CN1309771A - 抗原的检测方法以及生物传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种表面胞质团共振用传感器芯片,它具有:金属薄膜;相对于具有甾体骨架的物质,甾体类激素,性激素以及环境激素(但,三嗪类化合物除外)的抗体;用于将所述抗体固定在所述金属薄膜上的固定层。还提供一种环境激素的检测方法,包括下述步骤:将所述胞质团共振用传感器芯片的抗体暴露在试样中;用光照射所述金属薄膜;检测由所述金属薄膜发出的反射光强度。该检测方法灵敏度高,而且选择性优良。
Description
发明所属技术领域
本发明涉及抗原的检测方法以及生物传感器,特别是利用表面胞质团(plasmon)共振的抗原检测方法以及生物传感器。
背景技术
环境激素是指对生物的内分泌功能有不良影响的化学物质,释放到环境中的化学物质如果进入生物体内,产生激素样作用,扰乱了原有激素(例如甲状腺激素或卵泡激素)的作用,就会给健康的生物及其子孙的生殖功能或免疫功能等带来不良影响。“环境激素”有时也称作内分泌扰乱化学物质、内分泌障碍性化学物质(Endocrine-Disrupting Chemical Endocrine Disruptors)、激素样化学物质。
根据环境厅“关于外因性内分泌扰乱化学物质问题的研究班中间报告”(1997),环境激素可以分为(a)工业化学物质(合成洗剂、涂料、化妆品、塑料可塑剂等)、(b)二噁英类、(c)农药(除草剂、抗真菌基、杀虫剂等)、(d)药品(合成激素)、(e)天然物质。
工业化学物质例如壬基苯酚、辛基苯酚等烷基苯酚类,双酚A等一部分双酚,邻苯二甲酸丁基苯甲酯、邻苯二甲酸二丁基酯等邻苯二甲酸衍生物。农药例如DDT(DDD、DDE)、硫丹、甲氧氯、七氯、毒杀芬、迪厄耳丁、林丹等。药品例如二乙基己烯雌酚(DES,diethylstilbestrol)、乙炔雌二醇(口服避孕药)等。天然物质例如大豆,特别是大豆中含有的植物性雌激素——金雀异黄素。
环境激素的分类如表1所示。表1
(引用环境厅“关于外因性内分泌扰乱化学物质问题的研究班中间报告书”(1997))
物质分类 | 例 | 用途 | 已报道的作用 |
<天然物质> | |||
植物雌激素 | 异黄酮类木质素coumestans | 存在于植物体内 | 拟雌激素作用抗雌激素作用 |
女性激素 | 17β-雌二醇雌酮 | 在包括人在内的动物体中自然生成 | 拟雌激素作用 |
<人工物质> | |||
聚氯化有机化合物 | 二噁英类 | 焚烧、化学工业过程中不希望产生的副产物 | 抗雌激素作用 |
PCB类 | 已中止制造、使用但有时还使用含PCB的设施(主要是电学) | ||
有机氯类农药 | DDT迪厄耳丁林丹(γ-BHC) | 杀虫剂(有的已禁止使用或中止制造) | 拟雌激素作用抗雌激素作用 |
有机锡 | 三丁基锡 | 防污剂 | |
烷基苯酚 | 壬基苯酚 | 用于制备壬基苯酚乙氧化物和聚合物 | 拟雌激素作用 |
烷基苯酚乙氧化物 | 壬基苯酚乙氧化物 | 表面活性剂 | 拟雌激素作用 |
邻苯二甲酸酯类 | 二丁基邻苯二甲酸酯(DBT)丁基苯甲基邻苯二甲酸酯(BBP) | 塑料可塑剂 | 拟雌激素作用 |
双酚化合物 | 双酚A | 聚碳酸酯与环氧树脂的成分 | 拟雌激素作用 |
合成类固醇 | 乙炔雌二醇 | 避孕药 | 拟雌激素作用 |
环境激素主要是通过食物摄入到生物体内。环境激素大多脂溶性高,难以分解,容易通过食物链蓄积在生物体内,特别是高度蓄积在处于食物链上位的鸟类和海生哺乳动物中。如果环境激素蓄积在生物体内,就会破坏激素的平衡,导致发育、生育、免疫功能的异常或诱发乳腺癌、精巢癌等癌症,引起精子数减少。例如,已有三丁基锡引起海产蜗牛变异、在佛罗里达由于DDT引起鳄鱼数减少的报道。
近年来,最受瞩目的环境激素是二噁英类。二噁英在人类创造出的物质中毒性最高,具有致癌性。由于二噁英的毒性这么高,因而其允许的摄取量很小。
例如,日本卫生部于1996年6月提出二噁英的1日耐受摄取量为10pg-TEQkg-1day-1。对此,日本环境厅于1996年12月将健康危险评价规定值设定为5pg-TEQKg-1day-1。现将各国规定的二噁英类的允许摄取量归纳于表2。表2(1997年5月至今)
(引用:环境厅二噁英评价研究会主编,“二噁英的危险评价”,中央法规,1997)
国名·机构(设定时期) | 允许摄取量(pg/kg/day) | 备注 |
德国(1985) | 1~10 | (预防水平~紧急处理水平) |
瑞典(1985) | 0~5 | (每周0~35) |
丹麦(1988) | 0~5 | (每周0~35) |
WHO欧洲事务局(1990) | 10 | |
加拿大(1990) | 10 | |
荷兰(1991) | 10 | |
英国(1992) | 10 | |
美国(1994) | 0.01等 | (EPA等正在提案中) |
荷兰(1996) | 1 | (国家保健审议会汇报) |
卫生部(1996) | 10 |
由于二噁英类的允许摄取量极低,测定这种极微量的二噁英类很困难。另外,二噁英类有多种异构体,使其分析变得更难。而且,含有二噁英类的试样中大多同时存在与二噁英类结构类似的二苯并呋喃类、PCB等,也需要与这些物质分离。
以前,在二噁英类的测定中气相色谱-质量分析(GC-MS)法是最可信的方法。但是,GC-MS需要非常复杂的预处理,例如预处理需要2~3周。
图12表示排水试样的预处理流程图。将排水试样适量用玻璃纤维滤纸(孔径1μm)过滤,分成滤液和固体成分。对于1L滤液用二氯甲烷100ml萃取2次。固体成分用丙酮脱水后,用甲苯进行索氏(Soxhlet)萃取16小时以上。
将各种萃取液混合后,添加内标准13C-2,3,7,8-TCDD、13C-2,3,7,8-TCDF、13C-2,3,7,8-OCDD、13C-2,3,7,8-OCDF,用浓缩器浓缩至5ml,再通入氮气,尽可能蒸馏除去甲苯,然后用硫酸处理试样。另外,内标准的添加优选含有所述4种异构体以外的氯取代体,在17种异构体的适当范围内尽可能使用,进行回收补正。这样预处理后,通过常规的GC-MS测定二噁英。
如上所述,采用GC-MS需要非常复杂的预处理,预处理需要花费时间。另外,在预处理阶段为了使操作人员不暴露在环境激素中,需要高度安全的措施。
因此,需要一种可以代替GC-MS,简单而且安全的二噁英类等环境激素的检测方法。
另外,有些公知的物质可能还不知道是环境激素。另外,在合成出新型物质时,有时该新型物质可能是环境激素。
但是,考察某种物质在生物体内是否发挥与激素相同或类似的作用,扰乱内分泌并不容易。
因此,需要简易筛选尚未确认是环境激素的物质究竟是不是环境激素。也就是说,简易筛选某种物质是环境激素的可能性,之后考察筛选出的环境激素候选物质在生物体内是否扰乱内分泌。
另外,1998年6月3日~6月5日在德国柏林Inter-ContinentalHotel召开的“The Fifth World Congress on Biosensors”的要点集记载了使用固定有莠去津(atrazine)的传感器芯片,通过表面胞质团共振检测莠去津的方法。但是,在该文献中,对于莠去津以外的环境激素的抗体并没有记载。
1998年7月17日的Satoshi Sasaki,Ryohei Nagata,Bertold Hock,Isao Karube,Analytica Chimica Acta 368(1998)71-76中记载使用固定有莠去津抗体的传感器芯片,通过表面胞质团共振检测莠去津。但是,在该文献中,对于莠去津以外的环境激素的抗体并没有记载。
发明概述
本发明利用表面胞质团共振可以高灵敏度地检测出抗原。例如,有时灵敏度可以达到约0.1ppb。另外,可以定性、定量的检测出抗原。而且,与以前的GC-MS法相比操作简单。另外,由于本发明中使用抗原抗体反应,因此选择性优良。
抗原为环境激素的场合,可以检测出环境激素。另一方面,抗原为具有甾体骨架的物质,维持、促进或抑制甾体类激素生理作用的物质,或维持、促进或抑制性激素生理作用的物质时,对环境激素的筛选是有用的。
抗原是甾体类激素、性激素等的场合,作为医疗用传感器也是有用的。例如可以应用于甾体类激素、性激素分泌异常的检查(例如:不孕检查)、妊娠检查、更年期障碍检查、运动员选手等的兴奋剂检测等。
本发明一方面提供一种表面胞质团共振用传感器芯片,它具有金属薄膜;选自具有甾体骨架的物质,维持、促进或抑制甾体类激素生理作用的物质,维持、促进或抑制性激素生理作用的物质以及环境激素(但,三嗪类化合物除外)的1种以上抗原的1种以上抗体;以及用于将所述抗体固定在所述金属薄膜上的固定层。
在本发明中,优选所述抗体为甾体类激素或与甾体类激素具有相同生理作用的物质的抗体。或者,优选所述抗体为性激素或与性激素具有相同生理作用的物质的抗体。
更优选所述抗体为雌激素的抗体。或者,优选所述抗体为具有环状烃部分的环境激素的抗体,更优选所述抗体为二噁英类的抗体。
另外,优选所述抗体通过共价键固定在所述固定层上。所述固定层优选含有1层以上的有机薄膜层。
所述有机薄膜层优选具有被覆金属薄膜的连接层。或者优选所述有机薄膜层具有水凝胶层。或者优选所述有机薄膜层具有抗生蛋白链菌素(streptavidin)层。或者优选所述有机薄膜层具有疏水层。所述疏水层优选含有与金属薄膜结合的硅原子。
所述金属薄膜优选具有被入射光照射的照射面以及所述照射面的反面——-检测面,所述固定层被覆在所述金属薄膜的所述检测面上。所述金属薄膜的所述照射面优选覆盖有可以透过照射光的基板。优选具有2种以上所述抗原的2种以上所述抗体。
本发明另一方面提供一种抗原的检测方法,包括下述步骤:将具有金属薄膜,选自具有甾体骨架的物质,维持、促进或抑制甾体类激素生理作用的物质,维持、促进或抑制性激素生理作用的物质以及环境激素(但,三嗪类化合物除外)的1种以上抗原的1种以上抗体以及用于将所述抗体固定在所述金属薄膜上的固定层的表面胞质团共振用传感器芯片的所述抗体暴露在试样中;用光照射所述金属薄膜;检测由所述金属薄膜发出的反射光强度。
优选所述抗体为相对于甾体类激素或与甾体类激素具有相同生理作用的物质的抗体。或者,优选所述抗体为相对于性激素或与性激素具有相同生理作用的物质的抗体。优选所述抗体为雌激素的抗体。
或者,优选所述抗体为具有环状烃部分的环境激素的抗体。优选所述抗体为二噁英类的抗体。
所述表面胞质团共振用传感器芯片优选具有2种以上抗原的2种以上抗体,可以检测出2种以上的抗原。
本发明的另一方面提供表面胞质团共振装置,它包括:表面胞质团共振用传感器芯片,具有金属薄膜,选自相对于具有甾体骨架的物质,维持、促进或抑制甾体类激素生理作用的物质,维持、促进或抑制性激素生理作用的物质以及环境激素(但,三嗪类化合物除外)的1种以上抗原的1种以上抗体以及用于将所述抗体固定在所述金属薄膜上的固定层;
光学系统,具有用于照射所述表面胞质团共振用传感器芯片的光源、用于检测由所述表面胞质团共振用传感器芯片发出的反射光的检测器、至少可以透过照射光的棱镜;
流路系统,用于使试样与所述表面胞质团共振用传感器芯片的所述抗体接触。
本发明中,所述流路系统具有流动池,优选将所述表面胞质团共振用传感器芯片安装在所述流动池的相对应的位置。
图面说明
图1A是本发明的环境激素测定方法的概略图。
图1B是本发明的环境激素测定方法的概略图。
图2A是表示照射光的入射角,也就是反射光的反射角与反射光强度之间关系的图。
图2B是表示时间与共振信号之间关系的图。
图3是本发明表面胞质团共振用传感器芯片的一种实施方式的剖面示意图。
图4是本发明表面胞质团共振用传感器芯片的其它实施方式的剖面示意图。
图5A是SPR装置以及本发明表面胞质团共振用传感器芯片分解后的剖面图。
图5B是SPR装置以及本发明表面胞质团共振用传感器芯片的剖面示意图。
图6A是SPR装置中流路系统的示意图。
图6B是SPR装置中流路系统的放大剖面图。
图7是SPR装置中流路系统的放大示意图。
图8A、图8B和图8C是竞合法的示意图。
图9表示竞合法中二噁英浓度与应答值(RU)之间的关系。
图10表示抗二噁英单克隆抗体固定后的时间与应答值之间的关系。
图11表示抗雌激素单克隆抗体固定后的时间与应答值之间的关系。
图12表示以前排水试样的预处理流程图。
图13表示偶合方法。
图14表示偶合方法。
发明的优选实施方式
本发明涉及利用表面胞质团共振(SPR)的生物传感器以及抗原的检测方法。表面胞质团共振是指用光照射金属表面时,光传播到与照射表面相反的表面上的现象。确定表面胞质团共振发生的条件是唯一的。
本发明中可以优选使用瑞典Pharmacia Biosensor公司(现Biacore公司)制造的被称为BIACORE(注册商标)的SPR装置。在日本这种装置可以由Biacore株式会社(169-0073东京都新宿区百人町3-25-1)购得。
利用表面胞质团共振的生物传感器以及BIACORE(注册商标)的测定原理以及测定方法记载于桥本节子,“利用表面胞质团共振现象的生物体分子相互作用的解析”,分析1997(5)362~368;永田和宏、半田宏编“生物体物质相互作用的实时解析试验方法——以BIACORE为中心”,Schpringer Fairlark东京株式会社,1998年;河田聪(1989)“表面胞质团传感器”O plus E,112,133-139。在本说明书中引用这些记载。
参照图1A,首先说明表面胞质团共振的原理。在图1A中,传感器芯片10包括金属薄膜,传感器芯片10的另一表面固定有规定抗原的抗体19。抗体19暴露在可以含有规定抗原29的试样所流过的流路22中。试样是流体,典型的是液体。
图3是传感器芯片10的剖面示意图。图3中,传感器芯片10包括金属薄膜14,金属薄膜14具有入射光照射的照射面14s以及照射面14s的反面——检测面14t。换言之,金属薄膜14具有固定抗体19一侧的检测面14t以及其反面——照射面14s。
图1A中,传感器芯片10的表面10s侧安装有棱镜34。光源32通过棱镜34将光照射到传感器芯片10的金属薄膜14的照射面14s上。光优选为偏振光,波长优选为300~2000nm。另一方面,检测器36监测由传感器芯片10的金属薄膜14的照射面14s反射并通过棱镜34的反射光强度。照射光的入射角与反射光的反射角当然相同。金属薄膜通常反射入射光的9成以上,残余的透过金属薄膜。
图2A表示照射光的入射角,也就是反射光的反射角与反射光强度之间的关系。更换入射角用光照射时,如曲线40的“光谷”42所示,存在反射光强度衰减的角度。这个角度称作反射光的消失角度或SPR角度。在该消失角度,在金属薄膜14的检测面14t上发生所谓表面胞质团共振的量子力学现象。更确切的说是产生仅由金属薄膜14的检测面14t传播的波(这种波称作衰逝波),诱发金属薄膜的自由电子的表面胞质团。照射光的能量一部分转换成表面胞质团共振的能量,随之反射光的强度衰减。
该消失角度根据金属薄膜14的检测面14t,即固定有抗体19一侧的金属薄膜14的表面14t的状态,例如规定抗原29是否与抗体19结合而变化。因此,本发明方法的一种实施方式是测定该消失角度的移动。
如图1A所示,如果含有规定抗原29的试样在流路22中流动,如图1B所示,规定抗原29就会与传感器芯片10表面的抗体19结合。
本发明方法的一种实施方式如图2A所示是测定消失角度的变化。本发明方法的其它实施方式如图2B所示是测定在某一角度,典型的是消失角度,共振信号的经时变化。
在图2A中,曲线40表示规定抗原29与抗体19没有结合的状态下入射光的入射角与反射光强度之间的关系。另一方面,曲线44表示在规定抗原29与抗体结合的状态下入射光的入射角与反射光强度之间的关系。通过规定抗原29与抗体19结合,“光谷”42向“光谷”46移动。也就是说,通过规定抗原29与抗体19结合,消失角度发生移动。而且,消失角度的移动度与抗体19所结合的规定抗原29的量,即试样中规定抗原的量有关。
作为表示“光谷”移动度的单位,SPR角发生0.1度的变化定义为1000共振单位(RU)。使用放射性同位素标识的蛋白质,通过观察SPR信号和传感器芯片表面的蛋白质浓度之间的关系,确认1000RU相当于传感器芯片表面的蛋白质约1ng/mm2的质量变化。这个值不论蛋白质的种类几乎都是一定的。实际测定中,可以观察到约10RU(约10pg/mm2)以上的变化。
图2B表示时间与“光谷”42,即处于该消失角度时反射光强度之间的关系。换言之,表示处于消失角度42时反射光强度的经时变化。随着规定抗原29与抗体19结合,消失角度发生变化,不再引起表面胞质团共振。可以实时监测传感器芯片10的表面上抗体19与规定抗原29的相互作用。
图3表示本发明表面胞质团共振用传感器芯片的一种实施方式。美国专利第5242828号中记载了生物传感器用检测表面。该生物传感器用检测表面可以适用于本发明的表面胞质团共振用传感器芯片。本说明书引用美国专利第5242828号公开的所有内容。
传感器芯片10优选具有光可以透过的基板12。典型的基板12可以使用玻璃。基板也可以使用光纤维材料。例如可以使用0.2~0.8mm厚的载玻片。
传感器芯片10具有金属薄膜14。这是由于表面胞质团共振是通过在规定条件下用光照射金属薄膜14的照射面14s,在金属薄膜14的检测面14t上发生的。制造传感器芯片10时,例如通过蒸镀、飞溅、化学沉积等在玻璃基板12上形成金属薄膜14。蒸镀的场合可以是物理蒸镀,也可以是化学蒸镀。
金属薄膜14可以具有1层结构,也可以具有2层结构等的多层结构。图3中,金属薄膜14具有1层结构。
金属薄膜14的厚度优选10nm~100nm,更优选20nm~80nm,最优选20~60nm。比100nm厚时,难以引起表面胞质团共振。另一方面,比10nm薄时,难以形成均一的厚度。为了提高SPR信号的再现性,优选金属薄膜14的厚度是均一的。
金属薄膜14优选由金、银、铜、铝、铂、铱等构成,更优选由金、银、铂等贵金属构成,特别是照射面14s优选由贵金属构成。这是由于贵金属呈化学惰性,而且SPR信号的发生效率良好。贵金属中从化学稳定性、SPR信号的发生效率好等观点来看,优选金。
不过,金属薄膜14也可以由80重量%以上(优选90重量%以上)的贵金属以及20重量%以下(优选10重量%以下)的其它金属构成。其它金属例如铝等典型金属、铬等过渡金属。
传感器芯片10具有用于将抗体19固定在金属薄膜14上的固定层16。固定层16在金属薄膜14的检测面14t上形成。这是由于抗体19难以直接固定在金属薄膜14上。
固定层16可以具有2层结构等多层结构,也可以具有1层结构。图3中,固定层16具有连接层17和固定本体18两层结构。连接层17优选被覆在金属薄膜14的检测面14t上,如所述美国专利第5242828号记载的那样,优选可以防止金属薄膜14的检测面14s被腐蚀。
另一方面,固定本体18是稳定固定抗体19的物质。优选抗体19通过共价键固定在固定本体18上。另外,固定本体18优选通过共价键与连接层17结合。
作为连接层17,例如美国专利第5242828号记载的那样,是X-R-Y表示的一层有机分子,X为二硫化物、硫化物、硒化物、硫醇、腈、异腈等。
R是碳原子数为12~30的烃基,也可以被氧原子等杂原子隔断,例如亚烷基。
Y是羟基、羧基、氨基、醛基、酰肼基、羰基、环氧基、乙烯基等用来与抗体19结合的活性基团。
X-R-Y例如可以使用16-巯基十六烷醇。
固定本体18如美国专利5436161号记载的那样可以使用水凝胶。本说明书引用美国专利第5436161号公开的内容。水凝胶可以使用多糖类、有机高分子。多糖类包括琼脂糖、葡聚糖或其羧甲基化衍生物。有机高分子例如聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚乙二醇等。
水凝胶优选葡聚糖或羧甲基葡聚糖等它的衍生物,特别优选不具有交联结构的单链葡聚糖或羧甲基葡聚糖等它的衍生物。由于使用葡聚糖或其衍生物,具有下述优点。
①可以采用广泛使用的化学反应将抗体19通过共价键固定。
②可以增大抗体19的结合容量。
③可以通过适于抗体19与规定的抗原29之间相互作用的弹性、亲水性的基质环境。
④可以将传感器芯片表面的非特异性结合抑制到很低。
为了容易观察SPR信号,固定本体18的厚度优选为金属薄膜15的厚度的1倍~3倍。固定本体18的厚度优选50~200nm,更优选60~150nm。固定本体的厚度由于SPR的再现性优选是均一的。
图4表示本发明薄膜胞质团共振传感器芯片的另一实施方式。相同的要素具有相同的编号,在此省略说明。图4的传感器芯片中,金属薄膜14具有2层结构。在基板12上形成铬等过渡金属薄膜15a,在该过渡金属薄膜15a上形成贵金属薄膜15b。过渡金属薄膜15a优选比贵金属薄膜15b薄,优选过渡金属薄膜15a的厚度为金属薄膜14厚度的30%,更优选20%以下。
图14中固定层16不具有2层结构,而是具有1层结构。在一种实施方式中,可以使用具有γ-氨基丙基乙氧基甲硅烷、(NH2CH2CH2CH2)(CH3CH2O)SiH2等官能团的有机硅化合物,通过硅原子稳定地结合在金属薄膜14上。另外,使有机硅化合物的氨基与醛反应,然后引入抗体19,可以在固定层16与抗体19之间形成共价键。
所述固定层以及所述抗体优选具有式Si-L-Z-A所示的部分(式中,L为碳原子数为1~18的烃基,也可以被氧原子等杂原子隔断;A为所述抗体,Z为所述隔断层的活性基团与所述抗体偶合形成的键)
L优选式-(CH2)n-所示基团(式中n为1~18的整数,优选2~10)。
Z例如硫醇键(-SS-)、酰胺键(-C(=O)NH-)、抗生蛋白链菌素(streptavidin)·生物素键、式-C(=O)-N(H)N=C-所示的键。
在图4的另一实施方式中,固定层16也可以是巯基烷基。这样可以形成疏水性非常高的表面,另外可以在传感器表面再现近似生物膜的状态。例如通过形成一层厚的所述连接层,可以形成具有一层结构的固定层16。
固定层也可以具有3层结构。例如可以使抗生蛋白链菌素(streptavidin)通过胺偶合结合在图3记载的表面胞质团共振用传感器芯片的固定本体18上,形成抗生蛋白链菌素层。例如也可以将固定层按连接层17、水凝胶层以及抗生蛋白链菌素层的顺序层叠形成。
抗生蛋白链菌素是分子量为60000的具有四级结构的蛋白质。抗生蛋白链菌素-生物素结合的解离常数为1015M,因此抗生蛋白链菌素可以非常稳定地固定生物素化的抗体。
而且,采用图13以及图14所示公知的偶合方法,可以在固定层中形成各种层,设计多层结构。
本发明的传感器芯片中,规定抗体19固定在固定层16上。首先对规定抗原进行说明,然后再对其抗体19进行说明。
本发明中,具有甾体骨架的物质;维持、促进或抑制甾体激素生理作用的物质;维持、促进或抑制性激素生理作用的物质;或环境激素(但,三嗪类化合物除外)成为抗原。维持、促进或抑制甾体激素生理作用的物质,特别是维持甾体激素生理作用的物质,典型的例子为甾体激素。同样,维持、促进或抑制性激素生理作用的物质,特别是维持性激素生理作用的物质,典型的例子为性激素。
某种物质是具有甾体骨架的物质,有时它即是甾体激素同时也是性激素。例如雌二醇-17β是具有甾体骨架的物质,它是甾体激素同时也是性激素。另外,有时某种物质是维持、促进或抑制甾体激素生理作用的物质,是维持、促进或抑制性激素生理作用的物质,同时也是环境激素(但,三嗪类化合物除外)。本发明的目的在于检测出属于所述任意一种的物质。
例如,雌二醇-17β的抗体固定在传感器芯片上时,通过表面胞质团共振,可以检测出试样中雌二醇-17β。另外,即使是雌二醇-17β以外的物质,有时也会与雌二醇-17β抗体结合。而且,通过胞质团共振,可以检测出某种物质是否与雌二醇-17β的抗体结合。
这里,与传感器芯片上雌二醇-17β的抗体结合的物质在生物体内也有与雌二醇-17β受体结合,扰乱内分泌的可能。也就是说,这种物质可能具有与雌二醇-17β类似的生理作用,可能属于环境激素。因此,通过检测某种物质是否与雌二醇-17β的抗体结合,可以筛选该物质是否是环境激素。
筛选环境激素的原理不仅仅适用于具有与雌二醇-17β类似的生理作用的物质,同样也适用于与其它甾体激素、性激素具有类似生理作用的物质。
而且,某种物质与二噁英类的抗体结合则该物质在生物体内可能具有与二噁英类类似的生理作用。
考虑到这些情况,筛选的原理同样可以适用于具有甾体骨架的物质;维持、促进或抑制甾体激素生理作用的物质;以及维持、促进或抑制性激素生理作用的物质。以下更详细的说明抗原。
甾体是具有甾体骨架,即环戊烷并全氢菲碳骨架的一类化合物的总称。甾体骨架的结构如下所示。
甾体中包括甾醇、胆汁酸、性激素、肾上腺皮质激素等。另外,性激素大多为甾体化合物,但也包括雌性激素等非甾体激素。
C18甾体化合物例如雌激素。C19甾体化合物例如雄激素。C21甾体化合物例如促孕激素、肾上腺皮质激素。C24甾体化合物例如胆汁酸。
肾上腺皮质激素大致分为糖皮质激素和盐皮质激素。糖皮质激素包括氢化可的松、可的松、皮质酮等。盐皮质激素包括醛固酮、11-去氧皮质酮、11-去氧氢化可的松。
哺乳类等高等脊椎动物的胆汁酸大多为胆烷酸的羟基衍生物,人的胆汁中含有胆酸、去氧胆酸、鹅去氧胆酸、石胆酸等。根据动物的种不同,胆汁酸的种类、组成也有一些差别。
具有甾体骨架的物质中也包括河豚毒素。由于河豚毒素是剧毒,简便地检测出极微量的河豚毒素是有意义的。
甾体激素是指甾体化合物类的激素,例如雌激素、雄激素、促孕激素、肾上腺皮质激素等。
性激素主要是由生殖腺分泌的,诱发、促进生殖系统生长、发育,引起第二性征表达或生殖行为的激素的总称。性激素包括雄激素、雌激素和促孕激素。
雄激素一般是具有雄性激素作用的甾体激素的总称。但是,在本说明书中雄激素是指由19个碳原子构成的具有雄甾烷骨架的甾体化合物。雄甾烷骨架如下所示。
雄激素包括睾酮、雄甾烯二酮、脱氢反雄甾酮。
雄激素的生理作用例如分化胚胎时期的性别、维持雄性生殖器官(输精管、前列腺、精囊、附睾、外生殖器)的功能、表达第二性征、促进精子形成、促进骨骼肌等的蛋白质同化作用等。以及作用于丘脑下部或垂体,抑制通过负反馈机理引起的促黄体生成激素分泌。
例如,睾酮具有下述生理作用。睾酮具有第二性征的表达、蛋白质同化作用、促进肌肉发育等功能。另外,也具有作用于垂体,抑制促性腺激素的分泌,通过反馈机理维持一定的血中睾酮浓度的生理作用。
雌激素是在脊椎动物中主要由卵巢分泌的,促进雌性生殖腺附件发育发挥其功能的性激素的一种。对于哺乳动物会诱发动情期。胎盘分泌雌激素,此外肾上腺皮质或精巢也分泌少量雌激素。雌激素包括雌性激素和黄体激素。雌激素主要是雌二醇-17β、雌酮、雌三醇。
雌激素大致分为1)卵巢的成熟卵细胞以及妊娠时胎盘合成、分泌的雌二醇、尿中多见的雌酮、雌三醇、马烯雌酮、马萘雌酮等甾体激素及其代谢物;2)这些激素的化学衍生物中具有发情作用的物质(例如:高雌酮(homoestrone)、乙炔雌二醇、道益氏酸);3)不具有甾体结构,具有发情作用的合成物质,即合成雌激素(syntheticestrogen)(例如己烯雌酚、己烷雌酚)。
例如雌二醇-17β具有下述生理作用。对哺乳动物可促进卵细胞和乳腺的发育,作用于付性腺促进第二性征。另外,作用于脑弓形核,诱导对促黄体生成激素(LH)的负反馈,确实作用于视束前野分泌促性腺激素释放激素(GnRH),另外对垂体的GnRH敏感性高,引起排卵前的LH增多。对于鸟类,可促进输卵管中卵白蛋白质的合成、分泌。对于卵生脊髓动物,雌二醇-17β作用于肝脏,将卵黄蛋白质前体卵黄生成物(vitellogenin)通过血液运输到卵巢,摄取到卵中成为卵黄蛋白。
促孕激素(gestagen)是对于哺乳动物具有受精卵着床、维持妊娠作用等孕酮样作用的化合物的总称。促孕激素也称作孕激素(progestin、progestogen)。促孕激素的典型例子是孕酮,也包括20β-二羟基孕酮、孕甾二醇等不具有所述活性的类似于孕酮的甾体化合物。促孕激素由接受黄体激素作用的黄体分泌。
促孕激素的生理作用例如与雌激素协同作用,通过引起子宫内膜的肥厚和子宫腺分歧,促进受精卵着床;以及与雌激素发生拮抗性作用,抑制发情,使妊娠继续。
促孕激素也由哺乳黄体分泌,另外根据种不同在妊娠过程中大量分泌。促孕激素与雌激素协同作用于垂体前叶,抑制促黄体生成激素的分泌,因此在黄体活动时不引起排卵。
环境激素如上所述,是对生物的内分泌功能有不良影响的化学物质,释放到环境中的化学物质如果引入生物体内,就会发挥类似于激素的作用,扰乱了原有激素(例如甲状腺激素或卵泡激素)的作用,就会给健康的生物及其子孙的生殖功能或免疫功能等带来不良影响。
环境激素例如二噁英类、聚氯联苯类(PCB)、聚溴联苯类(PCB)、六氯苯(HCB)、五氯苯酚(PCP)、2,4,5-三氯苯氧乙酸、2,4-二氯苯氧乙酸、氨二唑、莠去津、甲草胺、simazine、六氯环己烷、乙基对硫磷、甲萘威、氯丹、氧化氯丹、反式-九氯、1,2-二溴-3-氯丙烷、DDT、DDE、DDD、三氯杀螨醇、氯甲桥萘、异狄氏剂、狄氏剂、硫丹(endosulfan、benzoepin)、七氯、环氧化七氯、马拉硫磷、甲氨叉威、甲氧氯、全氯五环癸烷、硝基苯(nitrophen)、毒杀芬、三丁基锡、三苯基锡、氟乐灵、烷基苯酚(C4-C9)、双酚A、邻苯二甲酸二2-乙基己酯、邻苯二甲酸丁基苯甲基酯、邻苯二甲酸二正丁基酯、邻苯二甲酸二环己酯、邻苯二甲酸二乙酯、苯并〔a〕芘、2,4-二氯苯酚、己二酸二2-乙基己酯、二苯甲酮、4-硝基甲苯、八氯苯乙烯、丁醛肟威、苯菌灵、开蓬(Kepone、chlordecone)、代森锰锌(manzeb、mancozeb)、代森锰、methyram、赛克嗪、氯氰菊酯、esfenvalerate、杀灭菊酯、permathrin、烯菌酮、亚乙基双二硫代氨基甲酸锌、二甲基二硫代氨基甲酸锌、邻苯二甲酸二戊酯、邻苯二甲酸二己酯、邻苯二甲酸二丙酯、苯乙烯的二聚物和三聚物、苯乙烯、正丁基苯、雌二醇等。这些环境激素中,三嗪类化合物例如莠去津、simazine。
具有环式烃部分的环境激素中存在毒性高的物质。环式烃部分有时是芳香族,有时是脂肪族。环式芳香烃部分例如苯环、萘环、菲环、蒽环、芘环等。例如茚、苯酚、苯乙烯等具有苯环这种芳香族环烃部分。环式烃部分有时是缩合环的基础成分。
具有环式烃部分的环境激素例如二噁英类、聚氯联苯类(PCB)、聚溴联苯类(PCB)、六氯苯(HCB)、五氯苯酚(PCP)、2,4,5-三氯苯氧乙酸、2,4-二氯苯氧乙酸、三苯基锡、烷基苯酚(C4-C9)、双酚A、邻苯二甲酸酯类、苯并〔a〕芘、2,4-二氯苯酚、二苯甲酮、4-硝基甲苯、八氯苯乙烯、苯乙烯的二聚物和三聚物、苯乙烯、正丁基苯、雌二醇等。
具有被卤素原子取代的环式烃部分,特别是被卤素原子取代的环式芳香烃部分的环境激素中含有毒性特别高的物质。卤素原子是指氟原子、氯原子、溴原子、碘原子或它们的任意组合,特别是氯原子和溴原子更成问题。具有被卤素原子取代的环式烃部分的环境激素例如二噁英类、聚氯联苯类(PCB)、聚溴联苯类(PCB)、六氯苯(HCB)、五氯苯酚(PCP)、2,4,5-三氯苯氧乙酸、2,4-二氯苯氧乙酸、2,4-二氯苯酚等。
二噁英类是指聚氯二苯并对二噁英(polychlorodibenzoparadioxine,以下称为PCDD)和聚氯二苯并呋喃(polychlorodibenzofuran,以下称为PCDF)的总称。结构式如下所示。
PCDD、PCDF都是含有2个苯环的缩合环,其1至9位碳上可以结合1~8个氯,因此PCDD存在75种异构体,PCDF存在135种异构体。
已知这些异构体中2,3,7,8-PCDD毒性最高。2,3,7,8-PCDD(分子量321.9)熔点在300℃附近,在常温下是稳定的物质,具有耐酸性、耐碱性。另一方面,紫外线照射容易分解,该性质可用于PCDD、PCDF的废弃处理。
二噁英类难溶于水(2×10-7g L-1),特别易溶于极性相近的间二氯苯(1.8g L-1)。此外,溶于甲醇、氯仿、壬烷、甲苯等。溶解于氯仿时最大吸收光谱为310nm。这种二噁英类是脂溶性的,这种性质对二噁英类摄取到生物体内时的体内蓄积分布有影响。
对于二噁英类的各种异构体的毒性,考虑与受体的结合能力、烯丙基烃氢氧化酶诱导能力、毒性影响,以2,3,7,8-PCDD的毒性为基准进行效价换算表示。表3
氯原子数 | 化合物名 | TEF | 化合物名 | TEF |
4 | Tetra CDD2,3,7,8-1,3,6,8-1,3,7,9-其他 | 1000 | Tetra CDF2,3,7,8-1,3,6,8-其他 | 0.100 |
5 | Penta CDD1,2,3,7,8-其他 | 0.50 | Penta CDF1,2,3,7,8-2,3,4,7,8-其他 | 0.050.50 |
6 | Hexa CDD1,2,3,4,7,8-1,2,3,6,7,8-1,2,3,7,8,9-其他 | 0.10.10.10 | Hexa CDF1,2,3,4,7,8-1,2,3,6,7,8-1,2,3,7,8,9-2,3,4,6,7,8,-其他 | 0.10.10.10.10 |
7 | Hepta CDD1,2,3,4,6,7,8-其他 | 0.010 | Hepta CDF1,2,3,4,6,7,8-1,2,3,4,7,8,9-其他 | 0.010.010 |
8 | Octa CDD | 0.001 | Octa CDF | 0.001 |
其次,对这些抗原的抗体进行说明。抗体可以是从商业上购得的物质,也可以试验室制备。
抗雄激素抗体、抗雌激素抗体、抗促孕激素抗体、抗皮质类固醇抗体、抗胆汁酸抗体,例如可以由Cosmobio株式会社(135-0016日本东京江东区东阳2-2-20)购得下述列举的抗体。
抗雄激素抗体例如抗睾酮抗体、抗雄甾烯二酮抗体、抗去氢表雄甾酮抗体、抗二氢睾酮抗体、抗19-OH-睾酮抗体、抗19-OH-雄甾烯二酮抗体、抗11-氧代-睾酮抗体、抗19-去甲-睾酮抗体、抗19-去甲-4-雄甾烯二酮抗体、抗16α-OH-4-雄甾烯二酮抗体、抗16α-OH-去氢表雄甾酮抗体、抗16α-OH-去氢雄甾酮抗体、抗16α-OH-睾酮抗体、抗5α-雄甾烷-3α,17β-二醇抗体、抗睾酮-葡萄糖醛酸化物抗体、抗雄甾烯二酮抗体、抗11β-OH-雄甾烯二酮抗体、抗5α-雄甾烷-3α,17β-二醇-3-葡萄糖醛酸化物抗体、抗5α-雄甾烷-3α,17β-二醇-17-葡萄糖醛酸化物抗体。
抗雌激素抗体例如抗雌酮抗体、抗雌二醇可以、抗雌三醇抗体、抗雌醇(estrol)抗体、抗16α-OH-雌酮抗体、抗2-OH-雌酮抗体、抗4-OH-雌酮抗体、抗2-甲氧基雌酮抗体、抗4-甲氧基雌酮抗体、抗乙炔雌二醇抗体、抗雌酮-3-葡萄糖醛酸化物抗体、抗雌酮-3-硫酸酯抗体、抗马萘雌酮抗体、抗马烯雌酮抗体、抗二乙基己烯雌酚抗体、抗雌酮-3抗体。
抗促孕激素抗体例如抗孕酮抗体、抗16α-OH-孕酮抗体、抗17α-OH-孕酮抗体、抗20α-孕酮抗体、抗20β-OH-孕酮抗体、抗孕烯醇酮抗体、抗孕烯醇酮-3抗体、16α-OH-孕烯醇酮抗体、17α-OH-孕烯醇酮抗体、抗5α-孕烯-3-20-二酮抗体、抗17α-OH-孕烯醇酮-3-硫酸酯抗体、抗17,20α-二羟基孕酮抗体、抗17α,20β-二羟基孕酮抗体、抗孕烯二醇-3-葡萄糖醛酸化物抗体、抗孕烯二醇-3-CMO抗体、抗孕烯三醇-3-葡萄糖醛酸化物抗体、抗17α,20β,21-三羟基孕酮抗体。
抗皮质类固醇抗体例如抗氢化可的松抗体、抗可的松抗体、抗去氧可的松抗体、抗皮质酮抗体、抗去氧皮质酮抗体、抗18-OH-皮质酮抗体、抗18-OH-去氧皮质酮抗体、抗醛甾酮抗体、抗11-去氢皮质酮抗体、抗6β-OH-氢化可的松抗体、抗THF(四氢氢化可的松)抗体、抗THE(四氢可的松)抗体、、抗THS(四氢去氧可的松)抗体、抗四氢醛甾酮抗体、抗皮甾五醇抗体、抗皮甾酮四醇抗体、抗11-去氧皮甾五醇抗体。
抗胆汁酸抗体例如抗胆酸抗体、抗甘胆酸抗体、抗去氧胆酸抗体、抗甘氨脱氧胆酸抗体、抗鹅去氧胆酸抗体、抗甘氨鹅去氧胆酸抗体、抗石胆酸抗体、抗甘氨石胆酸抗体、抗石胆酸硫酸酯抗体、抗甘氨石胆酸硫酸酯抗体、抗鹅去氧胆酸硫酸酯抗体、抗熊去氧胆酸抗体、抗猪去氧胆酸抗体。
另外,抗生长激素多克隆抗体可以由Cosmobio株式会社购得。另外,生长激素是一种甾体激素。
环境激素的抗体中可以由商业购得的物质如下所示。抗七氯抗体可以由Biostride公司以及Chemicon公司购得。抗马拉硫磷抗体、抗对硫磷抗体可以由Chemicon公司购得。抗PCB抗体可以由Concept公司购得。
抗二噁英类抗体的制备方法例如L.H.Stanker,B.Watkins,N.Rogers以及M.Vanderlaan,“抗二噁英单克隆抗体:抗体的特性因素以及分析开发”Toxicology,45(1987)229-243中记载的方法。
另外,如下述说明,可以制备抗原半抗原与高分子化合物的结合体,然后制备多克隆抗体。根据需要如下述说明由多克隆抗体制备单克隆抗体。制备抗原半抗原与高分子化合物的结合体
抗原的分子量小的场合,优选使抗原半抗原与适当的高分子化合物结合后用作免疫用抗原。
优选的高分子化合物例如钥孔嘁血蓝素(以下称为KLH)、卵白蛋白(以下称为OVA)、牛血清蛋白(以下称为BSA)、兔血清蛋白(以下称为RSA)等。
抗原半抗原与高分子化合物的结合可以按照例如活化酯法(A.E.KARU等,J.Agric.Food Chem.42 301-309(1994))或混合酸酐法(B.F.Erlanger等,J.Biol.Chem.234 1090-1094(1954))等公知方法进行。
活化酯法一般可以如下所述进行。首先,将半抗原化合物溶解在有机溶剂中,在偶合剂的存在下使之与N-羟基琥珀酰亚胺反应,生成N-羟基琥珀酰亚胺活化酯。
偶合剂可以使用缩合反应中惯用的常规偶合剂,包括例如二环己基碳化二亚胺、羰基二咪唑、水溶性碳化二亚胺等。有机溶剂可以使用例如二甲基亚砜(以下称为DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氧六环等。反应所使用的半抗原化合物与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比优选为1∶10~10∶1,更优选1∶1~1∶10,最优选1∶1。反应温度为0℃至100℃,优选5℃至50℃,更优选22℃至27℃,反应时间为5分钟至24小时,优选30分钟至6小时,更优选1小时至4小时。反应温度可以在各熔点以上沸点以下的温度下进行。
偶合反应后,将反应液加入到溶解有高分子化合物的溶液中使之反应,例如高分子化合物具有游离氨基的场合,该氨基与半抗原化合物的羧基之间形成酰胺键。反应温度为0℃至60℃,优选5℃至40℃、更优选22℃至27℃,反应时间为5分钟至24小时,优选1小时至16小时,更优选1小时至2小时。将反应物通过透析、脱盐柱等精制,可以得到抗原半抗原与高分子化合物的结合体。
另一方面,混合酸酐法中使用的混合酸酐可以通过羧酸和卤代甲酸酯的反应得到,通过使之与高分子化合物反应可以制得目的产物半抗原-高分子化合物结合体。该反应在碱性化合物的存在下进行。碱性化合物例如三丁基胺、三乙胺、三甲胺、N-甲基吗啉、吡啶、N,N-二甲基苯胺、DBN、DBU、DABCO等有机碱,碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸氢钠等无机碱等。该反应通常在-20℃至100℃下进行,优选0℃至50℃,反应时间为5分钟至10小时,优选5分钟至2小时。得到的混合酸酐与高分子化合物的反应通常在-20℃至150℃下进行,优选0℃至100℃,反应时间为5分钟至10小时,优选5分钟至5小时。混合酸酐法一般在溶剂中进行。溶剂可以使用混合酸酐法惯用的任意一种溶剂,具体例如二氧六环、二乙基醚、四氢呋喃、二甲氧基乙烷等醚类,二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷等卤代烃类,苯、甲苯、二甲苯等芳香烃类,乙酸甲酯、乙酸乙酯等酯类,N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、六甲基磷酰三胺等非质子性极性溶剂等。混合酸酐法中使用的卤代甲酸酯例如氯代甲酸甲酯、溴代甲酸甲酯、氯代甲酸乙酯、溴代甲酸乙酯、氯代甲酸异丁酯等。该方法中半抗原与卤代甲酸酯和高分子化合物的使用比例可以在宽范围内适当选择。
另外,按照与所述相同的方法使酶等标识物与抗原半抗原结合得到的物质可以用于抗原的检测。标识物有辣根过氧化酶(以下称为HPR)、碱性磷酸酶等酶,荧光素异氰酸酯、蓝光硷性蕊香红等荧光物质,32P、125I等反射性物质、化学发光物质等。制备多克隆抗体
可以使用抗原半抗原与高分子化合物的结合体,按照常规方法制备多克隆抗体。例如可以通过将抗原半抗原-BSA结合体溶解于磷酸钠缓冲液(以下称为PBS),与弗罗因德完全或不完全辅助剂、或明矾等辅助剂混合,将该混合物作为免疫用抗原投给动物进行免疫得到。被免疫的动物可以使用该技术领域中常用的任意一种动物,例如小鼠、大鼠、兔、山羊、马等。
免疫时的给药方法可以是皮下注射、腹腔注射、静脉注射、皮内注射、肌肉注射中任意一种,优选皮下注射或腹腔注射。可以免疫1次或适当间隔进行数次免疫,优选的间隔1周至5周进行数次免疫。
由免疫的动物取血,使用由此分离出的血清,可以评价与抗原反应的多克隆抗体的存在。
以抗原半抗原与高分子化合物形成的结合体作为免疫用抗原得到的抗血清可以在间接竞争抑制ELISA法中,例如以约10ng/ml的浓度与抗原反应。制备单克隆抗体
使用抗原半抗原与高分子化合物的结合体,按照公知的方法制备单克隆抗体。
在单克隆抗体的制备中,至少下述操作步骤是必要的。
(a)制备作为免疫用抗原使用的抗原半抗原与高分子化合物的结合体。
(b)对动物进行免疫
(c)取血,分析,以及制备抗体产生细胞
(d)制备骨髓瘤细胞
(e)抗体产生细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合以及杂交瘤的选择性培养
(f)产生抗体的杂交瘤的筛选以及细胞克隆
(g)通过培养杂交瘤或将杂交瘤移植到动物配制单克隆抗体
(h)测定配制的单克隆抗体的反应活性等
用于制备产生单克隆抗体的杂交瘤的常规方法例如杂交瘤技术(Hybridoma Technique)(Cold Spring Harbor Laboratory,1980年版);细胞组织化学(山下修二等,日本组织细胞化学会编,学际企画,1986年)记载的方法。
以下,说明抗原的单克隆抗体的制备方法,本领域技术人员应当清楚并不受此限制。
(a)-(b)步骤可以按照与关于多克隆抗体所述的相同方法进行。
(c)步骤中产生抗体的细胞为淋巴细胞,一般可以由脾脏、胸腺、淋巴结、末梢血液或它们的组合得到,但一般最常用的是脾脏细胞。因此,最终免疫后,由确认产生抗体的小鼠摘出抗体产生细胞存在的部位,例如脾脏,配制脾细胞。
(d)步骤中可以使用的骨髓瘤细胞例如可以使用来源于Balb/c小鼠的骨髓瘤细胞株P3/X63-Ag8(X63)(Nature,256,495-497(1975))、P3/X63-Ag8.U1(P3U1)(Current Topics.in Microbio1ogy and Immunology,81,1-7(1987))、P3/NSI-1-Ag 4-1(NS-1)(Eur.J.Immunol.,6,511-519(1976))、Sp2/O-Ag14(Sp2/O)(Nature,276,269-270(1978))、FO(J.Immuno.Meth.,35,1-21(1980))、MPC-11、X63.653、S194等骨髓瘤细胞株,或来源于大鼠的210.RCY3.Ag1.2.3.(Y3)(Nature,277,131-133(1979))等。
用含有牛胎儿血清的Dulbecco改进的Eagle’s培养基(DMEM)或Iscoff改进的Dulbecco培养基(IMDM)对所述细胞株进行继代培养,在融合当日确保约1×106以上的细胞数。
(e)步骤的细胞融合可以按照公知的方法,例如Milstein等的方法(Methods in Enzymology,73,3(1981))等进行。现在最普通的是使用聚乙二醇(PEG)的方法。PEG法例如细胞组织化学、山下修二等(所述)记载的方法。作为其它的融合方法,也可以采用电处理(电融合)的方法(大河内悦子等,试验医学5,1315-19,1987)。也可以适当采用其它方法。另外,细胞的使用比例也与公知方法相同,例如相对于骨髓瘤细胞使用3倍至10倍的脾细胞。
对脾细胞与骨髓瘤细胞融合后获得抗体分泌能力以及增殖能力的杂交瘤的选择,例如使用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶缺失株作为骨髓瘤细胞株时,通过使用将次黄嘌呤·氨基蝶呤·胸腺嘧啶核甙添加到所述DMEM或IMDM中配制的HAT培养基进行。
(f)步骤中,取一部分含有选择后的杂交瘤的培养上清液,例如按照后述ELISA法测定抗体对抗原的活性。
而且,对于通过测定判断已产生与抗原反应的抗体的杂交瘤进行细胞克隆。作为这种细胞克隆方法,例如通过极限稀释使每1孔中含有1个杂交瘤的方法“极限稀释法”;接种在软琼脂培养基上回收菌落的方法;通过显微操作器取出1个细胞的方法;通过细胞分拣器分离1个细胞的“分拣器克隆法”等。极限稀释法简单,因此经常使用。
对于确认有抗体效价的孔,反复克隆1~4次(例如采用极限稀释法),选择得到稳定抗体效价的试样作为产生抗抗原单克隆抗体的杂交瘤株。培养杂交瘤的培养基可以使用例如含有牛胎儿血清(FCS)的DMEM或IMDM等。杂交瘤的培养优选在二氧化碳浓度5-7%以及37℃(100%湿度的恒温器中)进行培养。
(g)步骤中用于配制抗体的大量培养可以采用后继纤维型(followfiber type)培养装置进行。或者也可以使杂交瘤在同种小鼠(例如所述Balb/c)或Nu/Nu小鼠的腹腔内增殖,通过腹水配制抗体。
这样得到的培养上清液或腹水液可以用作抗抗原单克隆抗体,也可以进一步透析、用硫酸铵盐析、凝胶过滤、冷冻干燥等,收集抗体部分精制,得到抗抗原单克隆抗体。而且,有必要精制的场合,可以通过将离子交换柱色谱法、亲和色谱法、高效液相色谱法(HPLC)等常规方法组合实施。
如上所述制得的抗原的单克隆抗体可以采用例如ELISA法等公知方法,确定亚纲、抗体效价等。
在图3和图4中,抗体19可以按照公知方法与固定层16形成共价键。例如,可以采用所述活化酯法(A.E.KARU等,J.Agric.FoodChem.42 301-309(1994))、或混合酸酐法(B.F.Erlanger等,J.Biol.Chem.234 1090-1094(1954))以及其它公知的偶合方法。
公知的偶合方法如图13和图14所示。图13和图14的偶合方法详细记载于V.P.Torchilin,Adv.Drug Deliviry Rev.,1,41(1987);以及社团法人日本化学会编“第4版试验化学讲座29高分子材料”,丸善株式会社平成5年9月25日发行。
典型的是将没有固定抗体19的传感器芯片植入可以插入到由SIACORE(注册商标)公司可购得的SPR装置中的规定支架的规定位置,然后将该支架插入SPR装置,使规定的反应液流入SPR装置,将抗体19固定在传感器芯片的表面。
图5A和图5B表示SPR装置,特别是其流动池结构体以及本发明的表面胞质团共振用传感器芯片。在图5A中,为了便于说明将棱镜34、光学界面38等光学系统、传感器芯片10以及池结构体42等微流路系统分开表示。与此相对,图5B是光学系统、传感器芯片10与微流路系统的剖面图。
在图5A和图5B中,10表示本发明的表面胞质团共振用传感器芯片。流入图3和图4表示的表面胞质团共振用传感器芯片。典型的是传感器芯片10在支架中形成,将支架插入SPR装置,将传感器芯片10固定在光学系统和微流路系统之间。该支架也可以从SPR装置中取出。
传感器芯片10的一侧设置有微流路系统,另一侧设置有光学系统。
光学系统具有光源(图中未表示)、棱镜34、棱镜与传感器芯片10之间的光学界面38以及检测器(图中未表示)。光源优选使用发光二极管,例如用棱镜34将波长为760nm的偏振光集中为楔形光,在全反射条件下照射传感器芯片10。通过固定的二极管序列等检测器检测由传感器芯片10反射的契形反射光强度。将其用计算机解析,自动计算出SPR角度。
微流路系统具有基板40和表面形成凹穴44的池结构体42。凹穴44具有3面为壁上方开口的结构。在池结构体42的上面可以装有象盖一样的传感器芯片10,这样可以形成流动池46。流动池46优选有2个以上,在图5A和图5B中形成了4个流动池。
与4个流动池46相对应,形成了4个传感器芯片10。也就是说,分别与图5B所示4个流动池46相对应,在图3和图4所示基板12的表面上形成金属薄膜14和固定层16。另一方面,在图5B中没有设置流动池的部分,例如池之间的部分所对应的基板12的表面没有必要形成金属薄膜14和固定层16。
流动池中,在微流路中流过的抗原与固定在传感器芯片10的表面上的抗体19结合。
图6A表示SPR装置的微流路系统,图6B是图6A的部分放大剖面图。
微流路系统50具有试样注入口52以及缓冲液注入口54。试样和缓冲液可以通过注射泵注入,优选在1~100μl/min的范围内以一定的流速送液。
置于试样架(图中未表示)上的试样通过自动取样器(图中未表示)自动混合、稀释,由试样注入口52注入。注入的溶液通过微流路输送到流动池46,在流动池46中与传感器芯片10的表面接触。
微流路系统的试样回路的高度为50μm。在试样回路与流动池之间设置有数个通过压缩空气工作的微小隔膜阀56,控制向微流路系统中的试样回路、流动池送液。这些阀的开关与试样的注入一致是通过计算机软件控制的。
图7表示微流路系统的流动池部分。图7中,阀门48b、48c、49c开放,阀门49a、49b、48d关闭。这样,试样按照流动池46a、46b、46c的顺序流动。
例如,也可以是流动池46a对应的传感器芯片上固定有抗雌二醇-17β抗体,流动池46b对应的传感器芯片上固定有抗二噁英抗体,流动池46c对应的传感器芯片上固定有抗PCB抗体。仅将试样1次导入SPR装置,即可检测出试样中的雌二醇-17β、二噁英、PCB。
这样,传感器芯片具有2种以上抗原的2种以上抗体时,通过1次操作,可以检测出2种以上的抗原,提高了效率。
通过阀门的操作,可以选择流过1个流动池或依次流过流动池几种模式。在微流路系统中,试样与缓冲液之间用气阀分隔,将试样的稀释、扩散抑制到最小限度,可以正确控制试样与传感器芯片10的接触时间。
图8A、图8B和图8C是竞合法的示意图。在胞质团共振分析中,可以通过消失角度的变化检测出抗原29与传感器芯片10上固定的抗体19结合引起的变化。
但是,抗原29的分子量小的场合,消失角度的变化也小,因而有时难以检测出消失角度的变化。因此,在抗原29的分子量小的场合,通过下述竞合法可以检测出消失角度。
竞合法中,使用标识抗原,即与适当的高分子化合物结合的抗原。标识抗原典型的可以通过使抗原与高分子化合物偶合得到。这种偶合方法可以采用与制备抗体时使抗原半抗原与适当的高分子化合物结合的相同方法。例如,可以采用图13和图14所示的偶合方法。另外,高分子化合物也可以使用同样的物质。
而且,对于标识抗原以及未标识的抗原和标识抗原按一定比例混合得到的1种以上混合物,可采用表面胞质团共振传感器芯片测定消失角度。
图8A中,含有标识抗原29a的标准试样在流路中流过,标识抗原29a与传感器芯片10的抗体19结合。
图8B中,所述标准试样与含有抗原29的试样按一定比例混合得到的混合物在流路中流过。标识抗原29a与抗原29按照混合物中标识抗原29a与抗原29的比例与传感器芯片10的抗体19结合。
图8C中,与图8B相同,所述标准试样与含有抗原29的试样按一定比例混合得到的混合物在流路中流过。但是,图8C中含有抗原29的试样的比例比图8B中的多。
也就是说,按照图8A、图8B、图8C的顺序,标识抗原的浓度降低,另一方面抗原29的浓度上升。这里,由于标识抗原29a分子量大,因此该标识抗原29a的浓度减少可以通过消失角度的变化检测出来。
实施例
使用瑞典Upsula的BIACORE公司制造并由Biacore株式会社(日本东京新宿区100人町3-25-1)购得的称为BIAcore(注册商标)2000的这种SPR装置,测定试样中的二噁英。
实施例1
采用氨基偶合法,使用BIAcore(注册商标)2000,将抗二噁英单克隆抗体固定在传感器芯片上。
没有固定抗体的传感器芯片使用可由BIAcore公司购得的商品名为CM5的传感器芯片。该传感器芯片具有图3所示结构。金属薄膜14由金构成,其厚度为50nm。固定本体18为不具有交联结构的羧甲基葡聚糖,厚度为100nm。
抗二噁英单克隆抗体使用Research Diagnostics公司(PleasantHill Road,Flanders,新泽西,美国)的商品目录编号PDI-Dioxin-30。宿主使用小鼠。该抗二噁英单克隆抗体中含有3.125ml(3.2mg/ml)0.05%的叠氮化钠(含10mgIgG1,0.2M PBS,pH7.2)。
该抗二噁英单克隆抗体的反应活性如下所述。
2,3,7,8-TCDD 100%
2,3,7,8-TCDF 4.6%
2,3,7-三CDD <20%
2,3-DCDD 2.2%
2-CDD 0.3%
1,2,4-三CDD <1.0%
首先,将BIAcore公司产生的传感器芯片CM5安装在BIAcore(注册商标)2000上。其次,将N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸化物(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液注入BIAcore(注册商标)2000中(5μl/min),使传感器芯片CM5活化。
将1000ppm的抗二噁英单克隆抗体离心,更换溶剂。最终溶解于10mM的醋酸缓冲液100微升中。将50微升该溶液以每分钟5微升的比例注入到IBAcore(注册商标)2000中,将抗二噁英单克隆抗体固定在传感器芯片表面。
注入乙醇胺,将传感器芯片表面的未反应活性部位阻滞。最后用0.1N盐酸冲洗。
实施例2
使用实施例1得到的传感器芯片,采用竞合法检测二噁英类。在实施例2中,装置内的温度维持在25℃。
首先,在BIAcore(注册商标)2000内部用流动缓冲液将7.6ppm的2,3,7,8-TCDD/甲醇溶液稀释至76-3.8ppb。流动缓冲液(HBS)的组成为含有0.01M HEPES、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005%Polysorbate20(v/v)的水溶液。
将稀释至各种浓度的2,3,7,8-TCDD溶液与10ppm的HRP-2,3,7,8-TCDD在BIAcore中混合。HRP-2,3,7,8-YCDD是指采用氨基偶合法用辣根过氧化酶(HRP)标识的HRP-2,3,7,8-TCDD。2,3,7,8-TCDD本身与抗体结合引起的消失角度变化小,用SPR不能测定,因此使用标识的2,3,7,8-TCDD。
其次,将该混合液注入BIAcore2000中(3μl/min),测定SPR信号,求出消失角度。也就是说,用波长为760nm的偏振光照射,测定其反射光强度,使入射光的入射角变化。另外,每次测定时用0.1N盐酸洗涤。
结果如表4和图9所示。表4
二噁英浓度 | 3.8ppb | 7.6ppb | 76ppb |
ΔRU | 256.5 | 230.6 | 170.6 |
273.7 | 230.3 | 152.4 | |
272.3 | 223.5 | 146.3 | |
136.5 | 107.2 | 74.3 | |
平均 | 234.75 | 197.9 | 135.9 |
将4个池得到的值平均,绘制成图9所示的曲线图。HRP-2,3,7,8-TCDD结合减少表明2,3,7,8-TCDD与抗体结合。
另外,1000RU相当于消失角度0.1度。通常,在SPR测定中由于消失角度的变化小,采用共振单位(RU)。
另外,图10表示抗二噁英单克隆抗体固定后的时间与应答值之间的关系。
实施例3
采用氨基偶合法,使用BIAcore(注册商标)2000,将抗雌二醇抗体固定在传感器芯片上。BIAcore(注册商标)2000内部的操作在25℃下进行。
没有固定抗体的传感器芯片使用可由BIAcore公司购得的商品名为CM5的传感器芯片。该传感器芯片具有图3所示结构。金属薄膜14由金构成,其厚度为50nm。固定本体18为不具有交联结构的羧甲基葡聚糖,厚度为100nm。
抗雌二醇抗体使用由Cosmobio株式会社(135-0016日本东京江东区东阳2-2-20)购得的雌二醇抗血清FKA204。该抗原为6-氧代-雌二醇-6-CMO-BSA IgG。
流动缓冲液使用BIAcore公司生产的HBS缓冲液。该缓冲液中含有0.01M HEPES、0.015M NaCl、3mM EDTA、0.005%表面活性剂Polysorbate 20(v/v),pH7.4。
首先,将BIAcore公司产生的传感器芯片CM5安装在BIAcore(注册商标)2000上。其次,将N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸化物(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液注入BIAcore(注册商标)2000中(5μl/min),使传感器芯片CM5活化。
将雌二醇抗血清(Cosmobio公司生产)用10mM醋酸缓冲液(pH4.8)稀释到50倍。最终液量为100微升。将50微升该溶液以每分钟5微升的比例注入到BIAcore(注册商标)2000中,将抗雌二醇单克隆抗体固定在传感器芯片表面。
注入40μl的1M乙醇胺(pH8.5),将传感器芯片表面的未反应活性部位阻滞。最后用65μl的0.1N盐酸冲洗。
实施例4
使用实施例3得到的传感器芯片,采用竞合法检测雌二醇。在实施例4中,装置内的温度维持在25℃。流动缓冲液使用50mM的磷酸缓冲液(pH7.5)。
使用调节到规定浓度的多种雌二醇溶液。将各雌二醇溶液1体积份与10ppm的HRP标识雌二醇4体积份在BIAcore2000内部混合。HRP标识雌二醇是指采用氨基偶合法用辣根过氧化酶(HRP)标识的雌二醇。
其次,将各种混合液35μl注入BIAcore2000中(5μl/min),测定SPR信号,求出消失角度。也就是说,用波长为760nm的偏振光照射,测定其反射光强度,使入射光的入射角变化。
再将100ppm的抗HRP抗体50μl注入BIAcore中(5μl/min),使之反应,测定消失角度。这样可以并用竞合法和三明治法(sandwichmethod)。
另外,每次测定时用0.1N盐酸洗涤。
使用Molcut(Millipore公司生产,部分的分子量10000)更换50ppm的HRP标识雌二醇(Cosmobio公司生产)的缓冲液。
使用Molcut(Millipore公司生产,部分的分子量10000)更换1000ppm的抗HRP抗体(Biomeda公司生产)的缓冲液,将抗HRP抗体稀释到100ppm。
结果如表5和图11所示。将4个池得到的值平均,绘制成图11所示的曲线图。表5
雌二醇浓度 | 0.01ppm | 0.05ppm | 0.1ppm | 0.5ppm | 1ppm | |||||
ΔRU | 188.7 | 187.1 | 188.3 | 185.4 | 188.6 | 191.2 | 191.1 | 185.1 | 148.1 | 188.7 |
187.4 | 189.2 | 189.9 | 184.1 | 183.4 | 187.4 | 174.1 | 181.6 | 156.8 | 160.1 | |
187.7 | 189.3 | 190.4 | 184.7 | 183.1 | 187.9 | 176.0 | 183.1 | 179.6 | 168.4 | |
242.8 | 244.8 | 244.2 | 240.0 | 237.2 | 243.0 | 224.9 | 235.3 | 212.1 | 211.0 | |
平均 | 202.1 | 200.9 | 200.2 | 193.9 | 178.1 |
本发明通过利用表面胞质团共振,可以高灵敏度的检测出抗原。例如,有时灵敏度可以达到约0.1ppb。另外,可以定性、定量的检测出抗原。而且,与以前的GC-MS法、采用酶反应的方法相比操作简单。
另外,由于本发明中使用抗原抗体反应,因此选择性优良。按照本发明,可以检测出能与具有甾体骨架的物质、甾体类激素等、性激素等或环境激素的抗体结合的物质。这种物质有可能是新型的环境激素,对于环境激素的筛选是有用的。
本发明不仅可以检测具有甾体骨架的物质、甾体激素等、性激素等或环境激素,以及筛选环境激素,而且也可以应用于性激素分泌异常的检查(例如:不孕检查)、妊娠检查、更年期障碍检查、运动员选手等的兴奋剂检测等。
Claims (32)
1、表面胞质团共振用传感器芯片,它具有:
金属薄膜;
相对于选自具有甾体骨架的物质,维持、促进或抑制甾体类激素生理作用的物质,维持、促进或抑制性激素生理作用的物质以及环境激素(但,三嗪类化合物除外)的1种以上抗原的1种以上抗体;用于将所述抗体固定在所述金属薄膜上的固定层。
2、如权利要求1所述的表面胞质团共振用传感器芯片,所述抗体为相对于甾体类激素或与甾体类激素具有相同生理作用的物质的抗体。
3、如权利要求1所述的表面胞质团共振用传感器芯片,所述抗体为相对于性激素或与性激素具有相同生理作用的物质的抗体。
4、如权利要求1所述的表面胞质团共振用传感器芯片,所述抗体为相对于雌激素的抗体。
5、如权利要求1所述的表面胞质团共振用传感器芯片,所述抗体为相对于具有环状烃部分的环境激素的抗体。
6、如权利要求1所述的表面胞质团共振用传感器芯片,所述抗体为相对于二噁英类的抗体。
7、如权利要求1所述的表面胞质团共振用传感器芯片,所述抗体通过共价键固定在所述固定层上。
8、如权利要求1所述的表面胞质团共振用传感器芯片,所述固定层含有1层以上的有机薄膜层。
9、如权利要求8所述的表面胞质团共振用传感器芯片,所述有机薄膜层具有被覆金属薄膜的连接层。
10、如权利要求8所述的表面胞质团共振用传感器芯片,所述有机薄膜层具有水凝胶层。
11、如权利要求8所述的表面胞质团共振用传感器芯片,所述有机薄膜层具有抗生蛋白链菌素层。
12、如权利要求8所述的表面胞质团共振用传感器芯片,所述有机薄膜层具有疏水层。
13、如权利要求12所述的表面胞质团共振用传感器芯片,所述疏水层含有与金属薄膜结合的硅原子。
14、如权利要求1所述的表面胞质团共振用传感器芯片,所述金属薄膜具有被入射光照射的照射面以及所述照射面的反面的检测面,所述固定层被覆在所述金属薄膜的所述检测面上。
15、如权利要求14所述的表面胞质团共振用传感器芯片,所述金属薄膜的所述照射面覆盖有可以透过照射光的基板。
16、如权利要求1所述的表面胞质团共振用传感器芯片,具有2种以上相对于所述抗原的2种以上所述抗体。
17、抗原的检测方法,包括下述步骤:
将具有金属薄膜,相对于选自具有甾体骨架的物质,维持、促进或抑制甾体类激素生理作用的物质,维持、促进或抑制性激素生理作用的物质以及环境激素(但,三嗪类化合物除外)的1种以上抗原的1种以上抗体以及用于将所述抗体固定在所述金属薄膜上的固定层的表面胞质团共振用传感器芯片的所述抗体暴露在试样中;
用光照射所述金属薄膜;
检测由所述金属薄膜发出的反射光强度。
18、如权利要求17所述的抗原的检测方法,还包括下述步骤:求出所述反射光消失角度的移动。
19、如权利要求17所述的抗原的检测方法,还包括在所述暴露步骤之前使标识物质与所述抗原结合得到的标识抗原与所述抗体结合。
20、如权利要求17所述的抗原的检测方法,所述抗体为相对于甾体类激素或与甾体类激素具有相同生理作用的物质的抗体。
21、如权利要求17所述的抗原的检测方法,所述抗体为相对于性激素或与性激素具有相同生理作用的物质的抗体。
22、如权利要求17所述的抗原的检测方法,所述抗体为相对于雌激素的抗体。
23、如权利要求17所述的抗原的检测方法,所述抗体为相对于具有环状烃部分的环境激素的抗体。
24、如权利要求17所述的抗原的检测方法,所述抗体为相对于二噁英类的抗体。
25、如权利要求17所述的抗原的检测方法,所述表面胞质团共振用传感器芯片优选具有相对于2种以上抗原的2种以上抗体,可以检测出2种以上的抗原。
26、表面胞质团共振装置,它包括:
表面胞质团共振用传感器芯片,具有金属薄膜,相对于选自具有甾体骨架的物质,维持、促进或抑制甾体类激素生理作用的物质,维持、促进或抑制性激素生理作用的物质以及环境激素(但,三嗪类化合物除外)的1种以上抗原的1种以上抗体以及用于将所述抗体固定在所述金属薄膜上的固定层;
光学系统,具有用于照射所述表面胞质团共振用传感器芯片的光源,用于检测由所述表面胞质团共振用传感器芯片发出的反射光的检测器,至少可以透过照射光的棱镜;
流路系统,用于使试样与所述表面胞质团共振用传感器芯片的所述抗体接触。
27、如权利要求26所述的表面胞质团共振装置,所述抗体为相对于甾体类激素或与甾体类激素具有相同生理作用的物质的抗体。
28、如权利要求26所述的表面胞质团共振装置,所述抗体为相对于性激素或与性激素具有相同生理作用的物质的抗体。
29、如权利要求26所述的表面胞质团共振装置,所述抗体为相对于雌激素的抗体。
30、如权利要求26所述的表面胞质团共振装置,所述抗体为相对于具有环状烃部分的环境激素的抗体。
31、如权利要求26所述的表面胞质团共振装置,所述抗体为相对于二噁英类的抗体。
32、如权利要求26所述的表面胞质团共振装置,所述流路系统具有流动池,所述表面胞质团共振用传感器芯片安装在与所述流动池相对应的位置。
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