JP7241619B2 - 標的物質検出方法、標的物質検出キット、標的物質検出システム - Google Patents
標的物質検出方法、標的物質検出キット、標的物質検出システム Download PDFInfo
- Publication number
- JP7241619B2 JP7241619B2 JP2019114031A JP2019114031A JP7241619B2 JP 7241619 B2 JP7241619 B2 JP 7241619B2 JP 2019114031 A JP2019114031 A JP 2019114031A JP 2019114031 A JP2019114031 A JP 2019114031A JP 7241619 B2 JP7241619 B2 JP 7241619B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- substance
- binding
- capturing
- aptamer
- reporter
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54386—Analytical elements
- G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
- G01N33/54388—Immunochromatographic test strips based on lateral flow
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/16—Aptamers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
- C12N2310/3517—Marker; Tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
- C12N2310/3519—Fusion with another nucleic acid
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
Description
本開示は、捕捉用物質を用いた標的物質を検出する方法、キット及びシステムに関する。
標的物質を検出する方法としては、イムノクロマトグラフィー法、ＥＬＩＳＡ法、フロースルー法、ＳＰＲ法、及びビーズアッセイ法などが知られており、例えば、イムノクロマトグラフィー検出法においては、試料中の被検出物（標的物質）を捕捉するために、抗原や抗体等のタンパク質が使用されている（特許文献１）。高感度化を目的として核酸アプタマーを用いたイムノクロマトグラフィー検出法も開発され始めている（特許文献２）。
核酸アプタマーの固定化方法については、被検出物と特異的に結合する核酸アプタマーの末端にＮＨ2やビオチン、ジゴキシゲニン等の修飾を施し、ニトロセルロースメンブレンへの固定化や検出用物質と結合させている（非特許文献１）。核酸アプタマーの固相化担体への直接的な結合にはＵＶ照射法を、間接的な結合にはビオチン修飾アプタマーであればストレプトアビジン、ジゴキシゲニン修飾アプタマーであれば抗ジゴキシゲニン抗体を固相化担体に固定化し、核酸アプタマーを固相化担体に固定化している。タンパク質を使用しない固相化担体への間接的な核酸アプタマーの結合には、核酸アプタマーに相補的な配列を持つ一本鎖ＤＮＡもしくは一本鎖ＲＮＡを固相化担体に結合し、相補結合によって核酸アプタマーが固相化担体に結合する方法もある（特許文献３）。
核酸アプタマーの固定化方法については、被検出物と特異的に結合する核酸アプタマーの末端にＮＨ2やビオチン、ジゴキシゲニン等の修飾を施し、ニトロセルロースメンブレンへの固定化や検出用物質と結合させている（非特許文献１）。核酸アプタマーの固相化担体への直接的な結合にはＵＶ照射法を、間接的な結合にはビオチン修飾アプタマーであればストレプトアビジン、ジゴキシゲニン修飾アプタマーであれば抗ジゴキシゲニン抗体を固相化担体に固定化し、核酸アプタマーを固相化担体に固定化している。タンパク質を使用しない固相化担体への間接的な核酸アプタマーの結合には、核酸アプタマーに相補的な配列を持つ一本鎖ＤＮＡもしくは一本鎖ＲＮＡを固相化担体に結合し、相補結合によって核酸アプタマーが固相化担体に結合する方法もある（特許文献３）。
Pathogens. 2014 Jun; 3(2): 341-355.
従来の標的物質を検出する方法（いわゆるサンドイッチ法）においては、固定側（支持体側）あるいは検出側（レポーター側）どちらかは直接的に捕捉用物質が固定されているため、標的物質が変更となった場合、その標的物質に対応する捕捉用物質へと固定化されている捕捉用物質を変更する必要があるが、捕捉用物質が固定化されている支持体及びレポーター物質ごと、捕捉用物質を設計し直す必要があり、再度、捕捉用物質を固定化する検討を行わなければならない。
しかし、従来の直接的に捕捉用物質が固定されている検出方法においては、捕捉用物質を固定化する際の化学反応等により捕捉用物質自体も反応にさらされることにより、捕捉用物質の標的物質に対する認識機能が失われる、低下するなどの問題が生じるため、固定化の反応条件検討を行い、最適な条件を探索する必要がある。この条件検討だけでも多くの試料が必要となり、検討の時間が必要となる。さらに、捕捉用物質探索の初期段階では、多くの捕捉用物質候補に対して条件検討が必要となり、多大な時間を要するという課題があった。
例えば、核酸アプタマーの担体への固定化方法として、化学的な共有結合、UV照射による物理的エネルギーによる共有結合などの固定化方法が存在する（特許文献３）。しかしながらこれらの固定化処理は、核酸アプタマー本体へのダメージが生じ、核酸アプタマーの標的物質への結合力の低下や、機能を持たなくなる原因となる。
よって、本開示は、一態様において、固定側（支持体側）にも検出側（レポーター側）にも間接的に結合される捕捉用物質を用いる標的物質検出方法を提供する（第一の形態）。
また、従来のイムノクロマトグラフィー法では、標的物質（例えば、標的物質など）を２種類の結合物質（例えば、抗体やハプテン）を使用して捕捉するサンドイッチ法を行う場合、前記２種類の結合物質は、一方を固定側（支持体側）、他方を検出側（レポーター側）に特異的に結合するように設計されている。例えば、２種類の異なるモノクローナル抗体を用いてサンドイッチ法で標的物質を捕捉する場合、抗体によって固定側（支持体側）としたほうが好ましいとされる抗体や、検出側（レポーター側）としたほうが好ましいとされる抗体が知られている。
イムノクロマトグラフィーの検出対象の一つとしてインフルエンザウイルスが挙げられ、インフルエンザウイルスの亜型や薬剤耐性株を識別するためには、核タンパク質以外に、ヘマグルチニン（ＨＡ）やノイラミニダーゼ、ＲＮＡポリメラーゼなどを標的とする抗体や核酸アプタマーなどの捕捉用物質が必要となるが、これらのウイルスタンパク質は変異しやすく、感度を維持するためには捕捉用物質の変更が必須である。またインフルエンザウイルスに限らず、変異を伴うウイルスや細菌、真菌等も同様である。
アプタマーをイムノクロマトグラフィーに適用する場合、あるいは、新たな標的物質や変異した標的物質に対して得られたアプタマーをイムノクロマトグラフィーに適用する場合、従来の方法によれば、１種類のアプタマーに対して固定側（支持体側）用と検出側（レポーター側）用の２種類のアプタマープローブを設計する必要がある。
また、標的に結合した２種類のアプタマープローブのうち、一方が固定側（支持体側）用、他方が検出側（レポーター側）用に限定されると、支持体やレポーターへの結合反応効率（標的物質の捕捉効率）が低下することが考えられる。
よって、本開示は、その他の一態様において、間接的に、固定側（支持体側）にも検出側（レポーター側）にも結合可能なアプタマープローブを用いるイムノクロマトグラフィー検出法を提供する（第二の形態）。
イムノクロマトグラフィーの検出対象の一つとしてインフルエンザウイルスが挙げられ、インフルエンザウイルスの亜型や薬剤耐性株を識別するためには、核タンパク質以外に、ヘマグルチニン（ＨＡ）やノイラミニダーゼ、ＲＮＡポリメラーゼなどを標的とする抗体や核酸アプタマーなどの捕捉用物質が必要となるが、これらのウイルスタンパク質は変異しやすく、感度を維持するためには捕捉用物質の変更が必須である。またインフルエンザウイルスに限らず、変異を伴うウイルスや細菌、真菌等も同様である。
アプタマーをイムノクロマトグラフィーに適用する場合、あるいは、新たな標的物質や変異した標的物質に対して得られたアプタマーをイムノクロマトグラフィーに適用する場合、従来の方法によれば、１種類のアプタマーに対して固定側（支持体側）用と検出側（レポーター側）用の２種類のアプタマープローブを設計する必要がある。
また、標的に結合した２種類のアプタマープローブのうち、一方が固定側（支持体側）用、他方が検出側（レポーター側）用に限定されると、支持体やレポーターへの結合反応効率（標的物質の捕捉効率）が低下することが考えられる。
よって、本開示は、その他の一態様において、間接的に、固定側（支持体側）にも検出側（レポーター側）にも結合可能なアプタマープローブを用いるイムノクロマトグラフィー検出法を提供する（第二の形態）。
本開示は、一態様において、試料中の標的物質を検出する方法であって、前記試料と、第一の結合部分を備えた支持体と、前記標的物質を検出するための標識物質及び第二の結合部分を備えたレポーター物質と、前記第一の結合部分と結合可能な第一の結合パートナー部分を備える、前記標的物質に結合可能な第一の捕捉用物質と、前記第二の結合部分に結合可能な第二の結合パートナー部分を備える、前記標的物質に結合可能な第二の捕捉用物質と、を反応させる反応工程と、前記標識物質からのシグナルを検出する検出工程を含む、方法に関する。以下、この方法を「本開示に係る第一の検出方法」ともいう。
本開示は、その他の一態様において、試料中の標的物質を検出する上記方法を行うための標的物質検出システムに関する。以下、この方法を「本開示に係る第一の検出システム」ともいう。
本開示は、その他の一態様において、試料中の標的物質をイムノクロマトグラフィー法により検出する方法であって、標的物質に結合可能なアプタマー部分と、支持体に固定化された結合部分及びレポーター物質に固定化された結合部分の両方に結合可能な結合パートナー部分を備えるアプタマープローブを用い、前記支持体上に、「支持体－アプタマープローブ－標的物質－アプタマープローブ－レポーター物質」で表される結合状態で、前記標的物質及び前記レポーター物質を捕捉すること、並びに、前記レポーター物質からのシグナルを検出することを含む方法に関する。以下、この方法を「本開示に係る第二の検出方法」ともいう。
本開示は、他の一態様において、
結合部分が固定化された検出領域を備えるイムノクロマトグラフィー試験片と、
結合部分が固定化されたレポーター物質と、
検出領域の結合部分及びレポーター物質の結合部分の両方に結合可能な結合パートナー部分と標的物質に結合可能なアプタマー部分とを備えるアプタマープローブとを含む、イムノクロマトグラフィー法による標的物質の検出システムに関する。以下、この方法を「本開示に係る第二の検出システム」ともいう。
結合部分が固定化された検出領域を備えるイムノクロマトグラフィー試験片と、
結合部分が固定化されたレポーター物質と、
検出領域の結合部分及びレポーター物質の結合部分の両方に結合可能な結合パートナー部分と標的物質に結合可能なアプタマー部分とを備えるアプタマープローブとを含む、イムノクロマトグラフィー法による標的物質の検出システムに関する。以下、この方法を「本開示に係る第二の検出システム」ともいう。
本開示は、他の一態様において、
結合部分が固定化された検出領域を備えるイムノクロマトグラフィー試験片と、
結合部分が固定化されたレポーター物質と、
検出領域の結合部分及びレポーター物質の結合部分の両方に結合可能な結合パートナー部分と標的物質に結合可能なアプタマー部分とを備えるアプタマープローブとを含む、
本開示に係る第二の検出方法を行うためのキットに関する。以下、この方法を「本開示に係る第二の検出キット」ともいう。
結合部分が固定化された検出領域を備えるイムノクロマトグラフィー試験片と、
結合部分が固定化されたレポーター物質と、
検出領域の結合部分及びレポーター物質の結合部分の両方に結合可能な結合パートナー部分と標的物質に結合可能なアプタマー部分とを備えるアプタマープローブとを含む、
本開示に係る第二の検出方法を行うためのキットに関する。以下、この方法を「本開示に係る第二の検出キット」ともいう。
本開示に係る第一の形態（本開示に係る第一の検出方法、検出システム）によれば、例えば、固定側（支持体側）にも検出側（レポーター側）にも間接的に結合された捕捉用物質を用いた標的物質検出方法の提供が可能になる。
これにより、第一の結合部分と第二の結合部分を予め規定しておくことで、多数の捕捉用候補物質があっても、捕捉用候補物質を固定化するための条件検討を行うことなく、多数の捕捉用候補物質をそのまま活用したアッセイが可能となり、検討用試料量の削減につながり、さらに検討時間の大幅な短縮につながる。特に、ＳＥＬＥＸ法などの捕捉用物質の選定段階において、多数の捕捉用物質をスクリーニングする場合、本開示を用いることにより、大幅な期間の短縮とコストの削減ができる効果がある。
また、捕捉用物質を支持体やレポーター物質に固定化する処理を施さないため、固定化処理による捕捉用物質へのダメージが最小限に抑えることができ、標的物質への認識機能を保ったままのアッセイが可能となる。
さらに、固定側の第一の結合部分を介して捕捉用物質を固定することにより、捕捉用物質の配向性を保つことができる。
これにより、第一の結合部分と第二の結合部分を予め規定しておくことで、多数の捕捉用候補物質があっても、捕捉用候補物質を固定化するための条件検討を行うことなく、多数の捕捉用候補物質をそのまま活用したアッセイが可能となり、検討用試料量の削減につながり、さらに検討時間の大幅な短縮につながる。特に、ＳＥＬＥＸ法などの捕捉用物質の選定段階において、多数の捕捉用物質をスクリーニングする場合、本開示を用いることにより、大幅な期間の短縮とコストの削減ができる効果がある。
また、捕捉用物質を支持体やレポーター物質に固定化する処理を施さないため、固定化処理による捕捉用物質へのダメージが最小限に抑えることができ、標的物質への認識機能を保ったままのアッセイが可能となる。
さらに、固定側の第一の結合部分を介して捕捉用物質を固定することにより、捕捉用物質の配向性を保つことができる。
本開示に係る第二の形態（本開示に係る第二の検出方法、検出システム、検出キット）によれば、例えば、固定側（支持体側）にも検出側（レポーター側）にも結合可能なアプタマープローブを用いたイムノクロマトグラフィー検出法が可能になる。
これにより、第一の形態における効果に加え、限定されない一又は複数の実施形態において、固定側（支持体）のアプタマーとの結合部分と、検出側（レポーター物質）のアプタマーとの結合部分を共通化しておくことで、１種類のアプタマーを準備することでイムノクロマトグラフィー検出法が可能となる。
［第一の形態］
本開示に係る第一の形態は、捕捉用物質を用いた標的物質検出方法において、捕捉用物質が支持体あるいはレポーターに直接的に結合される場合、標的物質が変更となった際に、捕捉用物質のみではなく、固定化されている支持体及びレポーター物質ごと、捕捉用物質を設計し直す必要があり、コストや手間がかかる等という課題に関して、標的物質の変更に合わせて新たな捕捉用物質を用いる場合でも、捕捉用物質を支持体及びレポーター物質に固定するための結合様式（結合部分や結合パートナー部分）を予め規定しておくことで、捕捉用物質を支持体及びレポーター物質に固定する検討を行う必要がなく、新たな捕捉用物質をそのまま活用できる解決方法を見出したことに基づく。
本開示に係る第一の形態は、捕捉用物質を用いた標的物質検出方法において、捕捉用物質が支持体あるいはレポーターに直接的に結合される場合、標的物質が変更となった際に、捕捉用物質のみではなく、固定化されている支持体及びレポーター物質ごと、捕捉用物質を設計し直す必要があり、コストや手間がかかる等という課題に関して、標的物質の変更に合わせて新たな捕捉用物質を用いる場合でも、捕捉用物質を支持体及びレポーター物質に固定するための結合様式（結合部分や結合パートナー部分）を予め規定しておくことで、捕捉用物質を支持体及びレポーター物質に固定する検討を行う必要がなく、新たな捕捉用物質をそのまま活用できる解決方法を見出したことに基づく。
本開示に係る第一の態様によれば、一又は複数の実施形態において、捕捉用物質が支持体、あるいはレポーター物質に、ある結合様式を介して間接的に固定化されていることにより、標的物質が変更となった場合でも、第一の結合部分を備えた支持体や、第二の結合部分を備えたレポーター物質を変更せずとも、第一の結合パートナー部分を備えた第一の捕捉用物質及び、第二の結合パートナー部分を備えた第二の捕捉用物質を変更するだけで、標的となる標的物質にあわせた標的物質検出方法とすることができ、コストや手間の少ない、標的物質検出方法の提供を行うことができる。
第一の検出方法
本開示に係る第一の検出方法は、試料中の標的物質を検出する方法であって、
前記試料と、
第一の結合部分を備えた支持体と、
前記標的物質を検出するための標識物質及び第二の結合部分を備えたレポーター物質と、
前記第一の結合部分と結合可能な第一の結合パートナー部分を備える、前記標的物質に結合可能な第一の捕捉用物質と、
前記第二の結合部分に結合可能な第二の結合パートナー部分を備える、前記標的物質に結合可能な第二の捕捉用物質と、
を反応させる反応工程と、
前記標識物質からのシグナルを検出する検出工程を含む方法である。
本開示に係る第一の検出方法は、試料中の標的物質を検出する方法であって、
前記試料と、
第一の結合部分を備えた支持体と、
前記標的物質を検出するための標識物質及び第二の結合部分を備えたレポーター物質と、
前記第一の結合部分と結合可能な第一の結合パートナー部分を備える、前記標的物質に結合可能な第一の捕捉用物質と、
前記第二の結合部分に結合可能な第二の結合パートナー部分を備える、前記標的物質に結合可能な第二の捕捉用物質と、
を反応させる反応工程と、
前記標識物質からのシグナルを検出する検出工程を含む方法である。
第一の捕捉用物質
本開示において、「第一の捕捉用物質」は、標的物質認識部位を介して標的物質のみを結合する機能を有する標的物質認識部位と、支持体に固定化された第一の結合部分に結合可能な第一の結合パートナー部分とを備える。
ここで捕捉用物質とは、標的物質認識部位を介して標的物質を捕捉する機能を有する物質であり、標的物質により捕捉される物質ではない。
標的物質認識部分は、抗体、低分子抗体、ペプチド、アプタマーなどが挙げられ、標的物質に対応するものを取得することができるまでの時間の観点からアプタマーであることが好ましい。
第一の結合パートナー部分は、第一の捕捉用物質が予め備える部分でも良く、化学修飾等により付加された部分であっても良い。例えば、抗体が予め備えるFc部分や糖鎖を第一の結合パートナー部分とすることもできる。
アプタマーとしては、核酸アプタマーでもよくペプチドアプタマーでもよい。核酸アプタマーは、核酸であればよく、核酸としては、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びこれらの修飾物又はアナログが挙げられ、ＲＮＡであることが好ましい。
第一の捕捉用物質は、標的物質認識部分と第一の結合パートナー部分とが直接結合していてもよく、リンカーを介して結合していてもよい。また、第一の捕捉用物質は、支持体に固定された第一の結合部分に予め結合されていてもよい。
本開示において、「第一の捕捉用物質」は、標的物質認識部位を介して標的物質のみを結合する機能を有する標的物質認識部位と、支持体に固定化された第一の結合部分に結合可能な第一の結合パートナー部分とを備える。
ここで捕捉用物質とは、標的物質認識部位を介して標的物質を捕捉する機能を有する物質であり、標的物質により捕捉される物質ではない。
標的物質認識部分は、抗体、低分子抗体、ペプチド、アプタマーなどが挙げられ、標的物質に対応するものを取得することができるまでの時間の観点からアプタマーであることが好ましい。
第一の結合パートナー部分は、第一の捕捉用物質が予め備える部分でも良く、化学修飾等により付加された部分であっても良い。例えば、抗体が予め備えるFc部分や糖鎖を第一の結合パートナー部分とすることもできる。
アプタマーとしては、核酸アプタマーでもよくペプチドアプタマーでもよい。核酸アプタマーは、核酸であればよく、核酸としては、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びこれらの修飾物又はアナログが挙げられ、ＲＮＡであることが好ましい。
第一の捕捉用物質は、標的物質認識部分と第一の結合パートナー部分とが直接結合していてもよく、リンカーを介して結合していてもよい。また、第一の捕捉用物質は、支持体に固定された第一の結合部分に予め結合されていてもよい。
第二の捕捉用物質
本開示において、「第二の捕捉用物質」は、標的物質認識部位を介して標的物質のみを結合する機能を有する標的物質認識部位と、レポーター物質が備える第二の結合部分に結合可能な第二の結合パートナー部分とを備える。
ここで捕捉用物質とは、標的物質認識部位を介して標的物質を捕捉する機能を有する物質であり、標的物質により捕捉される物質ではない。
第二の結合パートナー部分は、第二の捕捉用物質が予め備える部分でも良く、化学修飾等により付加された部分であっても良い。例えば、抗体が予め備えるFc部分や糖鎖を第一の結合パートナー部分とすることもできる。
標的物質認識部分は、抗体、低分子抗体、ペプチド、アプタマーなどが挙げられ、アプタマーであることが好ましい。
アプタマーとしては、核酸アプタマーでもよくペプチドアプタマーでもよいが、核酸アプタマーであることが好ましい。核酸アプタマーは、核酸であればよく、核酸としては、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びこれらの修飾物又はアナログが挙げられ、ＲＮＡであることが好ましい。
第二の捕捉用物質は、標的物質認識部分と第二の結合パートナー部分とが直接結合していてもよく、リンカーを介して結合していてもよい。また、第二の捕捉用物質は、レポーター物質に固定された第二の結合部分に予め結合されていてもよい。
本開示において、「第二の捕捉用物質」は、標的物質認識部位を介して標的物質のみを結合する機能を有する標的物質認識部位と、レポーター物質が備える第二の結合部分に結合可能な第二の結合パートナー部分とを備える。
ここで捕捉用物質とは、標的物質認識部位を介して標的物質を捕捉する機能を有する物質であり、標的物質により捕捉される物質ではない。
第二の結合パートナー部分は、第二の捕捉用物質が予め備える部分でも良く、化学修飾等により付加された部分であっても良い。例えば、抗体が予め備えるFc部分や糖鎖を第一の結合パートナー部分とすることもできる。
標的物質認識部分は、抗体、低分子抗体、ペプチド、アプタマーなどが挙げられ、アプタマーであることが好ましい。
アプタマーとしては、核酸アプタマーでもよくペプチドアプタマーでもよいが、核酸アプタマーであることが好ましい。核酸アプタマーは、核酸であればよく、核酸としては、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びこれらの修飾物又はアナログが挙げられ、ＲＮＡであることが好ましい。
第二の捕捉用物質は、標的物質認識部分と第二の結合パートナー部分とが直接結合していてもよく、リンカーを介して結合していてもよい。また、第二の捕捉用物質は、レポーター物質に固定された第二の結合部分に予め結合されていてもよい。
前記第一又は第二の結合パートナー部分と、前記第一又は第二の結合部分との結合としては、一又は複数の実施形態において、抗体又はその抗原結合部分と抗原の結合、アビジン／ストレプトアビジン／ニュートラアビジンとビオチンの結合、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）と抗ＤＮＰ抗体の結合、ジゴキシンと抗ジゴキシン抗体の結合、ジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン抗体の結合、ハプテンと抗ハプテンの結合、多糖と多糖結合部分の結合、レクチンとその受容体の結合、リガンドとその受容体の結合、フルオレセインと抗フルオレセイン抗体の結合、並びに、相補的核酸の結合が挙げられ、相補的核酸の結合が特に好ましい。
上記結合は、間接的な結合であり、本開示における間接的な結合とは、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用などの非共有結合性の相互作用による結合のことをいう。一方で、直接的な結合とは、共有結合のことをいう。
一又複数の実施形態において、標的物質認識部分が核酸アプタマーの場合、結合パートナー部分も核酸とすることが挙げられ、その場合、結合部分も前記核酸の相補的核酸となることが挙げられる。捕捉用物質が核酸アプタマープローブの場合、一又は複数の実施形態において、結合パートナー部分と結合部分の組み合わせとしては、ポリＡとポリｄＴ、ポリＵとポリｄＡなどが挙げられる。この場合、ＳＥＬＥＸ法によって核酸アプタマーを取得する際、結合パートナー部分となる配列とランダム配列を有する核酸プールを設計しておくことで、取得された核酸アプタマーをそのまま本開示の検出方法に適用することができ、捕捉用候補物質を選定するために必要な条件検討を削減することができるため、特に好ましい。
上記結合は、間接的な結合であり、本開示における間接的な結合とは、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用などの非共有結合性の相互作用による結合のことをいう。一方で、直接的な結合とは、共有結合のことをいう。
一又複数の実施形態において、標的物質認識部分が核酸アプタマーの場合、結合パートナー部分も核酸とすることが挙げられ、その場合、結合部分も前記核酸の相補的核酸となることが挙げられる。捕捉用物質が核酸アプタマープローブの場合、一又は複数の実施形態において、結合パートナー部分と結合部分の組み合わせとしては、ポリＡとポリｄＴ、ポリＵとポリｄＡなどが挙げられる。この場合、ＳＥＬＥＸ法によって核酸アプタマーを取得する際、結合パートナー部分となる配列とランダム配列を有する核酸プールを設計しておくことで、取得された核酸アプタマーをそのまま本開示の検出方法に適用することができ、捕捉用候補物質を選定するために必要な条件検討を削減することができるため、特に好ましい。
反応工程
本開示における反応工程は、支持体上で、第一の捕捉用物質、標的物質、第二の捕捉用物質、レポーター物質の各要素を反応させ、各要素が非共有結合性の相互作用による結合を形成し、各要素から構成される複合体を形成する工程である。このとき、複合体中での各要素の順序は特に限定されず、例えば、「支持体－第一の捕捉用物質－標的物質－第二の捕捉用物質－レポーター物質」複合体あるいは、「支持体－第二の捕捉用物質－標的物質－第一の捕捉用物質－レポーター物質」複合体が形成される。
本開示における反応工程は、支持体上で、第一の捕捉用物質、標的物質、第二の捕捉用物質、レポーター物質の各要素を反応させ、各要素が非共有結合性の相互作用による結合を形成し、各要素から構成される複合体を形成する工程である。このとき、複合体中での各要素の順序は特に限定されず、例えば、「支持体－第一の捕捉用物質－標的物質－第二の捕捉用物質－レポーター物質」複合体あるいは、「支持体－第二の捕捉用物質－標的物質－第一の捕捉用物質－レポーター物質」複合体が形成される。
検出工程
本開示における検出工程は、支持体上に形成され、固定された上記複合体中の標的物質からのシグナルを検出する工程である。例えば、標的物質からのシグナルとしては蛍光などが挙げられ、蛍光イムノクロマトリーダーなどを用いて検出することができるが、特に限定されない。
本開示における検出工程は、支持体上に形成され、固定された上記複合体中の標的物質からのシグナルを検出する工程である。例えば、標的物質からのシグナルとしては蛍光などが挙げられ、蛍光イムノクロマトリーダーなどを用いて検出することができるが、特に限定されない。
本開示に係る第一の検出方法は、一又は複数の実施形態において、前記第一の結合パートナー部分が前記第二の結合部分と結合可能であり、かつ、前記第二の結合パートナー部分が前記第一の結合部分と結合可能であり、前記反応工程が、「支持体－第一の捕捉用物質－標的物質－第二の捕捉用物質－レポーター物質」複合体あるいは、「支持体－第二の捕捉用物質－標的物質－第一の捕捉用物質－レポーター物質」複合体を形成し、前記検出工程が、前記複合体中の前記標識物質からのシグナルを用いて前記標的物質を検出するための方法である。
本態様においては、前記第一の結合パートナー部分が前記第二の結合部分と結合可能であり、かつ、前記第二の結合パートナー部分が前記第一の結合部分と結合可能であるため、前記第一の結合パートナー部分と前記第二の結合パートナー部分を同一とすることができ、また、前記第一の結合部分と前記第二の結合部分を同一とすることができる。
本態様においては、前記第一の結合パートナー部分が前記第二の結合部分と結合可能であり、かつ、前記第二の結合パートナー部分が前記第一の結合部分と結合可能であるため、前記第一の結合パートナー部分と前記第二の結合パートナー部分を同一とすることができ、また、前記第一の結合部分と前記第二の結合部分を同一とすることができる。
「支持体－第一の捕捉用物質－標的物質－第二の捕捉用物質－レポーター物質」複合体
本開示における「支持体－第一の捕捉用物質－標的物質－第二の捕捉用物質－レポーター物質」複合体は、
支持体が、支持体が備える「第一の捕捉用物質と結合可能な第一の結合部分」を介して、第一の捕捉用物質が備える「結合部分と結合可能な第一の結合パートナー部分」と結合し、
第一の捕捉用物質が、第一の捕捉用物質が備える標的物質認識部分により標的物質を捕捉し、
標的物質が、第二の捕捉用物質が備える標的物質認識部分により捕捉され、
第二の捕捉用物質が、第二の捕捉用物質が備える「結合部分と結合可能な第二の結合パートナー部分」を介して、レポーター物質が備える「第二の捕捉用物質と結合可能な第二の結合部分」と結合することで、形成される。
本開示における「支持体－第一の捕捉用物質－標的物質－第二の捕捉用物質－レポーター物質」複合体は、
支持体が、支持体が備える「第一の捕捉用物質と結合可能な第一の結合部分」を介して、第一の捕捉用物質が備える「結合部分と結合可能な第一の結合パートナー部分」と結合し、
第一の捕捉用物質が、第一の捕捉用物質が備える標的物質認識部分により標的物質を捕捉し、
標的物質が、第二の捕捉用物質が備える標的物質認識部分により捕捉され、
第二の捕捉用物質が、第二の捕捉用物質が備える「結合部分と結合可能な第二の結合パートナー部分」を介して、レポーター物質が備える「第二の捕捉用物質と結合可能な第二の結合部分」と結合することで、形成される。
一つの「支持体－第一の捕捉用物質－標的物質－第二の捕捉用物質－レポーター物質」複合体中には、二つ以上の捕捉用物質が含まれ、この二つ以上の捕捉用物質は、同じ種類のものであってもよく、異なる種類のものであってもよい。
また、好ましくは、上記第一の結合パートナー部分が上記第二の結合部分と結合可能であり、上記第二の結合パートナー部分は上記第一の結合部分と結合可能であり、それぞれが支持体、レポーター物質、両方に結合することができる。そのため、二つ以上の種類の捕捉用物質を用いた場合、複数の「支持体－捕捉用物質－標的物質－捕捉用物質－レポーター物質」複合体パターンが形成されることとなり、例えば、第一の捕捉用物質と第二の捕捉用物質とを用いた場合、「支持体－第一の捕捉用物質－標的物質－第二の捕捉用物質－レポーター物質」複合体と、「支持体－第二の捕捉用物質－標的物質－第一の捕捉用物質－レポーター物質」複合体の両方が形成されることとなる。
複合体を形成する順序
「支持体－第一の捕捉用物質－標的物質－第二の捕捉用物質－レポーター物質」複合体を形成するにあたり、「支持体－第一の捕捉用物質」結合、「第一の捕捉用物質－標的物質」結合、「標的物質－第二の捕捉用物質」結合、「第二の捕捉用物質－レポーター物質」結合、が形成されるが、これらの結合はどの順序で形成されてもよく、また、これらの結合が同時に形成されてもよい。「支持体－第二の捕捉用物質－標的物質－第一の捕捉用物質－レポーター物質」複合体が形成される場合も同様である。
「支持体－第一の捕捉用物質－標的物質－第二の捕捉用物質－レポーター物質」複合体を形成するにあたり、「支持体－第一の捕捉用物質」結合、「第一の捕捉用物質－標的物質」結合、「標的物質－第二の捕捉用物質」結合、「第二の捕捉用物質－レポーター物質」結合、が形成されるが、これらの結合はどの順序で形成されてもよく、また、これらの結合が同時に形成されてもよい。「支持体－第二の捕捉用物質－標的物質－第一の捕捉用物質－レポーター物質」複合体が形成される場合も同様である。
本開示に係る第一の検出方法は、一又は複数の実施形態において、前記第一の捕捉用物質と前記第二の捕捉用物質が、同一の捕捉用物質であり、前記標的物質が、２以上の部分に前記同一の捕捉用物質が結合可能な標的物質である方法である。
本開示に係る第一の検出方法は、一又は複数の実施形態において、第一の捕捉用物質が、支持体が備える前記第一の結合部分に結合されている方法である。
支持体
支持体としては、一又は複数の実施形態において、ニトロセルロース、ナイロン又はポリアミド、紙、ガラス繊維などの膜（メンブレン）があげられ、具体的には、ラテラルフロータイプのイムノクロマトグラフィーストリップ（試験片）の固定化用メンブレン（反応メンブレンとも呼ばれる）が挙げられる。
また、本開示に係る支持体は、第一の結合部分を備えており、第一の結合部分は、化学的な共有結合、UV照射による物理的エネルギーによる共有結合などの固定化方法により固定される。
支持体としては、一又は複数の実施形態において、ニトロセルロース、ナイロン又はポリアミド、紙、ガラス繊維などの膜（メンブレン）があげられ、具体的には、ラテラルフロータイプのイムノクロマトグラフィーストリップ（試験片）の固定化用メンブレン（反応メンブレンとも呼ばれる）が挙げられる。
また、本開示に係る支持体は、第一の結合部分を備えており、第一の結合部分は、化学的な共有結合、UV照射による物理的エネルギーによる共有結合などの固定化方法により固定される。
レポーター物質
レポーター物質としては、イムノクロマトグラフィーで使用されるレポーター物質（検出剤）が使用でき、一又は複数の実施形態において、酵素、フェリチン、蛍光・吸光シリカ粒子、蛍光・吸光ラテックス粒子、半導体微粒子、金コロイド粒子などが挙げられる。これらと結合部分プローブの固定化は適宜行うことができる。
レポーター物質からシグナルを得る方法はレポーター物質に応じて適宜選択できる。蛍光や発光や発色を伴うものは、目視、適したリーダー装置、又は撮像装置を用いてシグナルを検出又は記録し、必要に応じて分析できる。
レポーター物質としては、イムノクロマトグラフィーで使用されるレポーター物質（検出剤）が使用でき、一又は複数の実施形態において、酵素、フェリチン、蛍光・吸光シリカ粒子、蛍光・吸光ラテックス粒子、半導体微粒子、金コロイド粒子などが挙げられる。これらと結合部分プローブの固定化は適宜行うことができる。
レポーター物質からシグナルを得る方法はレポーター物質に応じて適宜選択できる。蛍光や発光や発色を伴うものは、目視、適したリーダー装置、又は撮像装置を用いてシグナルを検出又は記録し、必要に応じて分析できる。
標的物質
標的物質としては、一又は複数の実施形態において、標的物質、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド、タンパク質、化学物質、病原体又はその一部等が挙げられる。標的物質を含む試料としては、血清、血液、血漿、唾液、尿、涙、鼻腔液及び他の体液、培養細胞の培養液、残存農薬検査を目的とした食物由来のサンプル、水質検査を目的とした水系のサンプルあるいは、これらの希釈物が挙げられるが、特に限定されない。
標的物質としては、一又は複数の実施形態において、標的物質、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド、タンパク質、化学物質、病原体又はその一部等が挙げられる。標的物質を含む試料としては、血清、血液、血漿、唾液、尿、涙、鼻腔液及び他の体液、培養細胞の培養液、残存農薬検査を目的とした食物由来のサンプル、水質検査を目的とした水系のサンプルあるいは、これらの希釈物が挙げられるが、特に限定されない。
本開示に係る第一の検出方法は、イムノクロマトグラフィー法、ＥＬＩＳＡ法、フロースルー法、ＳＰＲ法、及びビーズアッセイ法などに使用できる。
本開示に係るイムノクロマトグラフィー法は、支持体における毛細管現象を利用した測定法全般を指し、ラテラルフロー検出法とも読み替えることができ、標的物質を捕捉用物質が捕捉する原理が免疫反応ではないものも含まれる。例えば、捕捉用物質がアプタマープローブである測定法も、本開示に係るイムノクロマトグラフィー法に含まれる。
第一の検出システム
また、本開示は、その他の一態様において、試料中の標的物質を検出する上記方法を行うための標的物質検出システムに関する。本開示に係る第一の検出システムは、一又は複数の実施形態において、第一の結合部分を備えた支持体と、前記標的物質を検出するための標識物質及び第二の結合部分を備えたレポーター物質と、前記第一の結合部分と結合可能な第一の結合パートナー部分を備える前記標的物質に結合可能な第一の捕捉用物質と、前記第二の結合部分に結合可能な第二の結合パートナー部分を備える前記標的物質に結合可能な第二の捕捉用物質とを含む。
本開示に係る第一の検出システムは、本開示に係る第一の検出方法に使用できる。
また、本開示は、その他の一態様において、試料中の標的物質を検出する上記方法を行うための標的物質検出システムに関する。本開示に係る第一の検出システムは、一又は複数の実施形態において、第一の結合部分を備えた支持体と、前記標的物質を検出するための標識物質及び第二の結合部分を備えたレポーター物質と、前記第一の結合部分と結合可能な第一の結合パートナー部分を備える前記標的物質に結合可能な第一の捕捉用物質と、前記第二の結合部分に結合可能な第二の結合パートナー部分を備える前記標的物質に結合可能な第二の捕捉用物質とを含む。
本開示に係る第一の検出システムは、本開示に係る第一の検出方法に使用できる。
［第二の形態］
本開示に係る第二の形態は、第一の形態における捕捉用物質の結合パートナー部分が、支持体の結合部分にも、レポーターの結合部分にも結合可能な場合であって、かつ、検出法がイムノクロマトグラフィー検出法であり、かつ、標的物質認識部分がアプタマーである場合の実施形態である。
本開示に係る第二の形態は、アプタマーを用いたイムノクロマトグラフィー検出法において、固定側（支持体側）用のアプタマーと検出側（レポーター側）用アプタマーといったように、アプタマーの結合方向が固定側（支持体側）用又は検出側（レポーター側）用に限定されることについて以下の問題を見出したことに基づく。
１．アプタマー設計上の問題
（１）アプタマーによっては、抗体のように、検出側（レポーター側）、固定側（支持体側）、どちらに適しているかが異なる可能性がある。
（２）従来のイムノクロマトグラフィー検出法に従うと、アプタマーを取得する段階で、固定側（支持体側）用及び検出側（レポーター側）用の２種類のアプタマーを用意する必要があり、手間やコストがかかる。
例えば、ＳＥＬＥＸのような方法で核酸アプタマーを取得する場合、一度のＳＥＬＥＸにより複数種のアプタマー（非検出物を捕捉する領域の配列が異なるが、同一の相補配列を有する）が取得できるが、固定側（支持体側）用及び検出側（レポーター側）用の２種類の結合配列を有したアプタマーが必要とされる場合、異なる２種類のアプタマー候補配列のどちらか一方に、もう一方と異なる結合配列を付加する工程が必要となる。
２．反応効率上の問題
レポーター物質に結合するアプタマーと支持体に結合するアプタマーのそれぞれが結合できる箇所が限定されるため、「アプタマー－標的物質－アプタマー」複合体がレポーター物質及び支持体に結合する反応効率が低下する。
本開示に係る第二の形態は、第一の形態における捕捉用物質の結合パートナー部分が、支持体の結合部分にも、レポーターの結合部分にも結合可能な場合であって、かつ、検出法がイムノクロマトグラフィー検出法であり、かつ、標的物質認識部分がアプタマーである場合の実施形態である。
本開示に係る第二の形態は、アプタマーを用いたイムノクロマトグラフィー検出法において、固定側（支持体側）用のアプタマーと検出側（レポーター側）用アプタマーといったように、アプタマーの結合方向が固定側（支持体側）用又は検出側（レポーター側）用に限定されることについて以下の問題を見出したことに基づく。
１．アプタマー設計上の問題
（１）アプタマーによっては、抗体のように、検出側（レポーター側）、固定側（支持体側）、どちらに適しているかが異なる可能性がある。
（２）従来のイムノクロマトグラフィー検出法に従うと、アプタマーを取得する段階で、固定側（支持体側）用及び検出側（レポーター側）用の２種類のアプタマーを用意する必要があり、手間やコストがかかる。
例えば、ＳＥＬＥＸのような方法で核酸アプタマーを取得する場合、一度のＳＥＬＥＸにより複数種のアプタマー（非検出物を捕捉する領域の配列が異なるが、同一の相補配列を有する）が取得できるが、固定側（支持体側）用及び検出側（レポーター側）用の２種類の結合配列を有したアプタマーが必要とされる場合、異なる２種類のアプタマー候補配列のどちらか一方に、もう一方と異なる結合配列を付加する工程が必要となる。
２．反応効率上の問題
レポーター物質に結合するアプタマーと支持体に結合するアプタマーのそれぞれが結合できる箇所が限定されるため、「アプタマー－標的物質－アプタマー」複合体がレポーター物質及び支持体に結合する反応効率が低下する。
本開示に係る第二の検出方法は、一態様において、試料中の標的物質をイムノクロマトグラフィー法により検出する方法であって、標的物質に結合可能なアプタマー部分と、支持体に固定化された結合部分及びレポーター物質に固定化された結合部分の両方に結合可能な結合パートナー部分とを備えるアプタマープローブを用いる方法である。
本開示に係る第二の検出方法によれば、一又複数の実施形態において、結合方向が固定側（支持体側）用又は検出側（レポーター側）用に限定された２種類のアプタマープロープをそれぞれ準備することなく、イムノクロマトグラフィー検出法を行うことができる。
アプタマープローブ
本開示に係る第二の形態において、「アプタマープローブ」は、標的物質に結合するアプタマーとして機能するアプタマー部分（標的物質認識部分）と、支持体に固定化された結合部分及びレポーター物質に固定化された結合部分の両方に結合可能な結合パートナー部分とを備える。
アプタマープローブは、アプタマー部分と結合パートナー部分とが直接結合していてもよく、リンカーを介して結合していてもよい。
本開示に係る第二の形態において、「アプタマープローブ」は、標的物質に結合するアプタマーとして機能するアプタマー部分（標的物質認識部分）と、支持体に固定化された結合部分及びレポーター物質に固定化された結合部分の両方に結合可能な結合パートナー部分とを備える。
アプタマープローブは、アプタマー部分と結合パートナー部分とが直接結合していてもよく、リンカーを介して結合していてもよい。
アプタマー部分のアプタマーとしては、核酸アプタマーでもよくペプチドアプタマーでもよい。核酸アプタマーは、核酸であればよく、核酸としては、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びこれらの修飾物又はアナログが挙げられるが、ＲＮＡであることが好ましい。
結合パートナー部分は、支持体に固定化された結合部分及びレポーター物質に固定化された結合部分の両方に結合可能な部分である。
結合パートナー部分が結合可能であれば、支持体に固定化された結合部分とレポーター物質に固定化された結合部分とは、同一であってもよく、異なっていてもよい。
結合パートナー部分は、アプタマーに結合されたタグ部分とみなすこともできる。
結合パートナー部分が結合可能であれば、支持体に固定化された結合部分とレポーター物質に固定化された結合部分とは、同一であってもよく、異なっていてもよい。
結合パートナー部分は、アプタマーに結合されたタグ部分とみなすこともできる。
結合部分と結合パートナー部分の組み合わせ（結合パートナー部分と結合部分の組み合わせ）としては、一又は複数の実施形態において、抗体又は低分子抗体と標的物質の組み合わせ、アビジン／ストレプトアビジン／ニュートラアビジンとビオチンの組み合わせ、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）と抗ＤＮＰ抗体の組み合わせ、ジゴキシンと抗ジゴキシン抗体の組み合わせ、ジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン抗体の組み合わせ、ハプテンと抗ハプテンの組み合わせ、多糖と多糖結合部分の組み合わせ、レクチンとその受容体の組み合わせ、リガンドとその受容体の組み合わせ、フルオレセインと抗フルオレセイン抗体の組み合わせ、並びに、相補的核酸の組み合わせが挙げられる。
一又複数の実施形態において、アプタマー部分が核酸の場合、結合パートナー部分も核酸とすることが挙げられ、その場合、結合部分も前記核酸の相補的核酸となることが挙げられる。核酸アプタマープローブの場合、一又は複数の実施形態において、結合パートナー部分と結合部分の組み合わせとしては、ポリＡとポリｄＴ、ポリＵとポリｄＡなどが挙げられる。
一又複数の実施形態において、アプタマー部分が核酸の場合、結合パートナー部分も核酸とすることが挙げられ、その場合、結合部分も前記核酸の相補的核酸となることが挙げられる。核酸アプタマープローブの場合、一又は複数の実施形態において、結合パートナー部分と結合部分の組み合わせとしては、ポリＡとポリｄＴ、ポリＵとポリｄＡなどが挙げられる。
結合部分プローブ
支持体又はレポーター物質が結合部分を有していない場合、結合部分プローブで結合部分を固定化することができる。一又は複数の実施形態において、結合部分プローブは、結合部分と、支持体又はレポーター物質への結合又は架橋反応が可能な官能基を備える。その他の一又は複数の実施形態において、結合部分プローブは、結合部分と官能基との間にリンカーを有してもよい。
なお、本開示において、支持体自体が、本来、結合部分を有している場合も、当該結合部分は、「支持体に固定化された結合部分」に含まれる。同様に、レポーター物質自体が、本来、結合部分を有している場合も、当該結合部分は、「レポーター物質に固定化された結合部分」に含まれる。
前記官能基としては、一又は複数の実施形態において、アミノ基、カルボキシル基、ＮＨＳエステル基、イミドエステル基、マレイミド基、ハロ酢酸、ピリジルジスルフィド基、スルフヒドリル基、アルデヒド基、ヒドラジド基、アルコキシアミン基などが挙げられる。
支持体又はレポーター物質が結合部分を有していない場合、結合部分プローブで結合部分を固定化することができる。一又は複数の実施形態において、結合部分プローブは、結合部分と、支持体又はレポーター物質への結合又は架橋反応が可能な官能基を備える。その他の一又は複数の実施形態において、結合部分プローブは、結合部分と官能基との間にリンカーを有してもよい。
なお、本開示において、支持体自体が、本来、結合部分を有している場合も、当該結合部分は、「支持体に固定化された結合部分」に含まれる。同様に、レポーター物質自体が、本来、結合部分を有している場合も、当該結合部分は、「レポーター物質に固定化された結合部分」に含まれる。
前記官能基としては、一又は複数の実施形態において、アミノ基、カルボキシル基、ＮＨＳエステル基、イミドエステル基、マレイミド基、ハロ酢酸、ピリジルジスルフィド基、スルフヒドリル基、アルデヒド基、ヒドラジド基、アルコキシアミン基などが挙げられる。
支持体がニトロセルロース膜やその他の分析膜であって、結合部分がＤＮＡである場合、前記官能基としてはアミノ基が挙げられる。支持体上にアミノ基修飾をしたＤＮＡ（結合部分プローブ）を配置し、ＵＶを照射することで結合部分プローブを支持体に固相化できる（非特許文献１）。
レポーター物質がラテックス粒子を含む場合であって、結合部分がＤＮＡである場合、前記官能基としてはアミノ基が挙げられる。ラテックス粒子表面のカルボキシル基をカルボジイミド等で活性化してカルボキシル－アミン架橋を形成できる。
ただし、結合部分プローブの支持体又はレポーター物質への結合及び架橋方法はこれらに限定されず適宜架橋方法を選択し、該架橋方法に応じて官能基を選択できる。
レポーター物質がラテックス粒子を含む場合であって、結合部分がＤＮＡである場合、前記官能基としてはアミノ基が挙げられる。ラテックス粒子表面のカルボキシル基をカルボジイミド等で活性化してカルボキシル－アミン架橋を形成できる。
ただし、結合部分プローブの支持体又はレポーター物質への結合及び架橋方法はこれらに限定されず適宜架橋方法を選択し、該架橋方法に応じて官能基を選択できる。
支持体
支持体としては、展開液が展開でき、かつ、結合部分プローブが固定化できる膜が挙げられる。一又は複数の実施形態において、ニトロセルロース、ナイロン又はポリアミド、紙、ガラス繊維などの膜（メンブレン）があげられ、具体的には、ラテラルフロータイプのイムノクロマトグラフィーストリップ（試験片）の固定化用メンブレン（反応メンブレンとも呼ばれる）が挙げられる。一又は複数の実施形態において、支持体としては、ニトロセルロースメンブレンが挙げられる。
支持体としては、展開液が展開でき、かつ、結合部分プローブが固定化できる膜が挙げられる。一又は複数の実施形態において、ニトロセルロース、ナイロン又はポリアミド、紙、ガラス繊維などの膜（メンブレン）があげられ、具体的には、ラテラルフロータイプのイムノクロマトグラフィーストリップ（試験片）の固定化用メンブレン（反応メンブレンとも呼ばれる）が挙げられる。一又は複数の実施形態において、支持体としては、ニトロセルロースメンブレンが挙げられる。
レポーター物質
レポーター物質としては、イムノクロマトグラフィーで使用されるレポーター物質（検出剤）が使用でき、一又は複数の実施形態において、酵素、フェリチン、蛍光・吸光シリカ粒子、蛍光・吸光ラテックス粒子、半導体微粒子、金コロイド粒子などが挙げられる。これらと結合部分プローブの固定化は適宜行うことができる。
レポーター物質からシグナルを得る方法はレポーター物質に応じて適宜選択できる。蛍光や発光や発色を伴うものは、目視、適したリーダー装置、又は撮像装置を用いてシグナルを検出又は記録し、必要に応じて分析できる。
レポーター物質としては、イムノクロマトグラフィーで使用されるレポーター物質（検出剤）が使用でき、一又は複数の実施形態において、酵素、フェリチン、蛍光・吸光シリカ粒子、蛍光・吸光ラテックス粒子、半導体微粒子、金コロイド粒子などが挙げられる。これらと結合部分プローブの固定化は適宜行うことができる。
レポーター物質からシグナルを得る方法はレポーター物質に応じて適宜選択できる。蛍光や発光や発色を伴うものは、目視、適したリーダー装置、又は撮像装置を用いてシグナルを検出又は記録し、必要に応じて分析できる。
標的物質
標的物質としては、一又は複数の実施形態において、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド、タンパク質、化学物質、病原体又はその一部等が挙げられる。標的物質を含む試料としては、血清、血液、血漿、唾液、尿、涙、鼻腔液及び他の体液、培養細胞の培養液、残存農薬検査を目的とした食物由来のサンプル、水質検査を目的とした水系のサンプルあるいは、これらの希釈物が挙げられるが、特に限定されない。
標的物質としては、一又は複数の実施形態において、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド、タンパク質、化学物質、病原体又はその一部等が挙げられる。標的物質を含む試料としては、血清、血液、血漿、唾液、尿、涙、鼻腔液及び他の体液、培養細胞の培養液、残存農薬検査を目的とした食物由来のサンプル、水質検査を目的とした水系のサンプルあるいは、これらの希釈物が挙げられるが、特に限定されない。
イムノクロマトグラフィー検出法
本開示に係る第二の検出方法は、一態様において、上述した本開示に係るアプタマープローブを用いるイムノクロマトグラフィー法による検出方法であって、支持体上に「支持体－アプタマープローブ－標的物質－アプタマープローブ－レポーター物質」で表される結合状態で、前記標的物質及び前記レポーター物質を捕捉することを含む。
言い換えると、本開示に係る第二の検出方法は、一態様において、上述した本開示に係るアプタマープローブを用いるイムノクロマトグラフィー法による検出方法であって、支持体上に「支持体－アプタマープローブ－標的物質－アプタマープローブ－レポーター物質」複合体を形成することを含む。
イムノクロマトグラフィー試験片の検出領域（結合部分が固定化された支持体部分）において展開液が流れたのちに「支持体－アプタマープローブ－標的物質－アプタマープローブ－レポーター物質」複合体が形成され、前記レポーター物質からシグナルが検出されれば、試料中の標的物質が検出されたことになる。
したがって、本開示に係る第二の検出方法は、一態様において、さらに、レポーター物質からのシグナルを検出することを含む方法である。
本開示に係る第二の検出方法は、一態様において、上述した本開示に係るアプタマープローブを用いるイムノクロマトグラフィー法による検出方法であって、支持体上に「支持体－アプタマープローブ－標的物質－アプタマープローブ－レポーター物質」で表される結合状態で、前記標的物質及び前記レポーター物質を捕捉することを含む。
言い換えると、本開示に係る第二の検出方法は、一態様において、上述した本開示に係るアプタマープローブを用いるイムノクロマトグラフィー法による検出方法であって、支持体上に「支持体－アプタマープローブ－標的物質－アプタマープローブ－レポーター物質」複合体を形成することを含む。
イムノクロマトグラフィー試験片の検出領域（結合部分が固定化された支持体部分）において展開液が流れたのちに「支持体－アプタマープローブ－標的物質－アプタマープローブ－レポーター物質」複合体が形成され、前記レポーター物質からシグナルが検出されれば、試料中の標的物質が検出されたことになる。
したがって、本開示に係る第二の検出方法は、一態様において、さらに、レポーター物質からのシグナルを検出することを含む方法である。
２種類以上のアプタマープローブを用いる実施形態（実施形態１）
本開示に係る第二の検出方法の一又は複数の実施形態として、２種類以上のアプタマープローブを用いる実施形態が挙げられる。
この実施形態を図１の概略図を用いて説明する。本実施形態は、異なる２種類のアプタマープローブ４及び７を用いる方法である。アプタマープローブ４，７のアプタマー部分は異なり、それぞれが標的部分６の異なる部分に結合可能である。また、アプタマープローブ４，７は、共通の結合パートナー部分５を有している。レポーター物質１には結合プローブ２を介して結合部分３が固定化されている。支持体１１にも結合プローブ１０を介して結合部分３が固定化されている。アプタマープローブ４及び７は、どちらも、結合パートナー部分５と結合部分３の結合によって、レポーター物質１にも支持体１１にも結合可能である。
「アプタマープローブ４－標的物質６－アプタマープローブ７」複合体に着目すれば、支持体１１に対して２カ所の結合パートナー部分５が結合可能であり、アプタマープローブ４と７で結合パートナー部分５が異なっている場合よりも支持体へ捕捉される効率が高くなると考えることができる。
本開示に係る第二の検出方法の一又は複数の実施形態として、２種類以上のアプタマープローブを用いる実施形態が挙げられる。
この実施形態を図１の概略図を用いて説明する。本実施形態は、異なる２種類のアプタマープローブ４及び７を用いる方法である。アプタマープローブ４，７のアプタマー部分は異なり、それぞれが標的部分６の異なる部分に結合可能である。また、アプタマープローブ４，７は、共通の結合パートナー部分５を有している。レポーター物質１には結合プローブ２を介して結合部分３が固定化されている。支持体１１にも結合プローブ１０を介して結合部分３が固定化されている。アプタマープローブ４及び７は、どちらも、結合パートナー部分５と結合部分３の結合によって、レポーター物質１にも支持体１１にも結合可能である。
「アプタマープローブ４－標的物質６－アプタマープローブ７」複合体に着目すれば、支持体１１に対して２カ所の結合パートナー部分５が結合可能であり、アプタマープローブ４と７で結合パートナー部分５が異なっている場合よりも支持体へ捕捉される効率が高くなると考えることができる。
１種類のアプタマープローブを用いる実施形態（実施形態２）
本開示に係る第二の検出方法の一又は複数の実施形態として、１種類のアプタマープローブを用いる実施形態が挙げられる。
この実施形態を図２の概略図を用いて説明する。本実施形態は、標的物質が同一アプタマーを複数個結合できる場合（例えば、２以上の多量体を形成する場合）であって、１種類のアプタマープローブ４及び７を用いる方法である。アプタマープローブ４及び７は、アプタマー部分も結合パートナー部分５も同一である。アプタマープローブ４及び７は、どちらも、結合パートナー部分５と結合部分３の結合によって、レポーター物質１にも支持体１１にも結合可能である。
「アプタマープローブ４－標的物質６－アプタマープローブ７」複合体に着目すれば、実施形態１と同様に、支持体１１に対して２カ所の結合パートナー部分５が結合可能であり、アプタマープローブ４と７で結合パートナー部分５が異なっている場合よりも支持体へ捕捉される効率が高くなると考えることができる。
本開示に係る第二の検出方法の一又は複数の実施形態として、１種類のアプタマープローブを用いる実施形態が挙げられる。
この実施形態を図２の概略図を用いて説明する。本実施形態は、標的物質が同一アプタマーを複数個結合できる場合（例えば、２以上の多量体を形成する場合）であって、１種類のアプタマープローブ４及び７を用いる方法である。アプタマープローブ４及び７は、アプタマー部分も結合パートナー部分５も同一である。アプタマープローブ４及び７は、どちらも、結合パートナー部分５と結合部分３の結合によって、レポーター物質１にも支持体１１にも結合可能である。
「アプタマープローブ４－標的物質６－アプタマープローブ７」複合体に着目すれば、実施形態１と同様に、支持体１１に対して２カ所の結合パートナー部分５が結合可能であり、アプタマープローブ４と７で結合パートナー部分５が異なっている場合よりも支持体へ捕捉される効率が高くなると考えることができる。
１液の展開液の実施形態（実施形態３）
本開示に係る第二の検出方法の一又は複数の実施形態として、試料とアプタマープローブとレポーター物質とを含む展開液をイムノクロマトグラフィー試験片の検出領域（結合部分が固定化された支持体部分）に展開する実施形態が挙げられる。
本実施形態において、アプタマープローブは、２種類以上のアプタマープローブを用いる実施形態（実施形態１）でもよく、１種類のアプタマープローブを用いる実施形態（実施形態２）でもよい。
本実施形態であれば、１種類の展開液を用いて本開示に係る第二の検出方法を行うことができる。
本開示に係る第二の検出方法の一又は複数の実施形態として、試料とアプタマープローブとレポーター物質とを含む展開液をイムノクロマトグラフィー試験片の検出領域（結合部分が固定化された支持体部分）に展開する実施形態が挙げられる。
本実施形態において、アプタマープローブは、２種類以上のアプタマープローブを用いる実施形態（実施形態１）でもよく、１種類のアプタマープローブを用いる実施形態（実施形態２）でもよい。
本実施形態であれば、１種類の展開液を用いて本開示に係る第二の検出方法を行うことができる。
２液の展開液の実施形態（実施形態４）
本開示に係る第二の検出方法の一又は複数の実施形態として、最初に試料とアプタマープローブとを含む展開液（レポーター物質を含まない展開液）をイムノクロマトグラフィー試験片の検出領域（結合部分が固定化された支持体部分）に展開し、その後、レポーター物質を含む展開液を前記検出領域に展開する実施形態が挙げられる。
本実施形態において、アプタマープローブは、２種類以上のアプタマープローブを用いる実施形態（実施形態１）でもよく、１種類のアプタマープローブを用いる実施形態（実施形態２）でもよい。
本実施形態であれば、「アプタマープローブ－標的物質－アプタマープローブ」複合体をレポーター物質よりも前に検出領域（結合部分が固定化された支持体部分）に接触させることができる。それにより、例えば、検出領域への捕捉効率を向上できることが考えられる。
本開示に係る第二の検出方法の一又は複数の実施形態として、最初に試料とアプタマープローブとを含む展開液（レポーター物質を含まない展開液）をイムノクロマトグラフィー試験片の検出領域（結合部分が固定化された支持体部分）に展開し、その後、レポーター物質を含む展開液を前記検出領域に展開する実施形態が挙げられる。
本実施形態において、アプタマープローブは、２種類以上のアプタマープローブを用いる実施形態（実施形態１）でもよく、１種類のアプタマープローブを用いる実施形態（実施形態２）でもよい。
本実施形態であれば、「アプタマープローブ－標的物質－アプタマープローブ」複合体をレポーター物質よりも前に検出領域（結合部分が固定化された支持体部分）に接触させることができる。それにより、例えば、検出領域への捕捉効率を向上できることが考えられる。
第二の検出システム
本開示は、その他の態様において、標的物質のイムノクロマトグラフィー法検出システムに関する。本開示に係る第二の検出システムは、結合部分が固定化された検出領域を備えるイムノクロマトグラフィー試験片と、結合部分が固定化されたレポーター物質と、本開示に係るアプタマープローブとを含む。
本開示に係る第二の検出システムは、本開示に係る第二の検出方法を行うことができる。
本開示に係る第二の検出システムは、レポーター物質及びアプタマープローブは、イムノクロマトグラフィー試験片とは別に、共に又は別個に展開液の形態であってもよい。
また、レポーター物質及びアプタマープローブは、乾燥状態でイムノクロマトグラフィー試験片上に配置されていてもよい。
また、レポーター物質及びアプタマープローブは、イムノクロマトグラフィー試験片上に、共に又は別個に展開液の形態で配置されてもよい。
本開示は、その他の態様において、標的物質のイムノクロマトグラフィー法検出システムに関する。本開示に係る第二の検出システムは、結合部分が固定化された検出領域を備えるイムノクロマトグラフィー試験片と、結合部分が固定化されたレポーター物質と、本開示に係るアプタマープローブとを含む。
本開示に係る第二の検出システムは、本開示に係る第二の検出方法を行うことができる。
本開示に係る第二の検出システムは、レポーター物質及びアプタマープローブは、イムノクロマトグラフィー試験片とは別に、共に又は別個に展開液の形態であってもよい。
また、レポーター物質及びアプタマープローブは、乾燥状態でイムノクロマトグラフィー試験片上に配置されていてもよい。
また、レポーター物質及びアプタマープローブは、イムノクロマトグラフィー試験片上に、共に又は別個に展開液の形態で配置されてもよい。
第二の検出キット
本開示は、その他の態様において、本開示に係る第二の検出方法を行うためのキットに関する。本開示に係る第二の検出キットは、結合部分が固定化された検出領域を備えるイムノクロマトグラフィー試験片と、結合部分が固定化されたレポーター物質と、本開示に係るアプタマープローブとを含む。
本開示に係る第二の検出キットは、レポーター物質及びアプタマープローブは、イムノクロマトグラフィー試験片とは別に、共に又は別個に展開液の形態であってもよい。
また、レポーター物質及びアプタマープローブは、乾燥状態でイムノクロマトグラフィー試験片上に配置されていてもよい。
また、レポーター物質及びアプタマープローブは、イムノクロマトクロマトグラフィー試験片上に、共に又は別個に展開液の形態で配置されてもよい。
本開示は、その他の態様において、本開示に係る第二の検出方法を行うためのキットに関する。本開示に係る第二の検出キットは、結合部分が固定化された検出領域を備えるイムノクロマトグラフィー試験片と、結合部分が固定化されたレポーター物質と、本開示に係るアプタマープローブとを含む。
本開示に係る第二の検出キットは、レポーター物質及びアプタマープローブは、イムノクロマトグラフィー試験片とは別に、共に又は別個に展開液の形態であってもよい。
また、レポーター物質及びアプタマープローブは、乾燥状態でイムノクロマトグラフィー試験片上に配置されていてもよい。
また、レポーター物質及びアプタマープローブは、イムノクロマトクロマトグラフィー試験片上に、共に又は別個に展開液の形態で配置されてもよい。
本開示は以下の限定されない一又は複数の実施形態に関しうる。
〔１〕 試料中の標的物質を検出する方法であって、
前記試料と、
第一の結合部分を備えた支持体と、
前記標的物質を検出するための標識物質及び第二の結合部分を備えたレポーター物質と、
前記第一の結合部分と結合可能な第一の結合パートナー部分を備える、前記標的物質に結合可能な第一の捕捉用物質と、
前記第二の結合部分に結合可能な第二の結合パートナー部分を備える、前記標的物質に結合可能な第二の捕捉用物質と、
を反応させる反応工程と、
前記標識物質からのシグナルを検出する検出工程を含む、方法。
〔２〕 前記第一の結合パートナー部分が前記第二の結合部分と結合可能であり、
前記第二の結合パートナー部分が前記第一の結合部分と結合可能であり、
前記反応工程が、「支持体－第一の捕捉用物質－標的物質－第二の捕捉用物質－レポーター物質」複合体あるいは、「支持体－第二の捕捉用物質－標的物質－第一の捕捉用物質－レポーター物質」複合体を形成し、
前記検出工程が、前記複合体中の前記標識物質からのシグナルを検出する、〔１〕に記載の方法。
〔３〕 前記第一の捕捉用物質、又は、前記第二の捕捉用物質が、アプタマープローブである、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕 前記アプタマープローブが、核酸アプタマーである、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕 前記第一又は第二の結合パートナー部分と、前記第一又は第二の結合部分との結合全てが非共有結合性の相互作用による結合である、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕 前記非共有結合性の相互作用による結合が相補的核酸の結合である、〔５〕に記載の方法。
〔７〕 前記第一の捕捉用物質と前記第二の捕捉用物質が、同一の捕捉用物質であり、前記標的物質が、２以上の部分に前記同一の捕捉用物質が結合可能な標的物質である、〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕 イムノクロマトグラフィー法によって検出される、〔１〕から〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕 前記第一の捕捉用物質が、支持体が備える前記第一の結合部分に結合されている、〔１〕から〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕 前記試料と前記第一の捕捉用物質と前記第二の捕捉用物質と前記レポーター物質を、前記支持体に展開させることを含む、〔１〕から〔９〕いずれかに記載の方法。
〔１１〕 前記試料と前記支持体と前記第一の捕捉用物質あるいは前記第二の捕捉用物質とを反応させ、「支持体－第一の捕捉用物質－標的物質－第二の捕捉用物質」複合体あるいは「支持体－第二の捕捉用物質－標的物質－第一の捕捉用物質」複合体を形成させた後に、
前記レポーター物質との反応を行う、〔９〕又は〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕 〔１〕から〔１１〕のいずれかに記載の方法を行うための標的物質検出システム。
〔１３〕 試料中の標的物質をイムノクロマトグラフィー法により検出する方法であって、
標的物質に結合可能なアプタマー部分と、支持体に固定化された結合部分及びレポーター物質に固定化された結合部分の両方に結合可能な結合パートナー部分とを備えるアプタマープローブを用い、
前記支持体上に、「支持体－アプタマープローブ－標的物質－アプタマープローブ－レポーター物質」で表される結合状態で、前記標的物質及び前記レポーター物質を捕捉すること、並びに、
前記レポーター物質からのシグナルを検出することを含む、方法。
〔１４〕 前記アプタマープローブとして、前記標的物質の異なる部分に結合可能な２種類以上のアプタマープローブを用いる、〔１３〕に記載の方法。
〔１５〕 前記標的物質が、２以上の部分に同一のアプタマー部分が結合可能な標的物質である、〔１３〕に記載の方法。
〔１６〕 試料と前記アプタマープローブと前記レポーター物質を含む液体を、前記結合部分が固定化された支持体部分に展開させることを含む、〔１３〕から〔１５〕のいずれかに記載の方法。
〔１７〕 試料と前記アプタマープローブを含む液体を、前記結合部分が固定化された支持体部分に展開させること、及び、
その後、前記レポーター物質を含む液体を前記支持体部分に展開させること、
を含む、〔１３〕から〔１５〕のいずれかに記載の方法。
〔１８〕 結合部分が固定化された検出領域を備えるイムノクロマトグラフィー試験片と、
結合部分が固定化されたレポーター物質と、
検出領域の結合部分及びレポーター物質の結合部分の両方に結合可能な結合パートナー部分と標的物質に結合可能なアプタマー部分とを備えるアプタマープローブとを含む、
イムノクロマトグラフィー法による標的物質の検出システム。
〔１９〕 結合部分が固定化された検出領域を備えるイムノクロマトグラフィー試験片と、
結合部分が固定化されたレポーター物質と、
検出領域の結合部分及びレポーター物質の結合部分の両方に結合可能な結合パートナー部分と標的物質に結合可能なアプタマー部分とを備えるアプタマープローブとを含む、
〔１３〕から〔１７〕のいずれかに記載の方法を行うためのキット。
〔１〕 試料中の標的物質を検出する方法であって、
前記試料と、
第一の結合部分を備えた支持体と、
前記標的物質を検出するための標識物質及び第二の結合部分を備えたレポーター物質と、
前記第一の結合部分と結合可能な第一の結合パートナー部分を備える、前記標的物質に結合可能な第一の捕捉用物質と、
前記第二の結合部分に結合可能な第二の結合パートナー部分を備える、前記標的物質に結合可能な第二の捕捉用物質と、
を反応させる反応工程と、
前記標識物質からのシグナルを検出する検出工程を含む、方法。
〔２〕 前記第一の結合パートナー部分が前記第二の結合部分と結合可能であり、
前記第二の結合パートナー部分が前記第一の結合部分と結合可能であり、
前記反応工程が、「支持体－第一の捕捉用物質－標的物質－第二の捕捉用物質－レポーター物質」複合体あるいは、「支持体－第二の捕捉用物質－標的物質－第一の捕捉用物質－レポーター物質」複合体を形成し、
前記検出工程が、前記複合体中の前記標識物質からのシグナルを検出する、〔１〕に記載の方法。
〔３〕 前記第一の捕捉用物質、又は、前記第二の捕捉用物質が、アプタマープローブである、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕 前記アプタマープローブが、核酸アプタマーである、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕 前記第一又は第二の結合パートナー部分と、前記第一又は第二の結合部分との結合全てが非共有結合性の相互作用による結合である、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕 前記非共有結合性の相互作用による結合が相補的核酸の結合である、〔５〕に記載の方法。
〔７〕 前記第一の捕捉用物質と前記第二の捕捉用物質が、同一の捕捉用物質であり、前記標的物質が、２以上の部分に前記同一の捕捉用物質が結合可能な標的物質である、〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕 イムノクロマトグラフィー法によって検出される、〔１〕から〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕 前記第一の捕捉用物質が、支持体が備える前記第一の結合部分に結合されている、〔１〕から〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕 前記試料と前記第一の捕捉用物質と前記第二の捕捉用物質と前記レポーター物質を、前記支持体に展開させることを含む、〔１〕から〔９〕いずれかに記載の方法。
〔１１〕 前記試料と前記支持体と前記第一の捕捉用物質あるいは前記第二の捕捉用物質とを反応させ、「支持体－第一の捕捉用物質－標的物質－第二の捕捉用物質」複合体あるいは「支持体－第二の捕捉用物質－標的物質－第一の捕捉用物質」複合体を形成させた後に、
前記レポーター物質との反応を行う、〔９〕又は〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕 〔１〕から〔１１〕のいずれかに記載の方法を行うための標的物質検出システム。
〔１３〕 試料中の標的物質をイムノクロマトグラフィー法により検出する方法であって、
標的物質に結合可能なアプタマー部分と、支持体に固定化された結合部分及びレポーター物質に固定化された結合部分の両方に結合可能な結合パートナー部分とを備えるアプタマープローブを用い、
前記支持体上に、「支持体－アプタマープローブ－標的物質－アプタマープローブ－レポーター物質」で表される結合状態で、前記標的物質及び前記レポーター物質を捕捉すること、並びに、
前記レポーター物質からのシグナルを検出することを含む、方法。
〔１４〕 前記アプタマープローブとして、前記標的物質の異なる部分に結合可能な２種類以上のアプタマープローブを用いる、〔１３〕に記載の方法。
〔１５〕 前記標的物質が、２以上の部分に同一のアプタマー部分が結合可能な標的物質である、〔１３〕に記載の方法。
〔１６〕 試料と前記アプタマープローブと前記レポーター物質を含む液体を、前記結合部分が固定化された支持体部分に展開させることを含む、〔１３〕から〔１５〕のいずれかに記載の方法。
〔１７〕 試料と前記アプタマープローブを含む液体を、前記結合部分が固定化された支持体部分に展開させること、及び、
その後、前記レポーター物質を含む液体を前記支持体部分に展開させること、
を含む、〔１３〕から〔１５〕のいずれかに記載の方法。
〔１８〕 結合部分が固定化された検出領域を備えるイムノクロマトグラフィー試験片と、
結合部分が固定化されたレポーター物質と、
検出領域の結合部分及びレポーター物質の結合部分の両方に結合可能な結合パートナー部分と標的物質に結合可能なアプタマー部分とを備えるアプタマープローブとを含む、
イムノクロマトグラフィー法による標的物質の検出システム。
〔１９〕 結合部分が固定化された検出領域を備えるイムノクロマトグラフィー試験片と、
結合部分が固定化されたレポーター物質と、
検出領域の結合部分及びレポーター物質の結合部分の両方に結合可能な結合パートナー部分と標的物質に結合可能なアプタマー部分とを備えるアプタマープローブとを含む、
〔１３〕から〔１７〕のいずれかに記載の方法を行うためのキット。
以下、実施例により本開示をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであって、本開示はこれら実施例に制限されるものではない。
実施例１
［２種類の核酸アプタマープローブでのイムノクロマトグラフィー検出方法］
レポーター物質、及び、ニトロセルロースメンブレンに、それぞれ、結合配列を有する結合部分プローブを固定化し、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／１９９９（Ｈ３Ｎ２）のヘマグルチニン（以下、ＨＡとする）を認識する核酸アプタマーを用いて、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／１９９９（Ｈ３Ｎ２）のＨＡの検出を行った。
なお、以下の説明においてはＡ／Ｐａｎａｍａ／２００７／１９９９（Ｈ３Ｎ２）のＨＡをＨ３／ＰａｎａｍａまたはＨ３と省略する場合がある。またＨＡとはインフルエンザウイルスのエンベロープ上にあるＨＡタンパク質と称されるヘマグルチニンタンパク質のことを指す。
［２種類の核酸アプタマープローブでのイムノクロマトグラフィー検出方法］
レポーター物質、及び、ニトロセルロースメンブレンに、それぞれ、結合配列を有する結合部分プローブを固定化し、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／１９９９（Ｈ３Ｎ２）のヘマグルチニン（以下、ＨＡとする）を認識する核酸アプタマーを用いて、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／１９９９（Ｈ３Ｎ２）のＨＡの検出を行った。
なお、以下の説明においてはＡ／Ｐａｎａｍａ／２００７／１９９９（Ｈ３Ｎ２）のＨＡをＨ３／ＰａｎａｍａまたはＨ３と省略する場合がある。またＨＡとはインフルエンザウイルスのエンベロープ上にあるＨＡタンパク質と称されるヘマグルチニンタンパク質のことを指す。
＜１．一本鎖ポリヌクレオチド固定化イムノクロマトグラフィー試験片の作成＞
（１－１．イムノクロマトグラフィー試験片の作成）
イムノクロマトグラフィー試験片は、図３と同様の構成のものを作成した。ニトロセルロースメンブレン（支持体）１１と、バッキングシート１２と、吸収帯１３とを貼り合わせて、縦軸方向に沿って、幅３．９ｍｍとなるように切断し、イムノクロマトグラフィー試験片を作成した。
（１－１．イムノクロマトグラフィー試験片の作成）
イムノクロマトグラフィー試験片は、図３と同様の構成のものを作成した。ニトロセルロースメンブレン（支持体）１１と、バッキングシート１２と、吸収帯１３とを貼り合わせて、縦軸方向に沿って、幅３．９ｍｍとなるように切断し、イムノクロマトグラフィー試験片を作成した。
（１－２．一本鎖ポリヌクレオチド固定化イムノクロマトグラフィー試験片の作成）
以下に示す配列（配列番号１）からなる修飾ポリヌクレオチドを結合部分プローブとして、Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒで５００μＭの濃度となるように希釈し、結合部分プローブ溶液を調製した。プローブは５’末端がリンカーを介してアミノ基修飾されたものを使用した。
一本鎖ポリヌクレオチド（２）の配列：５’－［ＮＨ2］ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ－３’（配列番号１）
上記（１－１）で作成したイムノクロマトグラフィー試験片のニトロセルロースメンブレン側の一端（図３において、この端を上流端１４、反対側を下流端１５とする）から１．４ｃｍ離れた位置（図３における２）に、結合部分プローブ溶液を０．１μＬ滴下した。結合部分プローブ溶液を滴下したイムノクロマトグラフィー試験片をＵＶＰ社のＵＶ照射装置（ＵＶＧＬ－５８）を用いて１０００ｍＪ／ｃｍ2程度の紫外線光（２５４ｎｍ）を照射し、結合部分２をメンブレン１１上に固定化した。
以下に示す配列（配列番号１）からなる修飾ポリヌクレオチドを結合部分プローブとして、Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒで５００μＭの濃度となるように希釈し、結合部分プローブ溶液を調製した。プローブは５’末端がリンカーを介してアミノ基修飾されたものを使用した。
一本鎖ポリヌクレオチド（２）の配列：５’－［ＮＨ2］ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ－３’（配列番号１）
上記（１－１）で作成したイムノクロマトグラフィー試験片のニトロセルロースメンブレン側の一端（図３において、この端を上流端１４、反対側を下流端１５とする）から１．４ｃｍ離れた位置（図３における２）に、結合部分プローブ溶液を０．１μＬ滴下した。結合部分プローブ溶液を滴下したイムノクロマトグラフィー試験片をＵＶＰ社のＵＶ照射装置（ＵＶＧＬ－５８）を用いて１０００ｍＪ／ｃｍ2程度の紫外線光（２５４ｎｍ）を照射し、結合部分２をメンブレン１１上に固定化した。
＜２．ポリヌクレオチド固定化蛍光ラテックス粒子の作成＞
（２－１．蛍光ラテックス粒子の活性化）
蛍光ラテックス粒子上にあるカルボキシル基を活性化させるために、１０ｍｇ／ｍＬ １－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］－３－エチルカルボジイミド（以下、ＥＤＣ）、５０ｍｇ／ｍＬ Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（以下、ＮＨＳ）となるようにそれぞれを２－モルホリノエタンスルホン酸（以下、ＭＥＳ）緩衝液で希釈調製した。ＭＥＳ緩衝液２１５．５μＬにＥＤＣ溶液１１９．５μＬ、ＮＨＳ溶液１１５μＬを添加し、さらにＴｈｅｒｍｏ社の蛍光ラテックス粒子（Ｆｌｕｏｒｏ－ＭａｘＴＭ Ｄｙｅｄ Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ－Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）１％ｓｏｌｉｄｓ溶液を５０μＬ添加した後、ボルテックスミキサーでよく混和した。振盪機に混合溶液をセットし、３０分間、室温で反応させた。反応後、蛍光ラテックス粒子を１８，３００ｘｇで１５分間遠心分離し、上清を除去した。ペレット上に残った蛍光ラテックス粒子に新しいＭＥＳ緩衝液を５００μＬ添加し、ボルテックスミキサーと超音波洗浄機を用いてペレットを再懸濁した。同様に洗浄操作を２回繰り返し行い、５００μＬのＭＥＳ緩衝液に懸濁した蛍光ラテックス粒子溶液を用意した。
（２－１．蛍光ラテックス粒子の活性化）
蛍光ラテックス粒子上にあるカルボキシル基を活性化させるために、１０ｍｇ／ｍＬ １－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］－３－エチルカルボジイミド（以下、ＥＤＣ）、５０ｍｇ／ｍＬ Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（以下、ＮＨＳ）となるようにそれぞれを２－モルホリノエタンスルホン酸（以下、ＭＥＳ）緩衝液で希釈調製した。ＭＥＳ緩衝液２１５．５μＬにＥＤＣ溶液１１９．５μＬ、ＮＨＳ溶液１１５μＬを添加し、さらにＴｈｅｒｍｏ社の蛍光ラテックス粒子（Ｆｌｕｏｒｏ－ＭａｘＴＭ Ｄｙｅｄ Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ－Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）１％ｓｏｌｉｄｓ溶液を５０μＬ添加した後、ボルテックスミキサーでよく混和した。振盪機に混合溶液をセットし、３０分間、室温で反応させた。反応後、蛍光ラテックス粒子を１８，３００ｘｇで１５分間遠心分離し、上清を除去した。ペレット上に残った蛍光ラテックス粒子に新しいＭＥＳ緩衝液を５００μＬ添加し、ボルテックスミキサーと超音波洗浄機を用いてペレットを再懸濁した。同様に洗浄操作を２回繰り返し行い、５００μＬのＭＥＳ緩衝液に懸濁した蛍光ラテックス粒子溶液を用意した。
（２－２．一本鎖ポリヌクレオチドの蛍光ラテックス粒子への感作）
以下に示す配列（配列番号１）からなる修飾ポリヌクレオチドを結合部分プローブとして、Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒで１６μＭに希釈し、結合部分プローブ溶液を調製した。結合部分プローブは５’末端がリンカーを介してアミノ基修飾されたものを使用した。
一本鎖ポリヌクレオチド（２）の配列：５’－［ＮＨ2］ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ－３’（配列番号１）
上記（２－１）で準備した蛍光ラテックス粒子溶液に２００μＬの結合部分プローブ溶液を加え、Ｖｏｒｔｅｘで混和した。振盪機に混合溶液をセットし、６０分間、室温で反応させた。反応後、蛍光ラテックス粒子を１８，３００ｘｇで１５分間遠心分離し、上清を除去した。ペレット上に残った蛍光ラテックス粒子に新しいＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を５００μＬ添加し、ボルテックスミキサーと超音波洗浄機を用いてペレットを再懸濁した。同様に洗浄操作を２回繰り返し行い、５００μＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液に懸濁した一本鎖ポリヌクレオチド（結合部分）感作蛍光ラテックス粒子溶液を用意した。
以下に示す配列（配列番号１）からなる修飾ポリヌクレオチドを結合部分プローブとして、Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒで１６μＭに希釈し、結合部分プローブ溶液を調製した。結合部分プローブは５’末端がリンカーを介してアミノ基修飾されたものを使用した。
一本鎖ポリヌクレオチド（２）の配列：５’－［ＮＨ2］ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ－３’（配列番号１）
上記（２－１）で準備した蛍光ラテックス粒子溶液に２００μＬの結合部分プローブ溶液を加え、Ｖｏｒｔｅｘで混和した。振盪機に混合溶液をセットし、６０分間、室温で反応させた。反応後、蛍光ラテックス粒子を１８，３００ｘｇで１５分間遠心分離し、上清を除去した。ペレット上に残った蛍光ラテックス粒子に新しいＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を５００μＬ添加し、ボルテックスミキサーと超音波洗浄機を用いてペレットを再懸濁した。同様に洗浄操作を２回繰り返し行い、５００μＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液に懸濁した一本鎖ポリヌクレオチド（結合部分）感作蛍光ラテックス粒子溶液を用意した。
＜３．Ｈ３の検出＞
（３－１．ＨＡ添加展開液の調製）
下記の通り、ＨＡ添加展開液７０μＬを９６穴プレート上に調製した。
０．５ｍｇ／ｍＬ ＨＡ溶液
一本鎖ポリヌクレオチド感作蛍光ラテックス粒子 ０．５μＬ
核酸アプタマープローブ２種 ０．５μＬ（各０．２５μＬ）
展開液 ６９μＬ
ＨＡ溶液は被検出物（標的物質）としてＨ３を、もしくはネガティブコントロールとしてＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０６／２００９（Ｈ１Ｎ１）のリコンビナントＨＡ（以下、Ｈ１）を含有した溶液である。一本鎖ポリヌクレオチド感作蛍光ラテックス粒子は、上記（２－１）および（２－２）の配列の一本鎖ＤＮＡ（結合部分）が固定化された蛍光ラテックス粒子である。また使用した核酸アプタマープローブはＲＮＡであり、配列は下記に示す通りであり、下線部分は結合部分の相補配列（結合パートナー部分）を示す。
核酸アプタマープローブ１：５’－ＧＧＧＡＧＡＡＵＵＣＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧＡＡＵＡＧＵＡＧＡＡＵＧＡＧＣＵＣＵＧＵＣＧＧＡＣＣＣＡＧＣＣＵＵＵＣＣＵＣＵＣＵＣＣＵＵＣＣＵＣＵＵＣＵＵＵＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ－３’（配列番号２）
核酸アプタマープローブ２：５’－ＧＧＧＵＵＡＧＣＡＧＵＣＧＧＣＡＵＧＣＧＧＵＡＣＡＧＡＣＡＧＡＣＣＣＵＵＵＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ－３’（配列番号３）
（３－１．ＨＡ添加展開液の調製）
下記の通り、ＨＡ添加展開液７０μＬを９６穴プレート上に調製した。
０．５ｍｇ／ｍＬ ＨＡ溶液
一本鎖ポリヌクレオチド感作蛍光ラテックス粒子 ０．５μＬ
核酸アプタマープローブ２種 ０．５μＬ（各０．２５μＬ）
展開液 ６９μＬ
ＨＡ溶液は被検出物（標的物質）としてＨ３を、もしくはネガティブコントロールとしてＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０６／２００９（Ｈ１Ｎ１）のリコンビナントＨＡ（以下、Ｈ１）を含有した溶液である。一本鎖ポリヌクレオチド感作蛍光ラテックス粒子は、上記（２－１）および（２－２）の配列の一本鎖ＤＮＡ（結合部分）が固定化された蛍光ラテックス粒子である。また使用した核酸アプタマープローブはＲＮＡであり、配列は下記に示す通りであり、下線部分は結合部分の相補配列（結合パートナー部分）を示す。
核酸アプタマープローブ１：５’－ＧＧＧＡＧＡＡＵＵＣＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧＡＡＵＡＧＵＡＧＡＡＵＧＡＧＣＵＣＵＧＵＣＧＧＡＣＣＣＡＧＣＣＵＵＵＣＣＵＣＵＣＵＣＣＵＵＣＣＵＣＵＵＣＵＵＵＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ－３’（配列番号２）
核酸アプタマープローブ２：５’－ＧＧＧＵＵＡＧＣＡＧＵＣＧＧＣＡＵＧＣＧＧＵＡＣＡＧＡＣＡＧＡＣＣＣＵＵＵＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ－３’（配列番号３）
（３－２．Ｈ３の検出）
上記（３－１）で調製したＨ３添加展開液を上記（１－１）および（１－２）で作製したイムノクロマトグラフィー試験片の先端に浸して、１０分間Ｈ３展開液を試験片に吸収させた後に、ａｎａｌｙｔｉｋｊｅｎａ社のＵＶＰ ＵＶＧＬ－２５（９５－００２１－１３）を使用した目視での確認と蛍光イムノクロマトリーダー（アークレイ開発品）での発色の確認を行った。
上記（３－１）で調製したＨ３添加展開液を上記（１－１）および（１－２）で作製したイムノクロマトグラフィー試験片の先端に浸して、１０分間Ｈ３展開液を試験片に吸収させた後に、ａｎａｌｙｔｉｋｊｅｎａ社のＵＶＰ ＵＶＧＬ－２５（９５－００２１－１３）を使用した目視での確認と蛍光イムノクロマトリーダー（アークレイ開発品）での発色の確認を行った。
＜４．結果＞
イムノクロマトグラフィー試験片のＨ３検出の有無を示す蛍光イムノクロマトリーダーでの測定結果を図４に示した。縦軸はイムノクロマトグラフィー試験片上に現れた蛍光シグナルの強度を、横軸はグラフの右側を上流端としたイムノクロマトグラフィー試験片上のニトロセルロースメンブレンの位置を示し、（Ｕ）は上流側、（Ｄ）は下流側を指す。
図４に示すとおり、Ｈ３展開液中にＨ３が含まれている場合、一本鎖ポリヌクレオチド（結合部分）を固定化した位置に蛍光シグナルが確認でき、Ｈ３非添加展開液では蛍光シグナルは検出されなかった。このことから、核酸アプタマーに対する相補鎖（結合部分）を固定化したイムノクロマトグラフィー試験片と、試験片に固定した相補鎖と同一の相補鎖（結合部分）を固定化した蛍光ラテックス粒子を使用することで、目的とする被検出物Ｈ３を補捉できることが示された。
イムノクロマトグラフィー試験片のＨ３検出の有無を示す蛍光イムノクロマトリーダーでの測定結果を図４に示した。縦軸はイムノクロマトグラフィー試験片上に現れた蛍光シグナルの強度を、横軸はグラフの右側を上流端としたイムノクロマトグラフィー試験片上のニトロセルロースメンブレンの位置を示し、（Ｕ）は上流側、（Ｄ）は下流側を指す。
図４に示すとおり、Ｈ３展開液中にＨ３が含まれている場合、一本鎖ポリヌクレオチド（結合部分）を固定化した位置に蛍光シグナルが確認でき、Ｈ３非添加展開液では蛍光シグナルは検出されなかった。このことから、核酸アプタマーに対する相補鎖（結合部分）を固定化したイムノクロマトグラフィー試験片と、試験片に固定した相補鎖と同一の相補鎖（結合部分）を固定化した蛍光ラテックス粒子を使用することで、目的とする被検出物Ｈ３を補捉できることが示された。
実施例２
［１種類の核酸アプタマープローブでのイムノクロマトグラフィー検出方法］
三量体構造をとる被検出物を標的物質とし、１種類のみの核酸アプタマープローブを使用した場合のイムノクロマトグラフィー検出方法の検出能を確認した。なお、ヘマグルチニン（ＨＡ）は、ホモ３量体を形成するタンパク質である。
［１種類の核酸アプタマープローブでのイムノクロマトグラフィー検出方法］
三量体構造をとる被検出物を標的物質とし、１種類のみの核酸アプタマープローブを使用した場合のイムノクロマトグラフィー検出方法の検出能を確認した。なお、ヘマグルチニン（ＨＡ）は、ホモ３量体を形成するタンパク質である。
＜１．一本鎖ポリヌクレオチド固定化イムノクロマトグラフィー試験片の作成＞
実施例１と同様の方法（１－１）～（１－２）で、核酸アプタマープローブの結合パートナー部分の相補配列（すなわち、結合部分）を固定化したイムノクロマトグラフィー試験片を準備した。ただし、ＵＶ照射による一本鎖ポリヌクレオチドの固定化は、Ａｎａｌｙｔｉｋ Ｊｅｎａ ＵＳ社のＵＶ照射装置（ＵＶＰ ＣＬ－１００）を用いて１２０ｍＪ／ｃｍ2程度の紫外線光（２５４ｎｍ）を照射したあと、４０度で５～１０分間乾燥させて固定化した。
実施例１と同様の方法（１－１）～（１－２）で、核酸アプタマープローブの結合パートナー部分の相補配列（すなわち、結合部分）を固定化したイムノクロマトグラフィー試験片を準備した。ただし、ＵＶ照射による一本鎖ポリヌクレオチドの固定化は、Ａｎａｌｙｔｉｋ Ｊｅｎａ ＵＳ社のＵＶ照射装置（ＵＶＰ ＣＬ－１００）を用いて１２０ｍＪ／ｃｍ2程度の紫外線光（２５４ｎｍ）を照射したあと、４０度で５～１０分間乾燥させて固定化した。
＜２．ポリヌクレオチド固定化蛍光ラテックス粒子の作成＞
実施例１と同様の方法（２－１）～（２－２）で、結合部分を固定化した蛍光ラテックス粒子を準備した。
実施例１と同様の方法（２－１）～（２－２）で、結合部分を固定化した蛍光ラテックス粒子を準備した。
＜３．一種類の核酸アプタマーのみでの多量体検出能の評価＞
（３－１．ＨＡ添加展開液の調製）
下記の通り、ＨＡ添加展開液７０μＬを９６穴プレート上に調製した。
ＨＡ溶液（Ｈ３ ２．５μｇ／ｍＬもしくは非添加）
一本鎖ポリヌクレオチド感作蛍光ラテックス粒子 ０．５μＬ
核酸アプタマープローブ１種 ０．２５μＬ
展開液 ６９．２５μＬ
ＨＡ溶液は被検出物としてＨ３を、含有もしくは非含有の溶液である。一本鎖ポリヌクレオチド感作蛍光ラテックス粒子は、実施例１の上記（２－１）および（２－２）の配列の一本鎖ＤＮＡ（結合部分）が固定化された蛍光ラテックス粒子である。
また使用した核酸アプタマーはＲＮＡアプタマーであり、配列は下記に示す通りであり、下線部分は結合部分の相補配列（結合パートナー部分）を示す。
核酸アプタマープローブ２：５’－ＧＧＧＵＵＡＧＣＡＧＵＣＧＧＣＡＵＧＣＧＧＵＡＣＡＧＡＣＡＧＡＣＣＣＵＵＵＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ－３’（配列番号３）
（３－１．ＨＡ添加展開液の調製）
下記の通り、ＨＡ添加展開液７０μＬを９６穴プレート上に調製した。
ＨＡ溶液（Ｈ３ ２．５μｇ／ｍＬもしくは非添加）
一本鎖ポリヌクレオチド感作蛍光ラテックス粒子 ０．５μＬ
核酸アプタマープローブ１種 ０．２５μＬ
展開液 ６９．２５μＬ
ＨＡ溶液は被検出物としてＨ３を、含有もしくは非含有の溶液である。一本鎖ポリヌクレオチド感作蛍光ラテックス粒子は、実施例１の上記（２－１）および（２－２）の配列の一本鎖ＤＮＡ（結合部分）が固定化された蛍光ラテックス粒子である。
また使用した核酸アプタマーはＲＮＡアプタマーであり、配列は下記に示す通りであり、下線部分は結合部分の相補配列（結合パートナー部分）を示す。
核酸アプタマープローブ２：５’－ＧＧＧＵＵＡＧＣＡＧＵＣＧＧＣＡＵＧＣＧＧＵＡＣＡＧＡＣＡＧＡＣＣＣＵＵＵＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ－３’（配列番号３）
（３－２．Ｈ３の検出）
上記（３－１）で調製したＨ３添加展開液を上記（１－１）および（１－２）で作製したイムノクロマトグラフィー試験片の先端に浸して、１０分間Ｈ３展開液を試験片に吸収させた後に、ａｎａｌｙｔｉｋｊｅｎａ社のＵＶＰ ＵＶＧＬ－２５（９５－００２１－１３）を使用した目視での確認と蛍光イムノクロマトリーダー（アークレイ開発品）での発色の確認を行った。
上記（３－１）で調製したＨ３添加展開液を上記（１－１）および（１－２）で作製したイムノクロマトグラフィー試験片の先端に浸して、１０分間Ｈ３展開液を試験片に吸収させた後に、ａｎａｌｙｔｉｋｊｅｎａ社のＵＶＰ ＵＶＧＬ－２５（９５－００２１－１３）を使用した目視での確認と蛍光イムノクロマトリーダー（アークレイ開発品）での発色の確認を行った。
＜４．結果＞
イムノクロマトグラフィー試験片のＨ３検出の有無を示す蛍光イムノクロマトリーダーでの測定結果を図５に示した。縦軸はイムノクロマトグラフィー試験片上に現れた蛍光シグナルの強度を、横軸はグラフの右側を上流端としたイムノクロマトグラフィー試験片上のニトロセルロースメンブレンの位置を示し、（Ｕ）は上流側、（Ｄ）は下流側を指す。
図５に示すとおり、Ｈ３展開液中にＨ３が含まれている場合、一本鎖ポリヌクレオチド（結合部分）を固定化した位置に蛍光シグナルが確認でき、Ｈ３非添加展開液では蛍光シグナルは検出されなかった。このことから、核酸アプタマーに対する相補鎖（結合部分）を固定化したイムノクロマトグラフィー試験片と、同配列（同結合部分）を固定化した蛍光ラテックス粒子を使用することで、被検出物が三量体構造をとる場合においては、１種類の核酸アプタマープローブであっても被検出物Ｈ３を補捉することができることが示された。
イムノクロマトグラフィー試験片のＨ３検出の有無を示す蛍光イムノクロマトリーダーでの測定結果を図５に示した。縦軸はイムノクロマトグラフィー試験片上に現れた蛍光シグナルの強度を、横軸はグラフの右側を上流端としたイムノクロマトグラフィー試験片上のニトロセルロースメンブレンの位置を示し、（Ｕ）は上流側、（Ｄ）は下流側を指す。
図５に示すとおり、Ｈ３展開液中にＨ３が含まれている場合、一本鎖ポリヌクレオチド（結合部分）を固定化した位置に蛍光シグナルが確認でき、Ｈ３非添加展開液では蛍光シグナルは検出されなかった。このことから、核酸アプタマーに対する相補鎖（結合部分）を固定化したイムノクロマトグラフィー試験片と、同配列（同結合部分）を固定化した蛍光ラテックス粒子を使用することで、被検出物が三量体構造をとる場合においては、１種類の核酸アプタマープローブであっても被検出物Ｈ３を補捉することができることが示された。
１： レポーター物質
２： 結合部分プローブ
３： 結合部分
４： アプタマープローブ
５： 結合パートナー部分
６： 標的物質
７： アプタマープローブ
１０： 結合部分プローブ
１１： 支持体
１２： バッキングシート
１３： 吸収帯
１４： 上流端
１５： 下流端
２： 結合部分プローブ
３： 結合部分
４： アプタマープローブ
５： 結合パートナー部分
６： 標的物質
７： アプタマープローブ
１０： 結合部分プローブ
１１： 支持体
１２： バッキングシート
１３： 吸収帯
１４： 上流端
１５： 下流端
Claims (19)
- 試料中の標的物質を検出する方法であって、
前記試料と、
第一の結合部分を備えた支持体と、
前記標的物質を検出するための標識物質及び第二の結合部分を備えたレポーター物質と、
前記第一の結合部分及び前記第二の結合部分と結合可能な第一の結合パートナー部分を備える、前記標的物質に結合可能な第一の捕捉用物質と、
前記第二の結合部分及び前記第一の結合部分と結合可能な第二の結合パートナー部分を備える、前記標的物質に結合可能な第二の捕捉用物質と、
を反応させる反応工程と、
前記標識物質からのシグナルを検出する検出工程を含み、
前記反応工程が、「支持体－第一の捕捉用物質－標的物質－第二の捕捉用物質－レポーター物質」複合体、及び／又は「支持体－第二の捕捉用物質－標的物質－第一の捕捉用物質－レポーター物質」複合体を形成することを含み、
前記検出工程が、前記複合体中の前記標識物質からのシグナルを検出する、方法。 - 前記第一の捕捉用物質及び前記第二の捕捉用物質は、抗体、低分子抗体、ペプチド及びアプタマーからなる群から選択される標的物質認識部分を有する、請求項１に記載の方法。
- 前記第一の捕捉用物質、及び／又は、前記第二の捕捉用物質が、アプタマープローブである、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記アプタマープローブが、核酸アプタマーである、請求項３に記載の方法。
- 前記第一及び第二の結合パートナー部分と、前記第一及び第二の結合部分との結合全てが非共有結合性の相互作用による結合である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
- 前記非共有結合性の相互作用による結合が相補的核酸の結合である、請求項５に記載の方法。
- 前記第一の捕捉用物質と前記第二の捕捉用物質が、同一の捕捉用物質であり、前記標的物質が、２以上の部分に前記同一の捕捉用物質が結合可能な標的物質である、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
- イムノクロマトグラフィー法によって検出される、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
- 前記第一の捕捉用物質が、支持体が備える前記第一の結合部分に結合されている、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
- 前記試料と前記第一の捕捉用物質と前記第二の捕捉用物質と前記レポーター物質を、前記支持体に展開させることを含む、請求項１から９いずれかに記載の方法。
- 前記試料と前記支持体と前記第一の捕捉用物質と前記第二の捕捉用物質とを反応させ、「支持体－第一の捕捉用物質－標的物質－第二の捕捉用物質」複合体及び／又は「支持体－第二の捕捉用物質－標的物質－第一の捕捉用物質」複合体を形成させた後に、
前記レポーター物質との反応を行う、請求項９又は請求項１０に記載の方法。 - 請求項１から１１のいずれかに記載の方法を行うための標的物質検出システム。
- 試料中の標的物質をイムノクロマトグラフィー法により検出する方法であって、
標的物質に結合可能なアプタマー部分と、支持体に固定化された結合部分及びレポーター物質に固定化された結合部分の両方に結合可能な結合パートナー部分とを備えるアプタマープローブを用い、
前記支持体上に、「支持体－アプタマープローブ－標的物質－アプタマープローブ－レポーター物質」で表される結合状態で、前記標的物質及び前記レポーター物質を捕捉すること、並びに、
前記レポーター物質からのシグナルを検出することを含む、方法。 - 前記アプタマープローブとして、前記標的物質の異なる部分に結合可能な２種類以上のアプタマープローブを用いる、請求項１３に記載の方法。
- 前記標的物質が、２以上の部分に同一のアプタマー部分が結合可能な標的物質である、請求項１３に記載の方法。
- 試料と前記アプタマープローブと前記レポーター物質を含む液体を、前記結合部分が固定化された支持体部分に展開させることを含む、請求項１３から１５のいずれかに記載の方法。
- 試料と前記アプタマープローブを含む液体を、前記結合部分が固定化された支持体部分に展開させること、及び、
その後、前記レポーター物質を含む液体を前記支持体部分に展開させること、
を含む、請求項１３から１５のいずれかに記載の方法。 - 結合部分が固定化された検出領域を備えるイムノクロマトグラフィー試験片と、
結合部分が固定化されたレポーター物質と、
検出領域の結合部分及びレポーター物質の結合部分の両方に結合可能な結合パートナー部分と標的物質に結合可能なアプタマー部分とを備えるアプタマープローブとを含む、
イムノクロマトグラフィー法による標的物質の検出システム。 - 結合部分が固定化された検出領域を備えるイムノクロマトグラフィー試験片と、
結合部分が固定化されたレポーター物質と、
検出領域の結合部分及びレポーター物質の結合部分の両方に結合可能な結合パートナー部分と標的物質に結合可能なアプタマー部分とを備えるアプタマープローブとを含む、
請求項１３から１７のいずれかに記載の方法を行うためのキット。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2019114031A JP7241619B2 (ja) | 2019-06-19 | 2019-06-19 | 標的物質検出方法、標的物質検出キット、標的物質検出システム |
| US16/905,460 US11391731B2 (en) | 2019-06-19 | 2020-06-18 | Target substance detection method, target substance detection kit, and target substance detection system |
| CN202010559528.8A CN112114134B (zh) | 2019-06-19 | 2020-06-18 | 靶物质检测方法、靶物质检测试剂盒以及靶物质检测系统 |
| EP20181054.6A EP3754335B1 (en) | 2019-06-19 | 2020-06-19 | Target substance detection method, target substance detection kit, and target substance detection system |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2019114031A JP7241619B2 (ja) | 2019-06-19 | 2019-06-19 | 標的物質検出方法、標的物質検出キット、標的物質検出システム |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2021000002A JP2021000002A (ja) | 2021-01-07 |
| JP7241619B2 true JP7241619B2 (ja) | 2023-03-17 |
Family
ID=71111307
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2019114031A Active JP7241619B2 (ja) | 2019-06-19 | 2019-06-19 | 標的物質検出方法、標的物質検出キット、標的物質検出システム |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11391731B2 (ja) |
| EP (1) | EP3754335B1 (ja) |
| JP (1) | JP7241619B2 (ja) |
| CN (1) | CN112114134B (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP4006154A3 (en) * | 2020-10-30 | 2022-06-29 | ARKRAY, Inc. | Nucleic acid aptamer for influenza virus and detection of influenza virus |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008545142A (ja) | 2005-07-07 | 2008-12-11 | ベックマン コールター インコーポレイテッド | オリゴヌクレオチド連結リガンドを検出するための標識された相補的オリゴヌクレオチド |
| JP2018132423A (ja) | 2017-02-15 | 2018-08-23 | 国立大学法人京都工芸繊維大学 | イムノクロマトグラフィー装置、イムノクロマトグラフィー装置を用いた試料液中の被検出物の有無の検出方法、イムノクロマトグラフィー装置の製造方法、及びキット |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5641629A (en) | 1990-06-11 | 1997-06-24 | Nexstar Pharmacueticals Inc | Spectroscopically detectable nucleic acid ligands |
| US5824478A (en) * | 1996-04-30 | 1998-10-20 | Vysis, Inc. | Diagnostic methods and probes |
| US20020037506A1 (en) * | 2000-04-18 | 2002-03-28 | Yun Lin | Aptamer based two-site binding assay |
| EP1890146A4 (en) | 2005-06-01 | 2009-05-13 | Olympus Corp | METHOD FOR DETECTING NUCLEIC ACID |
| CN101183106A (zh) * | 2007-09-21 | 2008-05-21 | 马北峰 | 一种口腔液体中乙肝病毒标志物的检测装置 |
| CN101430334A (zh) * | 2008-11-05 | 2009-05-13 | 中国科学院上海应用物理研究所 | 基于核酸适体的靶物质的检测方法及其固相生物感应器 |
| JP2012533064A (ja) | 2009-07-08 | 2012-12-20 | エイエヌピー テクノロジーズ， インコーポレイテッド | 免疫原性アッセイ |
| CN102135498B (zh) * | 2010-01-25 | 2014-08-06 | 常州博闻迪医药科技有限公司 | 一种以多捕获特性为特征的半定量胶体金属检测技术及其制备方法和用途 |
| CN101943699B (zh) * | 2010-08-31 | 2013-04-03 | 广州万孚生物技术股份有限公司 | 一种检测唾液中hiv抗体的试纸条及其制备方法 |
| CN102443585A (zh) * | 2011-11-25 | 2012-05-09 | 国家纳米技术与工程研究院 | 玉米赤霉烯酮核酸适体及其应用 |
| CN103048449B (zh) * | 2013-01-14 | 2015-06-24 | 谭蔚泓 | 基于核酸适配体的层析法检测试剂盒及其制备方法和检测方法 |
| US20160258938A1 (en) * | 2015-03-04 | 2016-09-08 | Headway Technologies, Inc. | Method of detecting an analyte in a sample |
| JP6675165B2 (ja) * | 2015-07-31 | 2020-04-01 | シスメックス株式会社 | 被検物質の検出方法、検出用試薬キットおよび検出用試薬 |
| CN106290831A (zh) * | 2016-08-02 | 2017-01-04 | 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 | 一种基于抗原‑适配体的竞争法检测试纸条及其应用 |
| CN107202895A (zh) * | 2017-05-23 | 2017-09-26 | 江南大学 | 一种基于适配体识别的凝血酶快速检测试纸条 |
-
2019
- 2019-06-19 JP JP2019114031A patent/JP7241619B2/ja active Active
-
2020
- 2020-06-18 CN CN202010559528.8A patent/CN112114134B/zh active Active
- 2020-06-18 US US16/905,460 patent/US11391731B2/en active Active
- 2020-06-19 EP EP20181054.6A patent/EP3754335B1/en active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008545142A (ja) | 2005-07-07 | 2008-12-11 | ベックマン コールター インコーポレイテッド | オリゴヌクレオチド連結リガンドを検出するための標識された相補的オリゴヌクレオチド |
| JP2018132423A (ja) | 2017-02-15 | 2018-08-23 | 国立大学法人京都工芸繊維大学 | イムノクロマトグラフィー装置、イムノクロマトグラフィー装置を用いた試料液中の被検出物の有無の検出方法、イムノクロマトグラフィー装置の製造方法、及びキット |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Biochemical and Biophysical Research Communications，2013年11月19日，Vol.443，pp.37-41 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2021000002A (ja) | 2021-01-07 |
| US20200400658A1 (en) | 2020-12-24 |
| EP3754335C0 (en) | 2023-11-22 |
| EP3754335A1 (en) | 2020-12-23 |
| CN112114134A (zh) | 2020-12-22 |
| CN112114134B (zh) | 2024-02-02 |
| EP3754335B1 (en) | 2023-11-22 |
| US11391731B2 (en) | 2022-07-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5340575B2 (ja) | イムノクロマトグラフィー用試験具 | |
| JP5200003B2 (ja) | 磁場を用いた試料中の標的分子の検出 | |
| US20090269858A1 (en) | Method of determining the concentration of an analyte using analyte sensor molecules coupled to a porous membrane | |
| JPH05504841A (ja) | リガンドレセプター及びリガンドのコンプレックスに対する抗体及びリガンド―レセプターアッセーでのそれらの用途 | |
| WO2007111847A2 (en) | Use of additives for the reduction of non-specific binding in assays | |
| JP2013120120A (ja) | ラテラルフロー型クロマト法用テストストリップ、およびそれを用いたアナライトの検出または定量方法 | |
| JP5006459B1 (ja) | 標識用複合粒子 | |
| CN108700581A (zh) | 用于定量生物试样中的测定对象物质的试剂盒及定量生物试样中的测定对象物质的方法 | |
| BR112014020513B1 (pt) | Métodos e sistemas para amplificação de sinal de bioensaios | |
| JP7041491B2 (ja) | バイオアッセイのための検出剤及びそれを用いたシグナルの増幅方法 | |
| JP7241619B2 (ja) | 標的物質検出方法、標的物質検出キット、標的物質検出システム | |
| WO2015109255A1 (en) | Lateral flow assays using dna dendrimers | |
| US20090156422A1 (en) | Device and method to detect analytes | |
| WO2017094825A1 (ja) | イムノクロマト試験片 | |
| KR102047517B1 (ko) | 막 기반 다중튜브를 포함하는 생체 물질 분석 장치 | |
| JP2018132423A (ja) | イムノクロマトグラフィー装置、イムノクロマトグラフィー装置を用いた試料液中の被検出物の有無の検出方法、イムノクロマトグラフィー装置の製造方法、及びキット | |
| JP6734011B2 (ja) | 生体分子検出用試験キット、及びこれを用いた生体分子の検出方法、並びにこれらに用いられる生体分子検出用試験片及び生体分子検出用標識試薬 | |
| KR102306097B1 (ko) | 고감도 면역접합체, 이의 제조방법, 이를 포함한 체외 진단시약 및 체외 진단키트 | |
| JP6076500B2 (ja) | 標的物質の検出方法 | |
| KR101326257B1 (ko) | 막 기반 다중튜브를 포함하는 생체 물질 분석 장치 | |
| JP5137880B2 (ja) | 結合性物質を固定化した乾燥粒子の製造方法 | |
| US9134308B2 (en) | Antibody immobilization using poly(ethylene glycol) crosslinking | |
| JP2005010001A (ja) | 免疫測定法 | |
| JP2024074809A (ja) | 側方流動アッセイのシグナルを増幅させるシステム、装置および方法 | |
| CN108713141A (zh) | 用于定量生物试样中的测定对象物质的试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20211210 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20221026 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20221101 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20221216 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230228 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230307 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7241619 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |