CN117343987A - 一种检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了一种检测方法,其依次包括如下步骤:(1)将与第一探针偶联的第一抗体、与第二探针偶联的第二抗体和待测样品在溶液中混合,使得第一抗体和第二抗体结合至待测样品中的分析物,形成免疫复合物;(2)使固体表面与步骤(1)的溶液接触,将所述免疫复合物捕获至所述固体表面;(3)清洗所述固体表面一次以上,去除未结合到固体表面上的分子;(4)洗脱,将结合在所述固体表面上的免疫复合物释放到第一洗脱缓冲液中;(5)将免疫复合物保持在第一洗脱缓冲液中,或者将免疫复合物置于与所述第一缓冲液不同的其他溶液中,加入连接体系,使免疫复合物发生邻位连接反应,可选地对邻位连接反应产物进行纯化;以及(6)检测,获得待测样品中的分析物的检测结果。相应地,本公开还提供了一种试剂盒。
Description
技术领域
本公开涉及分子生物学领域,更具体涉及一种改进的检测方法及试剂盒。
背景技术
在多种生物样品(例如血清、血浆、体液等)或细胞裂解液中,对微量分析物(例如蛋白分子)的检测对于预测多种疾病的发生发展、提高临床诊断的准确率、研究疾病发生发展机制十分重要。
夹心酶联免疫吸附反应(ELISA)是蛋白快速准确定量的金标准之一。捕获抗体对目标蛋白的富集,以及通过检测抗体的信号放大,使夹心酶联免疫吸附反应能够快速、准确、低背景地定量目标蛋白。该方法的主要缺点在于它的检测限在纳克每毫升水平,不能检测低浓度的蛋白。例如,早期癌症、阿尔兹海默检测等需要以fg/mL浓度有效检测分析物,这超出了ELISA免疫测定技术的能力范围。同时,对于传统的夹心酶联免疫吸附反应,一个反应体系只能检测一种蛋白;如果需要检测多种蛋白,则需要设置多个反应孔,这大大增加了样品用量,因而增加了实验工作量和检测成本。
2002年,邻位连接技术(PLA)由于高灵敏、高特异性而得到广泛关注,其是对传统免疫方法的重要补充。邻位连接技术是将待检测物同时用2种标记有核酸序列的抗体识别,当这些抗体与目标待检测物结合后,修饰的核酸序列被固定在邻位,这些核酸序列在核酸连接酶的作用下连接,连接后的核酸序列作为模板进行后续的核酸扩增。简而言之,邻位连接技术通过多种抗体的识别获得高特异性,并通过核酸扩增获得高灵敏性。邻近连接测定的方法不同于其他基于抗原抗体反应的原位杂交应用,因为其使用两种抗体(而不是单个抗体)识别相同蛋白的不同表位从而增加了蛋白特异性。此外,使用两种抗体识别不同蛋白质既可显示位置又可对蛋白质相互作用进行定量。只有在一对探针均与目标蛋白结合且相互间距离足够贴近时,邻位连接反应才能够发生,因此PLA的非特异性检测极少,这一优点使得PLA与常规PCR或RCA方法相比,具有更高的特异性和检测灵敏度。在目的蛋白的内源表达水平上,检测步骤的信号增强为研究稳定和瞬时相互作用提供独有的能力。配合各种图像处理及分析系统,PLA高度适合于高通量的细胞和作为基础的筛选实验。
传统邻位连接技术包括均相邻位连接技术(也称为液相邻位连接技术)和固相邻位连接技术。均相/液相邻位连接技术步骤简单,所有实验步骤都在同一溶液中进行。然而,由于缺乏洗涤步骤,导致均相/液相邻位连接技术背景相对较高;同时由于核酸连接酶在复杂生物样品(包括血清或血浆)中容易失去活性,因此影响反应效率、导致灵敏度降低。固相邻位连接技术,例如核酸连接的免疫-夹心测定(NULISA)技术,采用两种磁珠、两种捕获序列,分别捕获“抗原-抗体”复合物;洗涤步骤减低了背景干扰,后续用于qPCR或二代测序,可以实现蛋白的单检/共检。然而,此方法需要两种类型磁珠、两种捕获序列,实验成本较高;同时,在反应的大部分时间,所有“抗原-抗体”复合物被捕获在磁珠表面,在待检蛋白浓度很高或多种蛋白共检测时,容易发生抗体偶联序列的非正确连接,降低有用数据的占比。
因此,本领域亟需发展一种简单快速、灵敏度高、特异性强且稳定性高的定量方法来检测低丰度蛋白、修饰蛋白或蛋白复合体。
发明内容
在第一方面,本公开提供了一种检测方法,其依次包括如下步骤:
(1)将与第一探针偶联的第一抗体、与第二探针偶联的第二抗体和待测样品在溶液中混合,使得第一抗体和第二抗体结合至待测样品中的分析物,形成免疫复合物;
(2)使固体表面与步骤(1)的溶液接触,将所述免疫复合物捕获至所述固体表面;
(3)清洗所述固体表面一次以上,去除未结合到固体表面上的分子;
(4)洗脱,将结合在所述固体表面上的免疫复合物释放到第一洗脱缓冲液中;
(5)将免疫复合物保持在第一洗脱缓冲液中,或者将免疫复合物置于与所述第一缓冲液不同的其他溶液中,加入连接体系,使免疫复合物发生邻位连接反应,并可选地对邻位连接反应产物进行纯化;以及
(6)检测,获得待测样品中的分析物的检测结果;
优选地,所述方法在步骤(5)和(6)之间还包括如下步骤:
(5'-1)二次捕获及清洗:将免疫复合物再次捕获至固体表面,清洗所述固体表面一次以上,去除固体表面上未结合的分子;
(5'-2)洗脱,将结合在所述固体表面上的免疫复合物释放到第二洗脱缓冲液中。
优选地,在步骤(6)中,所述检测包括多重荧光定量PCR或二代测序,可选地对PCR扩增产物进行纯化。
在本文中,固体表面与溶液接触包括固体被完全浸没在溶液中、固体被溶液包围、固体的一个以上表面与溶液接触、固体的一个以上表面被溶液浸没等情况。
在一些实施方式中,在步骤(5)中,将免疫复合物保持在第一洗脱缓冲液中,或者将免疫复合物置于与所述第一缓冲液不同的其他溶液中,其中,所述第一洗脱缓冲液或与所述第一缓冲液不同的其他溶液与所述固体(例如磁珠)表面接触,例如,所述第一洗脱缓冲液或与所述第一缓冲液不同的其他溶液与所述固体(例如磁珠)在同一容器中。
在一些实施方式中,在步骤(5)中,将免疫复合物保持在第一洗脱缓冲液中,或者将免疫复合物置于与所述第一缓冲液不同的其他溶液中,其中,所述第一洗脱缓冲液或与所述第一缓冲液不同的其他溶液不与所述固体(例如磁珠)表面接触,例如,将所述第一洗脱缓冲液或与所述第一缓冲液不同的其他溶液置于与所述固体(例如磁珠)不同的容器中。
在一些实施方式中,在步骤(5)中,将免疫复合物保持在第一洗脱缓冲液中可以是将免疫复合物继续保持在步骤(4)的第一洗脱缓冲液中,也可以置换为新的第一洗脱缓冲液。
在一些实施方式中,在步骤(5)中,向第一洗脱缓冲液中加入连接体系,进行连接反应。
在一些实施方式中,在步骤(5)中,向与第一洗脱缓冲液不同的其他溶液中加入连接体系,进行连接反应。
在本文中,与第一洗脱缓冲液不同的其他溶液可以是任何与连接反应兼容的溶液,例如,其可以选自TE缓冲液、Tris、HEPES、Bis-Tris和MOPS中的一种以上,优选地,所述与第一洗脱缓冲液不同的其他溶液的阳离子浓度为1mM至100mM,例如,1mM至5mM、5mM至10mM、1mM至10mM、5mM至20mM、5mM至30mM、10mM至30mM、10mM至50mM、10mM至60mM、10mM至80mM、20mM至40mM、20mM至50mM、20mM至60mM、20mM至80mM、30mM至50mM、30mM至70mM、40mM至60mM、40mM至80mM或50mM至100mM;优选地,所述阳离子为钠离子。
在一些实施方式中,清洗所述固体表面一次以上包括清洗1-5次、1-4次、1-3次,例如,1次、2次、3次、4次和/或5次。
在一些实施方式中,步骤(2)至(4)可以重复进行2次、3次、4次或5次。
在一些实施方式中,第一抗体和/或第二抗体具有停泊基团,所述固体表面具有捕获基团,所述停泊基团与所述捕获基团结合,由此将免疫复合物捕获至固体表面。
在一些实施方式中,第一探针和/或第二探针具有停泊基团,所述固体表面具有捕获基团,所述停泊基团与所述捕获基团结合,由此将免疫复合物捕获至固体表面。
在一些实施方式中,可以通过捕获序列将免疫复合物捕获至固体表面,所述捕获序列与第一探针和/或第二探针的捕获区域互补,所述捕获序列具有停泊基团,所述固体表面具有捕获基团,所述停泊基团与所述捕获基团结合,由此将免疫复合物捕获至固体表面。
优选地,所述停泊基团选自生物素、polydT、polydA中的一种以上,所述捕获基团选自链霉亲和素抗生物素蛋白、polydT、polydA中的一种以上。
在一些实施方式中,步骤(2)中的固体表面的捕获基团与步骤(5'-1)中的固体表面的捕获基团相同。
在一些实施方式中,步骤(2)中的固体表面的捕获基团与步骤(5'-1)中的固体表面的捕获基团不同。
优选地,所述停泊基团为生物素,所述固体表面的捕获基团为链霉亲和素和/或抗生物素蛋白。
优选地,所述停泊基团为polydT,所述捕获基团为polydA。
优选地,所述停泊基团为polydA,所述捕获基团为polydT。
优选地,所述停泊基团为polydA和生物素,所述捕获基团为polydT或链霉亲和素(例如,步骤(2)中的固体表面的捕获基团为polydT,步骤(5'-1)中的固体表面的捕获基团为链霉亲和素)。
在一些实施方式中,停泊基团与固体表面的捕获基团之间还可以通过硫酯基团、二硫键或可切割键(光可切割键、化学可切割键或酶促可切割键)、蛋白-蛋白相互作用将免疫复合物捕获至固体表面。
优选地,可以通过改变盐离子浓度和/或温度等条件来实现将抗体结合至固体表面或从固体表面释放。
例如,可通过高盐捕获、低盐释放的方法来实现免疫复合物的捕获和释放。例如,可通过缀合在探针上的生物素与偶联至固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白之间的结合,来实现免疫复合物的捕获。
优选地,在步骤(1)和/或步骤(2)中,所述溶液为结合缓冲液,所述结合缓冲液选自SSC缓冲液、Tris、HEPES、Bis-Tris和MOPS中的一种以上,优选地,所述结合缓冲液的阳离子浓度为100mM至1M,例如,100mM至200mM、100mM至400mM、100mM至600mM、100mM至800mM、100mM至1000mM、200mM至400mM、200mM至600mM、200mM至800mM、200mM至1000mM、400mM至600mM、400mM至800mM、400mM至1000mM、500mM至750mM、500mM至1000mM、600mM至800mM、600mM至1000mM或800mM至1000mM;优选地,所述阳离子为钠离子;
优选地,在步骤(3)和(5'-1)中使用清洗溶液进行清洗,所述清洗溶液选自SSC缓冲液、Tris、HEPES、Bis-Tris和MOPS中的一种以上;优选地,所述清洗溶液的阳离子浓度为10mM至200mM,例如,10mM至50mM,10mM至100mM、10mM至150mM、20mM至50mM、20mM至100mM、20mM至150mM、20mM至200mM、30mM至50mM、30mM至100mM、30mM至150mM、30mM至200mM、40mM至50mM、40mM至100mM、40mM至150mM、40mM至200mM、50mM至100mM、50mM至150mM、50mM至200mM、60mM至100mM、60mM至150mM、60mM至200mM、70mM至100mM、70mM至150mM、70mM至200mM、80mM至100mM、80mM至150mM、80mM至200mM、90mM至100mM、90mM至150mM、90mM至200mM、100mM至150mM、100mM至200mM、110mM至150mM、110mM至200mM、120mM至150mM、120mM至200mM、130mM至150mM、130mM至200mM、140mM至150mM、140mM至200mM或150mM至200mM;优选地,所述阳离子为钠离子。
优选地,第一洗脱缓冲液选自TE缓冲液、Tris、HEPES、Bis-Tris和MOPS中的一种以上;优选地,所述第一洗脱缓冲液的阳离子浓度为1mM至100mM,例如,1mM至5mM、5mM至10mM、1mM至10mM、5mM至20mM、5mM至30mM、10mM至30mM、10mM至50mM、10mM至60mM、10mM至80mM、20mM至40mM、20mM至50mM、20mM至60mM、20mM至80mM、30mM至50mM、30mM至70mM、40mM至60mM、40mM至80mM或50mM至100mM;优选地,所述阳离子为钠离子。
优选地,第二洗脱缓冲液选自DEPC水、无RNA酶/DNA酶的水、TE缓冲液、Tris、HEPES、Bis-Tris和MOPS中的一种以上;当第二洗脱缓冲液选自TE缓冲液、Tris、HEPES、Bis-Tris和MOPS时,所述第二洗脱缓冲液的阳离子浓度为1mM至100mM,例如,1mM至5mM、5mM至10mM、1mM至10mM、5mM至20mM、5mM至30mM、10mM至30mM、10mM至50mM、10mM至60mM、10mM至80mM、20mM至40mM、20mM至50mM、20mM至60mM、20mM至80mM、30mM至50mM、30mM至70mM、40mM至60mM、40mM至80mM或50mM至100mM;优选地,所述阳离子为钠离子。
优选地,所述连接体系包括夹板序列和连接酶;优选地,连接酶选自T4 DNA连接酶、T7 DNA连接酶、SplintR连接酶、Taq连接酶;优选地,所述连接体系还包括连接酶缓冲液。
优选地,第一探针和第二探针各自独立地包含寡核苷酸链和与抗体偶联的基团,所述寡核苷酸链包含二代测序接头区域、条形码区域和夹板序列互补区域;优选地,所述与抗体偶联的基团选自叠氮基团、氨基和巯基中的一种以上,优选地,所述与抗体偶联的基团位于第一探针和/或第二探针的5’末端或3’末端。
优选地,第一探针和/或第二探针的寡核苷酸链还包含UMI区域和/或捕获区域。
优选地,邻位连接反应产物为核酸报告分子,所述核酸报告分子包含第一探针和第二探针的UMI区域、条形码区域和/或夹板序列互补区域。
优选地,所述固体选自磁性固体例如磁珠和微量滴定孔板。
在第二方面,本公开还提供了一种用于本发明的方法的试剂盒,其包括:
(i)第一探针和第一抗体;
(ii)第二探针和第二抗体;
(iii)结合缓冲液,所述结合缓冲液选自SSC缓冲液、Tris、HEPES、Bis-Tris和MOPS中的一种以上;优选地,所述结合缓冲液的阳离子浓度为100mM至1M;优选地,所述阳离子为钠离子;
(iv)清洗缓冲液,所述清洗缓冲液选自SSC缓冲液、Tris、HEPES、Bis-Tris和MOPS中的一种以上;优选地,所述清洗溶液的阳离子浓度为10mM至200mM,优选地,所述阳离子为钠离子。
(v)第一洗脱缓冲液,第一洗脱缓冲液选自TE缓冲液、Tris、HEPES、Bis-Tris和MOPS中的一种以上,优选地,所述第一洗脱缓冲液的阳离子浓度为1mM至100mM,优选地,所述阳离子为钠离子;
(vi)夹板序列和连接酶;优选地,所述连接酶选自T4 DNA连接酶、T7 DNA连接酶、SplintR连接酶、Taq连接酶;
(vii)可选的捕获序列,所述捕获序列与第一探针和/或第二探针的捕获区域互补,所述捕获序列具有停泊基团,优选地,所述停泊基团选自生物素、polydT、polydA中的一种以上;
(viii)可选的固体;优选地,所述固体选自磁性固体例如磁珠和微量滴定孔板;和/或优选地,所述固体表面具有捕获基团,所述捕获基团能够与停泊基团结合,所述捕获基团选自链霉亲和素、抗生物素蛋白、polydA、polydT序列中的一种以上;
(ix)可选的第二洗脱缓冲液,第二洗脱缓冲液选自DEPC水、无RNA酶/DNA酶的水、TE缓冲液、Tris、HEPES、Bis-Tris和MOPS中的一种以上;以及
(x)可选的PCR扩增试剂。
第一探针和第二探针各自独立地包含寡核苷酸链和与抗体偶联的基团,所述寡核苷酸链包含二代测序接头区域、条形码区域和夹板序列互补区域;优选地,所述与抗体偶联的基团选自叠氮基团、氨基和巯基中的一种以上,优选地,所述与抗体偶联的基团位于第一探针和/或第二探针的5’末端或3’末端。
优选地,第一探针和/或第二探针的寡核苷酸链还包含UMI区域和/或捕获区域。
除非本文另有说明或与上下文存在明显矛盾,否则针对第一方面的方法所描述的任意特征或任意特征组合也适用于第二方面的试剂盒。
附图说明
图1显示了根据本公开的一个示例性实施方式的原理图。1:抗原(即待测样品中的分析物)、偶联有探针的抗体、捕获序列的孵育。2:抗原-抗体免疫复合物通过捕获序列结合在固体表面。3:清洗固体表面后,抗原-抗体免疫复合物从固体表面释放至溶液中,在连接酶、夹板序列作用下发生邻位连接反应。4:抗原-抗体免疫复合物在固体表面再次捕获和清洗;5:免疫复合物从固体表面释放和PCR扩增。
图2显示了使用常规PLA方法和本公开PLA方法单检测IL-8(图2A)和IL-6(图2B)抗原梯度的数据对比(单抗原,单抗体对)。
图3显示了使用常规PLA方法(图3A)和本公开PLA方法(图3B)共检测IL-8、IL-6和PSA抗原梯度的数据对比(三抗原,三抗体对)。
图4显示了使用本公开PLA方法单检测和共检测IL-8(图4A)和IL-6(图4B)的数据对比。
图5A-5B显示了使用常规PLA方法和本公开PLA方法共检测IL-8、IL-6和PSA的背景信号对比(图5A)和10000pg/ml抗原浓度信号与背景信号的信号背景比(图5B)。图5C显示了使用常规PLA方法和本公开PLA方法在不同浓度下共检测IL-8、IL-6和PSA,测序数据中的有效数据占比。
图6显示了使用NULISA方法共检测IL-8、IL-6和PSA抗原梯度的数据结果(三抗原,三抗体对)。
具体实施方式
本文提供的具体实施方式用于以示例性方式描述本公开,而不意在以任何方式对本公开构成限制,本公开包括但不限于本文所述的具体实施方式。
除非在本文中另外定义,否则结合本发明所使用的科学和技术术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。此外,除非上下文另外要求,否则单数术语包括复数并且复数术语应包括单数。一般而言,本文所描述的分子生物学、免疫学、遗传学以及蛋白、核酸化学和杂交所使用的术语为本领域人员公知常用的那些。
如本文所用,“包含”、“包括”、“含有”、“具有”等类似表述为开放式的,其表示除所列要素、成分或步骤之外还含有其他未列出的要素、成分或步骤,这些额外的要素、成分或步骤不实质影响本公开的方法或产品的基本新颖性特征。
如本文所用,在短语“A和/或B”中使用的术语“和/或”旨在包括:A和B两者、A或B、(单独的)A和(单独的)B。同样地,在短语“A、B和/或C”中使用的术语“和/或”旨在涵盖如下实施方式:A、B和C;A、B或C;A或C;A或B;B或C;A和C;A和B;B和C;(单独的)A;(单独的)B;和(单独的)C。
如本文所用,“以上”和“以下”包括本数。例如,“一种以上”表示“一种或多种”,其中“多种”表示“两种或更多种”。
如本文所用,除非另有明确规定,否则本文提供的值的范围应理解为包含范围端点值、每一中间值以及下限的单位的十分之一。除非另有明确规定,否则排除端点的一者或两者的范围也涵盖在本公开范围内。
定义
如本文所用,术语“检测”或类似表述广泛用于包括确定分析物的存在(无论是否存在)的任何方式或者所述分析物的任何测量形式。因此,“检测”可以包括确定、测量或评价分析物的存在或不存在或量或位置,包括定量、半定量和定性确定、测量或评价。这种确定、测量或评价可以是相对的(例如当检测样品中两种以上不同分析物时),或者可以是绝对的。当在样品中目标分析物的定量的情况下使用时,术语“定量”可以表示绝对或相对定量。可以通过包含已知浓度的一种以上对照分析物和/或将所检测的目标分析物水平与已知对照分析物(例如,通过标准曲线产生)进行参比来实现绝对定量。作为另外一种选择,可以通过两种以上不同目标分析物之间所检测的水平或量的比较以提供两种以上不同分析物中每一种的相对定量,即相对于彼此的定量来实现相对定量。
如本文所用,术语“分析物”可以是通过本文所提供的测定方法所检测的任何物质(例如,分子)或实体。分析物是本文所提供的测定方法的靶标。因此,分析物可以是需要检测的任何生物分子或化合物,例如肽或蛋白、核酸分子或小分子,包括有机和无机分子。分析物可以是细胞或微生物(包括病毒)或其片段或产物。在一些实施方式中,分析物是蛋白或多肽。目标分析物包括蛋白质分子,例如多肽、蛋白或朊病毒或者含有蛋白或多肽组分或其片段的任何分子。在一些实施方式中,分析物是全部或部分蛋白质分子。分析物还可以是单个分子或含有两个以上分子亚基的复合物,所述亚基可以或可以不彼此共价结合并且可以是相同或不同的。因此,可以通过本文所述的测定方法检测的分析物可以是复合物分析物,其可以是蛋白质复合物。分子(例如蛋白)聚集体也可以是目标分析物。聚集体分析物可以是相同蛋白或不同蛋白的聚集体。分析物也可以是由蛋白或肽或核酸分子(例如DNA或RNA)所组成的复合物。在一些实施方式中,分析物是由蛋白和核酸两者所组成的复合物,例如调控因子,例如转录因子。优选地,所述分析物为一种以上修饰或未修饰的蛋白质。
在本文中,除非本文另有说明或与上下文存在明显矛盾,否则术语“分析物”和“抗原”可以互换使用。
如本文所用,术语“样品”可以是任何生物学和临床样品,包括例如生物的任何细胞或组织样品,或者由此衍生的任何体液或制剂,以及样品,例如细胞培养物、细胞制备、细胞裂解液等。还包括环境样品,例如,土壤和水样品或者食品样品。样品可以是新鲜制备的或先前以任何适当方式处理的(例如为了存储而处理的)。因此,代表性样品包括含有生物分子的任何材料,或者任何其它所期望的分析物或目标分析物,包括例如食品和类似产品、临床和环境样品。样品可以是生物样品,包括病毒或细胞材料,包括原核或真核细胞、病毒、噬菌体、支原体、原生质体和细胞器。这些生物材料包括所有类型的哺乳动物和非哺乳动物细胞、植物细胞、藻类,包括蓝绿藻、真菌、细菌、原生动物等。代表性样品还包括全血和血液-来源的产物,例如血浆、血清和血沉棕黄层、血细胞、尿液、粪便、脑脊髓液或任何其它体液(例如呼吸分泌物、唾液、乳汁等)、组织、活组织检查、细胞培养物、细胞混悬液、条件培养基或其它细胞培养物组成样品等。可以以任何适当或所期望的方式预处理样品以制备用于在本文所公开的方法中的使用。例如,可以通过细胞胞溶或者分析物的纯化、分离等处理样品。例如,可以使用本公开的方法检测脑脊液、血清或血浆中的神经生物标志物(例如p-Tau181、p-Tau217)以及其他疾病相关的生物标志物,为疾病的更早期诊断和监测提供依据;在血清中测定C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)水平,辅助进行细菌感染与非细菌感染的鉴别诊断;在疾病血浆及正常血浆样本中,多重检测多个蛋白表达(数千个蛋白表达),发现能够预测疾病进展的生物标记蛋白,用于疾病诊断,药物疗效判定。
如本文所用,术语“结合”表示分子(例如,抗体和分析物,或者停泊基团和捕获基团)之间形成复合物的相互作用。相互作用可以是(例如)非共价相互作用,包括氢键、离子键、疏水相互作用和/或范德华相互作用。在一些实施方式中,抗体特异性结合至其目标分析物,即所述抗体以大于样品中其它组分的亲和力结合至所述目标分析物。在一些实施方式中,抗体对目标分析物的结合可以不同于对非目标分析物的结合,其中抗体不结合至非目标分析物或者可忽略或不可检测地结合至非目标分析物,或者任何这种非特异性结合(如果存在)处于可以区分的相对低水平。目标分析物及其抗体之间的结合通常是非共价的。在本文所提供的方法中使用的抗体可以共价缀合至停泊基团(例如,polydA、polyd或生物素等)而不会显著消除抗体与其目标分析物的结合亲和力。
如本文所用,术语“抗体”包括抗体的抗体结合片段或衍生物或模拟物,其中这些片段、衍生物和模拟物具有针对目标分析物的结合亲和性。例如,抗体片段(如Fv、F(ab)2和Fab)可以通过对完整蛋白的裂解来制备,例如通过蛋白酶或化学裂解法。同样感兴趣的是以重组或合成方式产生的抗体片段或衍生物,例如单链抗体或scFv,或者其他抗体衍生物如嵌合抗体或CDR移植抗体,其中这些以重组或合成方式产生的抗体片段保留上述抗体的结合特点,即它们能够特异性地结合目标分析物。这样的抗体片段或衍生物一般包括至少本发明的抗体的VH和VL结构域,以保留本发明的抗体的结合特点。本发明的这些抗体片段、衍生物或模拟物可以使用任何方便的方法学容易地制备。抗体及其片段、衍生物和模拟物可以由商业来源获得和/或使用任何方便的技术制备。生产多克隆抗体、单克隆抗体、抗体的片段、衍生物和模拟物(包括所述抗体的重组衍生物)的方法为本领域技术人员已知。
如本文所用,术语“第一抗体”和“第二抗体”通常指能够特异性地结合同一个分析物并由此在空间上互相接近,从而通过各自偶联的第一探针和第二探针产生可用于所述分析物的检测的核酸报告分子的抗体对。在本公开提供的方法中,可以同时使用1种以上(例如1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、12种、15种、20种、25种)抗体对对样品中的不同分析物进行检测,同时使用的抗体对的种类数的上限没有特别限制,可以根据具体的检测目的确定使用的抗体对的种类数。其中,每种“抗体对”识别一种分析物(即1种以上抗体对中的每一种分别识别不同种类的分析物),优选地,每种“抗体对”偶联的第一探针和/或第二探针中包含与该抗体相对应的条形码(barcode)。例如在本公开的实施例中,可以同时使用分别识别IL-8、IL-6和PSA的“抗体对”对样品中的IL-8、IL-6和PSA进行检测。
如本文所用,“探针”通常指一段单链DNA或RNA片段(约20至500bp)。在本文中,可以通过该探针实现对分析物的检测。本领域技术人员可以合适地使用本领域常规方法(例如利用Primer 3软件等)根据具体的应用目的(例如不同的样品、不同的分析物等)设计相应探针。
如本文所用,与“固体表面”相关的术语“固体”通常指适合与核酸或蛋白连接并有助于检测步骤的任何固体载体。固相基质的示例包括颗粒材料(例如磁珠、凝胶珠)、胶体、单界面、管、芯片、多孔板、微量滴定板、膜、凝胶和树脂。示例性的固相基质可以包括磁珠和微量滴定板。当所述固相基质为颗粒材料(例如,磁珠)时,它们可以在多孔板的孔中或离心管中分布以便进行批量平行处理。在某些实施方式中,所述固体表面具有与停泊基团结合的捕获基团。
如本文所用,术语“捕获序列”通常指能够与第一探针和/或第二探针的捕获区域杂交并且能够结合至固体表面,从而将本文所述的免疫复合物捕获至固体表面的核苷酸序列。在某些实施方式中,捕获序列具有与固体表面的捕获基团结合的停泊基团。在本公开的方法的某些实施方式中,捕获序列可以在步骤(1)中加入,也可以在步骤(2)中加入。
如本文所用,术语“停泊基团”和“捕获基团”通常指任何能够与本文中的抗体、探针、捕获序列等偶联并且能够互相结合的化合物分子对。在本文中,通过“停泊基团”与“捕获基团”的结合将本文所述的免疫复合物捕获至固体表面(换言之,使本文所述的免疫复合物停泊至固体表面)。“停泊基团”和“捕获基团”可以是本领域已知的任何符合本公开需要的化合物分子对,例如生物素/链霉亲和素系统、生物素/抗生物素蛋白系统、polydT/polydA系统等。
如本文所用,术语“夹板序列”通常指同时与第一探针的游离末端核苷酸序列和第二探针的游离末端核苷酸序列杂交的核苷酸序列。在夹板序列与第一探针和第二探针结合后,可以在连接酶或聚合酶的作用下实现第一探针和第二探针的邻位连接。例如,夹板序列与结合同一个分析物的第一、第二探针上的核苷酸序列互补配对,形成带有缺口的部分双链DNA结构,在连接酶的作用下将缺口被补齐,从而形成特定的核酸报告分子。
如本文所用,术语“杂交”指两条核酸链的结合过程,并通过两条核酸链的残基间氢键形成反平行双链。在聚核苷酸方面,“杂交”和“结合”可以互换使用。
如本文所用,“引物”为寡核苷酸,其至少一部分序列与待扩增或待复制的核酸模板的一部分序列互补。引物通常用于聚合酶链式反应(PCR)。
如本文所用,术语“互补”指足够数量的互补碱基对核苷酸与目标核酸序列特异结合以用于扩增或检测。
如本文所用,术语“夹板序列互补区域”指第一探针和/或第二探针中能够与夹板序列杂交的核苷酸序列。通过夹板序列互补区域与夹板序列的杂交引发连接反应。
如本文所用,术语“捕获区域”指第一探针和/或第二探针中能够与捕获序列杂交的核苷酸序列。在某些实施方式中,第一抗体、第二抗体、第一探针和/或第二探针上不具有停泊基团,第一探针和/或第二探针具有捕获区域,通过第一探针和/或第二探针中的捕获区域与捕获序列杂交以及捕获序列的停泊基团与固体表面的捕获基团的结合将免疫复合物捕获至固体表面。
在本文中,术语“分子标签(Unique Molecular Identifier,UMI)”通常指用于区分样品中同一种分析物(例如抗原)的各个个体的一段随机核苷酸序列。通过UMI能够更精准定量分析物的起始分子数,降低PCR扩增所造成的不均一性。UMI通常由一段6nt到10nt左右的随机序列(例如NNNNNN,NNNNNNN,NNNNNNNN)或者简并碱基(NNNRNYN)组成。
如本文所用,术语“条形码(barcode)”指为了实现不同分析物(例如抗原)的检测而在各个探针上设计的一段核苷酸序列,其作为探针所偶联的不同抗体的标识,从而获得与抗体结合的分析物(例如抗原)的信息。
实施例
本公开的实施例中所使用的试剂和核酸序列如下所示:
SSC缓冲液:用20X SSC缓冲液(pH7.0,无菌)配制1X和0.5X SSC缓冲液,20X SSC缓冲液由3M NaCl以及0.3M柠檬酸钠组成。
TE缓冲液:10mM Tris,1mM EDTA,10mM NaCl,pH8.0
捕获序列(表2中序号7和8):浓度为1μM
鲑鱼精DNA:10mg/ml
Oligo(dT)磁珠:10mg/ml
夹板序列:表格序列11,浓度为1μM
表1:与抗体偶联的探针序列(小写为条形码,N为分子标签)
表2:捕获序列L、上游引物和下游引物,其中N为样品Index序列,用于区分建库样本。
本公开实施例中所使用的上述核酸序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
本公开的实施例中,测序下机数据通过UMI-tools软件对含有UMI的序列和每个抗体偶联的条形码序列进行提取,对提取的序列通过python脚本进行Count与UMI统计。
实施例1:探针与抗体的偶联
在实施例部分,发明人以IL-8(白介素8;爱博生)、IL-6(白介素6;爱博生)和PSA(前列腺特异抗原;Medix biochemica)为例对本公开的方法进行了验证。在本实施例中,探针1和探针2的与抗体偶联的示例性基团为叠氮基团(Azide),采用DBCO法分别将第一探针和第二探针与第一抗体和第二抗体偶联。对于每一种分析物,第一抗体和第二抗体配合使用,它们分别识别同一分析物(例如蛋白质)的不同位点。
将探针与抗体偶联的步骤概括如下:
1)将抗体保存缓冲液置换为PBS缓冲液,用PBS缓冲液将抗体浓度稀释为2mg/mL。IL-8和IL-6的抗体1和2都来自爱博生,PSA的抗体1和2都来自Medix biochemica。
2)使用2mg/mL抗体与2mM DBCO(二苯并环辛炔),按照体积比10:1进行混合,在冰上反应1小时,以制备DBCO标记的抗体。
3)用超滤离心管对DBCO标记的抗体进行超滤纯化,测定抗体浓度。
4)使DBCO标记的抗体分别与合成的末端修饰有叠氮基团(Azide)的单链探针(如表1中所示)按照摩尔比5:1进行混合,在4℃下孵育过夜。通过使DBCO与叠氮基团反应,将探针和抗体连接在一起,获得探针偶联抗体。
5)对单链探针偶联抗体进行超滤纯化,测定浓度,稀释为20fmol/μL待用。
比较例1:使用常规PLA方法单检测抗原IL-8或IL-6梯度(单抗原,单抗体对)
在本申请中,以IL-8或IL-6为待分析抗原,使用常规PLA方法(邻位连接反应发生于固体表面)进行单抗原、单抗体对的梯度检测。相关步骤概括如下:
1.抗原稀释:使用1X SSC结合缓冲液(添加0.01%Tween 20)将IL-8抗原或IL-6抗原稀释至所需浓度,总体积为50μL,抗原最高浓度为10000pg/mL,每次稀释5倍,共得到11个抗原浓度:10000、2000、400、80、16、3.2、0.64、0.128、0.0256、0.00512和0.001024pg/mL。
2.抗原-抗体孵育:将0.2μL捕获序列L、0.1μL鲑鱼精DNA、0.2μL实施例1中的探针偶联后抗体、50μL抗原IL-8或IL-6梯度加入1X SSC结合缓冲液中,混合均匀,在恒温振荡器上37℃震荡孵育1h,使得抗体与抗原形成免疫复合物。
3.免疫复合物在磁珠表面捕获和清洗:孵育结束后,短暂离心,加入2μL封闭好的Oligo(dT)磁珠,在旋转混匀仪上室温旋转结合10min,将免疫复合物捕获至磁珠表面上。接着短暂离心,将PCR反应管放置在磁力架上,计时1min;待磁珠完全吸附在磁力架上弃去反应液,加入150μL 0.5X SSC冲洗缓冲液重悬磁珠,磁力架静置,弃上清;重复2-3次“添加冲洗缓冲液-静置-弃上清”操作后,彻底弃上清。
4.邻位连接反应:配置20μL连接体系,其包含0.1μL夹板序列、2μL T4 DNA连接酶缓冲液和0.4μL T4 DNA连接酶(NEB),将连接体系加入步骤3的PCR反应管中,悬浮磁珠,在37℃下进行连接反应15min。
5.清洗:连接反应后,将PCR反应管放置在磁力架上,计时1min;待磁珠完全吸附在磁力架上弃去反应液,加入150μL 0.5X SSC冲洗缓冲液重悬磁珠,磁力架静置,弃上清;重复2-3次“添加冲洗缓冲液-静置-弃上清”操作后,彻底弃上清。
6.洗脱:向PCR反应管中加入20μL DEPC-H2O,震荡瞬离后在PCR仪中70℃反应10min;反应结束短暂离心后放置磁力架上计时1min,待磁珠完全吸附在磁力架上将澄清的洗脱产物全部转出。
7.PCR扩增:配置PCR反应体系,其包含1μL 10X Kod-plus-Neo DNA聚合酶缓冲液、0.2μL Kod-plus-Neo DNA聚合酶(Toyobo)、2mM dNTPs、25mM MgSO4、0.1μL上游引物、0.1μL下游引物、5μL洗脱产物;按照94℃2min,30循环(98℃20s,65℃40s),在PCR反应体系下进行PCR扩增反应,获得PCR扩增产物;纯化PCR扩增产物,测定其浓度,进行二代测序。
8.数据拆分和分析:下机数据按照样品Index序列拆分成样本,同时按照每个抗体偶联的条形码序列,分别对每个样品中IL-8,IL-6进行定量解析。
实施例2:使用本公开PLA方法单检测抗原IL-8或IL-6梯度(单抗原,单抗体对)
在本实施例中,以IL-8或IL-6为待分析抗原,使用本公开PLA方法(邻位连接反应发生于溶液中)进行单抗原、单抗体对的梯度检测。相关步骤概括如下:
1.抗原稀释:使用1X SSC结合缓冲液(添加0.01%Tween 20)将IL-8或IL-6抗原稀释至所需浓度,总体积为50μL,抗原最高浓度为10000pg/mL,每次稀释5倍,共得到11个抗原浓度:10000、2000、400、80、16、3.2、0.64、0.128、0.0256、0.00512和0.001024pg/mL。
2.抗原-抗体孵育:将0.2μL捕获序列L、0.1μL鲑鱼精DNA、0.2μL实施例1中的探针偶联后抗体、50μL抗原IL-8或IL-6梯度加入1X SSC结合缓冲液中,混合均匀,在恒温振荡器上37℃震荡孵育1h,使得抗体与抗原形成免疫复合物。
3.免疫复合物在磁珠表面捕获和清洗:孵育结束后,短暂离心,加入2μL封闭好的Oligo(dT)磁珠,在旋转混匀仪上室温旋转结合10min,将免疫复合物捕获至磁珠表面上。接着短暂离心,将PCR反应管放置在磁力架上,计时1min;待磁珠完全吸附在磁力架上弃去反应液,加入150μL 0.5*SSC冲洗缓冲液重悬磁珠,磁力架静置,弃上清;重复2-3次“添加冲洗缓冲液-静置-弃上清”操作后,彻底弃上清。
4.洗脱,将免疫复合物从磁珠表面释放:加入17.5μL TE缓冲液,重悬磁珠,在37℃下释放10min,将免疫复合物从磁珠表面释放到TE缓冲液中。
5.邻位连接反应:配置20μL连接体系,其包含0.1μL夹板序列、2μL T4 DNA连接酶缓冲液和0.4μL T4 DNA连接酶,将连接体系加入步骤4的TE缓冲液,在PCR反应管中,在37℃下使免疫复合物进行邻位连接反应15min,制得邻位连接反应产物。
6.免疫复合物在磁珠表面再次捕获和清洗:连接反应后,加入2X SSC结合缓冲液,在旋转混匀仪上室温旋转结合10min,再次将免疫复合物捕获至磁珠表面;将PCR反应管放置在磁力架上,计时1min;待磁珠完全吸附在磁力架上弃去反应液,加入150μL 0.5X SSC冲洗缓冲液重悬磁珠,磁力架静置,弃上清;重复2-3次“添加冲洗缓冲液-静置-弃上清”操作后,彻底弃上清。
7.洗脱:向PCR反应管中加入20μL DEPC-H2O,震荡瞬离后在PCR仪中70℃反应10min;反应结束短暂离心后放置磁力架上计时1min,待磁珠完全吸附在磁力架上将澄清的洗脱产物全部转出。
8.PCR扩增:配置PCR反应体系,其包含1μL 10X Kod-plus-Neo DNA聚合酶缓冲液、0.2μL Kod-plus-Neo DNA聚合酶、2mM dNTPs、25mM MgSO4、0.1μL上游引物、0.1μL下游引物、5μL洗脱产物;按照94℃2min,30循环(98℃20s,65℃40s),在PCR反应体系中进行PCR扩增反应,获得PCR扩增产物。纯化PCR扩增产物,测定其浓度,进行二代测序。
9.数据拆分和分析:下机数据按照样品Index序列拆分,同时按照每个抗体偶联的条形码序列,分别对每个样品中IL-8,IL-6进行定量解析。
本公开的PLA方法可进行如下变型:
变型1:
在步骤4中,将释放后的上清液转移至新的PCR反应管中,步骤5中则在新的PCR反应管中进行邻位连接反应,在步骤6中补加封闭好的Oligo(dT)磁珠。其余步骤相同。
变型2:
在本公开方法的简化流程中,可以省略上述步骤6和7(用于降低背景),步骤8中的“5μL洗脱产物”则相应地为“5μL邻位连接反应产物或邻位连接反应产物的稀释物”。其余步骤相同。
比较例2:使用常规PLA方法共检测抗原IL-8、IL-6和PSA梯度(三抗原,三抗体对)
在本比较例中,常规PLA方法实验流程参照比较例1进行,不同之处在于:在步骤1中对3种不同抗原(IL-8、IL-6和PSA)进行稀释,每次稀释5倍,共得到11个抗原浓度(30000至0.003072pg/mL);相应地,步骤2中同时加入3种抗原(各16.6μL)和对应的实施例1中的3种探针偶联后抗体对。
实施例3:使用本公开PLA方法共检测抗原IL-8、IL-6和PSA梯度(三抗原,三抗体对)
在本实施例中,本公开PLA方法实验流程参照实施例2进行,不同之处在于:在步骤1中对3种不同抗原(IL-8、IL-6和PSA)进行稀释,每次稀释5倍,共得到11个抗原浓度(30000至0.003072pg/mL);相应地,步骤2中同时加入3种抗原(各16.6μL)和对应的实施例1中的3种探针偶联后抗体对。
比较例3:使用核酸连接的免疫夹心测定(NULISA)共检测抗原IL-8、IL-6和PSA梯度(三抗原,三抗体对)
1.抗原稀释:使用1X SSC结合缓冲液(添加0.01%Tween 20)将IL-8抗原、IL-6抗原和PSA抗原分别稀释至所需浓度,总体积为50μL,抗原最高浓度为30000pg/mL,每次稀释5倍,共得到11个抗原浓度:30000、6000、1200、240、48、9.6、1.92、0.384、0.0768、0.01536和0.003072pg/mL。
2.抗原-抗体孵育:将0.2μL捕获序列L、0.1μL鲑鱼精DNA、0.2μL实施例1中的3种探针偶联后抗体对、各16.6μL的IL-8抗原、IL-6抗原和PSA抗原加入1X SSC结合缓冲液中,混合均匀,在恒温振荡器上37℃震荡孵育1h,使抗原与抗体形成免疫复合物。
3.免疫复合物在磁珠表面捕获和清洗:孵育结束后,短暂离心,加入2μL封闭好的Oligo(dT)磁珠,在旋转混匀仪上室温旋转结合10min。结合磁珠后短暂离心,将PCR反应管放置在磁力架上,计时1min;待磁珠完全吸附在磁力架上弃去反应液,加入150μL0.5*SSC冲洗缓冲液重悬磁珠,磁力架静置,弃上清;重复2-3次“添加冲洗缓冲液-静置-弃上清”操作后,彻底弃上清。
4.免疫复合物从磁珠表面释放:加入17.5μL TE缓冲液,重悬磁珠,在37℃下释放10min,将免疫复合物从磁珠表面释放到TE缓冲液中。释放结束后短暂离心,将PCR管放在96孔磁力架上,静置1min;待磁珠完全吸附在磁力架上,将澄清的反应液转移到新的PCR管中。
5.免疫复合物再捕获和清洗:加入2μL封闭好的链霉亲和素磁珠,0.5μL捕获序列R,20μL 2X SSC结合缓冲液,在37℃下孵育10min,旋转混匀仪上室温旋转结合10min,将免疫复合物再次捕获至磁珠表面上。接着短暂离心,将PCR反应管放置在磁力架上,计时1min;待磁珠完全吸附在磁力架上弃去反应液,加入150μL 0.5X SSC冲洗缓冲液重悬磁珠,磁力架静置,弃上清;重复2-3次“添加冲洗缓冲液-静置-弃上清”操作后,彻底弃上清。
6.邻位连接反应:配置20μL连接体系,其包含0.1μL夹板序列、2μL T4 DNA连接酶缓冲液和0.4μL T4 DNA连接酶,将连接体系加入步骤5的PCR反应管中,悬浮磁珠,在37℃下进行连接反应15min。注:不同于本公开PLA方法,NULISA方法的邻位连接反应在固体磁珠表面进行。
7.清洗:连接反应后,将反应管放置在磁力架上,计时1min;待磁珠完全吸附在磁力架上弃去反应液,加入150μL 0.5X SSC冲洗缓冲液重悬磁珠,磁力架静置,弃上清;重复2-3次“添加冲洗缓冲液-静置-弃上清”操作后,彻底弃上清。
8.洗脱:向PCR反应管中加入20μL DEPC-H2O,震荡瞬离后在PCR仪中70℃反应10min;反应结束短暂离心后放置磁力架上计时1min,待磁珠完全吸附在磁力架上将澄清的洗脱产物全部转出。
9.PCR扩增:配置PCR反应体系,其包含1μL 10X Kod-plus-Neo DNA聚合酶缓冲液、0.2μL Kod-plus-Neo DNA聚合酶、2mM dNTPs、25mM MgSO4、0.1μL上游引物、0.1μL下游引物、5μL洗脱产物;按照94℃2min,30循环(98℃20s,65℃40s),在PCR反应体系中进行PCR扩增反应,获得PCR扩增产物。纯化PCR扩增产物,测定其浓度,进行二代测序。
10.数据拆分和分析:下机数据按照样品Index序列拆分,同时按照每个抗体偶联的条形码序列,分别对每个样品中IL-8、IL-6和PSA进行定量解析。
捕获序列L及R参见表2。
有效数据占比
统计3种方案(常规PLA方法、本公开PLA方法和NULISA方法)二代测序下机数据中,有效数据(正确抗体对条形码区域邻位连接的数据)占下机总数据的比例。
结果与讨论
1.常规方法与本公开方法的单检测结果比较(即比较例1和实施例2的结果比较)
在单抗原、单抗体对测定(单检测)中,对常规PLA方法(比较例1,邻位连接反应发生于固体磁珠表面)和本公开PLA方法(实施例2,邻位连接反应发生于溶液中)进行了比较,其中,每个样品仅含有一种抗原(IL-8或IL-6),反应体系仅加入一种对应抗原的检测抗体对。
UMI读值表示检测到的样本中的抗原含量,读值越高表明检测到的抗原含量越高,0抗原浓度样本的UMI读值表示检测体系的检测背景值。在0pg/mL抗原浓度条件下,用常规PLA方法检测的UMI读值分别为2167.33(IL-8)、495.44(IL-6),用本公开的PLA方法检测的UMI读值分别为206(IL-8)、27.33(IL-6),这表明本公开的方法相对于常规方法降低了检测背景;在不同抗原浓度梯度下,用常规PLA方法和本公开的PLA方法单检测的UMI读数如图2A和图2B所示,常规方法在所有抗原浓度条件下的UMI读数均显著高于本公开的方法,这同样表明本公开的方法相对于常规方法降低了检测背景。
检测限LoD表示检测系统能够检测到的分析物的最低浓度,为背景信号+背景信号标准偏差的3倍。采用常规PLA方法进行检测时,IL-8的LoD=0.052pg/mL,IL-6的LoD=0.459pg/mL。采用本公开的PLA方法进行检测时,IL-8的LoD=0.012pg/mL,IL-6的LoD=0.040pg/mL。该结果表明在对抗原IL-8或IL-6进行单重检测的情况下,本公开的PLA方法的检测灵敏度均显著高于常规PLA方法。
由此可见,与常规PLA方法相比,本公开PLA方法具有检测背景低、准确度高、检测灵敏度高的优点。
2.常规方法与本公开方法的共检测结果比较(即比较例2和实施例3的结果比较)
在三种抗原、三种抗体对测定(共检测)中,将本公开的PLA方法(实施例3)与常规PLA方法(比较例2)进行比较,其中,每个样品含有三种抗原(IL-8、IL-6和PSA),反应体系加入三种对应抗原的检测抗体对。在不同抗原浓度梯度下的共检测的UMI读数如图3A(常规方法)、图3B(本公开方法)和图5A(常规方法vs本公开方法)所示。其中,图5A显示的是常规方案和本公开方案分别对比三种抗原(IL-8、IL-6和PSA)的UMI结果。
在0pg/mL抗原浓度条件下,用常规PLA方法检测的UMI读值分别为3160.5(IL-8),831.5(IL-6),705(PSA);用本公开的PLA方法检测的UMI读值分别为262.33(IL-8),16.33(IL-6),52.5(PSA),这表明本公开的方法相对于常规方法降低了检测背景;在不同抗原浓度梯度下,用常规PLA方法和本公开的PLA方法单检测的UMI读数如图3A、图3B和5A所示,常规方法的在所有抗原浓度UMI读数均显著高于本公开方法,这同样表明常规方法有较高的实验背景。
信背比(即信号背景比)指高浓度样本的信号值与0抗原浓度背景信号值的比值,如图5B所示,本公开的方法的信背比(即信号背景比)显著高于常规方法,这表明本公开方法的检测信号更强、检测动态范围也更大。
将由各样本的二代下机数据拆分出的IL8、IL6和PSA对应的检测counts相加,与各样本总的下机counts值对比,计算样本中有效数据的比例。图5C显示了将三种抗原(IL-8、IL-6和PSA)的UMI值相加合并后的总体结果。如图5C所示,本公开的方法在0.00512pg/ml及以上浓度梯度下的有效数据(正确的抗体对条形码区域邻位连接的数据)占下机总数据的比例比常规方法高出约10%,在高浓度抗原浓度10000pg/mL下甚至高出约20%,有效节省了测序空间。根据该结果,本公开的PLA方法在更多抗原种类共检时,能够有效避免错误抗体对上偶联核酸的错误邻位连接,比常规方法有更好检测效果。
采用常规PLA方法进行检测时,IL-8的LoD=0.042pg/mL,IL-6的LoD=0.302pg/mL,PSA的LoD=1.418pg/mL;采用本公开的PLA方法进行检测时,IL-8的LoD=0.016pg/mL,IL-6的LoD=0.062pg/mL,PSA的LoD=1.267pg/mL。该结果表明,在对抗原IL-8、IL-6和PSA进行三重检测的情况下,本公开的PLA方法对抗原IL-8、IL-6、PSA的检测灵敏度均优于常规PLA方法。
由此可见,与常规PLA方法相比,本公开PLA方法具有背景低、最高抗原浓度信号与背景信号倍数值高、有效数据占比高、检测灵敏度高的优点,适合用于含有多种不同分析物的样品的多重检测。
3.NULISA方法与本公开方法的共检测结果比较
在三抗原、三抗体对测定(共检测)中,对NULISA方法(比较例3)和本公开PLA方法(实施例3)进行了比较,其中,每个样品含有三种抗原(IL-8、IL-6和PSA),反应体系加入三种对应抗原的检测抗体对。在不同抗原浓度梯度下的共检测的UMI读数如图6(NULISA方法)和图3B(本公开方法)所示。
采用NULISA方法进行检测时,IL-8的LoD=0.034pg/mL,IL-6的LoD=0.410pg/mL;PSA未能得到好的拟合取消,无法求LoD值。采用本公开PLA方法进行检测时,IL-8的LoD=0.016pg/mL,IL-6的LoD=0.062pg/mL,PSA的LoD=1.267pg/mL。该结果表明,在对抗原IL-8、IL-6和PSA进行三重检测的情况下,本公开的PLA方法对抗原IL-8、IL-6的检测灵敏度均优于NULISA方法。针对PSA测定,在抗原PSA浓度低于100pg/mL时,NULISA方法的UMI读数区分很小(图6),该结果表明,对于抗原PSA的低浓度检测,NULISA方法不能实现检测目的,而本公开的方法则能够实现抗原PSA的低浓度检测,证明本公开的方法对于低浓度抗原的检测比NULISA方法更有优势,即,本公开方法的抗原检测种类范围更广、能够检出的最低浓度更低。
4.本公开方法的单检测、共检测的结果比较
将本公开方法单检测IL-8或IL-6的检测结果(实施例2)与在共检测3种抗原时IL-8或IL-6的检测结果(实施例3)进行了比较,比较结果显示在图4A和图4B中。
如图4A和图4B所示,本公开方法在对IL-8或IL-6进行单检测和共检测时的两组数据非常接近,并且在单检测和共检测时均显示出了令人满意的灵敏度:单检测时,IL-8的LoD=0.012pg/mL,IL-6的LoD=0.040pg/mL;3种抗原共检测时,IL-8的LoD=0.016pg/mL,IL-6的LoD=0.062pg/mL。由此可见,本公开方法可以有效地实现多种抗原的共检测、微量样品的低浓度蛋白检测。
除非本公开另有说明或与上下文明显矛盾,否则本公开描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。除非另有说明,否则本文提供的任何和所有实施例或示例性语言仅旨在更好地说明本公开,并且不对本公开的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释成表明任何未要求的要素对于本公开的实践是必不可少的。
本公开描述了优选的实施方式,包括发明人已知的实施本公开的最优方式。在阅读本公开的内容后,对优选实施方式进行变化对于本领域技术人员而言将是显而易见的。本领域技术人员可以适当地采用这些变型,并且本公开意在涵盖以不同于本文具体描述的方式实施本公开的变型。因此,本公开包括权利要求中所描述主题的所有变型和等同物。此外,除非本文另有说明或与上下文存在明显矛盾,否则本公开意在涵盖本文所描述要素的所有可能变型的任意组合。
Claims (15)
1.一种检测方法,其依次包括如下步骤:
(1)将与第一探针偶联的第一抗体、与第二探针偶联的第二抗体和待测样品在溶液中混合,使得第一抗体和第二抗体结合至待测样品中的分析物,形成免疫复合物;
(2)使固体表面与步骤(1)的溶液接触,将所述免疫复合物捕获至所述固体表面;
(3)清洗所述固体表面一次以上,去除未结合到固体表面上的分子;
(4)洗脱,将结合在所述固体表面上的免疫复合物释放到第一洗脱缓冲液中;
(5)将免疫复合物保持在第一洗脱缓冲液中,或将免疫复合物置于与所述第一缓冲液不同的其他溶液中,加入连接体系,使免疫复合物发生邻位连接反应,可选地对邻位连接反应产物进行纯化;以及
(6)检测,获得待测样品中的分析物的检测结果;
优选地,所述分析物为一种以上修饰或未修饰的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述方法在步骤(5)和(6)之间还包括如下步骤:
(5'-1)二次捕获及清洗:将免疫复合物再次捕获至固体表面,清洗所述固体表面一次以上,去除未结合到固体表面上的分子;
(5'-2)洗脱,将结合在所述固体表面上的免疫复合物释放到第二洗脱缓冲液中。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中,在步骤(6)中,所述检测包括多重荧光定量PCR或二代测序。
4.根据权利要求1或2所述的方法,其中,第一抗体、第二抗体、第一探针和/或第二探针具有停泊基团,所述固体表面具有捕获基团,所述停泊基团与所述捕获基团结合,由此将免疫复合物捕获至固体表面;优选地,所述停泊基团选自生物素、polydT、polydA中的一种以上,所述捕获基团选自链霉亲和素、抗生物素蛋白、polydT、polydA中的一种以上。
5.根据权利要求1或2所述的方法,其中,使用捕获序列将免疫复合物捕获至所述固体表面,所述捕获序列与第一探针和/或第二探针的捕获区域互补,所述捕获序列具有停泊基团,所述固体表面具有捕获基团,所述停泊基团与所述捕获基团结合,由此将免疫复合物捕获至固体表面;优选地,所述停泊基团选自生物素、polydT、polydA中的一种以上,所述捕获基团选自链霉亲和素抗生物素蛋白、polydT、polydA中的一种以上。
6.根据权利要求1或2所述的方法,其中,在步骤(1)和/或步骤(2)中,所述溶液为结合缓冲液,所述结合缓冲液选自SSC缓冲液、Tris、HEPES、Bis-Tris和MOPS中的一种以上,优选地,所述结合缓冲液的阳离子浓度为100mM至1M;优选地,所述阳离子为钠离子;和/或,在步骤(3)和(5'-1)中,使用清洗溶液进行清洗,所述清洗溶液选自SSC缓冲液、Tris、HEPES、Bis-Tris和MOPS中的一种以上,优选地,所述清洗溶液的阳离子浓度为10mM至200mM,优选地,所述阳离子为钠离子。
7.根据权利要求1或2所述的方法,其中,第一洗脱缓冲液选自TE缓冲液、Tris、HEPES、Bis-Tris和MOPS中的一种以上,优选地,所述第一洗脱缓冲液的阳离子浓度为1mM至100mM,优选地,所述阳离子为钠离子;和/或,第二洗脱缓冲液选自DEPC水、无RNA酶/DNA酶的水、TE缓冲液、Tris、HEPES、Bis-Tris和MOPS中的一种以上。
8.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述连接体系包括夹板序列和连接酶;优选地,所述连接酶选自T4 DNA连接酶、T7 DNA连接酶、SplintR连接酶、Taq连接酶。
9.根据权利要求1或2所述的方法,其中,第一探针和第二探针各自独立地包含寡核苷酸链和与抗体偶联的基团,所述寡核苷酸链包含二代测序接头区域、条形码区域和夹板序列互补区域;优选地,所述与抗体偶联的基团选自叠氮基团、氨基和巯基中的一种以上,优选地,所述与抗体偶联的基团位于第一探针和/或第二探针的5’末端或3’末端。
10.根据权利要求9所述的方法,其中,第一探针和/或第二探针的寡核苷酸链还包含UMI区域和/或捕获区域。
11.根据权利要求1或2所述的方法,其中,邻位连接反应产物为核酸报告分子,所述核酸报告分子包含第一探针和第二探针的UMI区域、条形码区域和/或夹板序列互补区域。
12.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述固体选自磁性固体例如磁珠和微量滴定孔板。
13.一种用于权利要求1-12中任一项所述的方法的试剂盒,其中,所述试剂盒包括:
(i)第一探针和第一抗体;
(ii)第二探针和第二抗体;
(iii)结合缓冲液,所述结合缓冲液选自SSC缓冲液、Tris、HEPES、Bis-Tris和MOPS中的一种以上,优选地,所述结合缓冲液的阳离子浓度为100mM至1M;优选地,所述阳离子为钠离子;
(iv)清洗缓冲液,所述清洗缓冲液选自SSC缓冲液、Tris、HEPES、Bis-Tris和MOPS中的一种以上,优选地,所述清洗溶液的阳离子浓度为10mM至200mM,优选地,所述阳离子为钠离子。
(v)第一洗脱缓冲液,
第一洗脱缓冲液选自TE缓冲液、Tris、HEPES、Bis-Tris和MOPS中的一种以上,优选地,所述第一洗脱缓冲液的阳离子浓度为1mM至100mM,优选地,所述阳离子为钠离子;
(vi)夹板序列和连接酶;优选地,所述连接酶选自T4 DNA连接酶、T7 DNA连接酶、SplintR连接酶、Taq连接酶;
(vii)可选的捕获序列,所述捕获序列与第一探针和/或第二探针的捕获区域互补,所述捕获序列具有停泊基团,优选地,所述停泊基团选自生物素、polydT、polydA中的一种以上;
(viii)可选的固体;优选地,所述固体选自磁性固体例如磁珠和微量滴定孔板;和/或优选地,所述固体表面具有捕获基团,所述捕获基团能够与停泊基团结合,所述捕获基团选自链霉亲和素、抗生物素蛋白、polydA、polydT序列中的一种以上。
(ix)可选的第二洗脱缓冲液选自DEPC水、无RNA酶/DNA酶的水、TE缓冲液、Tris、HEPES、Bis-Tris和MOPS中的一种以上;
以及
(x)可选的PCR扩增试剂。
14.根据权利要求13所述的试剂盒,其中,第一探针和第二探针各自独立地包含寡核苷酸链和与抗体偶联的基团,所述寡核苷酸链包含二代测序接头区域、条形码区域和夹板序列互补区域;优选地,所述与抗体偶联的基团选自叠氮基团、氨基和巯基中的一种以上,优选地,所述与抗体偶联的基团位于第一探针和/或第二探针的5’末端或3’末端。
15.根据权利要求13或14所述的试剂盒,其中,第一探针和/或第二探针的寡核苷酸链还包含UMI区域和/或捕获区域。
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