CN108713141A - 用于定量生物试样中的测定对象物质的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于提供一种即使在测定对象物质包含具有多个结构不同的物质的情况下，也能够以高精度定量生物试样中的测定对象物质的试剂盒。根据本发明，提供一种用于定量生物试样中的测定对象物质的试剂盒，其包含：荧光粒子，与测定对象物质具有结合性的第一结合物质；及基板，该基板具备检测区域，所述检测区域包含与上述测定对象物质或者上述第一结合物质中的任一者具有结合性的第二结合物质，所述用于定量测定对象物质的试剂盒中，上述测定对象物质包含至少3种结构不同的物质，上述第一结合物质包含与上述至少3种结构不同的物质分别具有结合性的至少3种结合物质。

Description

用于定量生物试样中的测定对象物质的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种用于定量生物试样中的测定对象物质的试剂盒。
背景技术
作为用于定量生物试样中所包含的蛋白质、酶或无机化合物等测定对象物质的高灵敏度且容易的测定法，广泛地利用荧光检测法。荧光检测法为如下方法：检测对认为包含通过特定波长的光被激发而发出荧光的测定对象物质的试样照射上述特定波长的激发光时发出的荧光，由此确认测定对象物质的存在。在测定对象物质不是荧光体的情况下，使利用荧光色素标记与测定对象物质特异性结合的物质而得的物质与试样接触，之后以与上述相同的方式，检测照射激发光时发出的荧光，由此能够确认测定对象物质的存在。
在上述荧光检测法中，已知为了提高检测的灵敏度而利用由等离激元共振产生的电场增强的效果的方法。该方法中，为了产生等离激元共振，准备在透明的支撑体上的规定区域设置有金属膜的传感器芯片。然后，从支撑体中的与金属膜形成面相反的一面侧以全反射角度以上的角度对支撑体与金属膜的界面射入激发光。通过照射该激发光而在金属膜产生表面等离激元，通过由该表面等离激元的产生而引起的电场增强作用，荧光得到增强，从而信号/干扰比(S/N比)有所提高。利用表面等离激元激发的荧光检测法(表面等离激元荧光：Surface Plasmon Fluorescence，以下，称为“SPF法”)相较于利用落射激发的荧光检测法(以下，称为“落射荧光法”)，可获得约10倍的信号增强度，从而能够以高灵敏度进行测定。
胆汁酸为在哺乳类胆汁中存在的类固醇衍生物中具有胆烷酸骨架的化合物的统称，作为典型的例子，可举出胆酸、脱氧胆酸及鹅去氧胆酸。作为胆汁酸的测定方法，例如，在专利文献1中记载有一种方法，其确定试样中的分析对象物的存在与否或者量，该方法的特征在于，(a)混合非金属标记组合物和该试样，该非金属标记组合物由结合有能够特异性识别该分析对象物的结合成分的胶体状非金属粒子组成，接着，(b)确定分析对象物/胶体状非金属粒子复合物的存在与否或者量。在专利文献1中记载有与非金属粒子结合的结合成分选自由抗原、半抗原及抗体组成的组，作为分析对象物，例示了胆酸、脱氧胆酸及鹅去氧胆酸等。
以往技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平1-35372号公报
发明内容
发明要解决的技术课题
如上所述，作为能够通过简单的测定方法以高灵敏度进行测定的方法，已知有利用表面等离激元激发的荧光检测法，但是测定对象物质包含具有多个结构不同的物质时，测定精度不够理想。尤其，为了定量如胆汁酸等那样3种以上的结构不同的物质，希望提供一种再现性高且简单的测定方法。
本发明待解决的课题在于，提供一种即使在测定对象物质包含具有多个结构不同的物质的情况下，也能够以高精度定量生物试样中的测定对象物质的试剂盒。
用于解决技术课题的手段
为了解决上述问题，本发明人等进行深入研究的结果，发现了在用于定量生物试样中的测定对象物质的试剂盒中，通过使用至少3种结合物质来作为上述第一结合物质，能够解决上述问题，所述试剂盒具有：荧光粒子，该荧光粒子具有与测定对象物质具有结合性的第一结合物质；及基板，该基板具备检测区域，所述检测区域包含与上述测定对象物质或者上述第一结合物质中的任一者具有结合性的第二结合物质。本发明是根据这些见解而完成的。即，根据本发明，提供以下发明。
(1)一种用于定量测定对象物质的试剂盒，其包含：
荧光粒子，该荧光粒子具有与测定对象物质具有结合性的第一结合物质；及
基板，该基板具备检测区域，所述检测区域包含与上述测定对象物质或者上述第一结合物质中的任一者具有结合性的第二结合物质，
所述用于定量测定对象物质的试剂盒中，
上述测定对象物质包含至少3种结构不同的物质，
上述第一结合物质包含与上述至少3种结构不同的物质分别具有结合性的至少3种结合物质。
(2)根据(1)所述的试剂盒，其中，上述荧光粒子的每一个荧光粒子具有上述至少3种结合物质。
(3)根据(1)或(2)所述的试剂盒，其中，上述第二结合物质为上述至少3种结构不同的物质或者上述3种结构不同的物质与载体的结合体。
(4)根据(1)至(3)中任一项所述的试剂盒，其中，上述第一结合物质包含胆酸抗体、脱氧胆酸抗体及鹅去氧胆酸抗体。
(5)根据(1)至(4)中任一项所述的试剂盒，其中，上述第二结合物质包含胆酸和/或胆酸·白蛋白结合体、脱氧胆酸和/或脱氧胆酸·白蛋白结合体、以及鹅去氧胆酸和/或鹅去氧胆酸·白蛋白结合体。
(6)根据(1)至(5)中任一项所述的试剂盒，其中，上述荧光粒子为荧光乳胶粒子。
(7)根据(1)至(6)中任一项所述的试剂盒，其中，上述检测区域为金膜表面。发明效果
根据本发明的试剂盒，即使在测定对象物质包含具有多个结构不同的物质的情况下，也能够以高精度定量生物试样中的测定对象物质。
附图说明
图1表示本发明的试剂盒中所包含的传感器芯片的示意图。
图2表示本发明的试剂盒中所包含的传感器芯片的分解图。
具体实施方式
以下，对本发明进行进一步详细说明。
[用于定量生物试样中的测定对象物质的试剂盒]
本发明的用于定量生物试样中的测定对象物质的试剂盒包含：荧光粒子，与测定对象物质具有结合性的第一结合物质；及基板，该基板具备检测区域，所述检测区域包含与上述测定对象物质或者上述第一结合物质中的任一者具有结合性的第二结合物质，上述测定对象物质包含至少3种结构不同的物质，且上述第一结合物质包含与上述至少3种结构不同的物质分别具有结合性的至少3种结合物质。
在本发明中，即使在测定对象物质包含至少3种结构不同的物质的情况下，通过使用与上述至少3种结构不同的物质分别具有结合性的至少3种结合物质来作为第一结合物质，也能够以高精度定量生物试样中的测定对象物质。在本发明中，新发现改善定量如胆汁酸等那样3种以上的结构不同的物质时的测定精度的问题，通过使用至少3种结合物质来作为第一结合物质，解决了上述问题。
(生物试样)
作为生物试样，只要是有可能包含测定对象物质的试样，则并无特别限定，例如，能够举出生物试样、尤其动物(例如，人、狗、猫等)的体液(例如，血液、血清、血浆、脊髓液、泪液、汗、尿、脓、鼻涕、或咳痰)或者排泄物(例如，粪便)、器官、组织、粘膜、皮肤等。
(测定对象物质)
作为测定对象物质，只要包含至少3种结构不同的物质，则并无特别限定，但是例如可举出胆汁酸、胆固醇，蛋白质等。
胆汁酸的主要作用为在消化道内促进胶束的形成，以使更加容易吸收膳食脂肪。将在肝脏中生物合成的物质称为初级胆汁酸。并且，一部分在肠道中受到由微生物引起的转换，其代谢物被称为次级胆汁酸。胆汁酸通常与甘氨酸、牛磺酸相结合，它们被称为结合胆汁酸(胆汁盐)。
关于测定狗及猫中的血清胆汁酸浓度的迅速且简单的方法，被认为是反映肝细胞功能及肠肝门静脉循环的高灵敏度且特异性检查。在与血清胆汁酸相关的研究中，尤其，在显示因临床症状不明确而无法解释的高肝酶活性但没有黄疸的狗和猫中，为了检测需要临床确诊的肝胆道系统疾病，示出血清胆汁酸的有用性。并且，在先天性门静脉循环分流的诊断中，为了提高诊断率，推荐空腹时及饭后的胆汁酸定量。胆汁酸浓度的值高时，怀疑急性肝炎、慢性肝病、胆汁淤积、肠内细菌过量繁殖、门静脉分流(portosystemic shunt、PSS)等，另一方面，胆汁酸浓度的值低时，怀疑肠吸收不良。
这种胆汁酸以结构稍微不同的化合物的集合体的形式存在，具体而言，存在10种化合物，但是在狗及猫的情况下，作为胆汁酸，由胆酸、脱氧胆酸及鹅去氧胆酸这3种牛磺酸结合物占大致100％。例如，若用平均值表示狗的血液中的3种结构不同的胆汁酸的比率，则成为胆酸牛磺酸结合物:脱氧胆酸牛磺酸结合物:鹅去氧胆酸牛磺酸结合物＝74％:20％:6％的比例(日本兽医学杂志：The Japanese journal of veterinary science，52(2)1990)。以下，示出胆酸、脱氧胆酸及鹅去氧胆酸的结构。
[化学式1]
(第一结合物质)
本发明中所使用的第一结合物质为与测定对象物质具有结合性的物质。作为第一结合物质，能够使用抗原、抗体或者它们的复合物，但是并不限定于这些。优选第一结合物质为抗体。在第一结合物质为抗体的情况下，作为与测定对象物质具有结合性的抗体，例如，能够使用由通过该测定对象物质被免疫的动物的血清制备的抗血清、从抗血清提纯的免疫球蛋白组分、通过使用通过该测定对象物质被免疫的动物的脾脏细胞进行细胞融合而获得的单克隆抗体、或者它们的片段[例如，F(ab’)2、Fab、Fab’或Fv]等。关于这些抗体的制备，能够通过常规方法来进行。而且，关于该抗体，可以是如嵌合抗体等的情况那样施加了修饰的抗体，并且即便是市售的抗体，也能够使用通过公知的方法由动物血清或培养上清液制备的抗体。
在本发明中，测定对象物质包含至少3种结构不同的物质，第一结合物质包含对上述至少3种结构不同的物质分别具有结合性的至少3种结合物质。
例如，在测定对象物质为胆汁酸的情况下，作为第一结合物质，使用与非结合物及结合物的胆汁酸具有结合性的(优选特异性识别胆汁酸的)抗胆汁酸抗体。在胆汁酸中包含胆酸、脱氧胆酸、鹅去氧胆酸和/或它们的结合物，因此在本发明中，作为第一结合物质，能够制作抗胆酸抗体、抗脱氧胆酸抗体及抗鹅去氧胆酸抗体，并使用上述3种抗体。
作为与非结合物及结合物这两者进行反应的抗胆酸抗体、抗脱氧胆酸抗体及抗鹅去氧胆酸抗体的具体的制作方法，例如，以抗胆酸抗体的制作方法为例在以下进行说明。
能够混合胆酸、牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，以下简称为BSA)及缩合剂来制作胆酸的羧酸的部分与BSA结合而成的胆酸-BSA结合体。将结合体用作小鼠免疫致敏抗原，并对于小鼠背部皮下进行多次免疫。在该情况下，能够适当地选择完全佐剂(弗氏完全佐剂(Freund‘s Complete Adjuvant)：FCA)和/或不完全佐剂(弗氏不完全佐剂(Freund‘s Incomplete Adjuvant)：FIA)并与免疫致敏抗原进行混合而使用。所谓完全佐剂，为刺激免疫的物质，是石蜡与ARLACEL的混合物。所谓不完全佐剂，是指在完全佐剂中添加杀灭的分枝杆菌或结核菌的死菌，并进一步增强抗原性的佐剂。在几个星期中适当进行数次免疫致敏之后从小鼠进行采血并实施抗体效价的测定。在观察到抗体效价的充分的上升的情况下向腹腔内施用抗原，数日后摘除脾脏。通过使以这种方式从免疫小鼠摘除的脾脏细胞与突变株骨髓瘤细胞(骨髓瘤)融合，能够制作具备抗体产生能力的融合细胞。从该融合细胞中仅选择针对目标抗原的抗体产生细胞，进而为了只增殖该细胞株而进行有限稀释。能够进行稀释后的细胞的培养(克隆)。将如此获得的融合细胞株注射到小鼠的腹腔内，并通过增殖腹水型抗体产生细胞，能够在腹水中产生单克隆抗体，回收这些抗体，由此能够获得目标抗体。
(荧光粒子)
作为本发明中所使用的荧光粒子，能够使用通常能用于免疫反应中的通过荧光而着色的粒子，例如，能够使用荧光聚苯乙烯珠等荧光高分子粒子、荧光玻璃珠等荧光玻璃粒子。作为荧光粒子的材质的具体例，有使用了苯乙烯、甲基丙烯酸、(甲基)丙烯酸缩水甘油酯、丁二烯、氯乙烯、醋酸乙烯酯丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸苯酯或甲基丙烯酸丁酯等单体的高分子、或使用了2种以上的单体的共聚物等合成高分子粉末，优选为使它们均匀地悬浮而得的乳胶。并且，可举出其他有机高分子粉末、无机物质粉末、微生物、血细胞、细胞膜片或脂质体等。
在使用乳胶粒子的情况下，作为乳胶的材质的具体例，可举出聚苯乙烯、苯乙烯-丙烯酸共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、苯乙烯-(甲基)丙烯酸缩水甘油酯共聚物、苯乙烯-苯乙烯磺酸盐共聚物、甲基丙烯酸聚合物、丙烯酸聚合物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯共聚物及聚乙酸乙烯酯丙烯酸酯等。作为乳胶，优选为至少包含苯乙烯来作为单体的共聚物，尤其优选为苯乙烯与丙烯酸或甲基丙烯酸的共聚物。乳胶的制作方法并无特别限定，能够通过任意的聚合方法来制作。其中，若抗体标记时存在表面活性剂，则抗体固定化变得困难，因此关于乳胶的制作，优选通过无乳化剂乳化聚合即不使用表面活性剂等乳化剂的乳化聚合来进行。
在通过聚合而获得的乳胶本身为荧光性的情况下，能够直接用作荧光乳胶粒子。在通过聚合而获得的乳胶为非荧光性的情况下，能够通过在乳胶中添加荧光物质(荧光色素等)来制作荧光乳胶粒子。即，荧光乳胶粒子能够通过在包含水及水溶性有机溶剂的乳胶粒子的溶液中添加荧光色素并进行搅拌等来制造。
还能够将含有荧光色素的脂质体、微胶囊等用作荧光粒子。关于荧光显色，只要吸收并激发紫外光等，并在恢复到基底状态时释放，则并无特别限制，例如，能够使用黄绿色(激发波长505nm/释放波长515nm，以下相同)、蓝色(350～356nm/415～440nm)、红色(535～580nm/575～605nm)、橙色(540nm/560nm)、红橙色(565nm/580nm)、深红色(625nm/645nm)、暗红色(660nm/680nm)等荧光显色。关于发出这些荧光的荧光粒子，例如，能够从ThermoFisher公司获得，在Thermo Fisher公司中以FluoSpheres(注册商标)的商品名称市售。
荧光粒子的平均粒径根据粒子的材质、定量测定对象物质的浓度范围、测定设备等而不同，但是优选为0.001～10μm(更优选为0.001～1μm)的范围。
(平均粒径的测定方法)
荧光粒子的平均粒径能够通过市售的粒度分布计等来测量。作为粒度分布的测定法，已知有光学显微镜法、共焦激光显微镜法、电子显微镜法、原子力显微镜法、静态光散射法、激光衍射法、动态光散射法、离心沉降法、电脉冲测量法、色谱法、超声衰减法等，市售与各自的原理对应的装置。
从粒径范围及测定的容易度考虑，在本发明中优选使用动态光散射法。作为使用了动态光散射的市售的测定装置，可举出Nanotrac UPA(NIKKISO CO.，LTD.)、动态光散射式粒度分布测定装置LB-550(HORIBA，Ltd.)、浓缩系统(concentrated-system)粒度分析仪FPAR-1000(OTSUKA ELECTRONICS Co.，LTD)、ZETA SIZER Nano series(纳米)(Malvern公司)等，在本发明中，作为在25℃的测定温度下测定出的中值粒径(d＝50)的值而求出。
(荧光粒子表面的第一结合物质)
用作第一结合物质的3种以上的结合物质优选吸附于每一个荧光乳胶粒子的表面而使用。在该方式中，所使用的荧光粒子中的1个荧光粒子具有上述3种结合物质。或者，还优选如下方式：分别制作吸附有上述3种以上的结合物质中的1种(例如，抗胆酸抗体)的荧光乳胶粒子、吸附有上述3种以上的结合物质中的另1种(例如，抗脱氧胆酸抗体)的荧光乳胶粒子、及吸附有上述3种以上的结合物质中的又1种(例如，抗鹅去氧胆酸抗体)的荧光乳胶粒子，并使用上述3种荧光乳胶粒子的混合物。
在本发明中，更优选将用作第一结合物质的3种以上的结合物质吸附于1个荧光粒子(每一个荧光粒子)的表面而使用的方式。测定对象物质为多种不同物质的集合体的情况下，优选使用具有各种不同物质所结合的所有结合物质的荧光粒子。作为本发明的一方式，在测定对象物质为胆汁酸的情况下，能够使用具有抗胆酸抗体、抗脱氧胆酸抗体及抗鹅去氧胆酸抗体的全部的荧光粒子。通过设为上述结构，所有荧光粒子能够与由存在于生物试样中的不同物质构成的所有测定对象物质进行相互作用。因此，优选将至少3种结合物质结合于每一个荧光粒子。
(利用第一结合物质进行的荧光粒子的修饰)
作为将第一结合物质固定于荧光粒子的方法，例如，记载于日本特开2000-206115号公报、Thermo Fisher公司FluoSpheres(注册商标)聚苯乙烯微球F8813中所附的协议等中，能够使用任何制备免疫凝集反应用试剂的公知的方法。并且，作为将作为结合物质的抗体固定于粒子的原理，还能够采用物理吸附及通过共价键进行的化学键合中的任一原理。作为覆盖在将抗体固定于粒子之后未被抗体所包覆的粒子表面的封闭剂，能够使用公知的物质、例如BSA、脱脂牛奶、酪蛋白、源自大豆的成分、源自鱼的成分或聚乙二醇等、以及包含上述物质或性质与上述物质相同的物质的市售的免疫反应用封闭剂等。根据需要，这些封闭剂还能够实施通过热、酸/碱等而进行的部分改性等预处理。
以下，例示将抗体固定于粒子的具体的方法。在以粒子的固体成分浓度成为0.1～10质量％的方式进行分散的液中，添加调整为0.01～20mg/mL的浓度的抗体溶液，并进行混合。在温度为4～50℃的条件下持续搅拌5分钟～48小时。接着，通过离心分离或其他方法来分离粒子和溶液，并充分地去除溶液中所包含的未与粒子结合的抗体。之后，反复进行0～10次通过缓冲液清洗粒子的操作。混合粒子和抗体，实施使抗体结合于粒子的操作之后，优选使用不参与抗原抗体反应的成分、优选为蛋白质、更优选为BSA、Block Ace(注册商标)、脱脂牛奶及酪蛋白等封闭剂，保护粒子表面的未结合有抗体的部分。
将抗原、抗体等固定于粒子时，能够根据需要添加稳定剂。所谓稳定剂，只要是蔗糖、多糖类等合成高分子或者天然高分子等、稳定抗原、抗体的稳定剂，则并无特别限制，还能够使用Immunoassay Stabilizer(Advanced Biotechnologies Inc(ABI公司))等的市售的稳定剂。
具有第一结合物质的荧光粒子包含于本发明的试剂盒中，且优选为包含于作为试剂盒的一部分的容器中、例如杯中的方式。在该情况下，将生物试样注入包含荧光粒子的容器中并进行混合、搅拌，由此能够使生物试样中的测定对象物质和第一结合物质结合。
(基板)
在本发明中，为了实现高灵敏度的测定，优选采用进行后述表面等离激元荧光(SPF)检测的测定法。作为该情况下的基板，优选使用在表面具有金属膜的基板。作为构成金属膜的金属，只要能够产生表面等离激元共振，则并无特别限定。可优选举出金、银、铜、铝或铂等自由电子金属，尤其优选金。在使用金的情况下，后述检测区域成为金膜表面。上述金属能够单独使用或组合使用。并且，考虑对上述基板的附着性，可以在基板与由金属形成的层之间设置由铬等形成的夹层。金属膜的膜厚是任意的，但是例如优选为1nm以上且500nm以下，尤其优选为10nm以上且200nm以下。若超过500nm，则无法充分地检测介质的表面等离激元现象。并且，在设置由铬等形成的夹层的情况下，该夹层的厚度优选为0.1nm以上且10nm以下。
金属膜的形成通过常规方法来进行即可，例如，能够通过溅射法、蒸镀法、离子镀敷法、电镀法、或者无电解镀敷法等来进行，但是为了设置基板材质和金属膜的混合层来提高金属膜的密合性，优选通过溅射法制作金属膜。在该情况下，基板材质和金属膜的混合层的厚度只要能够确保足够的密合性，则并无特别限制，但是优选为10nm以下。
金属膜优选配置于基板上。在此，所谓“配置于基板上”，除了包含金属膜配置成与基板上直接接触的情况，还包含金属膜配置成不与基板直接接触而隔着其他层的情况。作为本发明中能够使用的基板的材质，例如，能够使用作为一般光学玻璃的一种的BK7(硼硅酸盐玻璃)等光学玻璃、或者由合成树脂、具体而言聚甲基丙烯酸甲酯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚碳酸酯或环烯烃聚合物等相对于激光为透明的材料形成的玻璃。这种基板优选为相对于偏振光不显示各向异性且加工性优异的材料。
作为用于SPF检测的基板的优选方式，能够举出在聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)上蒸镀金膜而得的基板等。
基板具备检测区域，所述检测区域包含与测定对象物质或第一结合物质中的任一者具有结合性的第二结合物质。
(第二结合物质)
第二结合物质为与测定对象物质具有结合性的物质，或与第一结合物质具有结合性的物质。在通过夹心法(Sandwich assay)进行定量的情况下，作为第二结合物质，能够使用与测定对象物质具有结合性的物质。在通过竞争法进行定量的情况下，作为第二结合物质，能够使用与第一结合物质具有结合性的物质。在本发明中，优选通过竞争法进行定量，作为第二结合物质，优选使用与第一结合物质具有结合性的物质。
作为第二结合物质，并无特别限定，但是作为优选的例子，可举出抗原、抗体或它们的复合物，但是优选为抗原，作为第二结合物质，尤其优选使用测定对象物质(其为与第一结合物质具有结合性的物质)。
作为第二结合物质，在使用测定对象物质的情况下，第二结合物质优选为作为测定对象物质的至少3种不同结构的物质、或上述3种不同结构的物质与载体的结合体。所谓载体，是指能够与上述至少3种测定对象物质的多个分子结合的物质。在此，作为优选的第二结合物质，是包含相同种类的测定对象物质的多个分子与一分子的载体结合而成的至少3种结合体的方式。作为优选的载体的一例，可举出蛋白质等，其中，具体而言，能够举出牛血清白蛋白。
在测定对象物质为胆汁酸的情况下，第二结合物质优选包含胆酸和/或胆酸·白蛋白结合体、脱氧胆酸和/或脱氧胆酸·白蛋白结合体、以及鹅去氧胆酸和/或鹅去氧胆酸·白蛋白结合体。或者，在上述方式中，还优选设为如下方式：在胆酸中包含胆酸结合物的方式、由胆酸结合物取代胆酸的方式、在脱氧胆酸中包含脱氧胆酸结合物的方式、由脱氧胆酸结合物取代脱氧胆酸的方式、在鹅去氧胆酸中包含鹅去氧胆酸结合物的方式、或者由鹅去氧胆酸结合物取代鹅去氧胆酸的方式。尤其优选包含胆酸和/或胆酸·白蛋白结合体、脱氧胆酸和/或脱氧胆酸·白蛋白结合体、以及鹅去氧胆酸和/或鹅去氧胆酸·白蛋白结合体。
(将第二结合物质固定于基板的方法)
关于将第二结合物质固定于基板的方法，例如，记载于由Nunc公司所提供的TechNotes Vol.2-12等中，能够使用任何制备一般ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbentAssay：酶联免疫吸附法)试剂的公知的方法。并且，可以通过在基板上配置自组织单分子膜(SAM：Self-Assembled Monolayer(自组装单层膜))等而实施表面修饰，作为将第二结合物质固定于基板的方法，还能够采用利用了物理吸附的方法及利用了通过共价键进行的化学键合的方法中的任一方法。作为覆盖将第二结合物质固定于基板之后未被第二结合物质所包覆的基板表面的封闭剂，能够使用公知的物质、例如BSA、脱脂牛奶、酪蛋白、源自大豆的成分、源自鱼的成分或聚乙二醇等、以及包含上述物质或性质与上述物质相同的物质的市售的免疫反应用封闭剂等。根据需要，这些封闭剂还能够实施通过热、酸/碱等而进行的部分改性等预处理。
(检测区域＜测试区域＞)
本发明能够在基板上设置检测生物试样中有无测定对象物质的测试区域。在该测试区域中，例如能够通过捕获作为测定对象物质的抗原，检测与抗原结合的标记量并进行定量来定量抗原。或者，能够通过如下方法来定量抗原：仅使得与抗原结合的标记无法结合，只捕获未与抗原结合的标记，并算出与抗原结合的标记量。该检测方法称为竞争法，在此，对与竞争法相关的基板进行说明。
优选在基板的测试区域具有与存在于荧光粒子上的3种以上的所有结合物质(例如，抗体)进行反应的位置。作为本发明的优选的一方式，优选在基板的测试区域上具有存在于生物试样中的3种以上的抗原的方式。在该情况下，使抗原和BSA在缩合剂的存在下进行反应，而制作抗原·BSA结合体，将该结合体吸附于测试区域上，由此能够制作测试区域。因此，成为如下方式：与3种以上的抗原结合的BSA结合体在测试区域上共存于1个区域。在该情况下，优选在测试区域上将3种抗原·BSA结合体以随机混合的状态配置。抗原·BSA结合体能够通过如下方法来结合于基板上的测试区域：溶解于缓冲液，并点加到基板上，放置一定时间之后，吸出上清液，并进行干燥等。
(参考区域＜控制区域＞)
在本发明中，为了尽可能地抑制测定环境、尤其是测定温度的影响，在基板上具有控制区域，用控制区域的信息对测试区域的信息进行标准化，由此能够将环境依赖性抑制为非常低。作为控制区域，优选设计成不依赖于存在于所使用的生物试样中的测定对象物质的量，而能够与所有标记结合。优选具有与作为标记的荧光粒子上所存在的3种以上的所有抗体相互作用的抗体。通过如此设计，用控制区域的信息对测试区域的信息进行标准化，由此即使在例如低温环境下生物试样的流动、反应速度受到影响的情况下，也能够通过标准化消除该影响，并能够获得始终高精度且不受测定环境影响的结果。
作为存在于控制区域中的优选的抗体，若具有识别存在于荧光粒子上的3种以上的结合物质(例如，抗体)的功能，且该抗体源自小鼠，则优选为抗小鼠抗体，若荧光粒子上的抗体源自山羊，则优选为抗山羊抗体。这些控制区域上的抗体能够通过如下方法来结合于基板：溶解于缓冲液，并点加到基板上，放置一定时间之后，抽吸上清液，并进行干燥等。
(非特异性吸附防止物质)
本发明的试剂盒优选进一步利用与测定对象物质不具有特异性结合性的物质、或者结合物质修饰荧光粒子。例如，在竞争法中，存在除了对不包含测定对象物质且呈阴性的生物试样起反应以外，还对包含测定对象物质且呈阳性的生物试样起反应而呈阴性的生物试样，解决高值偏差的问题被认为是一种课题。虽然显示这种假阴性的原因尚不明确，但认为其原因之一应该是通过未被抗体覆盖的荧光粒子表面和检测区域(测试区域)的非特异性相互作用而存在原来不希望结合的荧光粒子。并且，即使在与存在于测试区域上的物质相同的物质存在于荧光粒子表面上的情况下，游离的抗体等存在于生物试样中时，该抗体与存在于测试区域上的物质和荧光粒子表面上的物质中的两者均结合，由此即使在测定包含测定对象物质且呈阳性的生物试样的情况下有时也检测为阴性。通常，为了抑制对固相表面(例如荧光粒子表面、基板的金膜表面)的非特异性吸附，使用利用BSA的封闭，但是在某种特定的生物试样中存在与BSA进行反应的抗BSA抗体的情况下，以在荧光粒子上的BSA与基板上的BSA之间进行交联的方式进行反应，从而有时会引起高值偏差。因此，作为优选的结合物质，优选使用与测定对象物质(例如，胆汁酸)不具有特异性结合性，且不与显示如上述那样的假阴性的原因物质结合的物质。作为结合物质，能够使用与胆汁酸不具有结合性的抗体、或者不用于测试区域的蛋白质(蛋白质A(Protein A)、蛋白质G(Protein G))等，但是其中优选为与胆汁酸不具有结合性的抗体。具体而言，能够使用由通过与胆汁酸不同的抗原被免疫的动物的血清制备的抗血清、从抗血清提纯的免疫球蛋白组分、通过使用通过该测定对象物质被免疫的动物的脾脏细胞进行的细胞融合而获得的单克隆抗体、或者它们的片段[例如，F(ab’)2、Fab、Fab’或Fv]等。关于这些抗体的制备能够通过常规方法来进行。而且，关于该抗体，可以是如嵌合抗体等的情况那样施加了修饰的抗体，并且即便是市售的抗体，也能够使用通过公知的方法由动物血清或培养上清液制备的抗体。在本发明中，作为结合物质，尤其优选使用抗CRP(C反应性蛋白)抗体的方式。
(抗体)
在本发明中，抗体能够与其动物种类、亚类等无关地使用。例如，在本发明中能够使用的抗体为源自小鼠、大鼠、仓鼠、山羊、兔子、绵羊、牛、鸡等能够引起免疫反应的生物的抗体，具体而言，为小鼠IgG、小鼠IgM、大鼠IgG、大鼠IgM、仓鼠IgG、仓鼠IgM、兔子IgG、兔子IgM、山羊IgG、山羊IgM、绵羊IgG、绵羊IgM、牛IgG、牛IgM、鸡IgY等，多克隆或单克隆均能够使用。片段化抗体为衍生自具有至少1个抗原结合位点的完整抗体的分子，具体而言为Fab、F(ab’)2等。这些片段化抗体为通过酶或化学处理、或者利用基因工程学方法而获得的分子。
(测定方法)
根据本发明，使生物试样及包含与测定对象物质具有结合性的第一结合物质的荧光粒子与具备包含与测定对象物质或者第一结合物质中的任一者具有结合性的第二结合物质的检测区域的基板接触，接着，测定由与检测区域上的第二结合物质结合的荧光粒子产生的荧光，由此能够定量生物试样中的测定对象物质。
关于本发明中的定量，只要是测定对象物质(例如，胆汁酸)的量的测定，则以最广泛的概念来解释。作为测定方法的具体实施方式，可举出竞争法及夹心法，但是优选竞争法。
作为竞争法的一例，以下对定量胆汁酸的情况进行说明。在定量除胆汁酸以外的物质的情况下，也能够以相同的方式实施。
在竞争法中，首先，使包含胆汁酸的生物试样及抗胆汁酸抗体标记荧光粒子与固定有胆汁酸/白蛋白比为7以上且14以下的胆汁酸·白蛋白结合体的胆汁酸免疫测定用基板接触。在该生物试样中不存在胆汁酸的情况下，通过抗胆汁酸抗体标记荧光粒子和基板上的胆汁酸(即，胆汁酸·白蛋白结合体中的胆汁酸)，在基板上引起抗原抗体反应。另一方面，在生物试样中存在胆汁酸的情况下，在生物试样中的胆汁酸与抗胆汁酸抗体标记荧光粒子之间引起抗原抗体反应，阻碍抗胆汁酸抗体标记荧光粒子与基板上的胆汁酸(即，胆汁酸·白蛋白结合体中的胆汁酸)之间的抗原抗体反应。在上述反应结束之后，去除未与上述基板上的白蛋白结合的抗胆汁酸抗体标记荧光粒子。接着，通过检测基板上的免疫复合物(即，抗胆汁酸抗体标记荧光粒子和基板上的胆汁酸·白蛋白结合体中的胆汁酸的复合物)的形成程度来作为荧光强度，能够测定生物试样中的胆汁酸的浓度等。
竞争法中的荧光的测定方式能够采用酶标仪测定或者流量测定中的任一测定，例如，能够通过以下方法来进行测定。预先，准备多个胆汁酸浓度不同且胆汁酸量是已知的试样，并预先混合该试样及抗胆汁酸抗体标记荧光粒子。使该混合液与固定有胆汁酸·白蛋白结合体的区域接触。在混合液与结合体以特定的时间间隔接触的期间，测定来自固定有胆汁酸·白蛋白结合体的区域的荧光信号来作为多个荧光信号。根据该多个荧光信号，在各胆汁酸浓度下，求出荧光量的时间变化(斜率)。将该时间变化绘制为Y轴，且将胆汁酸浓度绘制为X轴，使用最小二乘法等适当的拟合方法，获取胆汁酸浓度相对于荧光量的时间变化的关系式。根据如此获取的关系式，并利用使用了作为检查目标的生物试样的荧光量的时间变化的结果，能够定量生物试样中所包含的胆汁酸量。
该胆汁酸量的定量优选在短时间内进行。具体而言，优选在10分以内进行，更优选8分以内，进一步优选在6分以内进行。优选在该定量时间中包含如下时间，即利用使用最小二乘法等适当的拟合方法预先获取的荧光量的时间变化量和胆汁酸浓度的关系式，使试样及抗胆汁酸抗体标记荧光粒子与固定有胆汁酸·白蛋白结合体的检测区域接触之后，根据使用了作为检查目标的生物试样的荧光量的时间变化的结果，换算生物试样中所包含的胆汁酸量的时间。
在夹心法中，并无特别限定，但是例如能够通过以下顺序来测定测定对象物质。使有可能包含测定对象物质的生物试样和包含与测定对象物质具有结合性的第一结合物质的荧光粒子在基板上接触。在生物试样中存在测定对象物质的情况下，在测定对象物质、荧光粒子及基板之间产生结合反应(抗原抗体反应等)。其结果，在生物试样中存在测定对象物质的情况下，形成由与基板结合的第二结合物质、测定对象物质及具有第一结合物质的荧光粒子组成的免疫复合物。在夹心法中，在第二结合物质、测定对象物质及具有第一结合物质的荧光粒子的反应结束之后，去除未形成上述免疫复合物的、具有第一结合物质的荧光粒子，并进行清洗。接着，检测免疫复合物的形成程度来作为荧光强度，由此能够测定测定对象物质的浓度等。另外，荧光强度与测定对象物质的浓度具有、正相关关系。
(流路)
本发明的优选的方式中，能够将混合有可能包含测定对象物质的生物试样和具有第一结合物质的荧光粒子而得的混合液应用于基板上，并展开在流路上。所谓流路，只要是使生物试样和具有第一结合物质的荧光粒子流下至检测区域的通道，则并无特别限制。作为优选的流路的方式，存在点加包含具有第一结合物质的荧光粒子的生物试样液的点加口、作为检测区域的金属膜及超越金属膜的流路，且具有生物试样能够在金属膜上通过的结构。优选为，能够相对于金属膜，在与点加口相反的一侧设置抽吸口。
(表面等离激元荧光测定)
作为本发明中的荧光的检测方法，并无特别限定，但是例如优选使用能够检测荧光强度的设备、具体而言使用酶标仪或用于进行利用表面等离激元激发的荧光检测(SPF)的生物传感器等来检测荧光强度。另外，荧光的测定方式可以是酶标仪测定，也可以是流量测定。利用表面等离激元激发的荧光检测法(SPF法)较利用落射激发的荧光检测法(落射荧光法)，能够以高灵敏度进行测定。
作为表面等离激元荧光(SPF)生物传感器，例如能够使用如日本特开2008-249361号公报中记载那样的传感器，所述传感器具备：光波导，由透射规定波长的激发光的材料形成；金属膜，形成于该光波导的一表面上；光源，产生光束；光学系统，使上述光束通过光波导，并以产生表面等离激元的入射角射入于上述光波导与金属膜的界面；及荧光检测机构，检测通过由利用上述表面等离激元被增强的渐逝波激发而产生的荧光。
本发明的利用使用了荧光粒子的表面等离激元激发的荧光检测(SPF)系统优选为检测依赖于固定于基板上的金属膜上的测定对象物质的量的来自荧光物质的荧光的测定方法，且为与所谓的乳胶凝集法不同的方法，所述乳胶凝集法为例如检测光学透明度随着溶液中的反应的进行的变化来作为浊度的方法。在乳胶凝集法中，乳胶试剂中的抗体致敏乳胶和生物试样中的抗原通过抗体反应而结合，并进行凝集。该凝集块随着时间而增大，根据向该凝集块照射近红外光而获得的每单位时间的吸光度变化，定量抗原浓度的方式为乳胶凝集法。在本发明中，与乳胶凝集法相比，能够提供一种非常简单的测定对象物质的检测方法。
(试剂盒的其他要件)
本发明的试剂盒用于测定测定对象物质(例如，胆汁酸)的方法，在测定对象物质为胆汁酸的情况下，为胆汁酸测定诊断用试剂盒。在本发明中为包含传感器芯片的试剂盒，该传感器芯片包含实施胆汁酸等测定对象物质的测定时固定有胆汁酸·白蛋白结合体等第二结合物质的基板和保持荧光粒子的部件的传感器芯片，但也可以包含表面等离激元激发装置及荧光测定设备等用于测定对象物质的测定的各种设备或装置。而且，作为试剂盒要件，可以包括包含已知量的测定对象物质的试样、操作说明书等。
通过以下的实施例，对本发明进行进一步具体的说明，但是本发明不受实施例的限定。
实施例
(1)胆汁酸·牛血清白蛋白结合体的制备
(1-1)胆酸·牛血清白蛋白结合体的制备
向超级脱水二甲基甲酰胺(以下，标记为DMF。Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造)1.2mL中添加胆酸(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造)50mg、N-羟基琥珀酰亚胺(以下，标记为NHS。Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造)67mg及1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(以下，标记为EDC。Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造)110mg并进行混合，对胆酸进行了活性酯化。将该经活性酯化的胆酸滴加于溶解有作为白蛋白的1种的牛血清白蛋白(以下，标记为BSA。Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造)322mg的磷酸缓冲液(以下，标记为PBS。Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造)65mL的水溶液中并进行了反应。反应结束之后，使用乙腈(以下，标记为ACN。Wako PureChemical Industries，Ltd.制造)/水的比率为1/3的溶液1L并通过透析对反应溶液进行了提纯。最后进行冷冻干燥，获得了白色的固体。
[化学式2]
(1-2)脱氧胆酸-BSA结合体的制备
向超级脱水DMF1.2mL中添加脱氧胆酸(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造)50mg、NHS 67mg及EDC 110mg并进行混合，对脱氧胆酸进行了活性酯化。将该经活性酯化的脱氧胆酸滴加于溶解有BSA 322mg的PBS 65mL的水溶液中，并进行了反应。反应结束之后，使用ACN/水的比率为1/3的溶液1L并通过透析对反应溶液进行了提纯。最后进行冷冻干燥，获得了白色的固体。
(1-3)鹅去氧胆酸-BSA结合体的制备
向超级脱水DMF1.2mL中添加鹅去氧胆酸(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造)50mg、NHS 67mg及EDC 110mg并进行混合，对鹅去氧胆酸进行了活性酯化。将该经活性酯化的鹅去氧胆酸滴加于溶解有BSA 322mg的PBS 65mL的水溶液中，并进行了反应。在反应结束之后，使用ACN/水的比率为1/3的溶液1L并通过透析对反应溶液进行了提纯。最后进行冷冻干燥，获得了白色的固体。
(2)利用MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)的胆汁酸/BSA标记摩尔比(结合体的胆汁酸/白蛋白比)的测定
(测定步骤)
将在(1-1)至(1-3)中制备的结合体溶解于0.1质量％三氟乙酸(TFA):ACN的比率为2/1的溶液中，并调整为1mg/mL的浓度。混合该溶液1μL和基质(SA；芥子酸(Wako PureChemical Industries，Ltd.制造))4μL，并在金板上以1μL点加了4个点。在自然干燥之后，将金板插入MALDI-TOF-MS装置(Applied Bio Systems公司的产品Voyager)中，每个点累计900个镜头，并获取了成为质量信息的数据(N＝4)。使用该数据，采用与胆汁酸·BSA结合体对应的峰值的、峰值强度的最大值的50％强度处的分子量中心值来作为BSA结合体的峰值，并将从该峰值垂直下垂的位置视作胆汁酸·BSA结合体的分子量，取N＝4的平均值，以(胆汁酸·BSA结合体的分子量-天然(native)BSA的分子量)/胆汁酸的分子量(例如，在胆酸的情况下为408-18＝390)计算出胆汁酸相对于BSA的结合数。将所获得的结合体的胆汁酸/BSA比示于表1中。
[表1]
结合体 胆汁酸·BSA结合体 胆汁酸/BSA摩尔比
结合体-1 胆酸·BSA 13
结合体-2 脱氧胆酸·BSA 13
结合体-3 鹅去氧胆酸·BSA 13
(3)产生相对于胆酸的抗体、相对于脱氧胆酸的抗体、或相对于鹅去氧胆酸的抗体的杂交瘤的制作、以及抗体产生
(3-1)免疫原
使用了在上述制作的各2mg胆酸-BSA结合体、脱氧胆酸-BSA结合体及鹅去氧胆酸-BSA结合体来作为小鼠免疫致敏的免疫原。
(3-2)杂交瘤的制备
作为小鼠免疫致敏的免疫原，使用了胆酸-BSA结合体。
将第一次免疫设为100μg/只的量，将第2次以后的免疫设为50μg/只的量，在小鼠背部皮下施用胆酸-BSA结合体并进行了免疫。在免疫中，第一次施用与完全佐剂(FCA)混合而得的乳剂，在第2次～第4次的免疫中施用了与不完全佐剂(FIA)混合而得的乳剂。以2周间隔进行了4次免疫。另外，第3次、第4次免疫的第二周进行采血，使用采血清100μL并通过ELISA测定来进行了抗体效价的测定。确认抗体效价为目标值，将第4次免疫起2周后的免疫作为最终免疫，用磷酸缓冲液(PBS，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造，pH7.1～7.3)1mL稀释溶解作为抗原的结合体，以施用于小鼠的腹腔内的形式进行。施用3天后摘除了小鼠的脾脏。
以7:1的细胞数的比例混合从小鼠摘除的脾脏细胞和突变株骨髓瘤细胞(骨髓瘤：P3-X63-Ag8-U1)之后，添加聚乙二醇(PEG)，在离心分离后漂浮于培养基(RPMI-1640(罗斯威尔帕克纪念研究所培养基：Roswell Park Memorial Institute Medium)+10质量％胎牛血清(Fetal Bovine Serum：FBS))。将该漂浮的脾脏细胞接种到96孔板，以使细胞数量成为1.0×105(细胞/孔)。第二天，添加HAT培养基(次黄嘌呤·氨基蝶呤·胸苷培养基)，用抗体测定系统的ELISA对所增殖的杂交瘤的培养上清液进行了筛选。用PBS稀释作为测定用抗原的胆酸-BSA结合体以使成为500ng/mL，添加到ELISA的杯中并静置，将测定用抗原固定于杯的底部，并去除上清液。作为针对成为测定对象的脾脏细胞所产生的抗体的二次抗体，使用了抗小鼠IgG HRP标记抗体。IgG表示免疫球蛋白G，HRP表示辣根过氧化物酶。使用24孔板培养根据ELISA的结果呈阳性的孔，采集了各1mL的培养上清液。用相同的抗体测定系统的ELISA再次进行了二次筛选。在细胞融合时的同一个孔中，选择ELISA信号高的前6个孔而放入小瓶中。
使用包含10质量％的FBS的基础培养基RPMI1640，对每一个小瓶中的细胞进行有限稀释而制备了稀释物。用移液管向6个96孔板的每一个孔中添加了一滴稀释物。通过显微镜对每一个孔进行观察，确认到每一个孔中的细胞为单细胞。培养3周之后，以与上述相同的方式，通过抗体测定系统的ELISA对增殖的杂交瘤的培养上清液进行了筛选。选择ELISA信号高的前10个孔，结束了杂交瘤的制备。关于所获得的抗体的亚类的确定，使用了Isotyping kit(Roche公司制造)。
(3-3)利用小鼠腹水法的抗体的产生
进一步以相同的方式，对所选择的10个孔的细胞进行ELISA筛选，对于信号高的前1个孔的细胞，通过小鼠腹水法(使用2只小鼠)制作了抗体。将所获得的抗体称为抗胆酸抗体-1。
(3-4)针对月脱氧胆酸的抗体及针对鹅去氧胆酸的抗体的制备
针对脱氧胆酸的抗体及针对鹅去氧胆酸的抗体的制备也以与上述相同的方式进行。将所获得抗体分别称为抗脱氧胆酸抗体-1及抗鹅去氧胆酸抗体-1。
(3-5)抗体的亚类和抗体产生量
将在上述制备的抗体的亚类和抗体产生量示于表2中。
[表2]
亚类和产生抗体量
(4)抗小鼠抗体的制作
准备源自小鼠的球蛋白(LAMPIRE Biological Laboratories公司制造，目录编号7404302，小鼠γ—球蛋白盐析法(Mouse Gamma Globulin Salt Fractionation)，500mg)，通过第一次施用与完全佐剂(FCA)混合而得的乳剂，且在第2次～第4次的免疫中施用与不完全佐剂(FIA)混合而得的乳剂的方法，对于对山羊的免疫致敏(皮下免疫)以2周间隔进行了4次免疫。然后，进行ELISA测定并确认抗体效价的上升之后，进行全血采集，通过离心分离获得了抗血清。然后，通过ProteinA柱(Thermo scientific公司制造的Pierce ProteinAColumns，目录编号为20356)进行提纯，从而获取了目标抗小鼠抗体。
(5)抗CRP抗体的制作
准备市售的人CRP(KITAYAMA LABES CO.，LTD.制作)，通过第1次施用与完全佐剂(CFA)混合而得的乳剂，且在第2次～第4次的免疫中施用与不完全佐剂(IFA)混合而得的乳剂的方法，对于对小鼠的免疫致敏(皮下免疫)以2周间隔进行了4次免疫。然后，进行ELISA测定并确认抗体效价的上升之后，进行全血采集，通过离心分离获得了抗血清。然后，通过ProteinA柱(Thermo scientific公司制造的Pierce ProteinA Columns，目录编号为20356)进行提纯，从而获取了目标抗CRP抗体-1。
(6)用抗胆汁酸抗体标记的荧光粒子的制备
(6-1)吸附3种抗胆汁酸抗体的荧光粒子1的制备
以如下方式制备了用3种抗胆汁酸抗体标记的荧光粒子。
在2质量％(固体成分浓度)荧光乳胶粒子水溶液(Invitrogen公司制造，平均粒径200nm)357μL中，添加50mmol/L的MES(2-吗啉乙磺酸(2-Morpholinoethanesulfonicacid))缓冲液(pH6.0)282μL，并添加5mg/mL的抗胆酸抗体-1(在上述制作的)5.3μL、5mg/mL的抗脱氧胆酸抗体-1(在上述制作的)5.3μL、5mg/mL的抗鹅去氧胆酸抗体-1(在上述制作的)6.9μL及5mg/mL的抗CRP抗体-1(虚拟)(在上述制作的)75.5μL，在室温下搅拌了15分钟。然后，添加10mg/mL的EDC水溶液7.5μL，在室温下搅拌了1.5小时。添加2mol/L的甘氨酸(Glycine)(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造)水溶液37.5μL并搅拌15分钟之后，进行离心分离(15,000rpm，4℃，15分)，使荧光乳胶粒子沉淀，rpm表示每分钟转速(revolution per minute)，为1rpm＝1min-1。然后，去除上清液，添加PBS(pH7.4)750μL，通过超声波清洗机使荧光乳胶粒子再分散。再次进行离心分离(15,000rpm，4℃，15分)并去除上清液之后，添加包含1质量％BSA的PBS(pH7.4)750μL，使荧光乳胶粒子再分散，由此制备了结合有3种抗胆汁酸抗体和抗CRP抗体的荧光乳胶粒子的1质量％溶液。
(6-2)仅吸附有抗胆酸抗体的荧光粒子2的制备
在2质量％(固体成分浓度)荧光乳胶粒子水溶液(Invitrogen公司制造，平均粒径200nm)357μL中，添加50mmol/L的MES缓冲液(pH6.0)282μL，并添加5mg/mL的抗胆酸单克隆抗体-1(在上述制作的)201μL，在室温下搅拌了15分钟。然后，添加10mg/mL的EDC水溶液7.5μL，在室温下搅拌了1.5小时。添加2mol/L的甘氨酸(Glycine)(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.制造)水溶液37.5μL并搅拌15分钟之后，进行离心分离(15,000rpm，4℃，15分)，使荧光乳胶粒子沉淀。然后，去除上清液，添加PBS(pH7.4)750μL，通过超声波清洗机使荧光乳胶粒子再分散。再次进行离心分离(15,000rpm，4℃，15分)并去除上清液之后，添加包含1质量％BSA的PBS(pH7.4)750μL，使荧光乳胶粒子再分散，由此制备了结合有抗胆酸抗体1种的荧光乳胶粒子的1质量％溶液。
(6-3)仅吸附有抗脱氧胆酸抗体的荧光粒子3的制备
在2质量％(固体成分浓度)荧光乳胶粒子水溶液(Invitrogen公司制造，平均粒径200nm)357μL中，添加50mmol/L的MES缓冲液(pH6.0)282μL，并添加5mg/mL的抗脱氧胆酸单克隆抗体-1(在上述制作的)201μL，在室温下搅拌了15分钟。然后，添加10mg/mL的EDC水溶液7.5μL，在室温下搅拌了1.5小时。添加2mol/L的甘氨酸(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.制造)水溶液37.5μL并搅拌15分钟之后，进行离心分离(15,000rpm，4℃，15分)，使荧光乳胶粒子沉淀。然后，去除上清液，添加PBS(pH7.4)750μL，通过超声波清洗机使荧光乳胶粒子再分散。再次进行离心分离(15,000rpm，4℃，15分)并去除上清液之后，添加包含1质量％BSA的PBS(pH7.4)750μL，使荧光乳胶粒子再分散，由此制备了结合有抗脱氧胆酸抗体1种的荧光乳胶粒子的1质量％溶液。
(6-4)仅吸附有抗鹅去氧胆酸抗体的荧光粒子4的制备
在2质量％(固体成分浓度)荧光乳胶粒子水溶液(Invitrogen公司制造，平均粒径200nm)357μL中，添加50mmol/L的MES缓冲液(pH6.0)282μL，并添加5mg/mL的抗鹅去氧胆酸单克隆抗体(在上述制作的)201μL，在室温下搅拌了15分钟。然后，添加10mg/mL的EDC水溶液7.5μL，在室温下搅拌了1.5小时。添加2mol/L的甘氨酸(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.制造)水溶液37.5μL并搅拌15分钟之后，进行离心分离(15,000rpm，4℃，15分)，使荧光乳胶粒子沉淀。然后，去除上清液，添加PBS(pH7.4)750μL，通过超声波清洗机使荧光乳胶粒子再分散。再次进行离心分离(15,000rpm，4℃，15分)并去除上清液之后，添加包含1质量％BSA的PBS(pH7.4)750μL，使荧光乳胶粒子再分散，由此制备了结合有抗鹅去氧胆酸抗体1种的荧光乳胶粒子的1质量％溶液。
(7)基板的制作
准备了聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)的基板(MITSUBISHI RAYON CO.，LTD.制造，ACRYPET(注册商标)VH)。通过磁控溅射法，在检测区域和参考区域这两处，分别以单面宽度成为4mm，且长度成为3mm的方式制作厚度为45nm的金膜，并将其用作用于构成基板的芯片。在该芯片的检测区域的金膜表面上，点加以含有比率(以质量比计为1:1:1)包含结合体1、结合体2及结合体3的液(浓度：在50mmol/L的MES缓冲液(pH6、150mmol/L NaCl)中为50μg/mL)，并进行干燥，从而制作了多个固定有3种结合体的基板1。并且，在各基板的参考区域中，点加包含在(4)中制作的抗小鼠抗体的液(浓度：在50mmol/L的MES缓冲液(pH6、150mmol/L NaCl)中为50μg/mL)，并进行了干燥。
在将如此制备的3种多个基板用作传感器芯片的流路之前，使用预先制备的清洗用溶液(包含0.05质量％Tween20(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯，Wako PureChemical Industries，Ltd.制造)的PBS(pH7.4))300μL，反复清洗了3次。
(8)流路型传感器芯片的制作
以成为日本特开2010-190880号公报的第2实施方式的构成的方式，制作了流路型传感器芯片。将其示意图示于图1、图2。图1为传感器芯片1的示意图，图2为传感器芯片1的分解图。传感器芯片1由上部部件2、中间部件3及基板4构成。在上部部件2设置有第一容器5及第二容器6。另外，将第一容器5及第二容器6统称为容器组7。在基板4上形成有流路10，在流路10上形成有检测区域8及参考区域9。
(9)利用大型机器(现有的胆汁酸测定试剂)的测定
在免疫测定中，通过作为由本领域技术人员广泛使用的大型机器的日立自动分析装置7170，根据操作说明书，测定胆汁酸的量为已知的试样，获得了胆汁酸的测定值。
(10)使用了荧光粒子的胆汁酸的免疫测定
在包含在(6-1)中制备的吸附有3种胆汁酸抗体的荧光粒子1的杯中，预先经10分钟对在(9)中测定出的胆汁酸的量为已知的试样一边进行搅拌一边进行了混合。接着，分别点加在密封有在(7)中制作的基板1的流路型传感器芯片。点加之后，一边进行泵抽吸一边使混合液以10μL/分的速度流下，并与固定有胆汁酸·BSA结合体的金膜表面上接触之后持续1.5分钟而测定了荧光强度。求出在各基板中获得的检测区域和参考区域各自的荧光强度在单位时间内的增加速度来作为荧光信号值，并将检测区域的信号值除以参考区域的信号值，由此进行了标准化。并且，准备胆汁酸浓度为0的试样，并以相同的方式，进行荧光信号值的标准化，并由不包含胆汁酸的试样进行了信号值的标准化。
(11)校准曲线的制作
通过将对于在(10)中求出的胆汁酸的量为已知的试样进行标准化而得的荧光信号值和在(9)中求出的利用大型机器的测定值建立对应关联，对于使用了在(1-1)至(1-3)中制备的、胆汁酸·BSA结合体-1～3的基板，分别制作了校准曲线。
(12)胆汁酸的量为未知的试样的测定结果
从KITAYAMA LABES CO.，LTD.获得狗的血清1～4，并以如表3所示的荧光粒子和基板的组合分别进行实验，使用在(11)中制作的校准曲线获得了胆汁酸的测定值。并且，关于上述血清1～4，使用大型机器求出了胆汁酸的测定值。
以大型机器的测定值为基准，通过以下的计算公式计算测定值从该值偏离了多少，并将结果汇总于表3中。
与大型机器的偏差幅度％的计算公式
[数式1]
[表3]
根据表3的结果可知，在荧光粒子为3种不同的抗体混合而存在的荧光粒子的情况下，能够准确地测定作为测定对象物质的胆汁酸，并确认到本发明的效果。
符号说明
1-传感器芯片，2-上部部件，3-中间部件，4-基板，5-第一容器，6-第二容器，7-容器组，8-检测区域，9-参考区域，10-流路。

Claims (7)

1.一种用于定量生物试样中的测定对象物质的试剂盒，其包含：
荧光粒子，该荧光粒子具有与测定对象物质具有结合性的第一结合物质；及
基板，该基板具备检测区域，所述检测区域具有第二结合物质，该第二结合物质与所述测定对象物质或者所述第一结合物质中的任一者具有结合性，
所述用于定量测定对象物质的试剂盒中，
所述测定对象物质包含至少3种结构不同的物质，
所述第一结合物质包含与所述至少3种结构不同的物质分别具有结合性的至少3种结合物质。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，
所述荧光粒子的每一个荧光粒子具有所述至少3种结合物质。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中，
所述第二结合物质为所述至少3种结构不同的物质或者所述3种结构不同的物质与载体的结合体。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的试剂盒，其中，
所述第一结合物质包含胆酸抗体、脱氧胆酸抗体及鹅去氧胆酸抗体。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的试剂盒，其中，
所述第二结合物质包含胆酸和/或胆酸·白蛋白结合体、脱氧胆酸和/或脱氧胆酸·白蛋白结合体、以及鹅去氧胆酸和/或鹅去氧胆酸·白蛋白结合体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的试剂盒，其中，
所述荧光粒子为荧光乳胶粒子。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的试剂盒，其中，
所述检测区域为金膜表面。
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