CN110106290A

CN110106290A - 一种基于CRISPR/Cas系统用于检测ASFV的现场快速检测方法及试剂盒

Info

Publication number: CN110106290A
Application number: CN201910467339.5A
Authority: CN
Inventors: 黄黎珍; 林浩斯; 白静; 周阳; 武鹭婷; 汪凯婷; 江伟凡; 白云梦; 杜红丽
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2019-05-31
Filing date: 2019-05-31
Publication date: 2019-08-09
Anticipated expiration: 2039-05-31
Also published as: CN110106290B

Abstract

本发明公开一种基于CRISPR/Cas系统用于检测ASFV的现场快速检测方法及试剂盒。本发明利用crRNA的特异性有效保证对病毒特征序列核酸检测的正确度，且常温下1～2小时内即可通过试纸或荧光确定样品中是否存在ASFV，相比传统基于PCR的检测方法精确度有所提高。本发明可在现场，如猪场，屠宰场方便快速地对ASFV进行检测，且不需要复杂的控温仪器如PCR仪和离心机等复杂设备，只需要一个恒温装置及简易荧光检测装置即可快速获得可观测的结果，如果使用侧流试纸显色方案甚至可实现不需要仪器的肉眼现场检测，由此可更加高效地了解猪场的健康状况，避免损失；为ASFV的检测提供更低成本，更快速方便的检测方法。

Description

一种基于CRISPR/Cas系统用于检测ASFV的现场快速检测方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及畜牧领域，具体涉及一种用于检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的现场快速检测方法及试剂盒，具体是利用Cas12a/crRNA特异性现场快速识别并检测ASFV。

背景技术

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引发的一种急性、出血性、烈性猪传染疾病。非洲猪瘟发病时间短，病死率高，急性感染死亡率可达100％，严重影响经济效益。2018年八月以来中国出现了影响较大的非洲猪瘟疫情。

由于非洲猪瘟与普通猪瘟症状相似，只能通过实验室手段进行区分。然而目前该病毒的检测方法检测时间较长，且对仪器的要求较高。对于该病毒的检验较为常用的方法主要有病毒分离，病毒抗原抗体检测，基于PCR等核酸扩增的检查方法，血清抗原检测等。这些方法虽然可以有效检验ASFV或者它的特征序列核酸，但是分别存在检查周期长，实验条件要求高，检测成本高等问题。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种用于检测ASFV的现场快速检测试剂盒。

本发明的另一目的在于提供一种用于检测ASFV的现场快速检测方法。该方法是一种利用LbaCas12a/crRNA系统进行ASFV的检测方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种用于检测ASFV的现场快速检测试剂盒，包括LbaCas12a、ASFV特异性crRNA序列、针对ASFV特征序列的RPA引物、报告单链DNA分子；

为了更好的实现本发明，所述试剂盒还包括Rehydration Buffer、NEB Buffer 3、RNase Inhibitor、冻干RPA反应微球、MgAc；

所述的ASFV特异性crRNA序列为ASFV target 1 crRNA(SEQ ID NO：1)、ASFVtarget 2 crRNA(SEQ ID NO：2)、ASFV target 3 crRNA(SEQ ID NO：3)和ASFV target 4crRNA(SEQ ID NO：4)中的至少一种；

所述的针对ASFV特征序列的RPA引物为ASFV target 1 F/R引物组、ASFV target2 F/R引物组(SEQ ID NO：9、10)、ASFV target 3 F/R引物组(SEQ ID NO：11、12)和ASFVtarget 4 F/R引物组(SEQ ID NO：13、14)中的至少一种；其中，所述的ASFV target 1 F/R引物组为ASFV target 1 F1/R引物组(SEQ ID NO：5、8)、ASFV target 1 F2/R引物组(SEQID NO：6、8)或ASFV target 1 F3/R引物组(SEQ ID NO：7、8)；

所述的ASFV target 1 F/R引物组用于扩增含有与ASFV target 1 crRNA互补的核酸片段；所述的ASFV target 2 F/R引物组用于扩增含有与ASFV target 2 crRNA互补的核酸片段；所述的ASFV target 3 F/R引物组用于扩增含有与ASFV target 3 crRNA互补的核酸片段；所述的ASFV target 4 F/R引物组用于扩增含有与ASFV target 4 crRNA互补的核酸片段。

所述的报告单链DNA分子为SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16。

一种用于检测ASFV的现场快速检测方法，该方法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：

(1)对不同ASFV病毒株的基因组序列，设计靶点特异性的crRNA序列，设计的crRNA序列如序列表中SEQ ID NO：1～4所示，再构建crRNA体外转录载体并进行体外转录和纯化，或者直接合成；

(2)针对步骤(1)所述的ASFV的靶点设计RPA扩增引物，引物序列如序列表SEQ IDNO：5～14所示，对待测核酸样品进行RPA反应，获得RPA反应产物；

(3)将步骤(1)所述的纯化后的crRNA体外转录产物或合成的crRNA分子、RPA反应产物、LbaCas12a、报告单链DNA分子以适当比例混合于适当体系中进行反应；

(4)反应产物通过侧流免疫层析试纸或荧光检测获得检测结果。

优选的，步骤(1)中所述的将设计的crRNA序列的合成方法为：构建crRNA体外转录载体并进行体外转录和纯化，或直接化学合成，但不限于此。

优选的，步骤(1)中所述的ASFV的基因组指BA71V，L60，BA71，NHV，Kenya 1950，Ken05Tk1，Ken06.Bus，26544OG10，Odintsovo_0214，Warthog，Warmbaths，Tengani 6，Pretorisuskop964，Mkuzi 1979，Malawi Lil-201(1983)，47Ss2008，Benin 971，OURT 883，E75，Georgia 20071，Estonia 2014病毒株所对应基因组；对应NCBI登陆号为NC_001659.2，KM262844.1，KP055815.1，KM262845.1，AY261360.1，KM111294.1，KM111295.1，KM102979.1，KP843857.1，AY261366.1，AY261365.1，AY261364.1，AY261363.1，AY261362.1，AY261361.1，KX354450.1，AM712239.1，AM712240.1，FN557520.1，FR682468.1，I:LS478113.1的核酸序列。

优选的，步骤(2)中所述的待测核酸样品可以为从临床样本中抽提的核酸，或者以其他核酸检测手段中样本处理方法处理过的样品。

优选的，步骤(3)中所述的LbaCas12a可以由重组表达和纯化获得或使用NEBLbaCase12a产品；

优选的，步骤(3)中的报告单链DNA分子设计：用于侧流免疫层析试纸检测时，两端分别带有FAM和Biotin基团的12碱基随机序列单链DNA分子5′-FAM-NNNNNNNNNNNN-Biotin-3′(SEQ ID NO：15)，但不限于此。

用于荧光检测时，两端分别带有FAM和BHQ1基团的12碱基随机序列单链DNA分子5′-FAM-NNNNNNNNNNNN-BHQ1-3′(SEQ ID NO：16)，但不限于此；

优选的，用于侧流免疫层析试纸检测时，步骤(3)中所述的反应体系为20μL体系中，50～250nM LbaCas12a，100～500nM crRNA，1000nM报告单链DNA分子，10U RNaseinhibitor(TaKaRa)，2.0～2.5μL RPA反应产物，1×NEB buffer 3；其中，LbaCas12a与crRNA的摩尔比为1：2；

进一步优选的，用于侧流免疫层析试纸检测时，步骤(3)中所述的反应体系为20μL体系中，250nM LbaCas12a，500nM crRNA，1000nM报告单链DNA分子，10U RNase inhibitor(TaKaRa)，2.0～2.5μL RPA反应产物，1×NEB buffer 3；

优选的，用于荧光检测时，步骤(3)中所述的反应体系为20μL体系中，50～250nMLbaCas12a，100～500nM crRNA，500～1000nM报告单链DNA分子，10U RNase inhibitor(TaKaRa)，2.0～2.5μL RPA反应产物，1×NEB buffer 3；其中，LbaCas12a与crRNA的摩尔比为1：2；

进一步优选的，用于荧光检测时，步骤(3)中所述的反应体系为20μL体系中，250nMLbaCas12a，500nM crRNA，500nM报告单链DNA分子，10U RNase inhibitor(TaKaRa)，2.0～2.5μL RPA反应产物，1×NEB buffer 3；

优选的，步骤(3)中的反应体系可以进行冻干，冻干方法为将配制好的反应体系(不含RPA反应产物)置于-80℃冰箱冷冻2h后，-50℃真空干燥12h；冻干后的反应体系使用方法为用17～17.5μL无RNA酶水溶解冻干反应体系，加入2.0～2.5μL RPA反应产物后进行反应。

优选的，步骤(3)中所述的反应的条件为37℃反应1～1.5小时；更优选为1小时。

优选的，步骤(4)中侧流免疫层析试纸的设计：测流免疫层析试纸采用商业化MileniaHybridetect 1(TwistDx，Cambridge，UK)试纸，在侧流免疫层析试纸上依次有上样区，Gold-NP抗FITC抗体区，strepavidin条带(即control条带)，抗抗体条带(即检测条带)。

优选的，步骤(4)中的侧流免疫层析试纸的检测方法为将步骤(3)检测反应体系按体积比1：5稀释于HybriDetect assay buffer，将试纸上样区浸泡至上述稀释后的样本中，室温孵育5min后肉眼读取检测条带强度；或者其他侧流试纸按照对应的显色方法进行。

优选的，步骤(4)中的荧光检测所用的检测装置可以为常用的酶标仪或任何能在FAM荧光通道上进行荧光激发并检测的荧光检测装置。

更优选的，步骤(4)中的荧光检测采用的检测条件为使用波长492nm的激发光激发荧光，在波长522nm处检测荧光强度。

本发明的机理是：

LbaCas12a蛋白是来自Lachnospiraceae bacterium ND2006细菌CRISPR系统的一个DNA酶。LbaCas12a酶在crRNA引导下可以特异性识别指定序列并激活产生非特异性单链DNA酶切活性。基于21个重要ASFV病毒株基因组中的对应的保守序列，利用CRISPR/Cas12a的单链DNA酶切特异性切割和报告分子检测ASFV特征序列。

本发明通过设计ASFV特异性crRNA，结合LbaCas12a蛋白可以实现在缺乏实验条件的情况下，对ASFV特异性核酸进行快速的检测区分。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明利用crRNA的特异性有效保证对病毒特征序列核酸检测的正确度，且常温下1～2小时之内即可通过试纸或荧光确定样品中是否存在ASFV，相比传统基于PCR的检测方法精确度有所提高。本发明可以发展形成配有纯化的冻干LbaCas12a和crRNA试剂盒，可以在现场，如猪场，屠宰场方便快速地对ASFV进行检测，且不需要复杂的控温仪器如PCR仪和离心机等复杂设备，只需要一个恒温装置及简易荧光检测装置即可快速获得可以观测的结果，如果使用侧流试纸显色方案甚至可以实现不需要仪器的肉眼现场检测，由此可以更加高效地了解猪场的健康状况，避免损失；本发明为ASFV的检测提供更低成本，更快速方便的检测方法。

附图说明

图1是ASFV target 1～4特异性crRNA对应靶点及其PAM(TTTN)序列设计。

图2是Cas12a核酸检测系统检测ASFV结果；其中，RPA扩增引物采用SEQ ID NO：5、8所示序列；A：荧光法检测，n＝3，误差线：±SD，**：p<0.001；B：侧流试纸法检测，1：靶点核酸浓度10^-9M；2：靶点核酸浓度10^-11M；3：10^-13M；4：10^-15M；5：10^-17M；6：空白对照。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。

实施例1

本发明实施例中，基于CRISPR/Cas12a技术现场快速检测ASFV特征序列核酸，该方法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：

1)对ASFV的21个重要病毒株设计靶点特异性的crRNA，设计的crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：1～4所示，再构建crRNA体外转录载体并进行体外转录和纯化。

针对21个重要病毒株BA71V，L60，BA71，NHV，Kenya 1950，Ken05Tk1，Ken06.Bus，26544OG10，Odintsovo_0214，Warthog，Warmbaths，Tengani 6，Pretorisuskop964，Mkuzi1979，Malawi Lil-201(1983)，47Ss2008，Benin 971，OURT 883，E75，Georgia 20071，Estonia 2014病毒株对应基因组(NCBI登陆号为NC_001659.2，KM262844.1，KP055815.1，KM262845.1，AY261360.1，KM111294.1，KM111295.1，KM102979.1，KP843857.1，AY261366.1，AY261365.1，AY261364.1，AY261363.1，AY261362.1，AY261361.1，KX354450.1，AM712239.1，AM712240.1，FN557520.1，FR682468.1，I:LS478113.1)的保守区域设计特异性crRNA，并进行脱靶分析，筛选四条特异性好，低脱靶的crRNA，设计结果如表1所示；靶点序列与ASFV基因组比对结果如图1所示。

表1特异性crRNA序列

名称	crRNA特异性序列(5'-3')	基因组位置
			ASFV target 1	CAUCGGUAAGAAUAGGUU	P72
ASFV target 2	AGGAUAGAGAUACAGCUC	P72
			ASFV target 3	UCAUAAAAUUCUUUUUGC	M1249L
ASFV target 4	AUGUUUAGGUAUUCUGUU	M1249L

同时针对所选靶点设计RPA扩增引物，如SEQ ID NO：5～14所示。

crRNA体外转录的方法为：在以下体系中37℃反应16小时：Nuclease-free water加至20μL，NTP各1.5μL，10×reaction buffer 1.5μL，Template DNA 1μg，T7RNAPolymerase Mix 1.5μL。

crRNA纯化方法：20μL体外转录产物与160μL nuclease-free water及20μL 3M醋酸铵混合，使用1：1苯酚氯仿混合液萃取，去除有机相，用氯仿重复萃取两次，收集水相至新的无酶1.5mL离心管，加入两倍体积(400μL)无水乙醇混合均匀，-20℃保温30分钟以沉淀RNA，10000g离心10分钟收集RNA沉淀，弃去上清，用冷的75％乙醇漂洗沉淀两次，离心收集沉淀，弃去上清，用50μL 0.1mM EDTA溶液溶解RNA沉淀获得RNA溶液。

待测核酸样品预处理方法为取样品溶液2μL进行RPA扩增，所得的扩增产物即处理的核酸样品；本实施例中涉及待测核酸样品为合成的包含设计的靶向片段的双链DNA分子。

RPA反应体系：50μL体系中，上游引物240nM，下游引物240nM，Rehydration Buffer29.5μL，待测核酸样品模板，RNase Inhibitor(NEB M3014L)2.5μL，补dH₂O至47.5μL。将上述体系混合后加至冻干RPA反应微球，加入醋酸镁MgAc 280mM 2.5μL以启动反应。

2)报告单链DNA分子的设计：两端分别带有FAM和BHQ1基团的12碱基随机单链DNA分子5′-FAM-NNNNNNNNNNNN-BHQ1-3′(SEQ ID NO：16)。

3)将上述crRNA体外转录产物、处理的核酸样品、NEBLbaCas12a、报告单链DNA分子以适当比例混合于适当体系中进行反应。

4)反应体系为：20μL体系中，250nM LbaCas12a，500nM crRNA，500nM报告单链DNA分子，10U RNase inhibitor(TaKaRa)，2μL处理的核酸样品，1×NEB buffer 3。反应体系在37℃反应1小时。

5)反应产物在荧光检测装置，使用波长492nm的激发光激发荧光，在波长522nm处检测荧光强度以获得检测结果。

以RPA扩增引物(SEQ ID NO：5、8)为例，结果如图2-A所示，表明靶标核酸浓度在10^-17M及以上通过本核酸检测方法可以得到阳性结果。

实施例2

针对21个重要病毒株BA71V，L60，BA71，NHV，Kenya 1950，Ken05Tk1，Ken06.Bus，26544OG10，Odintsovo_0214，Warthog，Warmbaths，Tengani 6，Pretorisuskop964，Mkuzi1979，Malawi Lil-201(1983)，47Ss2008，Benin 971，OURT 883，E75，Georgia 20071，Estonia 2014病毒株对应基因组(NCBI登陆号为NC_001659.2，KM262844.1，KP055815.1，KM262845.1，AY261360.1，KM111294.1，KM111295.1，KM102979.1，KP843857.1，AY261366.1，AY261365.1，AY261364.1，AY261363.1，AY261362.1，AY261361.1，KX354450.1，AM712239.1，AM712240.1，FN557520.1，FR682468.1，I:LS478113.1)的保守区域设计特异性crRNA，并进行脱靶分析，筛选四条特异性好，低脱靶的crRNA，设计结果如实施例1的表1所示。

同时针对所选靶点设计RPA扩增引物，如SEQ ID NO：5～14所示。

待测核酸样品预处理方法为取样品溶液2μL进行RPA扩增，所得扩增产物即处理的核酸样品；本实施例中涉及待测核酸样品为合成的包含设计的靶向片段的双链DNA分子。

2)报告单链DNA分子的设计：两端分别带有FAM和Biotin基团的12碱基随机单链DNA分子5′-FAM-NNNNNNNNNNNN-Biotin-3′(SEQ ID NO：15)。

4)反应体系为：20μL体系中，250nM LbaCas12a，500nM crRNA，1000nM报告单链DNA分子，10U RNase inhibitor(TaKaRa)，2μL处理的核酸样品，1×NEB buffer 3。反应体系在37℃反应1小时。

5)将检测反应体系20μL与100μL HybriDetect 1assay buffer充分混匀，将HybriDetect 1试纸上样区浸泡至上述混合液中室温孵育5min，肉眼读取试纸条带以获得检测结果。

以RPA扩增引物(SEQ ID NO：5、8)为例，结果如图2-B所示，表明靶标核酸浓度在10^-15M及以上通过本核酸检测方法可以得到阳性结果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一种基于CRISPR/Cas系统用于检测ASFV的现场快速检测方法及试剂盒

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ASFV target 1 crRNA

<400> 1

caucgguaag aauagguu 18

<210> 2

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ASFV target 2 crRNA

<400> 2

aggauagaga uacagcuc 18

<210> 3

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ASFV target 3 crRNA

<400> 3

ucauaaaauu cuuuuugc 18

<210> 4

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ASFV target 4 crRNA

<400> 4

auguuuaggu auucuguu 18

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ASFV target 1 F1

<400> 5

acattcatga tttgcacaag ccgcaccaaa gca 33

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ASFV target 1 F2

<400> 6

ctcctatgca acattcatga tttgcacaag ccg 33

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ASFV target 1 F3

<400> 7

agtggccctc tcctatgcaa cattcatgat ttg 33

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ASFV target 1 R

<400> 8

tgaacattac gtcttatgtc cagatacgtt g 31

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ASFV target 2 F

<400> 9

tatgtaagag ctgcagaact ttgatgga 28

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ASFV target 2 R

<400> 10

aactaatgtc tgctcttaaa tggcc 25

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ASFV target 3 F

<400> 11

ccaccacacc cgcaggcttt cttcttga 28

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ASFV target 3 R

<400> 12

gtggcccgta ttgacggcag catccctatg 30

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ASFV target 4 F

<400> 13

gcttctgccg cttgaagctg tataagcatg tc 32

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ASFV target 4 R

<400> 14

ctatacgtga aattcttaca atgga 25

<210> 15

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> modified_base

<222> (1)..(1)

<223> FAM修饰

<220>

<221> modified_base

<222> (12)..(12)

<223> Biotin修饰

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 15

nnnnnnnnnn nn 12

<210> 16

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> modified_base

<222> (1)..(1)

<223> FAM修饰

<220>

<221> modified_base

<222> (12)..(12)

<223> BHQ1修饰

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 16

nnnnnnnnnn nn 12

Claims

1.一种用于检测ASFV的现场快速检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括LbaCas12a、ASFV特异性crRNA序列、针对ASFV特征序列的RPA引物、报告单链DNA分子；

所述的ASFV特异性crRNA序列为SEQ ID NO：1所示的ASFV target 1 crRNA、SEQ IDNO：2所示的ASFV target 2 crRNA、SEQ ID NO：3所示的ASFV target 3 crRNA和SEQ IDNO：4所示的ASFV target 4 crRNA中的至少一种；

所述的针对ASFV特征序列的RPA引物为ASFV target 1 F/R引物组、SEQ ID NO：9、10所示的ASFV target 2 F/R引物组、SEQ ID NO：11、12所示的ASFV target 3 F/R引物组和SEQID NO：13、14所示的ASFV target 4 F/R引物组中的至少一种；其中，所述的ASFV target 1F/R引物组为SEQ ID NO：5、8所示的ASFV target 1 F1/R引物组、SEQ ID NO：6、8所示的ASFV target 1 F2/R引物组或SEQ ID NO：7、8所示的ASFV target 1 F3/R引物组；

2.根据权利要求1所述的用于检测ASFV的现场快速检测试剂盒，其特征在于：

所述试剂盒还包括Rehydration Buffer、NEB Buffer 3、RNase Inhibitor、冻干RPA反应微球、MgAc。

3.根据权利要求1或2所述的用于检测ASFV的现场快速检测试剂盒，其特征在于：

所述的报告单链DNA分子为SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16。

4.一种用于检测ASFV的现场快速检测方法，其特征在于：该方法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：

(2)针对步骤(1)所述的ASFV的靶点设计RPA扩增引物，引物序列如序列表SEQ ID NO：5～14所示，对待测核酸样品进行RPA反应，获得RPA反应产物；

5.根据权利要求4所述的用于检测ASFV的现场快速检测方法，其特征在于：

步骤(3)中的报告单链DNA分子设计：用于侧流免疫层析试纸检测时，两端分别带有FAM和Biotin基团的12碱基随机序列单链DNA分子5′-FAM-NNNNNNNNNNNN-Biotin-3′，见SEQ IDNO：15；

用于荧光检测时，两端分别带有FAM和BHQ1基团的12碱基随机序列单链DNA分子5′-FAM-NNNNNNNNNNNN-BHQ1-3′，见SEQ ID NO：16。

6.根据权利要求4或5所述的用于检测ASFV的现场快速检测方法，其特征在于：

用于侧流免疫层析试纸检测时，步骤(3)中所述的反应体系为20μL体系中，50～250nMLbaCas12a，100～500nM crRNA，1000nM报告单链DNA分子，10U RNase inhibitor，2.0～2.5μL RPA反应产物，1×NEB buffer 3；其中，LbaCas12a与crRNA的摩尔比为1：2；

用于荧光检测时，步骤(3)中所述的反应体系为20μL体系中，50～250nM LbaCas12a，100～500nM crRNA，500～1000nM报告单链DNA分子，10U RNase inhibitor，2.0～2.5μLRPA反应产物，1×NEB buffer3；其中，LbaCas12a与crRNA的摩尔比为1：2。

7.根据权利要求6所述的用于检测ASFV的现场快速检测方法，其特征在于：

用于侧流免疫层析试纸检测时，步骤(3)中所述的反应体系为20μL体系中，250nMLbaCas12a，500nM crRNA，1000nM报告单链DNA分子，10U RNase inhibitor，2.0～2.5μLRPA反应产物，1×NEB buffer 3；

用于荧光检测时，步骤(3)中所述的反应体系为20μL体系中，250nM LbaCas12a，500nMcrRNA，500nM报告单链DNA分子，10U RNase inhibitor，2.0～2.5μL RPA反应产物，1×NEBbuffer 3。

8.根据权利要求4或5所述的用于检测ASFV的现场快速检测方法，其特征在于：

步骤(3)中的反应体系进行冻干，冻干方法为将配制好的不含RPA反应产物的反应体系置于-80℃冷冻2h后，-50℃真空干燥12h；冻干后的反应体系使用方法为用17～17.5μL无RNA酶水溶解冻干反应体系，加入2.0～2.5μL RPA反应产物后进行反应；

步骤(3)中所述的反应的条件为37℃反应1～1.5小时。

9.根据权利要求4或5所述的用于检测ASFV的现场快速检测方法，其特征在于：

步骤(4)中的侧流免疫层析试纸的检测方法为将步骤(3)检测反应体系按体积比1：5稀释于HybriDetect assay buffer，将试纸上样区浸泡至上述稀释后的样本中，室温孵育5min后肉眼读取检测条带强度；或者其他侧流试纸按照对应的显色方法进行；

步骤(4)中的荧光检测所用的检测装置为酶标仪或任何能在FAM荧光通道上进行荧光激发并检测的荧光检测装置。

10.根据权利要求9所述的用于检测ASFV的现场快速检测方法，其特征在于：

步骤(4)中的荧光检测采用的检测条件为使用波长492nm的激发光激发荧光，在波长522nm处检测荧光强度。