可以利用PCR法进行扩增后再检测，也可以不进行扩增而直接用于检测。

结合在靶向核酸上的配体可以如图14所示那样使用二种配体。核酸的结构柔软，在本方法中，如后所述，核酸必须连结两个微粒，所以优选使用两种配体。

并且，结合在靶向核酸上的两种配体既可以各自为一个，也可以结合两个以上。由于“核酸”对“颗粒”的体积比极大，因此在一条核酸上结合三个以上的颗粒的可能性较低。因此，可以认为，即使在一条核酸上结合2个以上的配体，也不会影响微粒的凝集度。

然后，在分散性微粒上结合受体，该受体与结合在靶向核酸上的配体特异性结合。用于本发明的分散性微粒是指例如胶粒那样在溶液中分散的颗粒，虽然优选胶乳颗粒，但并不限于此。作为分散性微粒，粒径约为80～300nm左右的微粒在使用免疫比浊法装置测定比浊时是适宜的。

胶乳颗粒主要由聚苯乙烯构成，为了提高亲水性和分散性共聚有甲基丙烯酸。胶乳颗粒包括表面上不具有官能团的平坦型(プレ一ンタイプ)和具有官能团的官能团型。平坦型的表面荷电由于甲基丙烯酸的存在而具有负电荷，能够与蛋白质的具有正电荷的区域发生离子键合。并且能够进行疏水键合。平坦型的胶乳颗粒仅与蛋白质混合就能吸附蛋白质，使蛋白质的固定操作变得容易。

具有官能团的胶乳颗粒表面被设计为羧基和氨基等从表面暴露出，可以利用各种各样的官能团型胶乳颗粒。在胶乳颗粒上结合受体的方法包括：用水溶性碳化二亚胺结合羧酸和氨基的EDAC方法；预先混合EDC和NHS，结合羧酸和氨基的方法；使用具有双极性的连接物使氨基之间交联的方法；利用活化醛基或甲苯磺酰基结合蛋白质的方法等。本发明中，可以使用已有的任意方法，但特别优选EDAC法。另外，即使是胶乳颗粒以外的微粒，也可以利用公知的方法来结合受体。

结合在分散性微粒上的受体使用与结合在待检测的靶向核酸上的配体特异性结合的受体。作为受体，可以使用例如，抗体、植物凝血素、抗生蛋白链菌素、Ni等，但并不限于此。优选使用蛋白质，特别是抗体。将受体结合在微粒上的方法可以根据微粒来使用适宜的公知方法。

在一个方式中，在一个分散性微粒上结合单一种类的受体。根据本实施方式，在靶向核酸上结合有至少两种的配体，因此对应于一种靶向核酸要准备至少两种分散性微粒。即，要准备结合有与第一配体相对应的受体的第一分散性微粒(图15a)和结合有与第二配体相对应的受体的第二分散性微粒(图15b)。

在其他的方式中，也可以在一个分散性微粒上结合两种以上的受体。在该方式中，使与结合在一个靶向核酸上的两种配体中的一个配体相对应的受体和与另一个配体相对应的受体以外的受体结合在微粒上。即，进行设计使得靶向核酸的两种配体没有均结合在微粒上。

此外，本工序中受体在分散性微粒上的结合可以在检测核酸时进行，也可以使用预先结合有受体的分散性微粒来检测。并且，本工序也可以与上述制备靶向核酸的工序相继进行。

接着，对结合靶向核酸和微粒的工序进行说明。通过使上述那样的结合了配体的靶向核酸与结合了受体的第一和第二分散性微粒进行反应来结合。该反应可以通过同时混合含有靶向核酸的溶液和含有分散性微粒的溶液这两种溶液来进行，或者可以通过按顺序混合各分散性微粒，依次地进行。

图16给出了靶向核酸与微粒结合的示意图。图16中，结合在靶向核酸30上的第一配体31与第一微粒33结合。并且，结合在靶向核酸30上的第二配体32与第二微粒34结合。即，一个靶向核酸与第一微粒和第二微粒相结合，由此使第一和第二微粒连结在一起。进而，在一个微粒上结合2个以上的靶向核酸，该靶向核酸再分别与其他的微粒结合，由此使大量的微粒相互连结起来，结果产生微粒的凝集。另外，图16中，由受体延长出的虚线用于简易地表示核酸。

由此，靶向核酸存在于试样中的情况下，产生微粒的凝集，从而能够检测靶向核酸。此处，可以使用上述的发光标记物进行标记，通过光信号的分散状态来检测是否有微粒的凝集，但优选不使用发光标记物，而通过利用分光光度法测定吸光度来进行判定。

如图17的示意图所示，单独的微粒几乎不散射近红外光(图17a)。另一方面，凝集后的微粒与单独的微粒相比，表观直径变大，能够产生近红外光的散射(图17b)。因此，通过利用光度计测定相对于近红外区域的入射光的透过光的光度，就可以测定微粒的凝集度。此时，由于粒径为300nm以下的微粒凝集时会散射近红外光，所以优选使用粒径为300nm以下的微粒。

优选制备含有微粒的溶液，使其混合后(凝集前)的最终浓度以OD值表示为0.01～1，并且，凝集后的OD值为3以下。将含有靶向核酸的溶液与含有微粒的溶液进行混合时，为了避免配体和受体的结合不均，优选一方的体积不低于另一方的体积的20％，并且，优选使用混合乳胶搅拌器或通过移液操作迅速地搅拌。用于反应体系的缓冲液优选使用促进凝集的溶液。当使用不同的缓冲液的情况下，优选用该不同的缓冲液清洗微粒2～3次后使用。

使用抗原抗体作为配体-受体的情况下，优选在0℃～37℃的的温度反应5分钟～30分钟。其他的配体-受体可以使用适于反应的温度、时间、缓冲液，这些可以适当地进行选择。

另外，将混合后的反应溶液用于分光光度测定时，由于未凝集的微粒不散射近红外光，从而不需要B/F分离，可以直接用于测定反应体系。并且，利用PCR制备靶向核酸时，由于结合有配体的未反应的引物、或是未反应的核苷酸等的存在，可能会产生测定误差，在这种情况下，也可以将这些未反应的物质分离。分离的方法为：例如在一方的配体上结合生物素，使用结合有抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素的磁性颗粒进行B/F分离。此时，也可以将该磁性颗粒用作分散性微粒。

[进行核酸定量的方法]

接着，对使用本发明的方法进行核酸定量的方法进行说明。进行定量时，使用结合有上述那样的配体的靶向核酸，制备以各种浓度含有该靶向核酸的溶液。将各浓度的核酸溶液按照上述方法与微粒反应，利用分光光度法测定吸光度。根据该测定结果，制作基于核酸浓度和吸光度的标准曲线。根据该标准曲线，由测定了检测对象的靶向核酸的吸光度的结果确定核酸浓度。由此可以进行靶向核酸的定量。

并且，在含有两种以上的靶向核酸的试样中，在每种靶向核酸上结合不同的两种配体，仅将结合有与结合在应检测的靶向核酸上的配体特异性结合的受体的分散性微粒供给至反应中，由此可以从含有两种以上的靶向核酸的试样中同时对所期望的靶向核酸进行检测。

此处，结合在核酸上的配体以完全不同的配体为宜。或者，两种配体之中，一种配体可以使用与其他核酸通用的配体。

此外，上述的检测方法中，对于一个靶向核酸使用了两种配体，但也可以使用3种以上的配体，还可以使用结合有与各种配体特异性结合的受体的分散性微粒。

[对核酸的碱基序列中的变异进行检测的方法]

下面说明按照本发明对核酸的碱基序列中的变异进行检测的方法。作为核酸的变异，可以举出单核苷酸多态性(SNP)、缺失、插入等。此处，SNP(Single Nucleotide Polymorphisms)是指，基因组DNA上随处可见的随个体不同而不同的单核苷酸的多样性。

作为本发明的第一方式，提供了利用PCR-SSP法的核酸变异检测方法。PCR-SSP法是使用DNA聚合酶进行PCR的方法，但是，如果引物的3’末端不与模板DNA完全杂交的话，DNA聚合酶就几乎不起作用。

因此，使用具有与标准型的靶向核酸序列互补的序列的引物，利用PCR产生了扩增产物的情况下，说明未出现变异，反过来，不产生扩增产物的情况下，说明出现了变异。

该方法中使用的一个引物是结合有第一配体的检测用引物，其具有与靶向核酸序列互补的序列，其3’末端与所述靶向核酸序列中的变异部位相对应。另一个引物是结合有与所述第一配体不同的第二配体的通用引物，该引物具有与比所述靶向核酸的该变异部位更靠近5’末端侧的序列互补的序列。

图18给出了本实施方式的概念框图。图18(a)为没有变异的靶向核酸50、即标准型的靶向核酸50，可能存在变异的部位用实心圆52表示。图18(a)中，检测用引物54完全杂交，可以在与通用引物56之间利用PCR来获得扩增产物。另一方面，图18(b)为变异型的靶向核酸50。这种情况下，检测用引物54的3’末端不杂交，不发生PCR扩增。

下面依次对本实施方式中的工序进行说明。首先，(i)利用所述靶向核酸及所述两种引物54、56进行PCR。该PCR中，如上所述，仅在检测用引物54与靶向核酸完全杂交的情况下才能获得扩增产物。另外，无论是否存在靶向核酸的变异，通用引物56都会发生杂交。

接着，(ii)使所述工序中得到的PCR产物、结合有两个以上的与所述第一配体特异性结合的受体的第一分散性微粒、以及结合有两个以上的与所述第二配体特异性结合的受体的第二分散性微粒发生反应。

进而，(iii)通过一个所述PCR产物与所述第一分散性微粒和第二分散性微粒相结合，使该第一和第二分散性微粒连结起来，并且，在一个分散性微粒上结合有2个以上的PCR产物，该PCR产物分别与其他的分散性微粒结合，由此导致大量的分散性微粒相互连结，产生凝集，利用分光光度法对该凝集进行测定。

这些工序(ii)和(iii)按照上文所详细说明的对使用分散性微粒的检测方法中的记载来实施。接下来，(iv)由该测定结果，对所述基于PCR的核酸扩增进行判断。出现微粒的凝集的情况下，说明得到了扩增产物。因此，出现了凝集的情况下，可知靶向核酸上不存在变异。

根据以上所述的本发明实施方式，能够简单并且迅速地对核酸序列中的单核苷酸多态性(SNP)、缺失、或者插入等变异进行检测。

此外，靶向核酸序列中的变异为单核苷酸多态性的情况下，作为本发明实施方式的其他实施方式，也可以使用标准型和变异型两者所用的靶向核酸的检测用引物。即，作为检测用引物，使用结合有标准型用配体且具有与标准型的靶向核酸互补的序列的第一引物、以及结合有变异型用配体且具有与变异型的靶向核酸互补的序列的第二引物。这两种检测用引物既可以分别地用于PCR，也可以在同一反应体系中同时进行PCR。

本实施方式中，作为第一分散性微粒，使用与结合在每个引物上的配体相对应的微粒。即，使用结合了两个以上的与标准型用配体特异性结合的受体的标准型用分散性微粒、以及结合了两个以上的与变异型用配体特异性结合的受体的变异型用分散性微粒。

由此，在本实施方式中，对于标准型用微粒和变异型用微粒分别地进行所述第一方式的工序(iii)中的凝集反应。在PCR反应液中存在基于标准型用引物的PCR产物和基于变异型用引物的PCR产物中的任意一种，或是两者都存在。因此，在该反应液中，混合标准型用微粒与第二分散性微粒的组合，进行凝集反应。在该反应中出现凝集的情况下，可知靶向核酸为标准型。与之不同，使用变异型用微粒与第二分散性微粒的组合进行凝集反应。在该反应中出现凝集的情况下，可知靶向核酸为变异型。进而，当每种凝集反应中都出现凝集的情况下，可知靶向核酸中存在标准型和变异型这两者。这会在如下情况中发生，例如，当某人的基因组DNA为检体时，其单核苷酸多态性中的基因型不同的情况下就会发生。

根据本实施方式，利用一次PCR反应就能够判断单核苷酸多态性中的碱基型，并且，由于不需要B/F分离操作，因而能够极其简单且精确地判断碱基型。

另外，本实施方式中，配体结合在引物上，但也不限于此，也可以结合在核苷酸上。也可以使用结合有配体的核苷酸来进行PCR，从而使配体结合在扩增产物上。

并且，本实施方式的方法可以在例如以基因组DNA等为试样对多个变异部位同时检测时使用。

作为本发明的第二方式，提供使用PCR-SSP法进一步使用Tag序列的检测核酸变异的方法。此处，Tag序列是指人工设计的碱基序列，优选被设计为在染色体等生物试样中不存在、相互不会错误杂交、解离温度相同的序列。对每一个应检测的变异部位设计、制备该Tag序列。

本实施方式中，在所述第一方式的检测用引物上结合Tag序列来代替配体。该Tag序列优选结合在检测用引物的5’末端。并且，在所述第一方式的通用引物上结合生物素来代替配体。

本实施方式的工序中，首先，(i)利用所述靶向核酸以及所述两种引物进行PCR。该PCR中，如上述第一方式中所述那样，仅在检测用引物与靶向核酸完全杂交时、即靶向核酸中没有变异的情况下，才会生成扩增产物。

接下来，(ii)使用结合有抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素的磁性颗粒将结合有生物素的PCR产物从上述(i)所得到的PCR反应液中分离出来。由于生物素与抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素相结合，所以通过这种结合使扩增产物结合在磁性颗粒上，可以利用磁力将该磁性颗粒从PCR反应液中分离出来。

接着，(iii)将如此分离出的PCR产物供给于PCR，该PCR中使用了具有与Tag序列互补的序列的结合有第一配体的第一引物以及结合有第二配体的第二引物。由此可以获得Tag序列的扩增产物。即，靶向核酸中没有变异的情况下，产生引物的扩增产物，由此生成Tag序列的扩增产物。因此，可以说是变异部位的序列转换为Tag序列。如上所述，由于Tag序列被设计成会在PCR中简单无误地进行扩增的序列，因此该转换能够顺利地进行。

该Tag序列的扩增产物为第一和第二配体结合后的产物。于是，(iv)通过使结合有两个以上的与第一配体特异性结合的受体的第一分散性微粒以及结合有两个以上的与第二配体特异性结合的受体的第二分散性微粒发生反应，能够如上述那样地产生凝集，(v)利用分光光度法对该凝集进行测定即可。最后，(vi)由测定结果对基于PCR的Tag序列的扩增进行判断。即，若确认到Tag序列的扩增，则说明靶向核酸上没有变异。

以上所述的本实施方式的方法也可以在例如以基因组DNA等为试样同时对多个变异部位进行检测时使用。进而，通过使用这样的Tag序列，可以同时对多个变异部位进行检测而不受配体种类的限制。

另外，以上所述的本实施方式的方法中，以靶向核酸中没有变异的情况为例进行了说明，在对例如单核苷酸多态性这种变异型进行检测的情况下也可以同样地进行。这种情况下，可以通过使用具有与变异型的靶向核酸互补的序列的引物作为检测用引物，与上述相同地进行检测。

作为本发明的第三方式，提供应用了连接的核酸变异检测方法。本实施方式中检测的核酸变异为单核苷酸多态性(SNP)。本实施方式中，使用具有与靶向核酸序列互补的序列、其3’末端与所述单核苷酸多态性部位相对应、且结合有第一配体的检测用引物；以及具有与比所述靶向核酸的该多态性部位更靠近5’末端侧的序列互补的序列、其5’末端与该多态性部位所相邻的碱基相对应、且结合有第二配体的通用引物。

图19给出了本实施方式的概念框图。图19(a)为没有变异的靶向核酸60、即标准型的靶向核酸，可能存在变异的部位用实心圆62表示。图19(a)中，检测用引物64完全杂交，其3’末端与通用引物66的5’末端相邻。因此，通过对它们进行连接反应能够将两个引物之间连结起来。另一方面，图19(b)为变异型的靶向核酸。这种情况下，由于检测用引物64的3’末端不杂交，因而不发生连接反应。另外，无论靶向核酸是否存在变异，通用引物66都会杂交。

下面对本实施方式中的工序依次说明。首先，(i)使所述两种引物64、66与所述靶向核酸60杂交。然后，(ii)进行连接，将所述两种引物连结起来。(iii)使此处得到的连结后的引物与结合有两个以上的与所述第一配体特异性结合的受体的第一分散性微粒以及结合有两个以上的与所述第二配体特异性结合的受体的第二分散性微粒发生反应。

对于由该反应产生的凝集，(iv)利用分光光度法进行测定，(v)由该测定结果判断基于所述PCR的核酸的扩增，根据该判断结果来判别所述靶向核酸序列中的单核苷酸多态性。

根据本实施方式，可以通过连接反应检测是否存在变异，而无需进行PCR。因此，反应工序可以得到进一步的简化，能够降低成本并缩短时间。但是，由于探针的序列只能在变异部位的前后使用而受到限制。于是，在例如以DNA基因组序列等为试样的情况下，也可以对含有检测对象的变异部位的区域进行PCR扩增，然后将该部分切下。由此能够获得改善本实施方式的检测灵敏度和精度的效果。

在本实施方式中，对于将配体结合在引物上的位置和数量没有限制，但优选结合在不阻碍连接酶的反应的变异部位附近以外的位置上，例如结合在与变异部位相反的末端。

进一步，作为本发明实施方式中的其他实施方式，也可以使用标准型和变异型的靶向核酸这两者所用的检测用引物。即，作为检测用引物，使用结合有标准型用配体且具有与标准型的靶向核酸互补的序列的第一引物以及结合有变异型用配体且具有与变异型的靶向核酸互补的序列的第二引物。这两种检测用引物既可以分别参与连接反应，也可以在同一反应体系中同时反应。

在这样的实施方式中，作为第一分散性微粒，使用与结合在各自的引物上的配体相对应的微粒。即，使用结合有两个以上的与标准型用配体特异性结合的受体的标准型用分散性微粒以及结合有两个以上的与变异型用配体特异性结合的受体的变异型用分散性微粒。

由此，在该实施方式中，对于标准型用微粒和变异型用微粒分别地进行所述工序(iii)中的凝集反应。在连接后的反应液中存在基于标准型用引物的产物和基于变异型用引物的产物中的任意一种，或是两者都存在。在该反应液中，混合标准型用微粒与第二分散性微粒的组合，进行凝集反应。在该反应中出现凝集的情况下，可知靶向核酸为标准型。另外，使用变异型用微粒与第二分散性微粒的组合进行凝集反应。在该反应中出现凝集的情况下，可知靶向核酸为变异型。进而，当每种凝集反应中都出现凝集的情况下，可知靶向核酸中存在标准型和变异型这两者。这会在如下情况中发生，例如，当某人的基因组DNA为检体时，其单核苷酸多态性中的基因型不同的情况下就会发生。

根据本实施方式，利用一次连接反应就能够判断单核苷酸多态性中的碱基型，并且，由于不需要B/F分离操作，因而能够极其简单且精确地判断碱基型。

作为本发明的第四方式，提供一种利用连接、进一步利用Tag序列的核酸变异检测方法。在本实施方式中，被检测的核酸变异为单核苷酸多态性。

本实施方式中与上述第二方式同样地使用Tag序列。并且，与上述第三方式同样地利用连接反应检测变异。

即，本实施方式中，使用具有与靶向核酸序列互补的序列、其3’末端与所述靶向核酸序列中的变异部位相对应、且其5’末端上结合有Tag序列的检测用引物，以及具有与所述靶向核酸的比该变异部位更靠近5’末端侧的序列互补的序列、结合有生物素的通用的引物，并具有如下工序：

(i)使所述两种引物与所述靶向核酸杂交的工序；

(ii)接着所述工序(i)进行连接，将所述两种引物连结起来的工序；

(iii)使用结合有抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素的磁性颗粒将结合有生物素的经连结的引物从所述工序(ii)的反应体系中分离出来的工序；

(iv)使用所述工序(iii)所得到的经连结的引物、具有与所述Tag序列互补的序列且结合有第一配体的第一引物以及结合有第二配体的第二引物，进行PCR，获得该Tag序列的PCR产物；

(v)使所述工序(iv)所得到的PCR产物、结合有两个以上的与所述第一配体特异性结合的受体的第一分散性微粒、以及结合有两个以上的与所述第二配体特异性结合的受体的第二分散性微粒反应的工序；

(vi)一个所述PCR产物与所述第一分散性微粒和第二分散性微粒相结合，由此使该第一和第二分散性微粒连结起来，并且，在一个分散性微粒上结合有2个以上的PCR产物，该PCR产物再分别与其他分散性微粒结合，从而使大量的分散性微粒彼此连结产生凝集，利用分光光度法对该凝集进行测定的工序；和

(vii)由该测定结果对基于所述PCR的核酸扩增进行判定，根据该判定结果对所述靶向核酸序列上的变异进行检测的工序。

本实施方式的方法也可以在例如以基因组DNA等为试样对多个变异部位同时进行检测时使用。进而，通过使用这样的Tag序列，可以同时对多个变异部位进行检测而不受配体种类的限制。并且，可以利用连接反应来检测是否存在变异而无需进行PCR。因此，反应工序可以得到进一步的简化，能够降低成本并缩短时间。

以上所述的本发明的各种方式还可以用于靶向核酸的定量。

进行定量时，制备以已知浓度含有作为检测对象的靶向核酸的溶液，与上述方法同样地进行测定。对各浓度的核酸溶液进行这种测定，根据其测定结果，制作基于核酸浓度和吸光度的标准曲线。根据该标准曲线，由对检测对象的靶向核酸的吸光度进行测定的结果确定核酸浓度。由此可以进行靶向核酸的定量。

并且，以上所述的本发明的各种方式可以在含有两种以上的靶向核酸的试样中、或在存在两处以上的变异部位的核酸中同时对所期望的靶向核酸的变异进行检测。这种检测可如下进行：对于两处以上的变异同时进行PCR或连接反应，分注该反应溶液，使用用于检测各个变异部位的分散性微粒进行凝集反应，由此可以简便且同时平行地对两处以上的变异进行检测。

此外，上述的检测方法中，对于一个靶向核酸使用了两种配体，但也可以使用3种以上的配体，还可以使用结合有与各种配体特异性结合的受体的分散性微粒。

正如上述详细叙述的那样，根据本申请发明的方法可以简单、迅速且高精度地对所期望的核酸进行检测。由此，可以在例如临床检查的简便化和迅速化方面起到作用，进而可以在从快速检查到全自动分析的范围中广泛地应用。

作为实施本发明的方法时所使用的材料，可以使用例如：300nm羧基型胶乳颗粒(CMP)G0201(0.104meq COO/g)(JSR社)、EDAC(Sigma社)、兔抗生物素抗体(BETHYL laboratory inc.)、兔抗异羟基洋地黄毒苷(Dig.)抗体(Roche diagnostic corp.)、模板DNA、5’生物素化SD引物、3’Diog.化ED引物、Titaniumn taq DNA polymerase(BD社)、MES(WAKO社)。并且，作为所使用的机器，可以使用旋转混合器、旋涡混合器、切向流系统(tangental flow system)、透析膜、磁力搅拌器、分光光度计、比色皿等。

另外，上述I和II的方法均是反应性高且特异性高的方法。并且，由于多重反应也很容易，因而对于在液槽(cuvette)或微孔之类的溶液体系中的反应是非常适合的。因此，能够提供出一种最适于利用组合分注喷嘴的液体操作的高通量自动分析装置的检测方法。

工业实用性

本发明的核酸的检测方法用于对核酸的多态性、变异、表达量进行检查。特别地，本发明的核酸的检测方法用于进行SNP的检测。利用本发明的核酸的检测方法可查明每个人的SNP，查明每个人的疾病的遗传背景。由此使最适于每个人的药品的开发成为可能。

序列表

<110>奥林巴斯株式会社

<120>核酸的检测方法

<130>06S0589P

<150>JP 2005-161560

<151>2005-06-01

<150>JP 2005-175208

<151>2005-06-15

<160>25

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>23

<212>PRT

<213>人类

<400>1

Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile Gly Thr Val Leu Asp Gln

1               5                   10                  15

Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg

            20

<210>2

<211>25

<212>PRT

<213>人类

<400>2

Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn Ile Glu Glu Val Ala

1               5                   10                  15

Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe

            20              25

<210>3

<211>16

<212>PRT

<213>人类

<400>3

Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val

1               5                   10                  15

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人类

<400>4

ctgtctgacg agatagca    18

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>人类

<400>5

ctgtctgacg agatagcg    18

<210>6

<211>38

<212>DNA

<213>人类

<400>6

acactagtaa atcacagcac tcttacaggt catgagaa    38

<210>7

<211>298

<212>DNA

<213>人类

<400>7

caaatcttcc agcactgact ggtttcaccg aactgcataa cttctacctg cttacacata   60

acacaagctt ctttgaccat tttttggaac tcacaattta kactagacct catggttgcc  120

ctgtccttgg atacctcctg actgggaagc tgtctaggcc tttatcttac tgcagctgtt  180

aggcagtcat agaggttgac aggcaggcca cctgtctgac gagatagcrc aggtcaggtg  240

ggctcactct aagcccctga ttctcatgac ctgtaagagt gctgtgattt actagtgt    298

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>人类

<400>8

ctgtctgacg agatagca    18

<210>9

<211>18

<212>DNA

<213>人类

<400>9

ctgtctgacg agatagcg    18

<210>10

<211>18

<212>DNA

<213>人类

<400>10

caggtcaggt gggctcac    18

<210>11

<211>45

<212>DNA

<213>人类

<400>11

acctgcttac acataacaca agcttctttg accatttttt ggaac 45

<210>12

<211>38

<212>DNA

<213>人类

<400>12

acactagtaa atcacagcac tcttacaggt catgagaa    38

<210>13

<211>18

<212>DNA

<213>人类

<400>13

ctgtctgacg agatagca    18

<210>14

<211>18

<212>DNA

<213>人类

<400>14

ctgtctgacg agatagcg    18

<210>15

<211>18

<212>DNA

<213>人类

<400>15

caggtcaggt gggctcac    18

<210>16

<211>18

<212>DNA

<213>人类

<400>16

ctgtctgacg agatagca    18

<210>17

<211>18

<212>DNA

<213>人类

<400>17

ctgtctgacg agatagcg    18

<210>18

<211>18

<212>DNA

<213>人类

<400>18

caggtcaggt gggctcac    18

<210>19

<211>51

<212>DNA

<213>人类

<400>19

ctcccctcag aacataacat agtaatgcgg taagtcgcat aaaaaccatt c    51

<210>20

<211>51

<212>DNA

<213>人类

<400>20

ttcccctcag aacataacat agtaatgcgg taagtcgcat aaaaaccatt c    51

<210>21

<211>48

<212>DNA

<213>人类

<400>21

gtgaaaattc ccctaattcg atgaggtcgg cgcatagctg ataacaat 48

<210>22

<211>48

<212>DNA

<213>人类

<400>22

ttgaaaattc ccctaattcg atgaggtcgg cgcatagctg ataacaat 48

<210>23

<211>24

<212>DNA

<213>人类

<400>23

gcttatcttt ccctttattt ttgc    24

<210>24

<211>20

<212>DNA

<213>人类

<400>24

gctgatcggc aaggtgttct    20

<210>25

<211>171

<212>DNA

<213>人类

<400>25

gcttatcttt ccctttattt ttgctgcggt aagtcgcata aaaaccattc ttcataattc     60

aatccattta ctatgttatg ttctgagggg atgaaaattc ccctaattcg atgaagattc    120

ttgctcaatt gttatcagct atgcgccgac cagaacacct tgccgatcag c             171

Claims (23)

1.一种核酸的检测方法，该方法包括如下工序：

(1)在检测对象的核酸上结合第一和第二配体的工序；

(2)在结合了所述配体的核酸中，使所述第一配体与担载有与该配体特异性结合的受体的固相载体相结合，获得核酸-固相载体的复合体的工序；

(3)在所述复合体中，使所述第二配体与经标记物质修饰的与该配体特异性结合的受体相结合的工序；和

(4)通过检测所述标记物质来检测所述核酸的工序。

2.如权利要求1所述的核酸的检测方法，其中，所述第一配体与所述第二配体相同或不同。

3.一种核酸的检测方法，该方法中，检测对象为两种以上的核酸，所述检测方法包括如下工序：

(1)分别在所述两种以上的核酸上结合第一和第二配体时，按照针对所述核酸的每一种类使第一配体的种类不同的方式来结合所述第一和第二配体的工序；

(2)针对每一种所述第一配体准备担载有与所述第一配体特异性结合的受体的固相载体，并使所述第一配体分别结合在对应的所述固相载体上，根据每一种所述第一配体分离出所述核酸的工序；

(3)在与所述固相载体结合后的核酸中，将经标记物质修饰的与所述第二配体特异性结合的受体结合在所述第二配体上的工序；和

(4)通过检测所述标记物质来检测所述两种以上的核酸的工序。

4.一种核酸的检测方法，该方法同时检测作为检测对象的两种以上的核酸，所述检测方法包括如下工序：

(1)分别在所述两种以上的核酸上结合第一和第二配体时，按照针对所述核酸的每一种类使第二配体的种类不同的方式来结合所述第一和第二配体的工序；

(2)使所述第一配体与所述担载有与该配体特异性结合的受体的固相载体相结合，获得核酸-固相载体的复合体的工序；

(3)准备与所述两种以上的第二配体分别特异性结合的两种以上的受体，所述两种以上的受体采用标记物质进行了修饰，所述标记物质针对每种所述配体而不同，并使对应的所述受体分别结合在所述第二配体上的工序；和

(4)通过分别检测所述不同的标记物质来同时检测所述两种以上的核酸的工序。

5.如权利要求1～4的任一项所述的核酸的检测方法，其中，在使配体结合在所述作为检测对象的核酸上的工序中，将含有带有第一配体的引物和带有第二配体的引物的检查试剂添加至含有所述核酸的样品中，利用PCR法获得结合有所述第一和第二配体的经扩增的核酸，所述带有第一配体的引物在伸长侧末端具有与所述核酸的变异部分相对应的碱基，所述带有第二配体的引物能够利用与上述带有第一配体的引物的关系通过PCR法对所述核酸进行扩增。

6.如权利要求1～4的任一项所述的核酸的检测方法，其中，在使配体结合在所述作为检测对象的核酸上的工序中，将含有带有第一配体的核酸探针和带有第二配体的核酸探针的检查试剂添加至含有所述核酸的样品中，然后使所述带有第一和第二配体的核酸探针杂交在所述核酸上，最后通过连接反应将所述带有第一和第二配体的核酸探针结合起来，获得结合有所述第一和第二配体的核酸，所述带有第一配体的核酸探针在结合侧末端具有与所述核酸的变异部分相对应的碱基，所述带有第二配体的核酸探针能够在所述核酸上与上述带有第一配体的核酸探针进行连接反应。

7.如权利要求6所述的核酸的检测方法，其中，在进行所述连接反应前，预先通过PCR法对至少含有进行所述连接反应的核酸部分的区域进行扩增。

8.一种核酸的检测方法，该方法由核酸样品中检测作为检测对象的含有变异部分的核酸和/或含有标准部分的核酸，所述检测方法包括如下工序：

(1)将含有如下引物(i)、引物(ii)和引物(iii)的检查试剂添加进所述核酸样品中的工序，所述(i)为带有第一配体的引物，该引物在伸长侧末端具有与所述核酸的变异部分相对应的碱基；所述(ii)为带有第二配体的引物，该引物在伸长侧末端不具有与所述核酸的变异部分相对应的碱基，而在伸长侧末端具有与所述标准部分相对应的碱基；所述(iii)为带有第三配体的引物，该引物被设计为能够利用与所述带有第一和第二配体的引物的关系通过PCR法对所述含有变异部分和标准部分的核酸进行扩增；

(2)在所述带有第一和第三配体的引物之间和/或所述带有第二和第三配体的引物之间进行PCR，获得扩增后的修饰有所述第一和第三配体的含有变异部分的核酸和/或修饰有所述第二和第三配体的含有标准部分的核酸的工序；

(3)分别准备担载有与所述第一或第二配体特异性结合的受体的固相载体，并使所述第一或第二配体分别与相对应的所述固相载体结合，使修饰有所述第一配体的含有变异部分的核酸与修饰有所述第二配体的含有标准部分的核酸相分离的工序；

(4)在与所述固相载体结合后的核酸中，将经标记物质修饰的与所述第三配体特异性结合的受体结合在所述第三配体上的工序；和

(5)通过检测所述标记物质，对作为所述检测对象的含有变异部分的核酸和/或含有标准部分的核酸进行检测的工序。

9.一种核酸的检测方法，该方法由核酸样品中检测作为检测对象的含有变异部分的核酸和/或含有标准部分的核酸，所述检测方法包括如下工序：

(1)将含有如下引物(i)、引物(ii)和引物(iii)的检查试剂添加进所述核酸样品中的工序，所述(i)为带有第一配体的核酸探针，其在结合侧末端具有与所述核酸的变异部分相对应的碱基；所述(ii)为带有第二配体的核酸探针，其在结合侧末端不具有与所述核酸的变异部分相对应的碱基，而在结合侧末端具有与所述标准部分相对应的碱基；所述(iii)为带有第三配体的核酸探针，其被设计为能够与所述带有第一和第二配体的核酸探针的结合侧末端进行连接反应；

(2)将所述带有第一和第三配体的核酸探针杂交在含有所述变异部分的核酸上，和/或将所述带有第二和第三配体的核酸探针杂交在所述含有标准部分的核酸上的工序；

(3)在所述带有第一和第三配体的核酸探针之间和/或所述带有第二和第三配体的核酸探针之间进行连接反应，获得修饰有所述第一和第三配体的含有变异部分的核酸和/或修饰有所述第二和第三配体的含有标准部分的核酸的工序；

(4)分别准备担载有与所述第一或第二配体特异性结合的受体的固相载体，并使所述第一或第二配体分别与相对应的所述固相载体结合，使修饰有所述第一配体的含有变异部分的核酸与修饰有所述第二配体的含有标准部分的核酸相分离的工序；

(5)在与所述固相载体结合后的核酸中，将经标记物质修饰的与所述第三配体特异性结合的受体结合在所述第三配体上的工序；和

(6)通过检测所述标记物质，对作为所述检测对象的含有变异部分的核酸和/或含有标准部分的核酸进行检测的工序。

10.如权利要求9所述的核酸的检测方法，其中，在进行所述连接反应前，预先通过PCR法对进行所述连接反应的核酸部分进行扩增。

11.一种核酸的检测方法，该方法由核酸样品中检测作为检测对象的含有变异部分的核酸和/或含有标准部分的核酸，所述检测方法包括如下工序：

(1)将含有如下引物(i)、引物(ii)和引物(iii)的检查试剂添加进所述核酸样品中的工序，所述(i)为带有第一配体的引物，其在伸长侧末端具有与所述核酸的变异部分相对应的碱基；所述(ii)为带有第二配体的引物，其在伸长侧末端不具有与所述核酸的变异部分相对应的碱基，而在伸长侧末端具有与所述标准部分相对应的碱基；所述(iii)为带有第三配体的引物，其被设计为能够利用与所述带有第一和第二配体的引物的关系通过PCR法对所述含有变异部分和标准部分的核酸进行扩增；

(2)在所述带有第一和第三配体的引物之间和/或所述带有第二和第三配体的引物之间进行PCR，获得扩增后的修饰有所述第一和第三配体的含有变异部分的核酸和/或修饰有所述第二和第三配体的含有标准部分的核酸的工序；

(3)使所述第三配体与担载有与该配体特异性结合的受体的固相载体相结合，获得核酸-固相载体的复合体的工序；

(4)准备经不同的标记物质修饰的分别与所述第一或第二配体特异性结合的两种受体，并在所述第一和第二配体上分别结合相对应的所述受体的工序；和

(5)通过分别检测所述不同的标记物质，对作为所述检测对象的含有变异部分的核酸和/或含有标准部分的核酸同时进行检测的工序。

12.一种核酸的检测方法，该方法由核酸样品中检测作为检测对象的含有变异部分的核酸和/或含有标准部分的核酸，所述检测方法包括如下工序：

(1)将含有如下(i)、(ii)和(iii)的检查试剂添加进所述核酸样品中的工序，所述(i)为带有第一配体的核酸探针，其在结合侧末端具有与所述核酸的变异部分相对应的碱基；所述(ii)为带有第二配体的核酸探针，其在结合侧末端不具有与所述核酸的变异部分相对应的碱基，而在结合侧末端具有与所述标准部分相对应的碱基；所述(iii)为带有第三配体的核酸探针，其被设计为能够与所述带有第一和第二配体的核酸探针的结合侧末端进行连接反应；

(2)将所述带有第一和第三配体的核酸探针杂交在含有所述变异部分的核酸上和/或将所述带有第二和第三配体的核酸探针杂交在所述含有标准部分的核酸上的工序；

(3)在所述带有第一和第三配体的核酸探针之间和/或所述带有第二和第三配体的核酸探针之间进行连接反应，获得修饰有所述第一和第三配体的含有变异部分的核酸和/或修饰有所述第二和第三配体的含有标准部分的核酸的工序；

(4)使所述第三配体与担载有与该配体特异性结合的受体的固相载体相结合，获得核酸-固相载体的复合体的工序；

(5)准备经不同的标记物质修饰的分别与所述第一或第二配体特异性结合的两种受体，并在所述第一和第二配体上分别结合相对应的所述受体的工序；和

(6)通过分别检测所述不同的标记物质，对作为所述检测对象的含有变异部分的核酸和/或含有标准部分的核酸同时进行检测的工序。

13.如权利要求12所述的核酸的检测方法，其中，在进行所述连接反应前，预先通过PCR法对进行所述连接反应的核酸部分进行扩增。

14.如权利要求1～4、8～10的任一项所述的核酸的检测方法，其特征在于，所述固相载体为带有磁性的颗粒状的支持体，通过在外部施加磁力能够使所述磁性颗粒聚集在一个部位。

15.如权利要求1～4、8～10的任一项所述的核酸的检测方法，其中，所述配体和受体分别为抗原或抗体，所述配体与受体的特异性结合是抗原抗体反应。

16.一种核酸的检测方法，该方法基于由应检测的靶向核酸与分散性微粒的交联反应所产生的凝集来检测所述靶向核酸，所述检测方法包括如下工序：

(1)使结合有种类不同的第一和第二配体的靶向核酸、结合有两个以上的与所述第一配体特异性结合的受体的第一微粒、以及结合有两个以上的与所述第二配体特异性结合的受体的第二微粒发生反应的工序；和

(2)一个所述靶向核酸结合在所述第一和第二微粒上，从而使所述第一和第二微粒连结，并且，一个微粒上结合有2个以上的靶向核酸，所述靶向核酸各自与其他微粒结合，从而使多个微粒相互连结产生凝集，利用分光光度法对所述凝集进行测定的工序。

17.如权利要求16所述的核酸的检测方法，该方法包括如下工序：

(1)使分别结合有一个以上的所述种类不同的第一和第二配体的浓度已知的靶向核酸与所述第一和第二微粒反应，利用分光光度法进行测定的工序；

(2)对于不同浓度的靶向核酸同样地进行上述工序，由测定结果制作标准曲线的工序；

(3)使所述应检测的靶向核酸与所述第一和第二微粒反应，利用分光光度法进行测定的工序；和

(4)基于所述标准曲线，确定应检测的靶向核酸的浓度的工序。

18.如权利要求16所述的核酸的检测方法，其中，所述靶向核酸为结合有3种以上配体的靶向核酸，并且所述分散性微粒为结合有用于与所述3种以上配体分别特异性结合的受体的分散性微粒。

19.如权利要求18所述的核酸的检测方法，该方法在含有两种以上靶向核酸的试样中仅检测所述应检测的靶向核酸，其中，在所述含有两种以上靶向核酸的试样中，针对每一靶向核酸的种类结合有一种或两种不同的配体，并且，所述分散性微粒为结合有用于与结合在应检测的靶向核酸上的配体特异性结合的受体的分散性微粒。

20.如权利要求19所述的核酸的检测方法，其中，所述分散性微粒是粒径为300nm以下的胶乳颗粒。

21.如权利要求16所述的核酸的检测方法，其中，所述配体选自亲水性有机化合物、分子氧、荧光素、Alexa、残基数为6以上的多肽、二糖以上的糖链、生物素、蛋白质、聚组氨酸、HA、GST和Flag。

22.如权利要求16所述的核酸的检测方法，其中，通过利用结合有第一配体的第一引物和结合有与第一配体种类不同的第二配体的第二引物的聚合酶链反应法来制备结合有所述配体的靶向核酸。

23.如权利要求16所述的核酸的检测方法，其中，通过利用结合有所期望的配体的核苷酸的聚合酶链反应法来制备结合有所述配体的靶向核酸。

Images