CN112557666B - 一种基于核酸滚环扩增反应的同时检测多种生物标志物的试剂盒 - Google Patents

一种基于核酸滚环扩增反应的同时检测多种生物标志物的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于核酸滚环扩增反应的同时检测多种生物标志物的试剂盒，涉及标志物检测技术领域。本发明所述试剂盒中包含四种独立的成分：标记单链脱氧核糖核酸的特异性抗体溶液；包被所述生物标志物的特异性抗体的磁珠悬浊液；含有环状脱氧核糖核酸的反应液；含有不同探针的反应液。本发明所述试剂盒进行多种标志物的检测时，与雅培化学发光检测结果相近，甚至在足够时间内能够检测到更低的浓度(ag/ml)，灵敏度明显优于化学发光检测方法；如在检测心血管疾病生物标志物如：心肌肌钙蛋白I(cTnI)、肌红蛋白(Myo)和肌酸激酶同工酶(CKMB)时，在一个反应杯中同时完成三项指标的检测，且互相不干扰结果。

Description

一种基于核酸滚环扩增反应的同时检测多种生物标志物的试 剂盒
技术领域
本发明属于标志物检测技术领域，具体涉及一种基于核酸滚环扩增反应 的同时检测多种生物标志物的试剂盒。
背景技术
免疫检测技术是目前最常用且最经典的检测技术之一，其主要特点是： 利用抗体和抗原的特异性识别相互结合发生免疫结合反应。根据标志物的不 同，主要有放射免疫检测技术、酶联免疫吸附检测技术、胶乳增强免疫比浊 检测技术、免疫层析检测技术和化学发光检测技术。放射免疫检测技术是基 于用放射性核素作为标记物标记抗原或抗体所进行的抗原抗体反应，放射免疫技术需特殊仪器设备且有一定的放射性危害，并没有广泛应用。酶联免疫 吸附检测技术是基于抗原抗体反应的特异性与酶对底物的高效催化活性相结合的免疫检测技术，通过将酶标记的抗原或抗体与待检标本中的相应成分 特异性结合，根据酶作用底物后的颜色变化，采用肉眼或酶标检测仪分析、 判断结果，其灵敏度较低(ng/ml)且操作繁琐，耗时较长。胶乳增强免疫比浊检测技术是目前在全自动生化分析仪上应用最广泛的检测技术，是基于 用胶乳颗粒作为标记物标记抗原或抗体进行的抗原抗体反应，通过抗原抗体 反应使胶乳颗粒交联形成浊度并与待检物浓度呈正比，但其灵敏度较低 (ng/ml)，对低浓度待检物无法保证准确度。免疫层析检测技术主要分为胶 体金免疫层析检测技术和荧光免疫层析检测技术，前者基于胶体金颗粒标记 物标记抗体或抗原进行反应，主要用于定性检测，后者基于其荧光标记物标 记抗体或抗原进行反应，通过检测荧光信号输出结果，其灵敏度较高 (pg/ml)，反应速度快且操作简便，被广泛应用于急诊和床旁诊断，但是其 固相反应原理导致其重复性不好，只能应用于初步筛查结果。化学发光免疫检测技术是将化学发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的 一种新型标记免疫测定技术，通过将发光物质或酶直接标记于抗原或抗体 上，反应后经氧化剂或催化剂的激发后，即可快速产生发光，其产生的光量 子的强度与待测物的浓度可成比例，化学发光免疫检测技术具有高灵敏度(fg/ml)、特异性和稳定性，宽线性范围，高通量和高度自动化等特点被临床广泛应用。上述常用免疫检测技术有各自的优势，但也有各种不同的缺陷， 例如灵敏度低、反应时间长、操作繁琐、不能同时联合检测多个生物标志物 等等。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于核酸滚环扩增反应的同时检 测多种生物标志物的试剂盒，可同时检测多种生物标志物，具有灵敏度高、 结果准确、操作简易、反应时间短且不同生物标志物之间不干扰等优点。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种基于核酸滚环扩增反应的同时检测多种生物标志物 的试剂盒，所述试剂盒由4个独立包装的组分组成；
组分1包括标记单链脱氧核糖核酸的特异性抗体溶液，每个所述生物标 志物标记不同的单链脱氧核糖核酸；
组分2包括包被所述生物标志物的特异性抗体的磁珠悬浊液；组分1中 的特异性抗体与组分2中的特异性抗体不同，但互为配对，且能够实现对所 述生物标志物的双抗夹心反应；
组分3包括含有不同环状脱氧核糖核酸的反应液，所述环状脱氧核糖核 酸分别与组分1中的对应的单链脱氧核糖核酸部分互补；
组分4包括含有不同探针的反应液，所述探针中包括一个荧光基团、一 个脱嘌呤/脱嘧啶和一个淬灭基团。
优选的，当所述生物标志物为检测心血管疾病的生物标志物时，包括心 肌肌钙蛋白I cTnI、肌红蛋白Myo和肌酸激酶同工酶CKMB。
优选的，所述组分1的特异性抗体溶液中包括ssDNA1-cTnI Ab1、 ssDNA2-Myo Ab1和ssDNA3-CKMB Ab1；述ssDNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，ssDNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，ssDNA3的核苷 酸序列如SEQ ID NO.3所示；
组分2的磁珠悬浊液中包括Mb-cTnI Ab2、Mb-Myo Ab2和Mb-CKMB Ab2；
组分3的反应液中包括Circular DNA1、Circular DNA2、Circular DNA3、DNA聚合酶、dNTP、MgAC2、DTT和Tris buffer；所述Circular DNA1 的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示，Circular DNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，CircularDNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
组分4的反应液中包括cTnI-FAM-AP-BHQ2、Myo-Cy3-AP-BHQ2、 CKMB-Cy5-AP-BHQ2、Endonuclease IV和buffer；所述cTnI-FAM-AP-BHQ2 的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述Myo-Cy3-AP-BHQ2的核苷酸序 列如SEQ ID NO.11所示，所述CKMB-Cy5-AP-BHQ2的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
优选的，所述ssDNA1-cTnIAb1、ssDNA2-Myo Ab1和ssDNA3-CKMB Ab1的制备方法，包括：(1)分别合成5’端修饰DIBO基团的ssDNA1、ssDNA2 和ssDNA3，得DIBO-ssDNA1、DIBO-ssDNA2和DIBO-ssDNA3；
(2)分别对cTnIAb1、Myo Ab1和CKMB Ab1进行重氮化处理，使抗 体Fc片段上的糖链被修饰生成重氮基团，得N3-cTnIAb1、N3-Myo Ab1和 N3-CKMB Ab1；
(3)分别将所述DIBO-ssDNA1、DIBO-ssDNA2和DIBO-ssDNA3与 N3-cTnI Ab1、N3-Myo Ab1和N3-CKMB Ab1进行偶联反应，得所述 ssDNA1-cTnIAb1、ssDNA2-Myo Ab1和ssDNA3-CKMB Ab1；
步骤(1)和步骤(2)不存在时间上的先后关系。
本发明提供了一种基于核酸滚环扩增反应的同时检测多种生物标志物 的试剂盒，所示试剂盒中包含了四种独立的成分，在进行相应的多种生物标 志物的检测时，原理如图1所示，将含有多种生物标志物的样品与组分1和组分2进行混合，使目标抗原能够与配对抗体充分发生“夹心”反应；利用磁 场固定反复漂洗，去除未发生反应的组分1；加入组分3和组分4，并置于 拥有多荧光通道的PCR仪器中恒温反应10～30分钟：该反应主要分为两步， 首先是利用DNA聚合酶、Circular DNA与抗体标记的ssDNA不断发生 滚环扩增反应形成具有重复序列的单链DNA产物，同时荧光探针与扩增后 的单链DNA发生杂交形成断续的短双链DNA，然后Endonuclease IV特异 性识别并切割短双链DNA上的AP位点，使荧光探针被切断并脱落下来， 此时荧光基团被释放，持续产生荧光；最后进行读数记录各种荧光强度数值， 间接计算得到各标志物的浓度值。本发明所述试剂盒进行多种标志物的检测时，与雅培化学发光检测结果相近，甚至能够检测到更低的浓度(ag/ml)， 灵敏度明显优于化学发光检测方法；如在检测心血管疾病生物标志物如：心 肌肌钙蛋白I(cTnI)、肌红蛋白(Myo)和肌酸激酶同工酶(CKMB)时， 在一个反应杯中同时完成三项指标的检测，且互相不干扰结果。
附图说明
图1为本发明所述试剂盒的检测原理图；
图2为不同浓度的cTnI样品的荧光值与时间关系；
图3为cTnI的定标曲线；
图4为不同浓度的Myo样品的荧光值与时间关系；
图5为Myo的定标曲线；
图6为不同浓度的CKMB样品的荧光值与时间关系；
图7为CKMB的定标曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种基于核酸滚环扩增反应的同时检测多种生物标志物 的试剂盒，所述试剂盒由4个独立包装的组分组成；
组分1包括标记单链脱氧核糖核酸的特异性抗体溶液，每个所述生物标 志物标记不同的单链脱氧核糖核酸；
组分2包括包被所述生物标志物的特异性抗体的磁珠悬浊液；组分1中 的特异性抗体与组分2中的特异性抗体不同，但互为配对，且能够实现对所 述生物标志物的双抗夹心反应；
组分3包括含有不同环状脱氧核糖核酸的反应液，所述环状脱氧核糖核 酸分别与组分1中的对应的单链脱氧核糖核酸部分互补；
组分4包括含有不同探针的反应液，所述探针中包括一个荧光基团、一 个脱嘌呤/脱嘧啶和一个淬灭基团。
本发明所述试剂盒可用于多种不同疾病的生物标志物的检测，包括蛋白 质、核酸、小分子等，均能被特异性识别和结合，且针对不同疾病的生物标 志物，其检测原理相同。
在本发明中，当所述生物标志物为检测心血管疾病的生物标志物时，优 选包括心肌肌钙蛋白I cTnI、肌红蛋白Myo和肌酸激酶同工酶CKMB；所 述组分1的特异性抗体溶液中优选包括ssDNA1-cTnIAb1、ssDNA2-Myo Ab1 和ssDNA3-CKMB Ab1；组分2的磁珠悬浊液中优选包括Mb-cTnI Ab2、 Mb-Myo Ab2和Mb-CKMB Ab2；组分3的反应液中优选包括CircularDNA1、 Circular DNA2、Circular DNA3、DNA聚合酶、dNTP、MgAC2、DTT 和Tris buffer；组分4的反应液中优选包括cTnI-FAM-AP-BHQ2、 Myo-Cy3-AP-BHQ2、CKMB-Cy5-AP-BHQ2、Endonuclease IV和buffer。
本发明所述组分1中特异性抗体溶液中ssDNA1-cTnIAb1、ssDNA2-Myo Ab1和ssDNA3-CKMB Ab1的制备方法相同，因此仅以ssDNA1-cTnI Ab1 的制备方法进行详细说明，ssDNA2-Myo Ab1和ssDNA3-CKMB Ab1的制备 方法在此不再赘述。本发明所述ssDNA1-cTnIAb1的制备方法，优选包括：
(1)合成5’端修饰DIBO基团的ssDNA1，得DIBO-ssDNA13；
(2)对cTnIAb1进行重氮化处理，使抗体Fc片段上的糖链被修饰生 成重氮基团，得N3-cTnIAb1；
(3)将所述DIBO-ssDNA1与N3-cTnI Ab1进行偶联反应，得所述 ssDNA1-cTnIAb1；
步骤(1)和步骤(2)不存在时间上的先后关系。
本发明所述ssDNA1的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.1所示： AAGTATTACCAGAAACATCCATCCTTATCAACTA。本发明优选使用 ThermoFisher公司的SiteClickTM AntibodyAzidoModification Kit对cTnI Ab1 进行处理，使该抗体Fc片段上的糖链被修饰生成重氮基团，从而得N3-cTnI Ab1。本发明所述偶联反应的体系优选包括：Tris buffer(pH7.0)20mM，DIBO-ssDNA1200μM和N3-cTnIAb11mg/ml；所述偶联反应的程序优选为 25℃静置12h。本发明在所述偶联反应结束后，优选还包括使用分子筛纯化 (购自GE，为HiPrep 16/60Sephacryl S-100HR*，柱容量160ml，流速0.5 ml/min)得到所述ssDNA1-cTnIAb1。本发明所述cTnIAb1优选购自海肽生 物，货号16A11。在本发明中，所述Myo Ab1优选购自菲鹏生物，货号 MYO02；所述CKMB Ab1优选购自菲鹏生物，货号CKMB04。
在本发明中，所述ssDNA2的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示： CCAGTTTCTCGAAGAGAAACCGGTAAGTGCAC；所述ssDNA3的核苷酸 序列优选如SEQ ID NO.3所示：GGTGTAGCTCAATTGGTAGAGCAAC。
本发明所述组分2的磁珠悬浊液中优选包括Mb-cTnIAb2、Mb-Myo Ab2 和Mb-CKMBAb2，且Mb-cTnI Ab2、Mb-Myo Ab2和Mb-CKMB Ab2的制 备方法相同，仅以Mb-cTnIAb2为例进行说明，Mb-Myo Ab2和Mb-CKMB Ab2的制备方法不再赘述。
本发明所述Mb-cTnIAb2的制备方法，优选包括：①取200μl的羧基磁 珠(ThermoFisher DynabeadsTM M-270 Carboxylic Acid)加入1个2ml的离心 管中，磁分离3min，然后去上清；
②向离心管中加入2倍体积的SDS清洗液，震荡混匀，磁分离去上清， 清洗2次；
③向离心管中同时加入100μl的50mg/ml EDC，和100μl的50mg/mL NHS震荡混匀；
④将一个离心管置于混匀器上活化30min。活化完成后，使用2倍体积 的0.02MMES清洗两次，去上清；
⑤在离心管中加入80μg的MyoAb2抗体，300μl的0.02M MES，偶联 2～3h。偶联结束后用2倍体积的磁珠封闭液清洗2次，去上清。
⑥再向离心管中加入2倍体积的磁珠封闭液，震荡混匀30min，去上清。
⑦用2倍体积的磁珠保存液清洗一次，去上清，然后移至30ml的磁珠 保存液中保存待用。
本发明所述组分2中，所述cTnI Ab2抗体优选购自海肽生物，货号 4T21-19C7；所述Myo Ab2抗体优选购自菲鹏生物，货号MYO03；所述CKMB Ab2抗体优选购自菲鹏生物，货号CKMB03。
本发明所述组分3的反应液中优选包括Circular DNA1、Circular DNA2、Circular DNA3、DNA聚合酶、dNTP、MgAC2、DTT和Tris buffer。本 发明所述CircularDNA1的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.4所示， TAGTTGATAAGGAATCAAAGCAGCCAGGAGCAAACTCTTGGTACAGC； Circular DNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，GTGCACTTACCG ATTCGGATCGCTCATCAGTTCTGCTCTGATACCTG；Circular DNA3的核 苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，GTTGCTCTACC CACCTGTGTATCTTTGATTCGTCAGCCCTGTATCC。本发明中所述Circular DNA1、Circular DNA2和Circular DNA3的制备方法相同，仅以Circular DNA1 为例进行说明，Circular DNA2和Circular DNA3的制备方法不再赘述。
本发明所述Circular DNA1的制备方法，优选包括：合成环状DNA1的 单链DNA序列，和对应的环状连接序列linker1(SEQ ID NO.7， TCCTTATCAACTAGCTGTACCA)，并溶解于10mM Tris-HCl，pH8.0，100 mM NaCl，1mM EDTA缓冲液中；
②取等体积的环状DNA和linker1混合，置于95℃加热5min，然后室 温冷却；
③在上述混合液中加入T4 DNAligase及ligase buffer(Takara)，置于37℃ 反应2h。反应结束后置于65℃加热5min，使T4 DNAligase失活；
④在上述反应液中加入ExoI(Takara)和ExoIII(Takara)，置于37℃ 反应过夜，降解未发生连接反应的linker1。反应结束后置于85℃加热20min，使ExoI和ExoIII失活；
⑤最后用乙醇沉淀法纯化得到环状脱氧核糖核酸Circular DNA1。
本发明所述Circular DNA2和Circular DNA3的制备方法中，其所用的 环状DNA2所对应的环状连接序列linker2的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.8 所示：CGGTAAGTGCACCAGGTATCA；环状DNA3所对应的环状连接序 列linker3的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示：GGTAGAGCAAC GGATACAGG。
本发明所述组分4的反应液中优选包括cTnI-FAM-AP-BHQ2、 Myo-Cy3-AP-BHQ2、CKMB-Cy5-AP-BHQ2、Endonuclease IV和buffer。本 发明所述buffer优选包括Tris-Ac(pH值为7.9)、MgAC2、NaAc和DTT。 本发明所述反应液在配制时，优选的将50mM的所述Tris-Ac、10mM的所 述MgAC2、100mM的NaAc、1mM的DTT、100U/ml的Endonuclease IV、 100nm的cTnI-FAM-AP-BHQ2、100nm的Myo-Cy3-AP-BHQ2和100nm的 CKMB-Cy5-AP-BHQ2进行混合即可；所述cTnI-FAM-AP-BHQ2的核苷酸 序列如SEQ ID NO.10所示：GGAGCAAACT(FAM)CXTGGT(BHQ2)CTTC， 所述Myo-Cy3-AP-BHQ2的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示： ATCAGTTCTGC(FAM)TXTGAT(BHQ2)CGAA，所述CKMB-Cy5-AP-BHQ2 的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示：TTTGATTCGTCA(FAM)GXCCTGT(BHQ2)GCTT。
本发明还提供了一种基于上述试剂盒检测多种标志物的方法，包括以下 步骤：1)将含有不同标志物的样品与组分1和组分2进行混合，使目标抗 原能够与配对抗体充分发生“夹心”反应；
2)利用磁场固定反复漂洗，去除未发生反应的组分1；
3)加入组分3和组分4，并置于拥有多荧光通道的PCR中恒温反应10～30 分钟；
4)数记录各种荧光强度数值，计算得到不同标志物的浓度值。
在本发明中，步骤1)所述“夹心”反应的温度优选为37℃，反应时间优 选为5min；步骤2)中所述磁场固定反复漂洗优选包括磁场分离10s，加入 漂洗液，去磁场混匀10s，再磁场分离后去除漂洗液，重复3次；步骤3) 中优选发生两步反应，首先是利用DNA聚合酶、CircularDNA与抗体标 记的单链DNA不断发生滚环扩增反应形成具有重复序列的单链DNA产物，同时荧光探针与扩增后的单链DNA发生杂交形成断续的短双链DNA，然后Endonuclease IV特异性识别并切割短双链DNA上的AP位点，使荧光探针 被切断并脱落下来，此时荧光基团被释放，持续产生荧光；所述恒温反应的 温度优选为37℃。
本发明实施例中同样利用所述试剂盒检测心血管疾病的三种标志物，具 体的：cTnI定标方程为y＝446.78x-1117.6，相关系数R2＝0.9894；x为标志物 浓度的lgC值，单位为fg/ml，y为10min时的荧光值；
Myo定标方程为y＝582.52x-73.814，相关系数R2＝0.9958；x为标志物 浓度的lgC值，单位为pg/ml，y为10min时的荧光值；
CKMB定标方程为y＝599.03x-141.31，相关系数R2＝0.9931；x为标志 物浓度的lgC值，单位为pg/ml，y为10min时的荧光值。
下面结合实施例对本发明提供的一种基于核酸滚环扩增反应的同时检 测多种生物标志物的试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发 明保护范围的限定。
实施例1
试剂盒中各组分的制备方法
1.组分1的制备方法：
1.1 ssDNA1-cTnIAb1的制备方法
①合成5’端修饰DIBO基团的单链DNA1(DIBO-ssDNA1，SEQ ID NO.1)；
②使用ThermoFisher公司的SiteClickTM Antibody Azido Modification Kit对cTnIAb1进行处理，使该抗体Fc片段上的糖链被修饰生成重氮基团；
③将5’端修饰DIBO基团的单链DNA1(DIBO-ssDNA1)与重氮化 后的cTnIAb1(N3-cTnIAb1)进行反应偶联生成ssDNA1-cTnIAb1；
表1偶联体系及反应条件
④反应结束后，使用分子筛纯化得到ssDNA1-cTnIAb1。
1.2 ssDNA2-Myo Ab1的标记方法
①合成5’端修饰DIBO基团的单链DNA2(DIBO-ssDNA2，SEQ ID NO.2)；
②使用ThermoFisher公司的SiteClickTM Antibody Azido Modification Kit对Myo Ab1进行处理，使该抗体Fc片段上的糖链被修饰生成重氮基团；
③将5’端修饰DIBO基团的单链DNA2(DIBO-ssDNA2)与重氮化后 的Myo Ab1(N3-Myo Ab1)进行反应偶联生成ssDNA2-Myo Ab1；
表2偶联体系及反应条件
④反应结束后，使用分子筛纯化得到ssDNA2-Myo Ab1。
1.3 ssDNA3-CKMB Ab1的标记方法
①合成5’端修饰DIBO基团的单链DNA3(DIBO-ssDNA3，SEQ ID NO.3)；
②使用ThermoFisher公司的SiteClickTM Antibody Azido Modification Kit对CKMB Ab1进行处理，使该抗体Fc片段上的糖链被修饰生成重氮基团；
③将5’端修饰DIBO基团的单链DNA3(DIBO-ssDNA3)与重氮化后 的CKMB Ab1(N3-CKMB Ab1)进行反应偶联生成ssDNA3-CKMB Ab1；
表3偶联体系及反应条件
④反应结束后，使用分子筛纯化得到ssDNA3-CKMB Ab1。
2.组分2的制备方法
2.1 Mb-cTnIAb2的偶联方法
①取200μl的羧基磁珠(ThermoFisher DynabeadsTM M-270 Carboxylic Acid)加入1个2ml的离心管中，磁分离3min，然后去上清；
②向离心管中加入2倍体积的SDS清洗液，震荡混匀，磁分离去上清， 清洗2次；
③向离心管中同时加入100μl的50mg/ml EDC，和100μl的50mg/ml NHS 震荡混匀；
④将一个离心管置于混匀器上活化30min。活化完成后，使用2倍体积 的0.02MMES清洗两次，去上清；
⑤在离心管中加入120μg的cTnIAb2抗体，300μl的0.02M MES，偶联 2～3h。偶联结束后用2倍体积的磁珠封闭液清洗2次，去上清。
⑥再向离心管中加入2倍体积的磁珠封闭液，震荡混匀30min，去上清。
⑦用2倍体积的磁珠保存液清洗一次，去上清，然后移至30ml的磁珠 保存液中保存待用。
2.2 Mb-MyoAb2的偶联方法
①取200μl的羧基磁珠(ThermoFisher DynabeadsTM M-270 Carboxylic Acid)加入1个2ml的离心管中，磁分离3min，然后去上清；
②向离心管中加入2倍体积的SDS清洗液，震荡混匀，磁分离去上清， 清洗2次；
③向离心管中同时加入100μl的50mg/mL EDC，和100μl的50mg/mL NHS震荡混匀；
④将一个离心管置于混匀器上活化30min。活化完成后，使用2倍体积 的0.02MMES清洗两次，去上清；
⑤在离心管中加入80μg的MyoAb2抗体，300μl的0.02M MES，偶联 2～3h。偶联结束后用2倍体积的磁珠封闭液清洗2次，去上清。
⑥再向离心管中加入2倍体积的磁珠封闭液，震荡混匀30min，去上清。
⑦用2倍体积的磁珠保存液清洗一次，去上清，然后移至30ml的磁珠 保存液中保存待用。
2.3 Mb-CKMBAb2的偶联方法
①取200μl的羧基磁珠(ThermoFisher DynabeadsTM M-270 Carboxylic Acid)加入1个2ml的离心管中，磁分离3min，然后去上清；
②向离心管中加入2倍体积的SDS清洗液，震荡混匀，磁分离去上清， 清洗2次；
③向离心管中同时加入100μl的50mg/ml EDC，和100μl的50mg/ml NHS 震荡混匀；
④将一个离心管置于混匀器上活化30min。活化完成后，使用2倍体积 的0.02MMES清洗两次，去上清；
⑤在离心管中加入80μg的CKMB Ab2抗体，300μl的0.02M MES，偶 联2～3h。偶联结束后用2倍体积的磁珠封闭液清洗2次，去上清。
⑥再向离心管中加入2倍体积的磁珠封闭液，震荡混匀30min，去上清。
⑦用2倍体积的磁珠保存液清洗一次，去上清，然后移至30ml的磁珠 保存液中保存待用。
3.组分3的制备方法
3.1环状脱氧核糖核酸的制备方法
①分别合成Circular DNA1(SEQ ID NO.4)、Circular DNA2(SEQ ID NO.5)、Circular DNA3(SEQ ID NO.6)的单链DNA序列，和它们对应的环 状连接序列linker1(SEQID NO.7)、linker2(SEQ ID NO.8)、linker3(SEQ ID NO.9)，并分别溶解于10mM Tris-HCl，pH8.0，100mM NaCl，1mM EDTA 缓冲液中；
②分别取等体积的Circular DNA和linker混合，置于95℃加热5min， 然后室温冷却；
③在上述混合液中加入T4 DNAligase及ligase buffer(Takara)，置于37℃ 反应2h。反应结束后置于65℃加热5min，使T4 DNAligase失活；
④在上述反应液中加入ExoI(Takara)和ExoIII(Takara)，置于37℃ 反应过夜，降解未发生连接反应的linker。反应结束后置于85℃加热20min， 使ExoI和ExoIII失活；
⑤最后分别用乙醇沉淀法纯化得到环状脱氧核糖核酸Circular DNA1、 CircularDNA2、CircularDNA3。
3.2反应液的制备方法
①按照表4进行反应液配制；
表4组分3的反应液配制表
②反应液配制好后，置于-20℃保存待用。
4.组分4的制备方法
4.1荧光探针的制备方法
①按表5分别合成SEQ ID NO.10～12的荧光探针；
表5荧光探针的结构
②将上述荧光探针分别按100μM溶解于100mM NaCl溶液中形成母液， 置于-20℃保存待用。
4.2反应液的制备方法
①按照表6进行反应液配制；
表6组分4的反应液配制
②反应液配制好后，置于-20℃保存待用。
实施例2
样品检测评价
1.样品制备
1.1 cTnI样品制备
取cTnI纯品用PBS缓冲液配制成不同浓度梯度的样品，浓度分别为0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、1、10、25、50ng/ml；
1.2 Myo样品制备
取Myo纯品用PBS缓冲液配制成不同浓度梯度的样品，浓度分别0.1、 1、5、10、50、100、500、1000ng/ml；
1.3 CKMB样品制备
取CKMB纯品用PBS缓冲液配制成不同浓度梯度的样品，浓度分别0.1、 0.5、1、2、5、10、20、50、100、200ng/ml；
1.4 cTnI、Myo、CKMB复合血清样品制备
取心内科心肌梗死病人样本和体检健康样本共20例，经雅培化学发光 试剂对20例样本进行hs-cTnI、Myo、CKMB定值，如表7所示。
表7雅培化学发光定值
2.样品检测评价
2.1检测参数(单位：μL)
如表8所示，实时监测样品荧光基团释放强度。
表8样品检测步骤
步骤参数 样品 组份1 组份2 洗液 组份3 组份4 过程
1 10 50 50 / / / 混匀，37℃孵育5min
2 / / / 200 / / 反复清洗三次
3 / / / / 50 50 混匀，37℃孵育10～20min
2.2定标曲线制备
①cTnI纯品样品测试及定标曲线制备
根据检测参数对浓度为0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、1、10、 25、50ng/ml的cTnI纯品样品进行测试，其荧光强度与检测时间关系如图2 所示，以反应至10min的荧光强度值与浓度值(fg/ml)的对数进行线性拟合 得到定标方程，如表9和图3所示，cTnI定标方程为y＝446.78x-1117.6，相 关系数R2＝0.9894。
表9反应至10min的荧光强度值与浓度值(fg/ml)的关系
②Myo纯品样品测试及定标曲线制备
根据检测参数对浓度为0.1、1、5、10、50、100、500、1000ng/ml的 Myo纯品样品进行测试，其荧光强度与检测时间关系如图4所示，以反应至 10min的荧光强度值与浓度值(pg/ml)的对数进行线性拟合得到定标方程， 如表10和图5所示，Myo定标方程为y＝582.52x-73.814，相关系数 R2＝0.99758。
表10反应至10min的荧光强度值与浓度值(pg/ml)的关系
浓度,ng/ml 0.1 1 5 10 50 100 500 1000 5000
浓度,pg/ml 100 1000 5000 10000 50000 100000 500000 1000000 5000000
lgC 2.0 3.0 3.7 4.0 4.7 5.0 5.7 6.0 6.7
荧光值10min 1100 1700 2000 2300 2600 2900 3200 3500 3800
③CKMB纯品样品测试及定标曲线制备
根据检测参数对浓度为0.1、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200ng/ml 的CKMB纯品样品进行测试，其荧光强度与检测时间关系如图6所示，以 反应至10min的荧光强度值与浓度值(pg/ml)的对数进行线性拟合得到定 标方程，如表11和图7所示，CKMB定标方程为y＝599.03x-141.31，相关 系数R2＝0.9931。
表11反应至10min的荧光强度值与浓度值(pg/ml)的关系
浓度,ng/ml 0.1 0.5 1 2 5 10 20 50 100 200
浓度,pg/ml 100 500 1000 2000 5000 10000 20000 50000 100000 200000
lgC 2.0 2.7 3.0 3.3 3.7 4.0 4.3 4.7 5.0 5.3
荧光值10min 1100 1400 1700 1850 2000 2300 2450 2600 2900 3050
2.3临床样本测试
取经化学发光定值后的临床样本进行对比测试，对比结果如表12所 示，检测方法与雅培化学发光检测临床复合样本时，差异较小；在检测hs-cTnI 时，相比雅培化学发光检测结果，能够检测到更低的浓度，灵敏度明显优于 化学发光检测方法；能够同时在一个反应杯中完成三项指标的检测，且互相 不干扰结果。
表12临床样本测试结果
注：*代表绝对偏差
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 湖南博奥瑞康生物科技有限公司
<120> 一种基于核酸滚环扩增反应的同时检测多种生物标志物的试剂盒
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aagtattacc agaaacatcc atccttatca acta 34
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccagtttctc gaagagaaac cggtaagtgc ac 32
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtgtagctc aattggtaga gcaac 25
<210> 4
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tagttgataa ggaatcaaag cagccaggag caaactcttg gtacagc 47
<210> 5
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtgcacttac cgattcggat cgctcatcag ttctgctctg atacctg 47
<210> 6
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gttgctctac ccacctgtgt atctttgatt cgtcagccct gtatcc 46
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tccttatcaa ctagctgtac ca 22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cggtaagtgc accaggtatc a 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggtagagcaa cggatacagg 20
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> modified_base
<222> (10)..(10)
<223> FAM
<220>
<221> gene
<222> (11)..(12)
<223> X
<220>
<221> modified_base
<222> (15)..(15)
<223> BHQ2
<400> 10
ggagcaaact ctggtcttc 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> modified_base
<222> (11)..(11)
<223> FAM
<220>
<221> gene
<222> (12)..(13)
<223> X
<220>
<221> modified_base
<222> (16)..(16)
<223> BHQ2
<400> 11
atcagttctg cttgatcgaa 20
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> modified_base
<222> (12)..(12)
<223> FAM
<220>
<221> gene
<222> (13)..(14)
<223> X
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(18)
<223> BHQ2
<400> 12
tttgattcgt cagcctgtgc tt 22

Claims (2)

1.一种基于核酸滚环扩增反应的同时检测多种生物标志物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由4个独立包装的组分组成；
组分1包括标记单链脱氧核糖核酸的特异性抗体溶液，每个所述生物标志物标记不同的单链脱氧核糖核酸；
组分2包括包被所述生物标志物的特异性抗体的磁珠悬浊液；组分1中的特异性抗体与组分2中的特异性抗体不同，但互为配对，且能够实现对所述生物标志物的双抗夹心反应；
组分3包括含有不同环状脱氧核糖核酸的反应液，所述环状脱氧核糖核酸分别与组分1中的对应的单链脱氧核糖核酸部分互补；
组分4包括含有不同探针的反应液，所述探针中包括一个荧光基团、一个脱嘌呤/脱嘧啶和一个淬灭基团；
所述生物标志物为检测心血管疾病的生物标志物，包括心肌肌钙蛋白I cTnI、肌红蛋白Myo和肌酸激酶同工酶CKMB；
所述组分1的特异性抗体溶液中包括ssDNA1-cTnI Ab1、ssDNA2-Myo Ab1和ssDNA3-CKMB Ab1；所述ssDNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，ssDNA2的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，ssDNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
组分2的磁珠悬浊液中包括Mb-cTnI Ab2、Mb-Myo Ab2和Mb-CKMB Ab2；
组分3的反应液中包括Circular DNA1、Circular DNA2、Circular DNA3、DNA聚合酶、dNTP、MgAC2、DTT和Tris buffer；所述Circular DNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，Circular DNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，Circular DNA3的核苷酸序列如SEQID NO.6所示；
组分4的反应液中包括cTnI-FAM-AP-BHQ2、Myo-Cy3-AP-BHQ2、CKMB-Cy5-AP-BHQ2、Endonuclease IV和buffer；所述cTnI-FAM-AP-BHQ2的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述Myo-Cy3-AP-BHQ2的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述CKMB-Cy5-AP-BHQ2的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述ssDNA1-cTnIAb1、ssDNA2-Myo Ab1和ssDNA3-CKMB Ab1的制备方法，包括：(1)分别合成5’端修饰DIBO基团的ssDNA1、ssDNA2和ssDNA3，得DIBO-ssDNA1、DIBO-ssDNA2和DIBO-ssDNA3；
(2)分别对cTnIAb1、Myo Ab1和CKMB Ab1进行重氮化处理，使抗体Fc片段上的糖链被修饰生成重氮基团，得N3-cTnIAb1、N3-Myo Ab1和N3-CKMB Ab1；
(3)分别将所述DIBO-ssDNA1、DIBO-ssDNA2和DIBO-ssDNA3与N3-cTnI Ab1、N3-Myo Ab1和N3-CKMB Ab1进行偶联反应，得所述ssDNA1-cTnIAb1、ssDNA2-MyoAb1和ssDNA3-CKMBAb1；
步骤(1)和步骤(2)不存在时间上的先后关系。
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